DE10057894A1

DE10057894A1 - Diagnose-Kit, DNS-Chip sowie Verfahren zur Diagnostik oder Behandlungskontrolle bei Hodenkrebs

Info

Publication number: DE10057894A1
Application number: DE10057894A
Authority: DE
Inventors: Stefanie Waschuetza; Cengiz Tamak; Alf-Andreas Krehan; Pia Steffens; Veit Zieglschmid
Original assignee: Adnagen GmbH
Current assignee: Alere Diagnostics GmbH
Priority date: 2000-11-22
Filing date: 2000-11-22
Publication date: 2002-06-06

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Diagnose-Kit, ein DNS-Chip sowie Verfahren zur Diagnostik oder Behandlungskontrolle bei Hodenkrebs, wie sie insbesondere im Rahmen der Krebsvor- und -nachsorge von größter Wichtigkeit sind. Die vorliegende Erfindung beruht dabei im wesentlichen darauf, daß die mRNS von Hodentumormarkern in einer Blutprobe nachgewiesen wird, wobei die Tumormarker eine tumorassoziierte Genexpression darstellen. Hierfür kommen insbesondere beta-hCG, AFP, PLAP oder GCAP in Frage. Der Nachweis der mRNS erfolgt durch reverse Transkription in cDNS und anschließende Amplifikation ausgewählter Abschnitte der cDNS mittels Polymerasekettenreaktion.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Diagnose-Kit, einen DNS-Chip sowie ein Verfahren zur Diagnostik oder Behandlungskontrolle bei Hodenkrebs. Im Rahmen der Krebsvor- und -nachsorge ist es von großer Wich tigkeit, maligne Hodentumore bzw. rezidive, maligne Hodentumore anhand des Auftretens metastasierender Tumorzellen im Blut frühzeitig nachweisen zu können.

Hodenkrebs ist für weniger als 2% aller bösartigen Neubildungen von Tumoren beim Mann verantwortlich. Allerdings handelt es sich bei 20-30% aller Krebser krankungen unter 40jähriger Männer um Hodenkrebs. Die Zahl der jährlichen Neuerkrankungen beispielsweise in der Bundesrepublik Deutschland beträgt ca. 3600, wo bei ca. 240 Männer an Hodenkrebs sterben. Die höchste Inzidenz findet man dabei zwischen dem 25. und 40. Lebensjahr. Durch den Fortschritt in der onkologischen Therapie können heute über 90% aller Betroffe nen langfristig geheilt werden. Die hohen Überlebens raten begründen sich dabei in der ausgeprägten Wirk samkeit der cis-Platin-basierenden Chemotherapien.

Dabei gilt es, im klinischen Stadium 1 der Erkrankung zu entscheiden, ob der Patient mit einer Chemothera pie und/oder mit einer Operation belastet werden muß, um einen dauerhaften Heilungserfolg zu erzielen. Eine große Anzahl von Patienten wird dabei chemotherapeu tisch behandelt, obwohl kein gesicherter Nachweis ei ner Metastasierung vorliegt. In den Konzepten, die auf einer reinen Überwachung aufbauen, kommt es je doch in 25% der Fälle zu Rezidiven mit zum Teil töd lichem Ausgang.

Bei den derzeit angewandten Untersuchungsmethoden werden bei Krebspatienten sogenannte Tumormarker auf Proteinebene (immunologisch bzw. enzymatisch) quanti tativ im Blut oder in anderen Körperflüssigkeiten er mittelt. Diese Nachweisverfahren sind jedoch für die Tumordiagnostik bzw. Behandlungskontrolle/Nachsorge bei Hodentumor nur bedingt geeignet, da erhöhte Tu mormarkerwerte in Körperflüssigkeiten auch durch nichttumoröse Erkrankungen, wie beispielsweise Ent zündungen des Magen-Darm-Traktes, Leberzirrhose, Vi rusinfekte oder starkes Rauchen, hervorgerufen werden können.

Molekulargenetische Verfahren erscheinen hier für den Nachweis von Tumorzellen im peripheren Blut hilf reich, da am Beginn des Metastasierungsprozesses der Übertritt von Tumorzellen ins venöses Blut stehen kann.

Die EP 0 520 794 B1 offenbart ein derartiges Verfah ren, bei dem Metastasierungen in Körpergeweben oder Flüssigkeiten erfaßt werden. Dabei werden Nukleinsäu ren erfaßt, beispielsweise mittels Vervielfältigung durch Polymerase-Kettenreaktion. Das Verfahren beruht nun entscheidend darauf, daß die nachgewiesene Nu kleinsäuresequenz in allen Zellen des Herkunftsgewe bes eines Tumors exprimiert wird, d. h. sowohl in den gesunden Zellen als auch in den Tumorzellen des Her kunftsgewebes. Weitere Bedingung ist, daß diese Se quenz jedoch nicht in denjenigen Zellen exprimiert wird, deren Gewebe untersucht wird. Wird also eine entsprechende Sequenz in der untersuchten Probe ge funden, so muß diese von verschleppten, d. h. metasta sierenden Zellen eines ortsfremden Tumors herrühren. Damit beruht dieses Verfahren letztlich auf dem Nach weis von Zellen, die in der Blutprobe von gesunden Personen nicht vorkommen.

Insgesamt ist festzustellen, daß die derzeit verwen deten, diagnostischen Methoden zu ungenau sind, wenn es um die Beurteilung der malignen Potenz von Resttu moren nach durchgeführter Chemotherapie in den meta stasierenden Stadien geht. Es gilt also weiterhin, Nachweise für eine okkulte bzw. restliche Metastasie rung zu finden, die eine rechtzeitige Einordnung in die vielfältigen, primär kurativen, therapeutischen Op tionen zulassen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren, ein Diagnose-Kit sowie einen Nukleinsäure- Mikroarray zur Verfügung zu stellen, mit denen Tumor zellen bei Hodentumorerkrankungen im peripheren Blut nachgewiesen werden können.

Diese Aufgabe wird durch das Diagnose-Kit nach An spruch 1, den Mikroarray nach Anspruch 22 sowie das Verfahren nach Anspruch 25 und deren Verwendung nach Anspruch 29 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen des erfindungsgemäßen Diagnose-Kits, Mikroarrays, Verfah rens oder der Verwendungen werden in den jeweiligen, abhängigen Ansprüchen gegeben.

Die vorliegende Erfindung beruht im wesentlichen dar auf, daß nicht etwa auf immunologischer oder enzyma tischer Ebene Hodentumormarker im Blut von Patienten nachgewiesen werden, sondern daß die mRNS (Messenger- Ribonukleinsäure) von Hodentumormarkern in einer Blutprobe nachgewiesen wird, wobei die Tumormarker eine tumorassoziierte Genexpression darstellen. Als Marker für Hodentumoren werden erfindungsgemäß die β- Untereinheit des humanen Choriongonadotropin (β-hCG), die in Chorionkarzinomen sowie Keimzelltumoren des Hodens exprimiert wird, das α-Fetoprotein (AFP), das bei nicht-seminösen Hodentumoren exprimiert wird, die Plazenta-spezifische, alkalische Phosphatase (PLAP) und die Keimzell-spezifische, alkalische Phosphatase (GCAP), die bei Hodentumoren exprimiert werden, er faßt. Der Nachweis kann dabei für nur einen der Mar ker oder auch für eine beliebige Anzahl dieser vier Hodentumorenmarker in Kombination miteinander durch geführt werden. Das erfindungsgemäße Kit kann daher Oligonukleotidpaare für nur einen oder eine beliebige Auswahl oder auch alle der vier Hodentumormarker ent halten. Dadurch werden alle diejenigen Fälle nicht erfaßt, bei denen beispielsweise aufgrund von anderen Krankheiten ebenfalls die Hodentumormarker im Ur sprungsgewebe exprimiert und als Protein in die Blut bahn gelangen. Es werden folglich lediglich Zellen erfaßt, die zum einen sich selbst in der Blutprobe befinden und zum anderen den jeweiligen Hodentumormarker exprimieren. Dabei handelt es sich folglich um Tumorzellen, die aus ihrem ursprünglichen Hodentumor gewebe stammen und in das Blut der Patienten ver schleppt wurden. Da im Blut nicht an einem Hodentumor Erkrankter die mRNA der untersuchten Marker nicht ex primiert werden, zeigt sich eine direkte Korrelation zwischen dem Auftreten der zugehörigen mRNA und einer Metastasierung schon im frühen Stadium im Metasta sierungsprozeß.

Vorteilhafterweise wird nicht nur die mRNS eines ein zelnen Hodentumormarkers erfaßt, sondern eine Kombina tion von Markern untersucht. Dadurch ist es möglich, beispielsweise alle Hodenkrebsformen über ihre im Blut metastasierenden Zellen erfassen zu können. Dies bedeutet, daß sowohl seminomatöse als auch nichtsemi nomatöse Hodenkrebsformen bzw. auch Mischtumore mit Anteilen eines Seminoms und damit 90-95% aller ma lignen Tumore des Hodens, nämlich sämtliche Keim zelltumoren, erfaßt werden.

Im folgenden werden einige Beispiele erfindungsgemä ßer Verfahren, hierzu verwendeter Diagnose-Kits und dergleichen beschrieben.

Es zeigen:

Fig. 1 den Nachweis von PCR-Produkten über eine gelelektrophoretische Trennung;

Fig. 2 ein weiteres Beispiel eines PCR- Produktnachweises über gelelektrophoreti sche Trennung;

Fig. 3 den Nachweis von PCR-Produkten über ABI- Fragmentanalyse;

Fig. 4 den Nachweis von PCR-Produkten über ABI- Fragmentanalyse, und

Fig. 5 einen weiteren Nachweis von PCR-Produkten über ABI-Fragmentanalyse.

In einem ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfah rens wird einem Patienten eine Blutprobe entnommen. Aus einem Milliliter dieses Vollblutes (als EDTA- Vollblut) erfolgt eine RNS-Aufarbeitung mit dem QIAampRNA-Blood-Mini-Kit™ (Firma Qiagen, Hilden). Kontaminationen mit genomischer DNS werden durch ei nen zusätzlichen DNS-Verdau mit dem RNase-Free-DNase- Set™, (Firma Qiagen, Hilden) auf der Säule vermie den.

Anschließend wurde die RNS in einem entsprechenden Volumen Wasser zusammen mit Oligo-(dT)₁₅-Primern der Firma Promega, Mannheim für 5 Minuten bei 65°C dena turiert und anschließend direkt auf Eis inkubiert. Es folgte eine cDNS-Synthese bei 37°C für eine Stunde und eine nachfolgende Inaktivierung der zugegebenen, reversen Transkriptase für 5 Minuten bei 93°C und Abkühlung auf Eis. Die gesamte, reverse Transkription wurde mittels des Sensiskript™-Reverse-Transkriptase- Kit der Firma Qiagen, Hilden durchgeführt.

Der Reaktionsansatz für 20 µl für die cDNS-Synthese ist in der nachfolgenden Tabelle 1 angegeben.

Tabelle 1

Komponenten der cDNS-Synthese

Im Anschluß an die reverse Transkription wurde eine Multiplex-PCR mit β-Aktin als interner Kontrolle durchgeführt. Der entsprechende Reaktionsansatz geht aus Tabelle 2 im folgenden hervor.

Tabelle 2 PCR-Ansatz

Die PCR-Synthese erfolgte in einem 20-µl-Reaktionsansatz

Als Primer wurden die in der folgenden Tabelle 3 zu sammengefaßten PCR-Primer eingesetzt.

Tabelle 3

Liste der PCR-Primer

Diese Primer wurden in den in Tabelle 4 aufgelisteten Mengen und Kombinationen eingesetzt. Für den Nachweis von GCAP/PLAP wurde eine nested-PCR durchgeführt mit den in der Tabelle 3 angegebenen Primern.

Tabelle 4 Auflistung der Primermengen und Pri merkombinationen

Die für die Hodentumormarkereinzel nachweise eingesetzten Primerkombina tionen und -mengen sind spaltenweise aufgeführt.

Die anschließende Multiplex-PCR wurde unter den in Tabelle 5 angegebenen Bedingungen und bei den in Ta belle 6 angegebenen, markerspezifischen Annealingtem peraturen und Zyklenzahlen durchgeführt. In Tabelle 5 ist die Annealingtemperatur mit x angegeben, wobei dabei jeweils die entsprechende Annealingtemperatur aus Tabelle 6 verwendet wurde.

Tabelle 5

PCR-Bedingungen

Tabelle 6

Marker-spezifische Annealingtemperatur und Zyklenzahl

Das Ergebnis der RT-PCR wurde anschließend über Aga rosegelelektrophorese ausgewertet. Hierzu wurden 25 µl des PCR- bzw. 10 µl des nested-PCR-Produktes über ein 2,5%iges Agarosegel aufgetrennt und die DNS-Banden mit Ethidiumbromid eingefärbt. Die Doku mentation erfolgte mit Hilfe des DUO-Store-Systems von Intas™.

Fig. 1 zeigt den Nachweis über UV-Detektion bei 260 nm eines derartigen Agarosegels nach Ethidiumbro midfärbung. In den Spuren 1 und 5 sind jeweils Lei tern mit Banden mit 100 Basenpaaren Abstand aufgetra gen. Bei Fig. 1 handelt es sich dabei um ein Beispiel für den Nachweis von Seminomen. In sämtlichen Spuren 2 bis 4, in denen die Marker AFP, β-hCG bzw. GCAP/PLAP nachgewiesen werden sollten, wurde als in terne Kontrolle auch β-Aktin nachgewiesen. Dieses zeigt sich als Bande bei ca. 116 Basenpaaren. In Spur 2 ist keine Bande bei 357 Basenpaaren zu erkennen, wie es beim Nachweis von AFP der Fall hätte sein sol len. Demgegenüber ist jedoch in Spur 3 und Spur 4 ei ne Bande bei 297 Basenpaaren bzw. bei 247 Basenpaaren zu erkennen, so daß zum einen β-hCG als auch durch eine nested-PCR GCAP bzw. PLAP nachgewiesen wurde.

Fig. 2 zeigt ein entsprechendes, mit Ethidiumbromid gefärbtes Agarosegel, wobei hier jedoch nicht die für Seminome typischen Tumormarker PLAP/GCAP zu erkennen sind sondern entsprechende Banden in Spur 2 bei 357 Basenpaaren (AFP, schwache Bande in Spur 2) und in Spur 3 bei 297 Basenpaaren (hCG, starke Bande in Spur 3). In Spur 4 ist keine Bande für GCAP/PLAP (bei 247 Basenpaaren für nested-PCR) zu erkennen. Hier wurde folglich ein Nicht-Seminom nachgewiesen, das die Mar ker AFP und β-hCG exprimiert.

Alternativ zu der Auswertung per Agarosegelelektro phorese wurde eine ABI-Fragmentanalyse durchgeführt. Hierzu wurde ein ABI-Prism-310-Genetic-Analyser der Firma PE Applied Biosystems, Weiterstadt, eingesetzt. Dazu wurden jeweils 1 µl des PCR-Produktes bzw. 1 µl der nested-PCR in der Verdünnung 1 : 50 eingesetzt.

Fig. 3 zeigt ein Chromatogramm einer ABI-Fragment anlayse, bei der unmittelbar sowohl der Peak des PCR- Produktes für β-Aktin bei 116 Basenpaaren als auch der Peak des PCR-Produktes für GCAP/PLAP in der ne sted-PCR bei 247 Basenpaaren zu erkennen ist.

Fig. 4 zeigt ein weiteres Chromatogramm, bei dem die Banden der PCR-Produkte für β-Aktin sowie für β-hCG bei 297 Basenpaaren zu erkennen ist.

Fig. 5 zeigt ein weiteres Beispiel eines Chromato gramms der ABI-Fragmentanalyse einer Probe, bei der neben der β-Aktin-Bande bei 116 Basenpaaren auch die Bande des PCR-Produktes für AFP bei 357 Hasenpaaren vorliegt.

Damit ist gezeigt, daß die entsprechenden Hodentumor marker, wie beschrieben und beansprucht, nachgewiesen werden können.

Zentral für die Qualität des Nachweises der isolier ten RNS und der daraus synthetisierten cDNS ist die Anreicherung der hierfür verwendeten Zellfraktion aus der verwendeten Blutprobe. Hierfür wurden beispiel haft drei Verfahren durchgeführt:

a) Es wurde durch wiederholte Zentrifugation nach Erythrozytenlyse die mRNS angereichert. Hierzu wurden 1 ml EDTA-Blut aus der Blutprobe 5 Volu mina Erythrozyten-Lysepuffer (siehe QIAamp Blood- Kit der Firma Qiagen, Hilden) zugegeben und an schließend für 20 min auf Eis lysiert. Anschlie ßend wurde zentrifugiert, und nach Abnehmen des Lysates von den pelletierten Zellen und der Re suspendierung der Zellen in Erythrozyten-Lyse puffer erfolgte eine erneute Zentrifugation bei 3000 g für 20 min. Nach Abnehmen des Überstandes steht die pelletierte Leukozytenfraktion für die RNS-Präparation, wie oben beschrieben, zur Verfü gung.
b) Es wurde alternativ eine Anreicherung der Zellen durch Dichtegradienten-Zentrifugation durchge führt. Hierbei lassen sich Zellen unterschiedli cher, mittlerer Volumendichte mittels eines über Zentrifugation erzeugten Dichtegradienten von einander trennen. Mononukleare Blutzellen wurden beispielsweise mittels eines Ficoll-Hypaque- Gradienten (Firma Pharmacia, Uppsala, Schweden) separiert und anschließend zweifach mit PBS/1% FCS gewaschen.
c) Als weitere Alternative wurden die Tumorzellen durch ein FACS-Durchflußzytometer angereichert.
Hierzu wurden die mononuklearen Zellen aus der mittels des Verfahrens unter a) oder b) angerei cherten Fraktion mit fluoreszenzmarkierten, mono klonalen Antikörpern gegen tumorspezifische Oberflächenproteine inkubiert. Die markierten Zellen wurden anschließend zweifach mit PBS ge waschen, und im Anschluß wurden insgesamt 10⁷ Zellen in 1 ml PBS resuspendiert. Anschließend erfolgt die Isolierung der Tumorzellen mittels fluoreszenzassoziierter Zellsortierung, wozu ein FACS-Vantage-SE-Durchflußzytometer der Firma Becton Dickinson verwendet wurde. Die sortierten Zellen wurden dann in ein 1,5-ml-Reaktionsgefäß, das mit 1 ml PBS gefüllt war, überführt.

Alternativ zur oben beschriebenen RNS-Isolierung ist es auch möglich, die isolierte Fraktion mononuklearer Blutkörperchen, wie sie oben unter a) und b) be schrieben sind, in TRIzol-Reagenz der Firma Gibco BRL, NY, USA aufzunehmen, zu lysieren und mittels Pi pette zu homogenisieren. Anschließend wird die RNS- haltige, wäßrige Phase aus einer Chloroform-Extraktion in Isopropanol bei -80°C gefällt. Nach zweimaligem Waschen in 80%igem Ethanol wird das Pellet an der Luft getrocknet und anschließend in RNase-freiem Was ser resuspendiert.

Die Analyse der mittels der PCR amplifizierten Frag mente kann noch durch weitere Verfahren erfolgen. Zum einen wurde beispielhaft 1 µl der PCR amplifizierten Fragmente auf einen DNA500-LabChip der Firma Agilent Technologies, Waldbronn, aufgetragen, mittels eines Agilent-2100-Bioanalyzers (Firma Agilent Technolo gies, Waldbronn) getrennt und das Trennergebnis zeit gleich dokumentiert. Das Resultat ist dann elektro nisch speicherbar.

Alternativ ist eine Quantifizierung über fluoreszenz basierte Echtzeit-PCR möglich. Hierzu wird dem PCR- Ansatz eine sequenzspezifische, fluoreszenzmarkierte Hybridisierungsprobe zugesetzt, durch die nach jedem Zyklus der PCR mittels der von ihr emittierten Fluo reszenz die Produktentwicklung, d. h. die Amplifikati on, verfolgt werden kann. Anhand spezieller Standards können dann Rückschlüsse auf die Mengen an Ausgangs- RNS gezogen werden. Damit ist auch eine Quantifizie rung der in der Blutprobe vorliegenden Hodentumoras soziierten RNS und folglich eine direkte Aussage über das Ansprechen auf eine gewählte Therapiemethode mög lich. Dieses Verfahren kann beispielsweise mit einem Light-Cycler™ der Firma Roche, Basel oder einem Taq- Man™ der Firma PE Applied Biosystems, Weiterstadt, wie es bereits hinlänglich aus der Literatur bekannt ist, durchgeführt werden.

Claims

1. Diagnose-Kit zur Diagnostik oder Behandlungskon trolle von Hodentumoren mit:
mindestens einem Paar Oligonukleotide (Reverse primer, Forwardprimer),
wobei die beiden Oligonukleotide des Paares als Primer zur Amplifikation mittels Polymeraseket tenreaktion jeweils eines der beiden komplemen tären Stränge eines gesuchten DNS-Abschnittes geeignet sind, und
wobei der gesuchte DNS-Abschnitt Teil der cDNS zu einem der Tumormarkerproteine α-Fetoprotein (AFP), β-Untereinheit des humanen Choriongona dotropin (β-hCG), plazenta-spezifische, alkali sche Phosphatase (PLAP) und/oder keimzell- spezifische, alkalische Phosphatase (GCAP) ist.

2. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens drei Paare Oligonukleotide (Reverseprimer, Forward primer) enthält,
wobei die beiden Oligonukleotide der jeweiligen Paare als Primer zur Amplifikation mittels Poly merasekettenreaktion jeweils eines der beiden komplementären Stränge verschiedener, gesuchter DNS-Abschnitte geeignet sind, und
wobei die gesuchten DNS-Abschnitte jeweils Teil der c-DNS zu verschiedenen Tumormarkerproteinen, ausgewählt aus den Tumormarkerproteinen α- Fetoprotein (AFP), β-Untereinheit des humanen Choriongonadotropin (β-hCG), plazenta-spezi fische, alkalische Phosphatase (PLAP) und/oder keimzell-spezifische, alkalische Phosphatase (GCAP) sind.

3. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden An sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es minde stens ein weiteres Paar Oligonukleotide (Rever seprimer, Forwardprimer) enthält, wobei die beiden Oligonukleotide des Paares als Primer zur Amplifikation mittels Polymeraseket tenreaktion der Reaktionsprodukte einer Polyme rasekettenreaktion mit einem der anderen Oligo nukleotidpaare geeignet sind.

4. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden An sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es ein wei teres Paar Oligonukleotide enthält, die jeweils als Primer zur Amplifikation zumindest eines Ab schnitts eines der beiden komplementären Stränge der cDNS zu dem Protein β-Aktin als interne Kon trolle geeignet sind.

5. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden Oligonu kleotide eines Paares paarweise die folgenden Sequenzen aufweisen:
CTCTTCAGCAAAGCAGACTTC und GCTGACATTATTATCGGACAC
und/oder
CTACTGCCCCACCATGACCCG und GGGAGTCGGGATGGACTTGGAA
und/oder
GGCTCTGTCCAAGACATACA und ACCTTGGCTGTAGTCATCTG
und/oder
AACCAGTGCAACACGACACG und CTAGGATCACATCAATGTCC.

6. Diagnose-Kit nach einem der beiden vorhergehen den Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zu mindest jeweils eines der beiden Oligonukleotide eines Paares von Oligonukleotiden mit Fluoropho ren markiert ist.

7. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotide verschiedener Paare mit verschiedenen Fluoropho ren markiert sind.

8. Diagnose-Kit nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligonukleotid mit der Sequenz:
GCTGACATTATTATCGGACAC
und/oder
CTACTGCCCCACCATGACCCG
und/oder
AACCAGTGCAACACGACACG
mit dem Fluorophor
Carboxyfluorescein
markiert ist.

9. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden An sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Am plifikation der cDNS zu β-Aktin ein Paar Oligo nukleotide mit den folgenden Sequenzen enthält:
CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT und AGCACTGTGTTGGCGTACAG.

10. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest jeweils eines der beiden Oligonukleotide des Paares zur Amplifikation der cDNS zu β-Aktin mit Fluoropho ren markiert ist.

11. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligonukleotid mit folgender Sequenz:
CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT
mit dem Fluorophor
4,7,2',4',5',7'-Hexachloro-6-Carboxyfluorescein
markiert ist.

12. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden An sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es die zur Durchführung einer Polymerasekettenreaktion er forderlichen Substanzen enthält.

13. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden An sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es als zur Durchführung einer Polymerasekettenreaktion erforderliche Substanzen eine Pufferlösung, Mag nesiumchlorid, Desoxynukleotid-Triphosphate so wie eine hitzestabile Polymerase enthält.

14. Diagnose-Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß es als hitzestabile Polymerase eine Polymerase aus Thermus aquaticus (Taq-Polymerase) enthält.

15. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden An sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es als Po sitivkontrolle eine DNS-Probe mit dem jeweils gesuchten DNS-Abschnitt enthält.

16. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden An sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Anleitung zur Durchführung der Polymer asekettenreaktion und/oder eine Anleitung zur Durchführung einer Fragment analyse enthält.

17. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden An sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Schema zur Auswertung der erhaltenen Meßergeb nisse enthält.

18. Diagnose-Kit nach einem der vorhergehenden An sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Mikroarray (DNS-Chip) enthält, wobei der Array eine Anzahl voneinander getrennter Zellen (Fel der) aufweist und in mindestens einer Zelle des Mikroarrays ein Oligonukleotid angeordnet ist, das mit dem gesuchten DNS-Abschnitt hybridi siert.

19. Diagnosekit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß in mindestens einer weiteren Zelle des Mikroarrays ein weiteres Oli gonukleotid angeordnet ist und die Sequenz des Oligonukleotids, das in der mindestens einen Zelle angeordnet ist, sich von der Sequenz des weiteren Oligonukleotids unterscheidet.

20. Diagnose-Kit nach einem der beiden vorhergehen den Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in mindestens zwei Zellen jeweils ein Oligonukleo tid angeordnet ist, wobei die in verschiedenen Zellen angeordneten Oligonukleotide jeweils mit verschiedenen, gesuchten DNS-Abschnitten hybridi sieren.

21. Mikroarray zur Diagnostik oder Behandlungskon trolle von Hodentumoren, beispielsweise DNS- Chip, mit einer Anordnung von mehreren, von einander getrennten Zellen, dadurch gekennzeich net, daß in mindestens einer Zelle ein Oligonu kleotid angeordnet ist, das mit einem DNS- Abschnitt hybridisiert, der Teil der cDNS zu ei nem der Tumormarkerproteine α-Fetoprotein (AFP), β-Untereinheit des humanen Choriongonadotropin (β-hCG), plazenta-spezifische, alkalische Phos phatase (PLAP) und/oder keimzellspezifische, al kalische Phosphatase (GCAP) ist.

22. Mikroarray nach Anspruch 21, dadurch gekenn zeichnet, daß in zwei bis vier Zellen jeweils verschiedene Oligonukleotide angeordnet sind, die mit jeweils zwei bis vier verschiedenen DNS- Abschnitten, die Teil der cDNS von jeweils ver schiedenen Tumormarkerproteinen, ausgewählt aus den Tumormarkerproteinen α-Fetoprotein (AFP), β- Untereinheit des humanen Choriongonadotropin (β- hCG), plazenta-spezifische, alkalische Phosphata se (PLAP) und/oder keimzell-spezifische, alkali sche Phosphatase (GCAP) sind, hybridisieren.

23. Verfahren zur Diagnostik oder Behandlungskon trolle von Hodentumoren bei einem Menschen, da durch gekennzeichnet, daß in einer Blutprobe des Menschen das Vorhandensein oder Fehlen von mRNS erfaßt wird, die für mindestens eines der Tumor markerproteine α-Fetoprotein (AFP), β-Unterein heit des humanen Choriongonadotropin (β-hCG), plazenta-spezifische, alkalische Phosphatase (PLAP) und/oder keimzell-spezifische, alkalische Phosphatase (GCAP) kodiert und daraus auf das Vorhandensein von Tumorzellen in der Blutprobe und damit auf mögliche Metastasierung geschlos sen wird.

24. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, da durch gekennzeichnet, daß die mRNS in herkömmli cher Weise unmittelbar aus der Vollblutprobe isoliert wird.

25. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, da durch gekennzeichnet, daß anschließend an die Isolation der mRNS ein DNS-Verdau durchgeführt wird.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß die RNS-haltigen Be standteile der Blutprobe zuerst aufkonzentriert werden und anschließend diese Fraktion unter sucht wird.

27. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, da durch gekennzeichnet, daß zur Aufkonzentration der RNS-haltigen Bestandteile mindestens eine Zentrifugation der Blutprobe zur Pelletierung der in ihr enthaltenen Leukozyten durchgeführt wird.

28. Verfahren nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zur Auf konzentration der RNS-haltigen Bestandteile eine Lyse darin enthaltener Erythrozyten durchgeführt und anschließend die nichtlysierten Leukozyten als Fraktion pelletiert und für die weitere Diagnose gewonnen werden.

29. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß zur Aufkonzentration der RNS-haltigen Bestandteile mindestens eine Dichtegradienten-Zentrifugation der Blutprobe zur Abseparierung und Gewinnung der in ihr ent haltenen, mononuklearen Blutzellen durchgeführt wird.

30. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß die gewonnenen, mono nuklearen Blutzellen mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern markiert und mittels fluoreszenzas soziierter Zellsortierung (FACS) von der Probe abgetrennt und gewonnen werden.

31. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß die mononuklearen Zellen der gewonnenen Fraktion lysiert und die mRNS abgetrennt wird.

32. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß die gewonnene mRNS in cDNS revers transkribiert wird und anschlie ßend das Vorhandensein oder Fehlen der cDNS er faßt wird, die dem Tumormarkerprotein zugeordnet ist.

33. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, da durch gekennzeichnet, daß zumindest ein vorbe stimmter Abschnitt der cDNS durch Polymerase- Kettenreaktion ("PCR") bzw. verschachtelte Poly merase-Kettenreaktion ("nested PCR") vervielfältigt wird.

34. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, da durch gekennzeichnet, daß zur Vervielfältigung der cDNS eines oder mehrere Oligonukleotid-Paare verwendet werden, die die folgenden Sequenzen aufweisen:
CTCTTCAGCAAAGCAGACTTC und GCTGACATTATTATCGGACAC
und/oder
CTACTGCCCCACCATGACCCG und GGGAGTCGGGATGGACTTGGAA
und/oder
GGCTCTGTCCAAGACATACA und ACCTTGGCTGTAGTCATCTG
und/oder
AACCAGTGCAACACGACACG und CTAGGATCACATCAATGTCC.

35. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeich net, daß die Oligonukleotide mit der Sequenz:
GCTGACATTATTATCGGACAC
und/oder
CTACTGCCCCACCATGACCCG
und/oder
AACCAGTGCAACACGACACG
mit dem Fluorophor
Carboxyfluorescein
markiert sind.

36. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 35, dadurch gekennzeichnet, daß als interne Kontrol le die mRNS des Proteins β-Aktin bestimmt wird.

37. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, da durch gekennzeichnet, daß die mRNS für β-Aktin in cDNS revers transkribiert und ein Abschnitt der cDNS mittels Polymerasekettenreaktion ver vielfältigt wird.

38. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, da durch gekennzeichnet, daß zur Vervielfältigung der cDNS des β-Aktins ein Oligonukleotid-Paar verwendet wird, wobei die Oligonukleotide des Paares die folgenden Sequenzen aufweisen:
CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT und AGCACTGTGTTGGCGTACAG.

39. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, da durch gekennzeichnet, daß das Oligonukleotid mit der Sequenz:
CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT
mit dem Fluorophor
4,7 2',4',5',7'-Hexachloro-6-Carboxyfluorescein
markiert ist.

40. Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 39, dadurch gekennzeichnet, daß der vervielfältigte cDNS-Abschnitt durch geeignete Restriktionsenzy me verdaut und anhand der erzeugten cDNS- Bruchstücke das Vorhandensein oder Fehlen der mRNS eines Tumormarkerproteins bestimmt wird.

41. Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 39, dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis der am plifizierten cDNS-Abschnitte eine Gelelektropho rese der PCR-Produkte durchgeführt wird.

42. Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 39, dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis der am plifizierten cDNS-Abschnitte eine Fragmentanaly se durchgeführt wird.

43. Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 39, dadurch gekennzeichnet, daß während des Verlaufs der Polymerasekettenreaktion die von den Produk ten erzeugte Fluoreszenz erfaßt und die Produk tentwicklung erfaßt wird (fluoreszenzbasierte Echtzeit-PCR).

44. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 39, dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis der mRNS oder cDNS ein Nukleotid-Mikroarray nach ei nem der Ansprüche 21 oder 22 verwendet wird.

45. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, da durch gekennzeichnet, daß zum Nachweis der am plifizierten cDNS das PCR-Produkt auf ein Nu kleotid-Mikroarray nach einem der Ansprüche 21 oder 22 aufgetragen wird.

46. Verwendung eines Diagnose-Kits, eines Mikro arrays und/oder eines Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Diagnose von Er krankungen oder Metastasierung oder zur Behand lungskontrolle bei Hodentumor.