BRPI0820538B1

BRPI0820538B1 - Usos de uma isoforma recombinante solúvel de neuregulina-1, e composição farmacêutica ou kit

Info

Publication number: BRPI0820538B1
Application number: BRPI0820538-8A
Authority: BR
Inventors: André Schrattenholz
Original assignee: Mind-Nrg Sa
Priority date: 2007-11-16
Filing date: 2008-11-17
Publication date: 2021-08-17
Also published as: DK2219662T3; US20210128687A1; WO2009062750A3; BR122020025248B1; BRPI0820538A2; EP2219662B1; JP2014193879A; US20150239948A1; JP2011503134A; WO2009062750A2; AU2008323169B2; JP5650537B2; RU2010124429A; RU2491955C2; CA2705328A1; JP5913426B2; CN101903036A; US10813978B2; CN105561299A; AU2008323169A1

Abstract

isoformas de neuregulina solúveis ativas modificadas pós-traducionalmente. a presente invenção refere-se às isoformas solúveis de neuregulina-1 que representam as modificações pós-traducionais de neuregulina-1 como uma medicação em distúrbios neurológicos relacionados com a cognição, em particular a esquizofrenia, doenças de alzheimer e parkinson.

Description

Descrição

[0001] A presente invenção se refere à isoformas de Neuregulina-1 solúveis em soluções fisiológicas que representam modificações pós- traducionais de Neuregulina-1 ou variantes de "splice", como um medicamento em distúrbios neurológicos relacionados com a cognição, em particular a esquizofrenia, doenças de Alzheimer e Parkinson.

Antecedentes

[0002] As neuregulinas (NRG) têm surgido como reguladoras principais da sinalização sináptica. Essas proteínas transmembrana são codificadas por quatro genes (NRG-1, -2, -3 e -4) e sua diversidade é aumentada pelo "splicing" alternativo de RNA e utilização do promotor e, em particular, pelas modificações pós-traducionais, como o processamento proteolítico que leva à liberação de isoformas solúveis das holoproteínas ligadas à membrana. Além disso, há evidências de fosforilação e glicosilação (Buonanno e Fischbach, 2001). Elas são caracterizadas por domínios extracelulares diferentes e são ligantes do receptor ErbB de tirosina quinases, que têm conotações a jusante para a neuroinflamação e transcrição de gene (Holbro e Hynes, 2004). Em particular, as isoformas solúveis de NRG-1 são produzidas a partir da forma transmembrana de NRG através da clivagem proteolítica durante a estimulação elétrica e subsequentemente secretadas como moduladores sinápticos dependentes de atividade (Ozaki et al., 2004).

[0003] Uma isoforma truncada de NRG-1, presumivelmente β1, que compreende o domínio extracelular N-terminal (ECD) da proteína de membrana completa, que foi constatado estar correlacionada com o aprendizado e a memória (Schillo et al., 2005a); WO03/014156). Estudos funcionais demonstraram que NRG-1 regula diretamente a composição da subunidade do receptor de NMDA (Ozaki et al., 1997; Eilam et al., 1998). Além disso, foi mostrado que fragmentos de NRG-1 desse tipo têm propriedades neuroprotetoras in vivo, por efeitos antiapoptóticos (Xu et al, 2005A; Xu et al., 2005B; Xu et al., 2004).

[0004] Muito recentemente, tornou-se claro que NRG-1 tem um papel central nas doenças neurológicas humanas devido à regulação dependente de NRG de receptores de NMDA (Schrattenholz e Soskic, 2006) e subsequentes eventos a jusante, como a excitotoxicidade, neuro-inflamação e apoptose (veja Figura 1 para um resumo). Existem resultados que mostram que NRG-1 desempenha um papel importante em condições que variam entre a esclerose lateral amiotrófica, doenças de Alzheimer e Parkinson ao acidente vascular cerebral e esquizofrenia (Britsch 2007).

[0005] Esse significado fundamental de NRG-1 implica depois da neuroproteção e de um papel positivo no aprendizado e memória relacionados àcognição, NRG-1 representa um fator neurotrófico crucial na regeneração de tecido neuronal depois de uma variedade de lesões, em uma variedade de regiões específicas do cérebro e tipos celulares. Obviamente ela é o fator crucial para a manutenção e reparo da integridade do circuito neuronal: neuroprotetora e com papéis na regeneração correta depois de perda da função, assim como na formação de plasticidade neuronal dependente de atividade.

[0006] O interesse na Neuregulina 1β foi reforçado mais ainda quando Kastin et al., 2004 mostraram que a Neuregulina 1β é capaz de cruzar a barreira hematoencefálica. Isto abriu a perspectiva para a utilização terapêutica de Neuregulina 1β.

[0007] Pesquisas recentes provaram a amplitude da aplicação na neuroproteção. Independentemente, foi mostrado em duas publicações, que a Neuregulina 1 também é um substrato de BACE (β-secretase, enzima que converte o β-amiloide), o que indica a relevância da Neuregulina-1 na doença de Alzheimer (Glabe 2006; Schubert 2006).

[0008] Além disso, foi constatado que, nas células de Schwann, a neuregulina-1 aumenta a transcrição da 3-hidróxi-3-metilglutaril- Coenzima A redutase, a enzima limitante da velocidade da biossíntese do colesterol nas células de Schwann (Pertusa et al. 2007). Isso tem implicações em grande parte de todas as condições onde a bainha de mielina está afetada, por exemplo, esquizofrenia e esclerose múltipla, ou nas funções relacionadas à cognição, onde os assim chamado "microdomínios ricos em colesterol" estão envolvidos (Schrattenholz e Soskic 2006). As células de Schwann que circundam os axônios expressam os receptores ErbB2/ErbB3 de NRG1 e NRG1 α e β solúveis sob condições fisiológicas. Depois da desnervação, as células de Schwann adultas perdem o contato com o axônio, alteram sua morfologia, param de expressar NRG1β e regulam positivamente a expressão de NRG1α e ErbB2/ErbB3 (Geuna et al. 2007; Karoutzou et al. 2007).

[0009] Além disso, a pesquisa epidemiológica genética mostrou a clara associação de Neuregulina 1 com a esquizofrenia e com a doença de Alzheimer e, em particular, com suas formas psicóticas (Farmer et al, 2007).

[00010] Algumas análises genéticas recentes da população mostram que certos SNPs de NRG-1 estão associados com Alzheimer e esquizofrenia (Go et al. 2005; Scolnick et al. 2006; Ross et al 2006; Meeks et al. 2006; Framer et al. 2007). As implicações desses achados estão relacionadas com outras proteínas do complexo funcional que contém NRG, descrito na Figura 1 (receptor ErbB: (Benzel et al. 2007; Thomson et al. 2007; Hahn et al. 2006). Também há uma implicação de NRG-1 na esclerose múltipla (Esper et al. 2006).

[00011] Existem resultados que sugerem que o mecanismo molecular da associação entre os alelos de risco de NRG1 e a esquizofrenia pode incluir a regulação negativa dos receptores nicotínicos de acetilcolina do subtipo alfa 7 (Mathew et al 2007).

[00012] De acordo com a presente invenção, foi constatado que as isoformas recombinantes solúveis de Neuregulina-1β mostram eficácia farmacêutica em modelos animais para o aprendizado e a memória, esquizofrenia, doença de Alzheimer e doença de Parkinson. Depois da administração i.v., as isoformas de Neuregulina-1β estavam ativas em concentrações que eram significativamente menores do que as concentrações de medicamentos de controle.

[00013] Portanto, um primeiro aspecto da presente invenção é o uso de uma isoforma recombinante solúvel de Neuregulina-1 para a fabricação de um medicamento para o tratamento de condições neurológicas, particularmente nas condições neurológicas relacionadas à cognição.

[00014] Um aspecto adicional da presente invenção é uma composição farmacêutica ou um kit compreendendo (i) uma isoforma recombinante solúvel de Neuregulina-1 e (ii) um medicamento adicional, particularmente para o tratamento de condições neurológicas, particularmente condições neurológicas relacionadas à cognição.

[00015] Outro aspecto adicional da presente invenção é o uso de uma isoforma recombinante solúvel de Neuregulina-1 para a melhora da memória e da cognição para a fabricação de um medicamento.

[00016] Um aspecto adicional da presente invenção é um método de tratamento de uma condição neurológica que compreende administrar uma isoforma recombinante solúvel de Neuregulina-1 em uma quantidade farmaceuticamente eficaz a um indivíduo necessitado.

[00017] Outro aspecto adicional da presente invenção é um método para melhorar a memória e a cognição compreendendo administrar uma isoforma recombinante solúvel de Neuregulina-1 em uma quantidade eficaz a um indivíduo necessitado.

[00018] Outro aspecto adicional da presente invenção é a co-admi- nistração de uma isoforma recombinante solúvel de Neuregulina-1 junto com um medicamento adicional.

[00019] De acordo com a presente invenção, as isoformas solúveis de Neuregulina-1 foram encontradas ser eficazes no tratamento de condições neurológicas, particularmente condições tais como distúrbios psicóticos como a esquizofrenia, distúrbio bipolar e depressão, distúrbios neuro-degenerativos, como a doença de Parkinson e a doença de Alzheimer, Esclerose Múltipla (MS) ou Esclerose Lateral Amiotrófica (ALS), epilepsia ou lesão neurológica como o acidente vascular cerebral, lesão traumática do cérebro e lesão da medula espinhal. É preferido o tratamento da esquizofrenia, em particular os aspectos relacionados à cognição da esquizofrenia, doença de Parkinson e a doença de Alzheimer. Além disso, a invenção também se refere ao uso de isoformas recombinantes solúveis de Neuregulina-1 para a melhora da memória e da cognição, particularmente para a redução e/ou inibição da memória e perda de cognição associadas com uma condição neurológica tal como a doença de Alzheimer e a esquizofrenia.

[00020] A isoforma recombinante solúvel de Neuregulina-1 é preferivelmente uma isoforma de Neuregulina-1 humana que compreende a sequência de aminoácidos primária de uma isoforma de Neuregulina-1 humana que ocorre naturalmente ou uma sequência que tem uma identidade de pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 95% e o mais preferivelmente de pelo menos 98%, com base na extensão total da isoforma recombinante.

[00021] A isoforma recombinante solúvel de Neuregulina-1 da presente invenção compreende preferivelmente pelo menos uma porção do domínio extracelular da Neuregulina-1 correspondente, por exemplo, pelo menos uma porção do domínio extracelular de uma Neuregulina-1 humana, por exemplo, a Neuregulina-1β humana.

[00022] A isoforma recombinante solúvel de Neuregulina da presente invenção tem uma extensão de até 250 aminoácidos, por exemplo, 150 a 250 aminoácidos. O peso molecular da isoforma de Neuregulina é preferivelmente cerca de 15 a cerca de 35 kD, particularmente cerca de 25 a cerca de 32 kD, como medido, por exemplo, pela eletroforese com SDS-poliacrilamida (PAGE). A isoforma recombinante solúvel de Neuregulina-1, particularmente a isoforma recombinante de Neuregulina-1β, tem um ponto isoelétrico (PI) de cerca de 4 a cerca de 9,5, preferivelmente de cerca de 4 a cerca de 6. A isoforma pode ser um polipeptídeo não modificado que consiste em uma sequência de aminoácidos não modificada ou um polipeptídeo modificado, em que a modificação pode ser selecionada entre fosforilação, glicosilação, metilação, miristilação, oxidação ou qualquer combinação dessas. Em uma modalidade especialmente preferida, a isoforma de Neuregulina-1 compreende pelo menos um resíduo de aminoácido fosforilado. Além disso, a presente invenção abrange a conjugação com porções heterólogas tais como porções de óxido de poli(alquileno), particularmente porções de polietileno glicol.

[00023] As isoformas recombinantes solúveis podem ser administradas de acordo com qualquer via, pela qual a liberação eficaz no tecido-alvo, por exemplo, o sistema nervoso, particularmente o sistema nervoso central, é obtida. Descobriu-se que concentrações farmaceuticamente eficazes de isoformas de Neuregulina podem ser obtidas pela administração sistêmica. Por exemplo, as isoformas podem ser administradas pela injeção ou infusão, por exemplo, por injeção intravenosa. As isoformas são preferivelmente administradas em uma quantidade de 0,1 a 5000 ng/kg de peso corporal, particularmente em uma quantidade de 2 a 1000 ng/kg de peso corporal e mais particularmente em uma quantidade de 3 a 600 ng/kg de peso corporal ao indivíduo a ser tratado, dependendo do tipo e da severidade da condição a ser tratada. Em outras modalidades da presente invenção, as isoformas solúveis também podem ser administradas localmente, por exemplo, pela administração direta ao sistema nervoso central, por exemplo, na medula espinhal e/ou no cérebro. A administração em doses maiores de até 500 μg/kg por injeções i.p. ou s.c., ou dispositivos de inalação também pode ser considerada. Preferivelmente, o indivíduo a ser tratado é um mamífero, mais preferivelmente um paciente humano.

[00024] As isoformas recombinantes solúveis de Neuregulina-1 podem ser administradas como uma medicação única, isto é, como uma monoterapia ou como uma comedicação, isto é, em combinação com um medicamento adicional, particularmente com um medicamento adicional que seja adequado para o tratamento de uma condição neurológica. Exemplos de medicamentos adicionais são os compostos que afetam o metabolismo das catecolaminas, inibidores da acetilcolina esterase, inibidores da MAO-B ou COMT, bloqueadores de canal do tipo de Memantine, agonistas ou antagonistas do receptor de dopamina ou serotonina, inibidores da reabsorção de catecolamina ou serotonina ou qualquer tipo de medicamentos anti-psicóticos como a clozapina ou olanzapina ou fármacos como a gabapentina, particularmente no tratamento das doenças de Alzheimer e Parkinson, esquizofrenia, transtorno bipolar, depressão ou outras condições neurológicas. Exemplos adicionais de medicamentos são os agentes neuroprotetores tais como os inibidores de PARP-1, por exemplo, como descrito em WO 2006/008118 e WO 2006/008119, que estão incorporados aqui por referência.

[00025] Portanto, uma modalidade da presente invenção se refere à combinação de uma isoforma recombinante solúvel de Neuregulina-1, como aqui descrita, com um medicamento para o tratamento de distúrbios psicóticos, tais como esquizofrenia, transtornos bipolares e depressão, por exemplo, olanzapina ou clozapina. Uma modalidade adicional se refere à combinação de uma isoforma recombinante solúvel de Neuregulina-1 e um medicamento para o tratamento de uma doença neurodegenerativa tal como a doença de Parkinson, doença de Alzheimer, MS ou ALS. Uma modalidade adicional se refere ainda à combinação de uma isoforma recombinante solúvel de Neuregulina-1 e um medicamento para o tratamento de lesão neurológica, tal como acidente vascular cerebral, lesão traumática do cérebro ou lesão da medula espinhal.

[00026] A terapia de combinação pode ser efetuada pela co-adminis- tração da isoforma recombinante solúvel de Neuregulina-1 e o medicamento adicional na forma de uma composição farmacêutica ou kit, em que os medicamentos individuais são administrados em separado ou por administração comum.

[00027] A isoforma de Neuregulina-1 pode ser uma isoforma de Neuregulina-1 do Tipo I, Tipo II, Tipo III, Tipo IV, Tipo V ou Tipo VI, preferivelmente uma isoforma de Neuregulina-1β, uma isoforma de Neuregulina-1 ou uma isoforma do fator derivado de neurônio motor e sensitivo (SMDF), particularmente uma isoforma de Neuregulina-1β e mais particularmente, uma isoforma de Neuregulina-1β humana.

[00028] As isoformas de Neuregulina-1β são transportadas ativamente através da barreira hematoencefálica. A excelente biodisponibilidade de Neuregulina-1β no cérebro depois da injeção i.v./i.p., como mostrada nos Exemplos, pavimenta a via em direção à aplicação terapêutica de NRG 1β.

[00029] Sua combinação de propriedades antiapoptóticas, estabilizante da mielina, propriedades anti-inflamatórias, junto com a interação direta com BACE, abre oportunidades no tratamento do acidente vascular cerebral, Alzheimer, MS e esquizofrenia e outras condições neurológicas.

[00030] Como delineado acima, o presente pedido abrange o uso de isoformas de Neuregulina-1, particularmente de isoformas de Neuregulina-1β. Há evidências de que as modificações pós- traducionais, como o processamento proteolítico, a fosforilação e a glicosilação, ocorram em certos resíduos de aminoácidos da Neuregulina-1 e, em particular, no seu domínio extracelular. Em particular, a liberação de fragmentos solúveis foi descrita (Buonanno e Fischbach 2001; Fischbach 2007). A oxidação em potencial também foi descrita (Nadri et al., 2007).

[00031] Os presentes inventores obtiveram evidências de que as isoformas de Neuregulina-1β fisiologicamente ativas preferidas compreendem o domínio extracelular de Neuregulina-1β ou uma parte desse, que foi modificado pós-traducionalmente. Preferivelmente, as isoformas foram modificadas pela fosforilação, em que 1, 2, 3 ou mais resíduos de aminoácidos da cadeia lateral, particularmente resíduos da cadeia lateral que têm um grupo OH, tal como Tyr, Ser ou Thr, foram fosforilados. Os sítios de fosforilação preferidos estão localizados nas posições dos aminoácidos 79-82, 133-136 e/ou 158-161 (nomenclatura de acordo com Falquet et al., 2002). Sítios de fosforilação adicionais preferidos estão localizados nos aminoácidos 12-14, 30-32 e/ou 85-87. Sítios de modificação potencial adicionais são sítios de amidação, preferivelmente localizados nas posições 22-25 e/ou 30-33, sítios de glicosilação nas posições 150-153, 156-159 e/ou 204-207 e sítios de miristilação, localizados preferivelmente nas posições 94-99, 149-154, 168-173, 175-180 e/ou 202-207, de acordo com a nomenclatura de Falquet et al., 2002.

[00032] A seguir, a relevância dos dados experimentais de acordo com o presente pedido é explicada com relação às indicações médicas preferidas.

Esquizofrenia

[00033] A esquizofrenia é um distúrbio mental sério e incapacitante com sintomas tais como alucinações auditivas, raciocínio descoordenado e delírios, abulia, anhedonia, afeto embotado e apatia. Estudos epidemiológicos, clínicos, neuropsicológicos e neurofisiológicos forneceram evidências substanciais de que anormalidades no desenvolvimento do cérebro e a neuroplasticidade progressiva desempenham papéis importantes na patogênese do distúrbio (Arnold et al., 2005).

[00034] A esquizofrenia é considerada incluir um distúrbio da neurotransmissão dopaminérgica, mas a modulação do sistema dopaminérgico pela neurotransmissão glutamatérgica parece desempenhar um papel importante. Essa visão é sustentada por achados genéticos dos genes da neuregulina e disbindina, que têm um impacto funcional sobre o sistema glutamatérgico (Muller e Schwarz, 2006). O que tem se tornado progressivamente claro é que diversas regiões que são prováveis de conter genes (incluindo neuregulinas) que contribuem para a esquizofrenia também são relevantes para o distúrbio afetivo bipolar, um achado sustentado pelos dados similares recentes (Farmer et al. 2007; Owen et al. 2007).

[00035] A Neuregulina-1, que é um gene de suscetibilidade a psicose com efeitos sobre a migração neuronal, orientação axonal e mielinização pode, potencialmente, explicar os achados de conectividade anatômica e funcional anormais na esquizofrenia e no transtorno bipolar (McIntosh et al. 2007).

[00036] Há evidências crescentes de uma ligação genética da Neuregulina-1 com a esquizofrenia (revisão: Farmer et al. 2007). A intensificação da neurotransmissão de glutamato, GABA e nicotínica pela Neuregulina-1 (Fischbach 2007; Woo et al. 2007; Li et al. 2007) é relevante nesse contexto, assim como a implicação na inflamação do cérebro (Hanninen et al. 2007).

[00037] A regulação de 3-hidróxi-3-metilglutaril-Coenzima-A redutase, enzima que limita a taxa de biossíntese do colesterol (Pertusa et al. 2007), importante para a mielinização, é presumida ter também implicações nessa condição.

[00038] O fato de que, entre os fatores de risco genéticos comuns para a esquizofrenia, transtorno bipolar e depressão, NRG1 desempenha um papel importante, desencadeou sugestões de que os genes implicados nessas psicoses tais como NRG-1, podem eventualmente fornecer a base para uma classificação mais à base da biologia do que nos sintomas, e levar a novas estratégias de tratamento para esses distúrbios complexos do cérebro (Blackwood et al. 2007; Bertram et al. 2007).

[00039] Os dados experimentais do presente pedido demonstram a eficácia da administração de uma isoforma recombinante solúvel de Neuregulina-1β em um modelo experimental de esquizofrenia.

Doença de Alzheimer

[00040] A pesquisa inicial pelos inventores mostrou que a Neuregulina-1β está diminuída em seções post-mortem de hipocampos de cérebros de pacientes com Alzheimer, quando comparados com controles da mesma idade (Sommer et al. 2004), com uma clara correlação positiva do fragmento solúvel de Neuregulina-1 com o desempenho do aprendizado em um teste de labirinto radial (Sommer et al. 2004).

[00041] Existem numerosos relatos que demonstram o papel de NRG-1 nas alterações sinápticas dependentes de atividade (Xie et al. 2006; Kwon et al. 2005; Rimer et al. 2005; Bao et al. 2004; Yang et al. 2005), importantes para o aprendizado e a memórias (Ozaki et al. 1997; Ozaki et al. 2004; Golub et al. 2004; Schillo et al. 2005b). Como mostrado abaixo, o fragmento solúvel de NRG1β, que contém o domínio extracelular, estava claramente associado com o aprendizado em um modelo de comportamento animal. Mostrando a expressão diminuída da proteína em fatias de cérebro post mortem da região do hipocampo (responsável pela formação da memória recente) de pacientes com Alzheimer quando comparados com controles da mesma idade, pode- se demonstrar a ausência de atividade sináptica relacionada à memória, em regiões de neurônios ainda aparentemente saudáveis.

[00042] Constatados muito recentes (Hu et al. 2006; Glabe 2006; Schubert 2006) mostram que NRG1 é processada por BACE (=β secretase), uma enzima que auxilia na geração de massas de β- amiloide nos cérebros de pessoas com doença de Alzheimer, o que explica a ligação com a doença de Alzheimer, seu papel concomitante na formação de mielina se refere a propriedades neurotrópicas de NRG1 (Hu et al. 2006; Glabe 2006; Schubert 2006). A enzima, BACE1 (enzima de clivagem da proteína precursora do amiloide em beta), é necessária para clivar o β-amiloide a partir de um precursor maior. (Depois da clivagem mediada por BACE1, o complexo de y-secretase que contém presenilina faz a clivagem final, liberando o β-amiloide).

[00043] A clivagem de NRG pelas secretases é crucial para a mielinização do nervo. Exatamente como a proteína precursora do amiloide, a neuregulina 1 também é clivada pela β secretase. A clivagem proteolítica de neuregulina 1 pela β secretase é crítica para a mielinização de nervos periféricos pelas células de Schwann. Os fármacos que atingem a β secretase podem afetar o desenvolvimento e a função do nervo periférico.

[00044] A observação inicial foi feita pelo grupo de Haass (Willem et al. 2006), que descobriu que BACE1 também parece ser necessária para a mielinização. A mielinização de nervos periféricos ocorre precocemente na vida, de maneira que não está claro como a inibição de BACE1 poderia afetar animais mais velhos. Existem indicações de que BACE1 também tem um papel na mielinização do sistema nervoso central. Animais transgênicos deficientes em BACE1 têm defeitos na mielina nos nervos periféricos.

[00045] Também no contexto de neurodegeneração e doença de Alzheimer, a constatado recente da intensificação da neurotransmissão de glutamato, GABA e nicotínico pela Neuregulina-1 (Fischbach 2007; Woo et al. 2007; Li et al. 2007) é relevante.

[00046] Os dados experimentais do presente pedido demonstram a eficácia da administração de uma isoforma recombinante solúvel de Neuregulina-1β em um modelo experimental de doença de Alzheimer. Acidente vascular cerebral, lesão traumática do cérebro

[00047] Uma série de experimentos relacionados com o acidente vascular cerebral in vivo de uma pesquisa externa independente nos Estados Unidos, demonstrou a neuroproteção pela Neuregulina 1, que por si mesma é antiapoptótica (Xu et al., 2004, 2005 e 2006; Guo et al. 2006).

[00048] NRG-1 reduz o dano neuronal e melhora o resultado neurológico depois da oclusão da artéria cerebral média (um modelo comum de acidente vascular cerebral (Xu et al., 2005b; Xu et al., 2004; Xu et al., 2006; Guo et al. 2006).

[00049] No mesmo estudo a cerca da eficácia terapêutica e do mecanismo da NRG-1 recombinante humana na atenuação da lesão cerebral por isquemia/reperfusão, foi constatado que NRG é antiapoptótico. NRG-1 (3,0 ng/kg) foi aplicada intravascularmente 10 min antes da oclusão da artéria cerebral média (MCAO) e subsequente isquemia cerebral focal por 90 min e reperfusão por 24 h.

[00050] Os dados da presente invenção demonstram que a administração de isoformas recombinantes solúveis de Neuregulina-1 em baixa concentração tem um efeito farmacológico significativo e, portanto, é presumida ser eficaz em modelos de acidente vascular cerebral e lesão traumática do cérebro.

[00051] A seguir, o presente pedido é explicado em mais detalhes pelas Figuras e Exemplos dados abaixo. Figura 1: Várias revisões e numerosos artigos de pesquisa sobre a Neuregulina-1 mostram a posição funcional importante de NRG 1como um princípio regulatório a montante de mecanismos considerados serem essenciais nas doenças neurodegenerativas, distúrbios neurológicos, assim como na função fisiológica.

[00052] NRG são partes importantes de complexos funcionais, que consistem pelo menos de neuregulinas (NRG), receptores de tirosina quinase (receptores de ErbB), proteoglicanos de sulfato de heparano (HSPG) e receptores de NMDA (NMDAR), que são transitoriamente e dependentes da atividade reunidos em microdomínios da membrana ricos em colesterol (CHO). Em particular, a formação de sinais de cálcio é importante para a interação com proteínas do arcabouço subsináptico pelas modificações pós-traducionais (PSD-95, pela interação com certos domínios fosforilados, como domínios PDZ ou SH sobre proteínas parceiras). O complexo PSD-95 regula diretamente as enzimas pró-inflamatórias como a óxido nítrico sintetase (NOS, iNOS é induzível, nNOS é neuronal) e Cox-2 (ciclo-oxigenase-2), que promovem seus efeitos em um relacionamento complexo com, mas não necessariamente, mecanismos a jusante, que envolvem enzimas dependentes de NAD+ como PARP-1 (poli-ADP-ribose polimerase) e Sir-2 (sirtuina-2); PARG é poli(ADP-ribose) glico-hidrolase, a enzima que é complementar e antagonista de PARP-1, HDAC são histona deacetilases, a classe geral de enzimas que inclui Sir-2. MPTP é responsável pelo poro de transição de permeabilidade mitocondrial. DRP-2 é uma proteína 2 relacionada à di-hidropirimidinase. Outras proteínas de membrana importantes, como certos receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChRα7), receptores GABAA (GABAAR), proteína precursora do amiloide (APP) e proteases (PS) são organizadas transitoriamente em microdomínios lipídicos e adquirem propriedades funcionais diferentes fora do ambiente fosfolipídico usual (PL); detalhes em Schrattenholz e Soskic 2006. Figura 2: Resumo de experimentos de aprendizagem no labirinto aquático de Morris: os animais tratados com uma dose diária de 3 ng/kg (i.v.) do domínio extracelular solúvel de neuregulinas-1 beta (ECD de NRG-1 beta) foram significativamente melhores no aprendizado do que os animais tratados com veículo; IAE: área de entrada interna; IAEF: frequência de entrada na área interna; TS: tempo gasto na área interna; DT: distância percorrida na área interna. Figura 3: Redução da hiperatividade induzida por anfetamina pelo ECD de NRG-1 beta, um modelo amplamente aceito para esquizofrenia. As concentrações variaram entre 15 a 600 ng/kg (injeção i.v. 15 minutos antes da aplicação de anfetamina). Um controle positivo de 0,125 mg/kg de Haloperidol foi incluído.

[00053] Apesar do Haloperidol, como outros antipsicóticos não típicos e típicos, geralmente reduzir a atividade abaixo do nível do controle (indicado aqui por linhas pontilhadas marcadas como veh/veh, em azul nas interseções e em vermelho para as elevações),a redução com ECD de NRG-1 beta aproximou-se assintoticamente dos níveis de controle da atividade, mas não causou redução posterior. As baixas concentrações eficazes de ECD de NRG-1 beta e a ausência de efeitos negativos (redução da atividade abaixo dos níveis de controle com veículo) são propriedades consideráveis nesse modelo. Os efeitos são significativos com p<0,05. Figura 4: Resumo de experimentos de aprendizagem com o modelo de camundongo APPPS de amiloidose cerebral e doença de Alzheimer em um labirinto aquático de Morris: os animais tratados com uma dose diária de 200 ng/kg i.p. de ECD de NRG-1 beta foram significativamente melhores no aprendizado do que os animais tratados com veículo; IAE: IAE: área de entrada interna; IAEF: frequência de entrada na área interna; TS: tempo gasto na área interna; DT: distância percorrida na área interna. Figura 5: Quantificação por HPLC de dopamina e seus metabólitos: As colunas marcadas com asteriscos são altamente significativas. Legenda S Salina (controle) aM MPTP aguda aMN MPTP aguda e ECD de NRG-1 beta aN ECD de NRG-1 beta agudo cM MPTP crônica cMN MPTP crônica e ECD de NRG-1 beta cN ECD de NRG-1 beta crônico Figura 6: Metabolismo de dopamina por MAO-B e COMT. Figura 7: A exposição à MPTP leva a uma perda considerável de neurônios dopaminérgicos na substância nigra (aMPTP, p=0,0005; e cMPTP, p=0,0075). A aplicação ip de 20 ng/kg de ECD de NRG-1 beta leva a uma reversão (aNR-MPTP; p=0,57, isto é, não diferente do controle com veículo) ou clara e significativa melhora da lesão de MPTP (cNR-MPTP; p=0,0097); no modelo crônico (5 dias depois da aplicação ip de20 ng/kg de ECD de NRG-1 beta) também há um efeito significativo no número de neurônios dopaminérgicos (cNR; p=0,0002). Legenda NaCl Salina (controle) aMPTP MPTP aguda aNR-MPTP MPTP aguda e ECD de NRG-1 beta aNR ECD de NRG-1 beta agudo cMPTP MPTP crônico cNR-MPTP MPTP crônico e ECD de NRG-1 beta cNR ECD de NRG-1 beta crônico Figura 8: Duas imagens representativas de Western blots 2D de proteínas do cérebro de camundongos APPPs coradas para Neuregulina-1β são mostradas de cada animal tratado e com bom aprendizado (alto) e animal não tratado com desempenho de aprendizado inferior (abaixo). Os números na parte superior são os valores de pI do gel 2D. Figura 9: Um experimento com Western blot compara a abundância do fragmento de ECD de NRG-1β em material cortical post mortem de pacientes com Alzheimer e controles. Figura 10: 2D-PAGE mostra a que a isoforma ácida de ECD de NRG-1β, com um pI de aproximadamente 5 a 5,5 e um peso molecular de aproximadamente 25 a 32 kD nesses experimentos está claramente diminuída em cérebros de pacientes com Alzheimer. Exemplos Geral:

[00054] Em todos os experimentos a seguir, os fragmentos de Neuregulina-1 beta foram usados, compreendendo apenas o domínio extracelular (ECD) do transcrito completo do gene nrg-1 humano. Eles tinham um peso molecular de aproximadamente 25 a 32 kD e pontos isoelétricos entre aproximadamente 5 e 9,5, dependendo do estado de fosforilação e/ou glicosilação.

[00055] A forma fisiologicamente ativa da isoforma de Neuregulina-1 tem um pI de aproximadamente 5,5. A forma fisiologicamente ativa tem um pI de aproximadamente 5,5 (a maioria dos experimentos foi realizada através de uma isoforma comercialmente disponível produzida em E. coli, com um peso molecular de 26kD e um pI de aproximadamente 9,0).

[00056] Essa isoforma é um fragmento recombinante solúvel de NRG-1 beta que consiste nos primeiros 245 aminoácidos de NRG-1β, adquirido de R & D Systems, Inc. (N° de Catalogo 377-HB-CF). Será denominado de ECD de NRG-1 beta a seguir. Essa isoforma ativa tem um pI de aproximadamente 9,0.

[00057] Foi também testado um fragmento correspondente de NRG- 1β com 8 kD, compreendendo apenas o domínio de EGF, adquirido de R & D Systems, Inc. (N° de Catalogo 396-HB). Esse fragmento parece ser neuroprotetor também in vitro e in vivo, mas não foi investigado em profundidade por causa de propriedades proliferativas muito maiores, o que causou preocupação a cerca de carcinogênese.

Exemplo 1

[00058] Dados toxicológicos iniciais indicam que NRG1β (ECD) não tem efeitos adversos na toxicologia aguda e em testes de mutagenicidade in vitro. • Não houve toxicidade intravenosa aguda em ratos: Todos os animais sobreviveram até o final do período do estudo. O peso corporal dos animais estava dentro da faixa comumente registrada para essa cepa e idade. Nenhum achado macroscópico foi registrado na necropsia. A dose letal média de NRG1β (ECD) depois de uma administração intravenosa única a ratos fêmeas, observadas durante um período de 14 dias é: LD50 (rato fêmea): superior a 5000 ng/kg de peso corporal. • A administração intravenosa diária de Neuregulina durante um período de sete dias em níveis de dose de 50, 200 e 600 ng/kg de peso corporal/dia não resultou em qualquer morte prematura. Nenhum sinal clínico foi registrado. O tratamento não afetou o consumo de alimento e o desenvolvimento do peso corporal. O nível de efeito não observado (NOEL) foi estabelecido em 600 ng/kg de peso corporal/dia. • No ensaio do lócus de timidina quinase de linfoma de camundongo usando a linhagem celular L5178Y, de acordo com o OECD Guideline for the Testing Chemicals, N° 476 "In vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test", NRG1β (ECD) não foi mutagênico. • No teste de aberração cromossômica em células V79 de hamster chinês, de acordo com o OECD Guideline for the Testing Chemicals, N° 473, NRG1β (ECD) não induz aberrações cromossômicas estruturais.

[00059] Além disso, em nenhum dos experimentos com animais realizados com relação à eficácia (alguns dos quais duraram vários meses com aplicações iv diárias) foram observados efeitos adversos de NRG1β (ECD).

[00060] A aplicação de NRG1β (ECD) nos vários modelos com animais descritos abaixo foi tanto com injeções intravenosas (iv) quanto intraperitoneais (ip); as concentrações variavam de 3 a 600 ng/kg.

Exemplo 2

[00061] Aprendizado e memória: Aprendizado Espacial com e sem a Aplicação de ECD de NRG-1 beta Métodos:

[00062] O Labirinto Aquático de Morris avaliou o aprendizado espacial. Ele requer que os animais nadem em uma piscina cheia de água e encontrem uma plataforma de resgate submersa logo abaixo da superfície. É obrigatório que a plataforma seja colocada longe das paredes do labirinto e que os animais tenham pontos de referência visíveis da superfície da água que permitam a estimativa da localização, mas não tão próximos do alvo para permitir o aprendizado associativo. Os animais foram treinados de que o resgate vinha apenas pela plataforma, significando que todos os animais que não encontravam a plataforma eram guiados até a plataforma e deixados descansar antes de serem removidos da instalação. Portanto, um dos pontos de referência mais importantes para o camundongo era o operador humano.

[00063] O experimento visa determinar dois parâmetros principais associados com a memória espacial de murino:

[00064] a frequência na qual os camundongos aprendem a relocalizar a plataforma

[00065] a habilidade de reter a informação a curto prazo (dentro de um período de treinamento ou durante uma noite).

Animais

[00066] O estudo é realizado com dois grupos de camundongos APP/PS (Meyer-Luehmann et al. 2006; Radde et al. 2006), um dos quais é tratado com uma dose diária de ECD de NRG-1 beta e o outro é tratado com um simulacro como controle. Cada grupo consiste em 8 machos que têm 9 semanas de idade no início da primeira série dos experimentos.

[00067] A primeira série de experimentos começou com os dois grupos de 8 camundongos tratados e 8 não tratados na semana 42 e durou 15 dias. Séries adicionais de experimentos idênticos serão realizadas 6, 12, etc. semanas mais tarde.

[00068] Para um segundo par de subgrupos (8 machos tratados e 8 não tratados com 9 semanas de idade), a mesma série de experimentos começou na semana 48, de maneira que os experimentos desses subgrupos defasaram exatamente 6 semanas depois daqueles dos primeiros subgrupos. Dispositivo

[00069] A aptidão de aprendizado dos camundongos APP/PS tratados e não tratados é avaliada usando um labirinto aquático de Morris circular que deve ser grande o suficiente para fornecer um espaço de procura sem cansar o animal. Cuidado extremo necessita ser tomado para manter cada detalhe da instalação experimental tão invariável quanto possível através de todos os experimentos.

[00070] No estudo atual, uma piscina de 120 cm de diâmetro é usada e colocada em uma posição exatamente reprodutível no laboratório sempre com orientação idêntica. Nas posições fixadas na piscina, é colocada uma plataforma branca, translúcida, circular com 15, 10 ou 5 cm de diâmetro que se prolonga para logo abaixo da superfície da água (de maneira que ela seja invisível para os camundongos) e que os animais podem escalar - o que é a única maneira de descansar da água. Para auxiliar a escalada, a plataforma é coberta com uma superfície de gaze aderente (veja a Figura 11).

[00071] A fim de realizar o procedimento de resgate em testes de sondagem como detalhados abaixo, a plataforma é equipada com um mecanismo que permite a elevação e a descida automaticamente sem a intervenção direta do operador. Portanto, dependendo de sua altura, a plataforma é acessível aos camundongos nadadores ou não. "Plataforma por comando" (Buresova et al. 1985).

[00072] As localizações da plataforma estão sempre situadas em uma região concêntrica, em forma de anel da piscina com diâmetros interno e externo de ~40 cm e ~80 cm, respectivamente. Quatro quadrantes são definidos tal que a plataforma ocupe a região central de um deles (o quadrante-alvo). Para detalhes adicionais sobre os tamanhos e posições da plataforma veja abaixo.

[00073] A fim de assegurar que a posição da plataforma seja exatamente a mesma através da série completa de experimentos, um soquete poderá ser afixado firmemente no piso da piscina sobre a qual a plataforma pode ser montada com um mínimo de tolerância espacial. No topo da plataforma, em seu centro, há outro suporte para um bastão (proximal) que se destaca da água e que é bem visível no registro em vídeo assim como para os camundongos que nadam na piscina. Para uma avaliação da posição da plataforma, um breve registro em vídeo será feito sem um animal, mas com o bastão colocado na plataforma sempre que a plataforma ou a câmera de vídeo tenham sido manipuladas de alguma forma.

[00074] A água é tornada opaca usando leite em pó desnatado. A temperatura da água deve ser fria o suficiente para encorajar a busca por uma saída, mas não tão fria para que os animais não sofram ou fiquem exaustos. Como um compromisso justo, a temperatura da água é monitorizada no início de cada experimento e modulada tanto com água morna quanto com flocos de gelo para 18°C. Entre os testes individuais, a temperatura é reajustada conforme necessário.

[00075] Quatro bastões distais (de formas geométricas simples diferentes e cores diferentes, ~20 cm de altura) são acoplados a ~20 cm acima dos lados da piscina, um em cada quadrante. É tomado cuidado para colocar cada bastão exatamente na mesma localização através de todos os experimentos. A piscina inteira é fechada com uma cortina branca translúcida. A iluminação é tênue e difusa.

[00076] Uma câmera de vídeo é montada firmemente em uma posição exatamente na vertical acima do centro da piscina, tal que a piscina preencha completamente a imagem de vídeo. Os registros de vídeo são tomados na resolução PAL (720x576 pixels, 25 quadros por segundo) pelo menos. Os vídeos são avaliados por um sistema de rastreamento automático que permite a detecção sem imperfeições dos movimentos dos animais com o tempo.

[00077] Os camundongos são colocados na água usando um dispositivo especial que é montado sobre uma vareta, tal que eles podem ser colocados na água em pontos exatamente definidos ao longo da borda da piscina sem que o operador entre na cabine feita com a cortina translúcida.

Projeto Experimental

[00078] Em cada sessão, os camundongos são colocados na piscina em locais predefinidos e são deixados nadar por 60 s. Os rastros do movimento dos animais são registrados por um sistema de rastreamento em vídeo e os parâmetros são computados, a partir dos quais as conclusões com relação à amplitude de aprendizado do animal podem ser extraídas (mais notavelmente o período até que o camundongo atinja a plataforma pela primeira vez = "latência de escape"; veja detalhes adicionais abaixo). Se um camundongo tem êxito em descobrir a plataforma, ele é deixado descansar nela por um curto período de tempo (~15 s). Caso contrário, depois de 60 s de natação, o camundongo é guiado para a plataforma pelo operador e deixado descansar por ~15 s. Subsequentemente, ele é pego pelo operador, cuidadosamente seco e levado de volta para seu alojamento ou preparado para o próximo nado.

[00079] Em cada dia de experimento, um teste por camundongo é realizado cedo pela manhã. Cada teste consiste em dois nados consecutivos que se originam de dois quadrantes diferentes, mas nunca do quadrante-alvo. Os sítios de deposição na água (e as posições da plataforma, sempre que aplicável) são designados aleatoriamente para cada nado de cada dia, mas não diferem entre camundongos individuais durante aquele dia.

[00080] Se os camundongos revelam-se extremamente lentos em aprender, o número de nados por teste ou testes por dia pode ser aumentado (e vice-versa). Além disso, em muitas linhagens de camundongo, animais mais jovens aprendem muito rapidamente, tal que depois de quatro ou cinco dias de treinamento, as latências de escape permanecem constantes em apenas poucos segundos, o que é igualmente verdadeiro em animais tratados como em animais não tratados. Entretanto, para a avaliação estatística, é vantajoso se a curva de latências de escape durante os dias de treinamento não satura, mas ao invés disso, diminui de forma monótona. Portanto, um projeto experimental é usado, no qual o problema a solucionar se torna mais difícil com o progresso do treinamento. Em dias predefinidos a plataforma é substituída por uma menor embora as coordenadas do centro da plataforma permaneçam as mesmas. Se e quando as plataformas são trocadas pode ser determinado independentemente para cada série de experimentos e pode depender dos resultados da série precedente.

[00081] Em cada série de experimentos, os camundongos são submetidos a três tipos diferentes de tarefas: - Navegação local sinalizada. A plataforma é marcada com um bastão e o camundongo é deixado nadar até encontrar a plataforma. Esse procedimento testa o aprendizado associativo e serve para dividir os camundongos em dois grupos experimentais, cujas aptidões de aprendizado são tão similares quanto possível. Além disso, na segunda e na série mais adiante de experimentos, a navegação local sinalizada reforça a memória de supressão da posição da plataforma nas séries precedentes. - Treinamento de aquisição de plataforma escondida. A plataforma é invisível para o rato e localizada na mesma posição como durante o nado precedente. Essa tarefa permite monitorizar o progresso do camundongo em relembrar a localização exata de uma plataforma escondida ("aprendizado espacial"). - Teste de sondagem. Nessa tarefa, a plataforma por comando é baixada maximamente abaixo da superfície e o camundongo é deixado nadar livremente procurando por ela. O teste de sondagem avalia a memória absoluta do animal que, nesse contexto, também pode ser interpretada como convicção, persistência ou certeza em relação à localização da plataforma. A abordagem convencional para interpretar o experimento é que os animais que fixaram firmemente a localização da plataforma, procurarão mais persistentemente em uma localização limitada e, portanto, gastarão mais tempo na zona próxima da plataforma. - No teste de sondagem há um risco de que a inabilidade para achar a plataforma possa reduzir o incentivo para nadar até a área da plataforma. A fim de manter essas irritações tão insignificantes quanto possível, as modalidades resgate humano devem permanecer as mesmas tal que haja alguma Constância espacial apesar da ausência da plataforma. Portanto, depois de 60 s de natação, a plataforma é içada para logo da superfície, o camundongo é guiado pelo operador e deixado descansar por ~15 s antes de ser retirado do dispositivo.

[00082] Em todos os dias de teste de sondagem, apenas um nado foi realizado.

[00083] Aproximadamente 60 minutos antes de cada experimento, os camundongos são tratados diariamente tanto com 5 ng/kg de ECD de NRG-1 beta (suspenso em soro de camundongo Black 6 e fornecido i.v. em um volume de 20 μl por camundongo) quanto com 20 μl de veículo i.v., respectivamente.

[00084] No dia 1 da primeira série de experimentos, todos os camundongos do estudo receberam apenas tratamento com um simulacro. Posteriormente, os camundongos foram designados para os grupos de Neuregulina e de controle tal que as distribuições de latências de escape combinassem em ambos os grupos.

[00085] Em cada série de experimentos, a seguinte cronologia foi aderida:

[00086] dia 1. Pesquisa da plataforma sinalizada com uma plataforma de 10 cm de tamanho e posição alterada para cada nado.

[00087] dia 2. Pesquisa da plataforma sinalizada com uma plataforma de 10 cm de tamanho e posição alterada para cada nado.

[00088] dia 3. Pesquisa da plataforma sinalizada com uma plataforma de 10 cm de tamanho e posição alterada para cada nado.

[00089] dia 4. Pesquisa da plataforma sinalizada com uma plataforma de 10 cm de tamanho e a mesma posição como no último dia 3.

[00090] dia 5. Pesquisa da plataforma escondida com uma plataforma de 15 cm e a mesma posição.

[00091] dia 6. Pesquisa da plataforma escondida com uma plataforma de 15 cm e a mesma posição.

[00092] dia 7. Pesquisa da plataforma escondida com uma plataforma de 15 cm e a mesma posição.

[00093] dia 8. Pesquisa da plataforma escondida com uma plataforma de 10 cm e a mesma posição.

[00094] dia 9. Teste de sondagem.

[00095] dia 10. Pesquisa da plataforma escondida com uma plataforma de 10 cm e a mesma posição.

[00096] dia 11. Pesquisa da plataforma escondida com uma plataforma de 10 cm e a mesma posição.

[00097] dia 12. Pesquisa da plataforma escondida com uma plataforma de 5 cm e a mesma posição.

[00098] dia 13. Pesquisa da plataforma escondida com uma plataforma de 5 cm e a mesma posição.

[00099] dia 14. Pesquisa da plataforma escondida com uma plataforma de 5 cm e a mesma posição.

[000100] dia 15. Teste de sondagem.

[000101] Pode ser necessário auxiliar a desaprender a posição da plataforma de um grupo precedente de experimentos, permitindo que os camundongos nadem livremente por alguns dias sem a presença da plataforma.

[000102] A taxa de aprendizado é avaliada pela monitorização de cada sessão de treinamento/teste e registrando o sucesso dos animais em encontrar a plataforma assim como a evolução da estratégia de procura a partir do contorno dos lados da piscina movendo-se para as laterais para procurar na proximidade da área central onde a plataforma está. Parâmetros Medidos

[000103] A partir dos registros em vídeo dos animais, cada rastro de movimento do camundongo é extraído e exportado para uma série de coordenadas x, y e de tempo para processamento posterior. Deve ser tomado cuidado para identificar confiavelmente cada ponto de partida dos rastros e para evitar erros de rastreamento. Simultaneamente, vários parâmetros são computados, a partir dos quais as conclusões com relação à aptidão de aprendizado do animal podem ser extraídas (veja abaixo). Os registros dos parâmetros são parados depois de 60 s ou se o camundongo tiver encontrado a plataforma (o que ocorrer primeiro). Para a definição dos parâmetros a serem computados a partir dos registros dos rastros do animal, as seguintes zonas são definidas (veja a Figura 12):

[000104] A fim de manter as avaliações tão flexíveis quanto possível, quatro zonas-alvo concêntricas (centralizadas a partir da plataforma) de 5, 5 x 30 cm de diâmetro são empregadas. Os parâmetros computados a partir dos registros dos rastros do animal incluem: - Distância total percorrida - Velocidade média global - Número de entradas para o centro da piscina - Tempo no centro da piscina - Latência até a primeira entrada para o centro da piscina - Distância percorrida até a primeira entrada no centro da piscina - Número de entradas na área interna - Tempo na área interna - Distância percorrida na área interna - Latência até a primeira entrada na área interna - Distância percorrida até a primeira entrada na área interna e para cada zona-alvo 1 a 4 e o quadrante-alvo - Número de entradas na zona - Tempo na zona - Distância percorrida na zona - Latência para a primeira entrada na zona - Distância percorrida até a primeira entrada na zona - Distância entre o início do rastro até o ponto mais próximo da zona - Distância média da zona quando do lado de fora da zona - Distância mínima da zona quando do lado de fora da zona - Tempo para a distância mínima da zona quando fora da zona - Tempo para chegar mais próximo da zona - Tempo para se afastar da zona - Tempo para se mover em direção à zona - Tempo para se afastar da zona - Número de entradas da cabeça na zona - Tempo da cabeça na zona - Distância percorrida pela cabeça na zona - Latência até a primeira entrada da cabeça na zona - Distância média da cabeça até a zona quando fora da zona - Distância mínima da cabeça até a zona quando fora da zona - Erro de rumo inicial - Erro de rumo médio - Número de saídas da zona

[000105] Para cada dia do experimento, as leituras dos parâmetros de progresso de aprendizado nos grupos tratados e não tratados são comparadas umas com as outras estatisticamente.

[000106] Ao examinar os registros dos rastros de camundongos individuais, um observador humano é capaz de chegar a uma percepção bastante realista da assertividade dos animais na localização da plataforma que não está totalmente refletida nos valores dos parâmetros medidos. Portanto, os registros dos rastros também são inspecionados manualmente e a lembrança do animal da localização da plataforma é avaliada. Resultados:

[000107] Aqueles animais tratados com uma dose diária de 3 ng/kg de ECD de NRG-1 beta i.v. 30 min antes do treinamento foram significativamente melhores nos parâmetros relacionados ao aprendizado do que o grupo tratado com veículo.

[000108] A Neuregulina não só melhorou o aprendizado, mas os animais tratados também desenvolveram estratégias de busca mais avançadas. Mais animais tratados entraram na área interna da piscina (11 vs 7, p=0,019), as entradas na área interna ocorreram mais frequentemente (2,17 vs. 0,92 vezes, p=0,02), o gasto de tempo e a distância percorrida na zona interna foram maiores (6,51 s vs. 2,13 s, p=0,09 e 0,64 m vs. 0,25 m, p=0,031, respectivamente).

[000109] Os resultados dos experimentos de aprendizado em um labirinto aquático de Morris estão resumidos na Figura 2. Exemplo 3

[000110] Esquizofrenia: Hiperatividade induzida por Anfetamina em rato Métodos:

[000111] O método, que detecta a atividade antipsicótica e antiParkinson, segue aquele descrito por Costall et al. 1978 e usa um medidor de atividade similar àquele descrito por Boissier e Simon 1966.

[000112] A anfetamina induz hiperatividade nessa situação de teste. A hiperatividade é antagonizada pelos antipsicóticos clássicos e atípicos que atuam sobre os sistemas dopaminérgicos a nível límbico e é potencializada pelos fármacos antiParkinsosn.

[000113] Os ratos são injetados com d-anfetamina (3 mg/kg i.p.) e são imediatamente colocados no medidor de atividade.

[000114] O medidor de atividade consiste em 12 gaiolas cobertas com Plexiglass (40 x 25 x 25 cm) contidas dentro de uma cabine escura. Cada gaiola é equipada com dois sensores de célula fotoelétrica em cada extremidade da gaiola, 3 cm acima do piso, a fim de medir o número de movimentos de cada animal (um por gaiola) entre uma extremidade da gaiola até a outra. Dois sensores com célula fotoelétrica adicionais são colocados a 20 cm acima do piso para registrar o comportamento. Os escores para a atividade e o comportamento são registrados por computador durante intervalos de 10 minutos e acumulados durante um período de 30 minutos.

[000115] 15 ratos foram estudados por grupo. Foi realizado um teste cego.

[000116] A substância de teste foi avaliada em 8 doses, administradas i.v. 15 minutos antes da anfetamina e comparadas com um grupo de controle com veículo. O experimento também incluiu um grupo de controle não tratado com anfetamina.

[000117] O Haloperidol (0,125 mg/kg i.v.), administrado sob as mesmas condições experimentais, foi usado como substância de referência.

[000118] O experimento inclui, portanto, 16 grupos.

[000119] Os dados foram analisados pela comparação dos grupos tratados com o controle apropriado usando testes t de Student não pareados. Resultados:

[000120] Como mostrado na Figura 3, ECD de NRG-1 beta, em uma maneira dependente da dose, inibe a hiperatividade induzida pela anfetamina em um modelo animal para a esquizofrenia.

[000121] Conspicuamente, os experimentos revelam as propriedades importantes de ECD de NRG-1 beta: - Os efeitos mostrados na Figura 3 são mais acentuados na segunda metade do experimento (minutos de 20 a 40). Nos primeiros 20 minutos, apenas um pequeno efeito pode ser encontrado, esse efeito retardado aponta para o processamento posterior da proteína. - As concentrações eficazes de ECD de NRG-1 beta usadas aqui são cerca de 200 a 1000 vezes menores do que aquelas usadas para neurolépticos de controle típicos como o Haloperidol (125 μg/kg). - Ao contrário do Haloperidol, Clozapina, Olanzapina e etc., não há efeitos negativos observados, caracterizado pelo fato de que ECD de NRG-1 beta não reduz a atividade dos animais de teste abaixo dos níveis de controle com veículo.

Exemplo 4

[000122] Esquizofrenia: Inibição pré-estimulação

[000123] Os roedores "knock-out" para NRG1 mostram inibição pré- estimulação (PPI) significativamente prejudicada, ligando NRG1 à esquizofrenia. Uma medida substituta amplamente usada de psicose em modelos animais, PPI é considerada um endofenótipo da esquizofrenia. Foi relatado que existem efeitos neurofisiológicos de mutações missense de um polimorfismo de nucleotídeo único não sinônimo localizado sobre NRG1 (rs3924999) sobre PPI depois de extensa genotipagem, em ambas as populações com esquizofrenia e de controle saudável (Hong et al. 2007). Foi testado o efeito de ECD de NRG-1 beta sobre a PPI. Os resultados até esse momento podem ser resumidos como a seguir:

[000124] Com 105 dB, ECD de NRG-1 beta mostrou uma tendência comum de restabelecimento de PPI (+26%, +23%, e +36%, com 150, 300 e 600 ng/kg, respectivamente), embora o efeito não tenha alcançado significância estatística e não tenha sido observado com 115 dB. Não houve efeitos sobre a movimentação espontânea na ausência de estímulo com 150 ou 300 ng/kg, mas os movimentos espontâneos diminuíram significativamente na ausência de estímulo com 600 ng/kg (-20% e -29%, em média e intensidades de pico, respectivamente, p<0,05, isso é similar com aripiprazol). ECD de NRG-1 beta não teve efeito sobre a reação ao pré-estímulo sozinho.

[000125] Os resultados sugerem até agora a ausência de efeitos significativos sobre os déficits de PPI induzidos por apomorfina para Propsy100 , na dose média de 150 a 300 ng/kg e uma diminuição de movimentos espontâneos assim como uma tendência para o restabelecimento de PPI com 600 ng/kg i.v. no Teste de Inibição de Pré- estimulação (PPI) no rato (déficits induzidos pela apomorfina).

[000126] Nessa série de experimentos, a substância de referência aripiprazol, teve uma atividade fraca, mas significativa com 3 mg/kg i.p., mas não com 10 mg/kg i.p. no mesmo teste.

[000127] Juntando tudo e sob as condições usadas, ECD de NRG-1 beta parece afetar a PPI em concentrações maiores, em torno de 600 ng/kg. Esses resultados abrem, surpreendentemente, uma nova compreensão da pesquisa neurobiológica recente que implica NRG1 como um dos genes candidatos importantes na esquizofrenia.

Exemplo 5

[000128] Aprendizado e memória em um modelo animal para doença de Alzheimer (camundongos APPPS dt).

[000129] Os experimentos com animais, que testam o aprendizado e a memória com ou sem a aplicação do domínio extracelular solúvel de Neuregulina-1β (ECD de NRG-1 beta) em um labirinto aquático de Morris descrito acima para camundongos normais, foram repetidos duas vezes em um modelo de camundongo transgênico para amiloidose cerebral (camundongos APPPS (Meyer-Luehmann et al. 2006; Radde et al. 2006)).

[000130] Aqui, novamente, aqueles animais que foram tratados com uma dose diária de ECD de NRG-1 beta (aqui 200 ng/kg i.p. foram aplicados) 30 minutos antes do treinamento foram significativamente melhores nos parâmetros relacionados com o aprendizado do que o grupo tratado com veículo.

[000131] A Neuregulina não só melhorou o aprendizado, mas os animais tratados também tinham desenvolvido estratégias de busca mais avançadas. Mais animais tratados entraram na área interna da piscina (12 vs. 7, p=0,009), as entradas para a área interna ocorrem com mais frequência (2,0 vs. 0,7 vezes, p=0,03), o tempo gasto e a distância percorrida na zona interna foram maiores (5,3 s vs. 2,1 s, p=0,09 e 0,7 m vs. 0,3 m, p=0,025, respectivamente).

[000132] Os resultados dos experimentos de aprendizado com o modelo de amiloidose cerebral e doença de Alzheimer de camundongo APPPS em um labirinto aquático de Morris estão resumidos na Figura 4.

Exemplo 6

[000133] Neuregulina-1 beta no modelo MPTP de doença de Parkinson de camundongo Métodos:

[000134] Camundongos C57Bl/6 com 10 semanas foram usados no modelo MPTP (1-Metil-4-fenil-1,2,3,6-tetra-hidropiridina) para a doença de Parkinson.

[000135] O tecido cerebral é dissecado (Substância negra, Estriado, Córtex) de camundongos C57Bl/6 com 10 semanas (N=10 por grupo) em diferentes momentos depois do tratamento (0, 1, 3, 7, 21 dias) com NaCl (controles) ou MPTP (modelos agudo e subcrônico). Os métodos seguiram procedimentos publicados (Hoglinger et al. 2007; Hoglinger et al. 2004).

[000136] MPTP é dissolvido como um pó em NaCl a 0,9% e é injetado intraperitonealmente (aplicação aguda: 4 x 20 mg/kg, cada em intervalos de 2 hora; aplicação crônica: 5 x 30 mg/kg, cada em intervalos de 24 horas). Essas injeções levam aproximadamente 10 segundos; os animais foram sacrificados em pontos de tempo definidos (veja a tabela) por deslocamento cervical. Os procedimentos seguem os protocolos publicados (Hoglinger et al. 2007; Hoglinger et al. 2004; Liberatore et al. 1999; Przedborski e Vila 2003; Vila e Przedborski 2003).

[000137] 0 dia depois da última administração de MPTP: Perda dos nervos dopaminérgicos do estriado

[000138] 1 dia depois da última administração de MPTP: Início da ativação da microglia

[000139] 3 dias depois da última administração de MPTP: Máximo de ativação da microglia

[000140] 7 dias depois da última administração de MPTP: Máximo de ativação de astrócito

[000141] 21 dias depois da última administração de MPTP: Máximo de morte celular

[000142] 21 dias depois da infusão intracerebral de ECD de NRG-1 beta e um peptídeo de controle através de bombas Alzet Mini, seguido pelo tratamento com MPTP (agudo vs. crônico), uma quantificação histológica dos neurônios dopaminérgicos do cérebro médio foi realizada de acordo com princípios estereológicos. Também é realizada uma quantificação bioquímica de dopamina e seus metabólitos no estriado por HPLC. Os procedimentos são realizados de acordo com protocolos publicados (Hoglinger et al. 2007; Hoglinger et al. 2004).

Total: N=80 Resultados:

[000143] Como mostrado na Figura 5, os resultados das medidas de HPLC de dopamina e seus metabólitos revelam um efeito claro da administração de ECD de NRG-1 beta durante a lesão com MPTP, nesse modelo para a doença de Parkinson.

[000144] Os efeitos não são clássicos: apesar de não haver efeito significativo sobre os níveis de dopamina, nem durante a lesão com MPTP em nos controles agudo ou crônico da administração de ECD de NRG-1 beta, houve efeitos pronunciados e claros sobre as concentrações de DOPAC e HVA. A administração crônica de ECD de NRG-1 beta resulta em uma redução clara e significativa desse metabólito na ausência de lesão por MPTP, enquanto que no regime agudo apenas uma discreta diminuição é observada. Durante a condição crônica da lesão com MPTP, ECD de NRG-1 beta causa um aumento significativo de ácido homovanílico (HVA), um efeito que é mais pronunciado na ausência de lesão por MPTP.

[000145] Esses resultados podem ser interpretados pela regulação negativa de MAO-B durante a administração crônica de ECD de NRG-1 beta e/ou a regulação positiva de COMT. Sob as condições aplicadas, um efeito positivo considerável e significativo sobre a sobrevivência de neurônios dopaminérgicos foi observado. ECD de NRG-1 beta também é altamente neuroprotetor nesse modelo. Dada a injeção ip durante essa série de experimentos, a clara eficácia também prova de novo que ECD de NRG-1 beta é altamente eficiente em cruzar a barreira hematoencefálica.

[000146] A Figura 6 mostra o esquema metabólico que parece ser afetado pela administração de ECD de NRG-1 beta: a dopamina é convertida por MAO-B em DOPAC e por COMT em 3-MT; o ácido homovanílico é subsequentemente gerado de ambos os metabólitos por COMT a partir de DOPAC e por MAO-B a partir de 3-MT; a administração de ECD de NRG-1 beta está regulando, obviamente as atividades de ambas as enzimas.

[000147] Até mais importante e como mostrado na Figura 7, no modelo de MPTP de doença de Parkinson, há um efeito neuroprotetor claro e significativo de ECD de NRG-1 beta, que se torna aparente pela quantificação histológica de neurônios dopaminérgicos do cérebro médio. O método estereológico está descrito em outro lugar (Liberatore et al. 1999, Przedborski & Vila 2003, Vila & Przedborski, 2003; Hoglinger et al. 2004; Hoglinger et al. 2007).

[000148] No total, há um efeito neuroprotetor surpreendentemente claro e benéfico no modelo animal de MPTP de doença de Parkinson: Os efeitos provam novamente que a administração intraperitoneal de concentrações muito baixas de ECD de NRG-1 beta (por exemplo, 20 ng/kg) é suficiente para se obter eficácia e, portanto, que ECD de NRG- 1 beta passa a barreira hematoencefálica. O complexo também influencia os metabólitos da dopamina (resultados de HPLC; Figura 5) apontando para a regulação de MAO-B e COMT por NGR-1 e ECD de NRG-1 beta.

Exemplo 7

[000149] Identificação de uma isoforma ácida pós-traducional de ECD de NRG-1 beta como princípio ativo

[000150] Foram publicadas evidências de que no aprendizado e na memória uma isoforma ácida pós-traducional de ECD de NRG-1 beta é a forma ativa (Schillo et al. 2005a). Aqui, foi mostrado que padrões similares são observados em modelos animais de doença de Alzheimer e no tecido cerebral post mortem de pacientes com doenças de Alzheimer e Parkinson. Foi concluído que essa isoforma ácida é o princípio ativo.

Métodos:

[000151] Para a coloração de Western blots foram usados os seguintes anticorpos: anti-NRG1-ECD, policlonal de coelho (sc-28916, Lote: I 2905 Santa Cruz; H-210). Neuregulina-1 (H-210) é um anticorpo policlonal de coelho que surge contra os aminoácidos 21-230 mapeados dentro do domínio extracelular N terminal da isoforma HRG-α de Neuregulina-1 de origem humana. Neuregulina-1 (H-210) é recomendado para a detecção de isoforma HRG-α, HRG-α1A, HRG- α2B, HRG-α3, HRG-β1, HRG-β2, HRG-β3 (GGF), GGF2 e SMDF de Neuregulina-1 de camundongo, rato e de origem humana por Western blotting (diluição inicial 1:200, faixa de diluição 1:100-1:1000), imunoprecipitação [1-2 μg por 100-500 μg de proteína total (1 ml de lisado celular)] e imunofluorescencia (diluição inicial 1:50, faixa de diluição 1:50-1:500).

[000152] Os anticorpos secundários eram:

[000153] Anticabra, HRP

[000154] sc-2922 Lote: C1405 Santa Cruz

[000155] Anticoelho, HRP

[000156] Sc-2054 Lote: G 2005 Santa Cruz

[000157] Depois da imunocoloração foi realizada a espectrometria de massa MALDI-TOF e Q-TOF para confirmar o ECD de NRG-1.

[000158] Agora foi encontrado um padrão muito similar no modelo de amiloidogênese cerebral e doença de Alzheimer de camundongo APPPS como mostrado na Figura 8. A concentração dessa isoforma ácida em particular de ECD de NRG-1 em um pI de aproximadamente 5,0 é consideravelmente maior em camundongos APPPS tratados que são, ao mesmo tempo, os melhores aprendizes.

[000159] Na Figura 8, duas imagens representativas são mostradas de cada animal tratado com bom aprendizado (alto) e animal não tratado com desempenho de aprendizado inferior (embaixo).

[000160] A Figura 9 mostra os resultados de um experimento Western blot usando material cortical post mortem de cada um dos 9 pacientes com Alzheimer e controles com a mesma idade. Ela revela claramente que o fragmento de ECD de NRG-1β é significativamente menos abundante nos casos de Alzheimer. Como um controle interno, a abundância de NRG-12 foi medida e parece não ser afetada pela perda de memória associada com a doença.

[000161] Uma investigação adicional dessa isoforma específica de ECD de NRG-1β associada com Alzheimer e memória por Western blots de géis bidimensionais (2D-PAGE) do mesmo material de cérebro humano post mortem usado na Figura 9, revelou como mostrado pelos exemplos representativos na Figura 10 que, de fato, é a isoforma ácida de ECD de NRG-1β que está diminuída na doença de Alzheimer.

Conclusões:

[000162] Foi apresentada aqui, pela primeira vez, uma evidência funcional de efeitos in vivo de modificações pós-traducionais do transcrito do gene nrg-1, em particular, uma forma truncada gerada pela clivagem proteolítica, que compreende o domínio extracelular de NRG- 1 beta com MW de 15-35, pI 4 a 10; mais especificamente, foi constatado uma atividade antipsicótica em modelos animais para esquizofrenia, provavelmente à base da regulação de MAO-B e COMT, em concentrações de 5 a 600 ng/kg (i.v.). Ao contrário dos neurolépticos de controle que são usados em concentrações 100 a 1000 vezes maiores, não houve efeito negativo observado.

[000163] Além disso, foi encontrado um efeito neuroprotetor no modelo de MPTP de doença de Parkinson em concentrações de 3 a 300 ng/kg (i.v.).

[000164] Além disso, foi encontrado um efeito positivo sobre a memória e o aprendizado em respectivos modelos animais (labirinto aquático de Morris) para a aprendizado e amiloidose cerebral e doença de Alzheimer.

[000165] Devido aos efeitos adversos de vários antipsicóticos atípicos, atualmente em uso (Haddad e Sharma 2007), foi concluído que o fragmento solúvel de ECD de NRG-1 com os domínios EGF de SMDF, NRG-1 alfa, mas em particular com NRG-1 beta podem ser úteis como um medicamento isolado ou em combinação para o tratamento de esquizofrenia, transtorno bipolar e depressão.

[000166] Ele também pode ser usado da mesma maneira em outras doenças do sistema nervoso central, como distúrbios neurodegenerativos como a doença de Alzheimer e doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica, esclerose múltipla, acidente vascular cerebral, lesões traumáticas de cérebro e da medula espinhal.

[000167] As proteínas solúveis de ECD de NRG-1 têm esses efeitos muito amplos devido a um papel central na transdução do sinal neuronal, em particular, mediando a sinalização do glutamato e a excitotoxicidade, que desempenha um papel central em toas as indicações mencionadas acima (Schrattenholz e Soskic 2006). Referências 1. Arnold SE, Talbot K, Hahn CG (2005) Neurodevelopment, neuroplasticity, and new genes for schizophrenia. Prog Brain Res 147:319-345 2. Bao J, Lin H, Ouyang Y, Lei D, Osman A, Kim TW, Mei L, Dai P, Ohlemiller KK, Ambron RT (2004) Activity-dependent transcription regulation of PSD-95 by neuregulin-1 and Eos. Nat Neurosci 7:1250-1258 3. Benzel I, Bansal A, Browning BL, Galwey NW, Maycox PR, McGinnis R, Smart D, St CD, Yates P, Purvis I (2007) Interactions among genes in the ErbB-Neuregulin signalling network are associated with increased susceptibility to schizophrenia. Behav Brain Funct 3:31 4. 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Claims

1. Uso de uma isoforma recombinante solúvel de Neuregulina-1β Tipo I humana, caracterizado pelo fato de que é para fabricação de um medicamento para tratamento de esquizofrenia, doença de Parkinson, ou lesão cerebral traumática , em que a isoforma de Neuregulina-1β Tipo I é: (a) um fragmento terminal de Neuregulina-1β Tipo I de 15KD a 35 KD, como medido por SDS-PAGE, (b) os primeiros 245, 246, 247, 248, 249 ou 250 aminoácidos da Neuregulina-1β Tipo I, e (c) capaz de atravessar a barreira hematoencefálica.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a isoforma de Neuregulina-1β Tipo I corresponde aos primeiros 245 aminoácidos da Neuregulina-1β.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a isoforma de Neuregulina-1 β apresenta um ponto isoelétrico de 4 a 10.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a isoforma de Neuregulina-1β apresenta um ponto isoelétrico de 4 a 6.

5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que é em combinação com um medicamento adicional.

6. Uso, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o medicamento adicional é um medicamento para o tratamento de esquizofrenia, doença de Parkinson, ou lesão cerebral traumática .

7. Uso, De Acordo Com A Reivindicação 6, Caracterizado Pelo Fato De Que O Medicamento Adicional É Selecionado Entre Compostos Que Afetam O Metabolismo De Catecolamina, Inibidores Da Acetilcolina Esterase, Inibidores Da Mao-b Ou Comt, Bloqueadores De Canal Do Tipo De Memantine, Agonistas Ou Antagonistas Do Receptor De Dopamina Ou Serotonina, Inibidores Da Reabsorção De Catecolamina Ou Serotonina Ou Qualquer Tipo De Medicamentos Antipsicóticos Como A Clozapina Ou Olanzapina Ou Fármacos Como A Gabapentina, Para O Tratamento Das Doenças De Parkinson, Esquizofrenia, Ou Lesão Traumática Do Cérebro.

8. Uso, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que o medicamento adicional é: um medicamento para esquizofrenia, um medicamento para o tratamento da doença de Parkinson, ou um medicamento para o tratamento de lesão cerebral traumática.

9. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a isoforma de Neuregulina-1β Tipo I é adaptada para ser administrada em uma quantidade de 3 a 600 ng/kg de peso corporal de um indivíduo a ser tratado.

10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a isoforma de Neuregulina-1β Tipo I está adaptada para ser administrada em uma quantidade de 150 a 300 ng/kg de peso corporal do indivíduo a ser tratado.

11. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a isoforma de Neuregulina-1β Tipo I é adaptada para ser administrada em uma quantidade de cerca de 3, 5, 20, 50, 150, 200, 300 ou 600 ng/kg de peso corporal do indivíduo a ser tratado.

12. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a isoforma de Neuregulina-1β Tipo I está adaptada para ser administrada em uma quantidade de cerca de 20 ng/kg de peso corporal do indivíduo a ser tratado.

13. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o medicamento é adaptado para injeção intravenosa ou intraperitoneal.

14. Composição farmacêutica ou kit, caracterizada pelo fato de compreende: (i) uma isoforma recombinante solúvel de Neuregulina-1β Tipo I humana, em que a isoforma da Neuregulina-1β Tipo I é um fragmento N-terminal de 15 KD a 35 KD da Neuregulina-1β Tipo I, conforme medido por SDS-PAGE, e os primeiros 245, 246, 247, 248, 249 ou 250 aminoácidos da Neuregulina-1β Tipo I, e (ii) um medicamento adicional, particularmente para o tratamento de esquizofrenia, doença de Parkinson ou lesão cerebral traumática.