CN101903036A - 经翻译后修饰的有活性的可溶性神经调节蛋白亚型 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及到使用以可溶性神经调节蛋白-1亚型为代表的神经调节蛋白-1翻译后修饰的亚型作为药物，治疗认知相关的神经性疾病，尤其是精神分裂症、阿尔茨海默氏症以及帕金森氏症。

Description

经翻译后修饰的有活性的可溶性神经调节蛋白亚型
技术领域
本发明涉及使用神经调节蛋白-1翻译后的各种修饰产物或剪切变体，尤其是可溶于生理溶液的神经调节蛋白-1亚型作为药物，来治疗与认知有关的精神紊乱类疾病，如精神分裂症、阿尔茨海默氏症以及帕金森氏症。
背景技术
神经调节蛋白(NRG)为突触信号传递中的关键调节物质。这种跨膜蛋白由四种基因编码(NRG-1、NRG-2、NRG-3和NRG-4)，并通过选择性的RNA剪接和启动子使用以及尤其翻译后修饰(如蛋白水解加工，其可自膜结合的全蛋白中释放可溶性的亚型)使其多样性进一步提高。此外经证实还存在磷酸化与糖基化(Buonanno andFischbach 2001)。它们的特征在于不同的胞外结构域，且是ErbB受体酪氨酸激酶的配体，其涉及神经炎症以及基因转录的下游(Holbroand Hynes 2004)。尤其是，NRG-1的可溶性亚型可由跨膜形式的NRG在电刺激过程中经蛋白水解切割得到，并随后分泌为依赖于活性的突触调节物(Ozaki et al.2004)。
包含整个跨膜蛋白的N端胞外结构域(ECD)的NRG-1的截短亚型(推测为β1)被证实与学习和记忆相关联(Schillo et al.2005a；WO03/014156)。对功能的研究证明，NRG-1直接调节NMDA受体亚基组成(Ozaki et al.1997；Eilam et al.1998)。此外，这类NRG-1片段由于抗凋亡作用而具有体内神经保护性质(Xu et al.2005A；Xu etal.2005B；Xu et al.2004)。
由于NMDA受体的NRG依赖性调节(Schrattenholz and Soskic2006)，以及随后的下游事件(如兴奋性中毒、神经炎症以及凋亡)(在图1中总结)，人们最近越发的认识到NRG-1在人神经性疾病中扮演中心角色。有结果表明NRG-1在从肌萎缩侧索硬化症、阿尔茨海默氏症和帕金森氏症至中风以及精神分裂症的疾病中均发挥着重要作用(Britsch 2007)。
NRG-1的这些重要的作用暗示其除了在神经保护以及在与认知相关的学习与记忆中起到积极作用外，NRG-1还是各种特定脑区和细胞类型中的各种损伤后神经原组织再生中的重要神经营养因子。很明显，它是维持及修复神经元回路的完整性的重要因子：神经保护和功能丧失后的正确再生以及活性依赖型神经元可塑性的形成中的作用。
在Kastin et al，2004证明调节蛋白1β可穿过血脑屏障后，对神经调节蛋白1β研究的兴趣得到了进一步的点燃。其开辟了神经调节蛋白1β的治疗应用的新途径。
最近的研究证明了其在神经保护方面具有广泛的应用范围。两份出版物分别独立的证明了神经调节蛋白1还是BACE(β分泌酶、β淀粉样蛋白转化酶)的底物，而这意味着神经调节蛋白1与阿尔茨海默氏症相关联(Glabe 2006；Schubert 2006)。
另外，在雪旺氏细胞中发现神经调节蛋白-1增加了3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶(雪旺氏细胞中胆固醇生物合成的限速酶)的转录(Pertusa et al.2007)。这对髓鞘受影响的疾病(如神经分裂症和多发性硬化症)或涉及所谓的“富含胆固醇的脂筏”的认知相关功能有深远意义(Schrattenholz and Soskic 2006)。围绕轴突的雪旺氏细胞在生理状态下表达NRG1受体ErbB2/ErbB3以及可溶性NRG1α和NRG1β。经去神经处理，成体的雪旺氏细胞脱离与轴突的接触后，改变其形态学，停止表达NRG1β，并上调NRG1α及ErbB2/ErbB3的表达(Geuna et al.2007；Karoutzou et al.2007)。
此外，遗传流行病学研究表明神经调节蛋白1与精神分裂症和阿尔茨海默氏症(尤其与其精神病形式)有着明显的相关性(Farmer etal.，2007)。
一些近期的遗传群体分析显示，特定NRG-1-SNP与阿尔茨海默氏症和精神分裂症有关(Go et al.2005；Scolnick et al.2006；Ross et al.2006；Meeks et al.2006；Farmer et al.2007)。最近的这些发现与图1中其他含有功能的NRG的复合物的蛋白有关(ErbB受体：(Benzel etal.2007；Thomson et al.2007；Hahn et al.2006)。还暗示了NRG-1在多发性硬化中的作用(Esper et al.2006)。
有结果提示NRG1的危险等位基因与精神分裂症之间相关联的分子机制可能包括α7亚类烟碱乙酰胆碱受体的下调(Mathew et al，2007)。
根据本发明，发现重组的可溶性神经调节蛋白-1β亚型对精神分裂症、阿尔茨海默氏症以及帕金森氏症的动物模型的学习和记忆状况可起到一定的药效。在静脉注射后，神经调节蛋白-1β亚型在显著低于对照药物浓度的浓度有活性。
发明内容
因此，本发明的第一方面为重组的可溶性神经调节蛋白-1亚型用于制备治疗神经性疾病(特别是与认知相关神经性疾病)的药物的用途。
本发明的另一方面为药物组合物或试剂盒，其包含：(i)重组的可溶性神经调节蛋白-1亚型、和(ii)其他的尤其是用于治疗神经性疾病(尤其是与认知相关的神经性疾病)的药物。
此外，本发明另一方面为重组的可溶性神经调节蛋白-1亚型用于制备增强记忆和认知的药物的用途。
此外，本发明另一方面为治疗神经性疾病的方法，包括：给有需要的受试者施用药学有效量的重组的可溶性神经调节蛋白-1亚型。
此外，本发明另一方面为增强记忆和认知的方法，包括：给有需要的受试者施用药学有效量的重组的可溶性神经调节蛋白-1亚型。
此外，本发明另一方面为共施用重组的可溶性神经调节蛋白-1亚型与其他药物。
据本发明可知，可溶性神经调节蛋白-1亚型已被证明对治疗神经性疾病(尤其是疾病(如精神障碍(如精神分裂症、双相型障碍和抑郁型)、神经退行性疾病(如帕金森氏症、阿尔茨海默氏症、多发性硬化(MS)、或肌萎缩侧索硬化症(ALS)、癫痫)或神经性损伤(如中风、创伤性脑损伤以及脊髓损伤)))有效。优选治疗精神分裂症，特别是精神分裂症的认知相关方面、帕金森氏症和阿尔茨海默氏症。另外，本发明还涉及重组的可溶性神经调节蛋白-1亚型用于增强记忆和认知，特别是用于减少和/或抑制与神经性疾病(如阿尔茨海默氏症和精神分裂症)相关的记忆和认知缺失的用途。
所述重组的可溶性神经调节蛋白-1亚型优选为人神经调节蛋白-1亚型，即包含天然的人神经调节蛋白-1亚型的一级氨基酸序列或与重组亚型全长具有至少90％的同一性，优选至少95％的同一性，及最优选至少98％的同一性的序列的重组亚型。
本发明的可溶性重组神经调节蛋白-1亚型优选包含相应神经调节蛋白-1胞外结构域的至少一部分(如人神经调节蛋白(如人神经调节蛋白-1β)胞外结构域的至少一部分)。
本发明的重组可溶性神经调节蛋白亚型的长度优选达250个氨基酸(如150～250个氨基酸)。例如通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定的神经调节蛋白亚型的分子量优选为约15KD～约35KD，尤其为约25KD～约32KD。重组的可溶性神经调节蛋白-1亚型(尤其为重组的神经调节蛋白-1β亚型)的等电点(pI)为约4～约9.5，优选为约4～约6。该亚型可为由未修饰的氨基酸序列构成的未修饰多肽或经修饰多肽，其中所述修饰可选自：磷酸化、糖基化、甲基化、十四烷基化、氧化及它们的任意组合。在特别优选的实施方式中，神经调节蛋白-1亚型包含至少一个磷酸化的氨基酸残基。另外，本发明包含缀合异源部分，如聚(环氧烷烃)部分，特别是聚乙二醇部分。
该重组的可溶性亚型可通过任何可有效递送到目标组织(如神经系统，特别是中枢神经系统，如脑和/或脊髓)的途径施用。已发现，神经调节蛋白亚型的药学有效浓度可通过全身给药达到。例如，该亚型可通过注射或输液(如静脉注射)施用。该亚型可根据待治疗疾病的类型和严重程度，优选以0.1～5000ng/kg待治疗受试者体重的量，尤其以2～1000ng/kg待治疗受试者体重的量，及更尤其以3～600ng/kg待治疗受试者体重的量施用。在本发明的其他实施方式中，该可溶性亚型还可局部施用，如通过直接施用于中枢神经系统(如脊髓和/或脑)。还可考虑通过腹膜内注射或皮下注射或吸入设备以达到500μg/kg的更高剂量施用。待治疗的受试者优选为哺乳动物，更优选为人患者。
该可溶性重组神经调节蛋白-1亚型可作为独立药物(即作为单一疗法)或组合药物(即与其他药物(特别是其他适合于治疗神经性疾病的药物)组合)施用。尤其在治疗阿尔茨海默氏症和帕金森氏症、精神分裂症、双相型障碍、抑郁症或其他神经性疾病中的其他药物的例子是：影响儿茶酚胺代谢的化合物、乙酰胆碱脂酶抑制剂，MAO-B-或COMT-抑制剂，美金刚型通道阻断剂，多巴胺或血清素受体激动剂或拮抗剂，儿茶酚胺或血清素再摄取抑制剂，以及任何类型的精神抑制药(如氯氮平、奥氯平或加巴喷丁类药物)。其他药物的其他例是神经保护剂，例如PARP-1抑制剂，如WO2006/008118和WO2006/008119中所公开，所述文献通过引用并入本文。
因此，本发明的一个实施方式涉及本文所述的重组的可溶性神经调节蛋白-1亚型与治疗精神障碍(如精神分裂症、双相型障碍及抑郁症)的药物(如奥氮平或氯氮平)的组合。进一步实施方式涉及重组的可溶性神经调节蛋白-1亚型与治疗神经退行性疾病(如帕金森氏症、阿尔茨海默氏症、MS或ALS)的药物的组合。再一实施方式涉及重组的可溶性神经调节蛋白-1亚型与治疗神经性损伤(如中风、创伤性脑损伤或脊髓损伤)的药物的组合。
可通过将重组的可溶性神经调节蛋白-1亚型与其他药物以药物组合物或试剂盒的形式共施用来实现联合治疗，其中单个药物可分开施用或共同施用。
神经调节蛋白-1亚型可为神经调节蛋白-1I型、II型、III型、IV型、V型或VI型亚型，优选为神经调节蛋白-1β亚型，神经调节蛋白-1α亚型或感觉神经元和运动神经元衍生因子(SMDF)亚型，特别是神经调节蛋白-1β亚型，更特别为人神经调节蛋白-1β亚型。
神经调节蛋白1β亚型具有穿过血脑屏障转运的活性。正如实施例中所显示的一样，神经调节蛋白1β经静脉注射/腹膜内注射后在脑中的优秀生物利用度为NRG1β的治疗应用铺平了道路。
其抗凋亡、稳定髓鞘、抗炎症特性及与BACE的直接相互作用的组合为治疗中风、阿尔茨海默氏症、MS和精神分裂症以及其他神经性疾病创造了机会。
如上所述，本申请包括未经修饰的以及经修饰的神经调节蛋白-1亚型(特别是神经调节蛋白-1β亚型)的用途。有证据表明，在神经调节蛋白-1(特别是其胞外结构域)的特定氨基酸残基上发生翻译后修饰(像蛋白水解加工、磷酸化和糖基化)。尤其已报道了神经调节蛋白-1可溶性片段的释放(Buonanno and Fischbach 2001；Fischbach2007)。可能的氧化也已被报道(Nadri et al.2007)。
本发明人证明优选的具有生理学活性的神经调节蛋白-1β亚型包含神经调节蛋白-1β的胞外结构域或其已经翻译后修饰的一部分。该亚型优选被磷酸化修饰，其中1、2、3个或者更多个氨基酸侧链残基(特别是如Tyr、Ser或Thr的有OH-基团的侧链残基)被磷酸化修饰。优选的磷酸化位点位于79～82位氨基酸，133～136位氨基酸和/或158～161位氨基酸(根据Falquet et al.，2002命名)。更优选的磷酸化位点位于12～14位氨基酸，30～32位氨基酸和/或85～87位氨基酸。更潜在的修饰位点是：酰胺化位点(优选位于22～25位和/或30～33位)；糖基化位点(在150～153位，156～159位和/或204～207位)；及十四烷基化位点(优选位于94～99位，149～154位，168～173位，175～180位和/或202～207位)，以上根据Falquet et al.，2002命名。
以下将使用优选的药物指标对本申请的实验数据的关联性进行解释。
精神分裂症
精神分裂症为一种严重并致残的精神障碍，具有如幻听、思维混乱以及妄想、情感缺乏、兴趣缺失、感情迟钝以及冷漠的症状。流行病学、临床学、神经心理学以及神经生理学研究提供了实质性的证据，证明脑发育以及持续的神经成型异常在其发病机理中扮演着重要的角色(Arnold et al.2005)。
认为精神分裂症包括多巴胺能神经传递障碍，而由谷氨酸能神经传递调节多巴胺能系统则扮演着重要的角色。此观点得到神经调节蛋白和dysbindin基因(其对谷氨酸能系统具有功能性影响)的遗传学发现的支持(Muller and Schwarz 2006)。变得越来越明晰的是，现象表明，可能包含有导致精神分裂症的基因(包括神经调节蛋白)的多个区域也与双相情感障碍有关，此发现得到最近两篇文章的支持(Farmer et al.2007；Owen et al.2007)。
神经调节蛋白-1，其是精神病易患基因，作用于神经元迁移、轴突导向与髓鞘的形成，可潜在解释精神分裂症和双相型障碍中异常的解剖学与功能连接的发现(McIntosh et al.2007)。
有越来越多的重要证据证明神经调节蛋白1与精神分裂症之间存在基因上的联系(综述：Farmer et al.，2007)。本文提到了神经调节蛋白-1引起的谷氨酸盐、GABA以及烟碱神经传递的增强(Fischbach2007；Woo et al.2007；Li et al.2007)并暗示了与脑炎相关联(Hanninen et al.2007)。
推测3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶(胆固醇生物合成的限速酶(Pertusa et al.2007))的调节(对于髓鞘形成重要)也与所述疾病相关。
事实上，在精神分裂症、双相型障碍以及抑郁症共同的遗传危险基因中，NRG1扮演了重要的角色，提示涉及这些精神病的基因(如NRG-1)可为以生物学为基础而不是按症状对疾病进行分类，从而针对这些复杂的脑部疾病开辟出新的治疗方法提供基础(Blackwood etal.2007；Bertram et al.2007)。
本申请的实验数据显示了在精神分裂症的实验模型中施用可溶性重组神经调节蛋白-1β的效力。
阿尔茨海默氏症
在本发明人最初的研究显示，相比年龄相配的对照，阿尔茨海默氏症患者的死后脑海马切片中神经调节蛋白1β减少(Sommer et al.，2004)，证明神经调节蛋白-1的可溶性片段与径向迷宫测试的学习表现之间存在着明显的正向关联(Sommer et al.，2004)。
有许多报道证实NRG-1在活性依赖型突触变化中的作用(Xie etal.2006；Kwon et al.2005；Rimer et al.2005；Bao et al.2004；Yang etal.2005)，对于学习和记忆重要(Ozaki et al.1997；Ozaki et al.2004；Golub et al.2004；Schillo et al.2005b)。正如下面所显示的，含胞外结构域的NRG1β片段与行为动物模型的学习明显相关。相比年龄相配的对照，阿尔茨海默氏症患者死亡后海马区(负责短期记忆的形成)脑切片中蛋白表达显示出减少表明，在明显仍健康的神经元区中缺乏与记忆相关的突触活性。
最新发现(Hu et al.2006；Glabe 2006；Schubert 2006)显示，NRG1可被BACE1(＝β分泌酶)(使患阿尔茨海默氏症的人脑中产生淀粉样蛋白β的团块的酶)的加工，这便解释了其与阿尔茨海默氏症之间的联系及其在与NRG1的神经营养性质相关的髓鞘形成中的伴随作用(Hu et al.，2006；Glabe 2006；Schubert 2006)。需要酶BACE1(β-位点淀粉样前体蛋白-切割酶1)来从较大的前提切割淀粉样蛋白-β。在经BACE1介导切割后，含有早老素的复合物γ分泌酶对其进行最终切割，并释放出淀粉样蛋白-β。
由分泌酶对NRG的切割对于神经髓鞘形成至关重要。正如淀粉样蛋白前提蛋白，神经调节蛋白1也被β分泌酶切割。β分泌酶对神经调节蛋白1的水解切割对于外周神经中雪旺氏细胞的髓鞘形成至关重要。靶向β分泌酶的药物可以影响到外周神经的发育与功能。
最初，Haass工作组(Willem et al.2006)观测到并发现了BACE1也为髓鞘形成所需。外周神经的髓鞘形成在始于生命早起，故尚不清楚BACE1的抑制如何影响更年长动物。有迹象表明，BACE1还在中枢神经系统的髓鞘形成中发挥作用。BACE-1有缺陷的转基因动物在外周神经中具有鞘磷脂缺陷。
最近发现的神经调节蛋白-1引起的谷氨酸盐、GABA以及烟碱酸神经传递的增强(Fischbach 2007；Woo et al.2007；Li et al.2007)也与神经退行和阿尔茨海默氏症有关。
本申请的实验数据证明施用可溶性重组神经调节蛋白-1β亚型对阿尔茨海默氏症的实验模型的效力。
中风、创伤性脑损伤
美国独立扩展研究的一系列与中风有关的体内实验证明了神经调节蛋白1(本身是抗凋亡剂)的神经保护作用(Xu et al.，2004，2005和2006；Guo et al.，2006)。
NRG-1可减少神经损伤并改善大脑中动脉闭塞(常用的中风模型)后的神经性结果(Xu et al.2005b；Xu et al.2004；Xu et al.2006；Guo et al.2006)。
在有关重组的人NRG-1在减弱缺血/再灌注造成的脑损伤中的治疗效力和机制的相同研究中发现，NRG是抗凋亡剂。在大脑中动脉闭塞(MCAO)及随后的灶性脑缺血90分钟，以及再灌注24小时前10分钟血管内应用NRG-1(3.0ng/kg)。
本发明的数据证明，以低浓度施用重组的可溶性神经调节蛋白-1亚型，即可起到显著的药效，因此，推测其对中风以及创伤性脑损伤模型有效。
附图简述
以下将通过下文给出的图及实施例对本申请进行更详细解释。
图1：对神经调节蛋白1的各种综述和众多研究文章显示，NRG1作为一种重要的上游调控元件，在神经退行性疾病、神经障碍以及生理功能的机制上扮演着重要的角色：
NRG为一种功能复合物的关键部分，该复合物至少包括神经调节蛋白(NRG)、受体酪氨酸激酶(ErbB受体)，硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparansulfate proteoglycans，HSPG)以及NMDA受体(NMDAR)，它们短暂地并依赖活性地组装于富含胆固醇(CHO)的膜微区。尤其是，钙信号的整形对通过翻译后修饰与突触支架蛋白间的相互作用(PSD-95，与特定的磷酸化结构域(如伴侣蛋白上的PDZ-或SH-结构域)相互作用)重要。PSD-95复合物直接调节促炎症酶(如一氧化氮合酶(NOS，iNOS是可诱导型，nNOS为神经源型)和Cox-2(环氧合酶-2))，其提高与相关(但非必需)下游机制(涉及NAD+-依赖型酶(如PARP-1(聚-ADP-核糖聚合酶-)和Sir-2(sirtuin-2)))的复杂关系中的其作用；PARG是聚(ADP-核糖)糖水解酶，与RARP-1相互补且拮抗的酶；HDAC为组蛋白去乙酰化酶(包括Sir-2在内的一大类酶)。MPTP为线粒体通透性转换孔。DRP-2为二氢嘧啶酶相关蛋白2。还有其他重要的膜蛋白(如特定烟碱乙酰胆碱受体(nAChRα7)，GABAA受体(GABAAR)、淀粉样前提蛋白(APP)以及蛋白酶(PS))短暂在脂筏中组织，并在通常的磷脂(PL)环境外获得不同的功能特性，细节见(Schrattenholz andSoskic 2006)。
图2：Morris水迷宫学习实验的总结：每日使用3ng/kg(静脉)神经调节蛋白-1β(NRG-1β-ECD)的可溶性胞外结构域处理的动物在学习上显著好于使用媒质处理的动物；IAE：进入内区；IAEF：进入内区的频率；TS：在内区耗费的时间；DT：在内区运动的距离。
图3：NRG-1β-ECD引起苯丙胺诱导的机能亢进(一种被广泛认可的精神分裂症模型)减弱。浓度范围为15～600ng/kg(在施用苯丙胺前15分钟经静脉注射)。包括0.125mg/kg氟哌啶醇的阳性对照。然而正如其他非经典的以及经典的抗精神病药物一样，氟哌啶醇通常会将活性降到对照水平以下(以标有veh/veh的虚线表示，蓝色的为横越情况，洋红色为进食情况)。NRG-1β-ECD将活性逐渐降低至接近对照组水平，但并未引起更进一步的降低。NRG-1β-ECD的低有效浓度及无负面作用(活性降至低于媒质对照水平)是本模型的出色的特点。效果以p＜0.05显著。
图4：在Morris水迷宫实验中，用脑淀粉样病变与阿尔茨海默氏症的APPPS型小鼠模型的学习实验的总结：每天经腹膜内注射200ng/kg NRG-1β-ECD治疗的动物在学习上显著好于经媒质治疗的动物；IAE：进入内区；IAEF：进入内区的频率；TS：在内区耗费的时间；DT：在内区运动的距离。
图5：多巴胺及其代谢物的HPLC定量：使用星号标记的栏为高度显著。
图例     S    盐(对照)
        aM    急性MPTP
        aMN   急性MPTP和NRG-1β-ECD
        aN    急性NRG-1β-ECD
        cM    慢性MPTP
        cMN   慢性MPTP和NRG-1β-ECD
        cN    慢性NRG-1β-ECD
图6：由MAO-B和COMT的多巴胺代谢。
图7：MPTP接触引起黑质中多巴胺能神经元的显著损失(aMPTP，p＝0.0005；且cMPTP，p＝0.0075)。腹膜内施用20ng/kgNRG-1β-ECD引起MPTP损伤的反转(aNR-MPTP；p＝0.57，即，与媒质对照无差异)或明显和显著的改善(cNR-MPTP；p＝0.0097)；在慢性模型(连续5天腹膜内施用20ng/kg的NRG-1β-ECD)中，也有对多巴胺能神经元数量的显著影响(cNR：p＝0.0002)。
图例    NaCl     盐(对照)
        aMPTP    急性MPTP
        aNR-MPTP 急性MPTP和NRG-1β-ECD
        aNR      急性NRG-1β-ECD
        cMPTP    慢性MPTP
        cNR-MPTP 慢性MPTP和NRG-1β-ECD
        cNR      慢性NRG-1β-ECD
图8：具有代表性的两张对神经调节蛋白-1β进行染色的APPPS小鼠脑蛋白的2D-蛋白印迹图，经治疗的，并且学习状况良好的动物(上图)，以及未经治疗的，学习表现较差的(下图)。
上半部中的数值为2D胶中的pI值。
图9：蛋白印迹实验比较了阿尔茨海默氏症患者和对照的死后皮层材料中的NRG-1βECD片段丰度。
图10：2D-PAGE显示，在这些实验中，NRG-1β-ECD的酸性亚型(pI约为5～5.5，分子量约为25～32kD)在阿尔茨海默氏症患者的脑中明显减少。
实施例
概述
在以下实验中使用了神经调节蛋白-1β片段，其仅包含人nrg-1基因的整个转录本的胞外结构域(ECD)。依据磷酸化和/或糖基化状态，其分子量约为25～32kD，且等电点介于约5和9.5之间。
神经调节蛋白-1亚型的生理活性形式具有约5.5的pI。所述生理活性形式具有约5.5的pI(大部分实验使用由大肠杆菌生产的，分子量约为26kD，pI约为9.0的商品化亚型进行)。
本亚型为重组的可溶性NRG-1β片段，其由NRG-1β的前245个氨基酸组成，购自R&D system公司(产品号：377-HB-CF)。在下文中将称其为NRG-1β-ECD。该活性亚型的pI值约为9.0。
我们还测试了相对应的仅含EGF结构域的8kD的NRG-1β片段，购自R&D system公司(产品号：396-HB)。该片段在体内及体外均表现出较好的神经保护作用，但由于其甚更高的增殖性(引起患癌症的担心)而未深入研究。
实施例1：最初的毒理学研究数据表明NRG1β(ECD)在急性毒 理学及体外突变测试中无负面作用。
●在大鼠中未出现急性静脉毒性：所有动物在实验结束时仍然存活。在研究的过程中未见临床体征。动物体重在该系与年龄的通常记录范围内。在尸检中未记录肉眼可辨的发现。在对雌性大鼠单次静脉注射后观测14天的NRG1β(ECD)的半数致死量为：LD 50 (雌性大 鼠)：大于5000ng/kg体重。
●连续7天以50、200、600ng/kg体重/天的剂量静脉施用神经调节蛋白不导致任何早产儿死亡。记录没有临床体征。治疗不影响采食量以及体重。在600ng/kg体重/天处建立了最大无作用水平(NOEL)。
●根据OECD Guideline for the Testing of Chemicals No.476“Invitro Mammalian Cell Gene Mutation Test”，使用细胞系L5178Y的小鼠淋巴瘤胸苷激酶位点测试中，NRG1β(ECD)是非诱变剂。
●根据OECD Guideline for the Testing of Chemicals No.473，在中国仓鼠V79细胞中的染色体畸变测试中，NRG1β(ECD)不引起染色体结构畸变。
此外，未在任何就效力进行的动物实验中(其中的一些经每日静脉施用持续了几个月)观测到NRG1β(ECD)的负面作用。
下述在各种动物模型中NRG1β(ECD)的施用通过静脉(iv)注射或腹膜内(ip)注射进行；浓度范围为3～600ng/kg。
实施例2：学习与记忆：使用及不使用NRG-1β-ECD施用的空间 学习
方法：
使用Morris水迷宫来评估空间学习。其要求动物在充满水的水池中游泳，并找到恰好没于水面下的救生平台。要求平台需要置于远离迷宫墙，动物有在水面可见的使估计位置的参考点，但不与目标接近到可允许联想学习。对动物进行训练为仅可通过平台方可获救，也就是说，将所有未发现平台的动物引导至该平台，并在被从设施上取走前允许其在平台休息。因此，对小鼠最重要的参考点之一即操作人员。
本实验旨在确定与鼠空间回忆相关的两个关键参数，即：
●小鼠学习找到平台的速度
●短期内记忆信息的能力(在训练期间或过夜)
动物
本研究用两组APP/PS小鼠进行(Meyer-Luehmann et al.2006；Radde et al.2006)，一组每日用NRG-1β-ECD治疗而另一组经假治疗作为对照。每组由8只在第一组实验开始时9周龄的雄性小鼠组成。
第一组实验在第42周开始，将小鼠按8只经过治疗，8只未经治疗分为两个小组，共持续实验15天。其他组相同实验会在6周，12周等后开始。
该组实验的第二小组对(8只经过治疗的与8只未经治疗的9周龄雄性)在第48周开始，即这些小组实验较第一小组而言落后6周。
设备
用圆形Morris水迷宫来评估经过治疗的与未经治疗的APP/PS小鼠学习的能力，所述圆形Morris水迷宫应足够大以提供搜寻空间，同时又应防止小鼠精疲力竭。对实验的每个细节均应给予足够的关注，以保证在整个实验过程中，实验设置尽可能均一。
在此实验中，使用了直径为120cm的水池，其以总是相同的方向被放置于实验室的精确可再现位置。在水池的固定位置放置有一个白色半透明的，直径15、10、或5cm的圆形平台，其高度刚好到达水面以下(因此其对小鼠是不可见的)，小鼠可以爬到其上，该圆盘为在水中唯一可供休息的地方。平台涂有易握的薄纱表面以辅助攀爬(见图11)。
为按照下文的要求进行救生过程，圆台配备有可以自动升降，而无实验者直接操作的装置。因此，取决于其高度，平台是游泳中的小鼠可够到的，或不是“请求式平台”(Buresova et al.1985)。
平台位置总是被设置在圆形的池中心区，内径和外径分别为～40cm和～80cm。定义四个象限，从而平台占据其中之一的中心区(靶象限)。关于平台尺寸及位置的进一步细节见下文。
为确保平台位置在整个组实验的准确相同，将底座牢固地固定在水池底板，可将平台以最小的空间耐受安置到其上。在平台上表面的中心，同样装配有伸出水面的提示棒(近端标记)，使其在视频记录设备上易见，以及在水池中游泳的小鼠易见。在平台或摄像机均可任意操作后，无实验动物而仅在平台上插有提示棒的情况下先行录制一段短视频，以检查平台的位置。
用低脂奶粉使水不透明度。水温应足够低，以激励小鼠尽快找到出口，但又不应过冷使得小鼠受到损害或精疲力竭。综合考虑各种因素，在每次实验开始时控制水温，并用温水或冰片调节至18℃。在每个独立的实验中，水温则根据需要进行调节。
将四个远端标记(不同的简单几何形状且不同颜色，高约20cm)连接在水池边缘上方～20cm，每个象限一个。注意在所有的实验中，将标记固定于完全相同的位置。整个水池被一白色半透明的布帘遮盖。灯光昏暗且散射。
摄像机被牢固地安装于水池中心上方完全垂直的位置，由此水池完全充满视频画面。至少以PAL分辨率获得视频记录(720×576像素，每秒25帧)。视频使用自动追踪系统(使随时移动的动物的无缝检测)评估。
小鼠使用一种特殊设备放入水中，该设备被安装于一小棒上，使得小鼠可以在指定位置沿着水池的边缘进入水中，而非由实验人员进入由半透明帘幕组成的空间中。
实验设计
在每次的实验中，小鼠在预先确定的地点被放入到水池中，并让其游泳60秒钟。使用视频跟踪系统记录动物的运动路径，并计算参数(由此可得出有关动物学习能力的结论)(最明显的是，至小鼠第一次接触到平台所用的时间＝“逃逸时间”；更进一步的描述请见下文)。如果小鼠成功地找到了平台，则使其在上面休息一小段时间(～15秒钟)。或者，在游泳60秒钟后，由实验人员引导小鼠找到平台并休息～15秒钟。随后由实验人员将其取走，轻柔的弄干，放回其笼或准备下次游泳。
在每一天的实验中，于每天早晨对每只小鼠进行一次实验。每个实验由连续的两次游泳组成，从非目标象限的两个不同象限开始。每天每次游泳实验的准确入水点(以及平台位置(如果可应用))均随机指定，但在当天个小鼠间无差别。
如果小鼠反馈结果学习极其缓慢，则相应增加每次实验的游泳次数或每天的实验次数(反之亦然)。此外，在许多小鼠系中，较年轻的动物学得非常快，所以在4或5天的训练后，逃逸时间即可稳定在几秒钟，仅此在经治疗以及未经过治疗的动物间大体相当。但是如果在训练期间逃逸时间曲线并未达到饱和，反而单调下降的话，则其对统计学评估有利。因此使用了一种实验设计，其中随着训练的进行待解决的问题将变得越发困难：故在预先设定的几天中，保持平台中心坐标不变，而将平台用较小的平台替代。对每组实验独立确定是否需要以及何时更换平台，且应依据之前组的结果。
在每组实验中，小鼠被安排执行三种不同类型的任务：
●提示位置航行。平台使用提示信号进行标记，使小鼠游泳直到找到平台。此方法测试联想学习，并将小鼠分为学习能力尽可能相近的两个实验组。此外，在第二以及此后组实验中，提示位置航行支持之前组实验中平台位置的消隐信号回忆。
●隐藏平台获得训练。平台对于小鼠不可见，且在小鼠进行游泳期间位于相同的位置。本任务可用于监控小鼠回忆起隐藏平台的准确位置的过程(“空间学习”)。
●探索实验。在本任务中，将请求式平台降到水表面下，并使小鼠通过自由游泳来寻找该平台。探索实验用来评估动物的绝对记忆，在本文中还可以将其解释为有关平台位置的确信、坚持或确定性。对本实验比较常规的解释是，对于平台位置有着确定记忆的动物，将更坚持在限定位置中进行搜寻，从而在平台附近区域耗费更长时间。
●在探索实验中，有无法找到平台而游向平台区的动力下降的危险。为尽可能的减少这种刺激，应保证人营救的方式不变，以确保在平台不存在的情况下空间状况的一致性。而在游泳60秒钟后，将平台升到恰恰位于水面以下的位置，并由实验者将小鼠引导到平台处，并在将其取走前允许小鼠在上方休息约15秒钟。
在每天的探索实验中，只允许进行一次游泳实验。
每次实验前约60分钟，对小鼠每天施用5ng/kg的NRG-1β-ECD(悬浮于黑色6小鼠血清中，按每只20μL的体积静脉注射提供)或者静脉注射20μL的媒质。
在第一组实验的第1天中，所有的小鼠均仅接受假治疗。然后将小鼠分成神经调节蛋白组与对照组，从而逃逸时间分布在两组中匹配。
在每组实验中随附如下时间表：
第1天提示平台搜索，使用尺寸10cm，并在每次游泳时改变位置的平台。
第2天提示平台搜索，使用尺寸10cm，并在每次游泳时改变位置的平台。
第3天提示平台搜索，使用尺寸10cm，并在每次游泳时改变位置的平台。
第4天提示平台搜索，使用尺寸10cm，且与第三天最后一次位置相同的平台。
第5天隐藏平台搜索，使用尺寸15cm，且相同位置的平台。
第6天隐藏平台搜索，使用尺寸15cm，且相同位置的平台。
第7天隐藏平台搜索，使用尺寸15cm，且相同位置的平台。
第8天隐藏平台搜索，使用尺寸10cm，且相同位置的平台。
第9天探索实验。
第10天隐藏平台搜索，使用尺寸10cm，且相同位置的平台。
第11天隐藏平台搜索，使用尺寸10cm，且相同位置的平台。
第12天隐藏平台搜索，使用尺寸5cm，且相同位置的平台。
第13天隐藏平台搜索，使用尺寸5cm，且相同位置的平台。
第14天隐藏平台搜索，使用尺寸5cm，且相同位置的平台。
第15天探索实验。
在实验前，需要通过使小鼠在无平台存在下自由游泳若干天，以帮助不从之前的实验设置中学习平台位置。
学习速率通过监控以下指标来进行评估：每一训练/测试阶段，并记录动物找到平台的成功率，及其搜索策略的演变，即从沿水池边缘游泳到远离边缘到在有平台的中心区附近搜索的演变。
测量的参数
从动物的视频记录中提取每只小鼠的运动路径，并按一系列x，y，以及时间坐标输出以供进一步的处理。小心仔细地辨认每条移动路径的起始点，并避免移动路径错误。同时，对大量参数进行计算，由此得到与动物学习能力相关的结论(见下)。60秒钟后或当小鼠找到平台时(以较早发生者计)则停止记录参数。作为待从动物的移动路径记录中计算的参数的定义，定义以下区域(见图12)：
为保证评估尽可能的灵活，应用了直径5.5～30cm的4个同心的靶区(以平台为中心)。自动物移动路径记录计算得到的参数包括：
●运动总距离
●总平均速度
●进入水池中心的数量
●在水池中心中的时间
●第一次进入水池中心所用的时间
●第一次进入水池中心所运动的距离
●进入内区的数量
●在内区中的时间
●在内区中运动的距离
●第一次进入内区所用的时间
●第一次进入内区所运动的距离以及靶区1～4以及靶象限中运动的距离
●进入区的数量
●在区中的时间
●在区中运动的距离
●第一次进入区所用的时间
●第一次进入区所运动的距离
●从移动路径起点到最接近区的点的距离
●在区外时，距离区的平均距离
●在区外时，距离区的最短距离
●在区外时，距离区的最短距离所需时间
●接近区的时间
●远离区的时间
●朝向区移动的时间
●远离区移动的时间
●头部进入区的数量
●头部在区中的时间
●头部在区中移动的距离
●第一次头部进入区前所用时间
●在区外时，头部距区的平均距离
●在区外时，头部距区的最小距离
●初始朝向的错误
●平均朝向的错误
●从区出来的数量
每天的实验均对经治疗组与未经治疗组小鼠学习进展的参数进行统计学比较。
在对单个小鼠移动路径的记录检测中，观测人员能够对不能由测定的参数值完全反应的动物自主寻找平台有相当现实的理解。因此，还要由人工对移动路径进行检测，并将动物对平台位置的记忆相关联。
结果
在每天训练前30分钟静脉注射3ng/kg NRG-1β-ECD的动物在学习相关的参数方面显著好于媒质治疗组。
神经调节蛋白不仅改善了学习状况，经治疗的动物还发展出更高级的搜索策略：更多的治疗组动物进入水池内区(11比7，p＝0.019)，进入内区的次数更为频繁(2.17比0.92次，p＝0.02)，在内区耗费的时间以及在内区移动的距离更长(分别为6.51秒钟比2.13秒钟，p＝0.09以及0.64m比0.25m，p＝0.031)。
在Morris水迷宫中进行学习实验的结果总结于图2。
实施例3：精神分裂症：大鼠中由苯丙胺诱导的机能亢进
方法：
根据Costall et al.1978的检测精神抑制活性以及抗帕金森氏症活性的方法使用类似于Boissier及Simon 1966所述的活性测定仪。
在本测试中苯丙胺诱导机能亢进。机能亢进由以边缘水平作用于多巴胺能系统的典型的和非典型的抗精神病药物拮抗，并可作为一种潜在的抗帕金森氏症的药物。
对大鼠注射d-苯丙胺(3mg/kg，静脉)，并立即放置于活性测定仪中。
该活性测定仪由包含于暗箱内的12个带盖的树脂玻璃的笼子(40×25×25cm)组成。在每个笼子两端各装有一个光电管部件，距底面高3cm，以便测定各动物(1只/笼)的从笼子一端运动到另一端的运动次数。在距底面20cm出还安装有两个光电管部件，以便记录进食情况。由计算机每10分钟记录一次活跃度与进食的评分，累计30分钟。
研究每组15只大鼠。进行盲测。
评估了苯丙胺前15分钟静脉施用的8个剂量的测试物质，并与媒质对照组进行比较。本实验还包括了一个未经苯丙胺处理的对照组。
将在相同的实验条件下施用的氟哌啶醇(0.125mg/kg，静脉)作为参照物质。
因此，本实验共包括16组。
通过用非对称t检验比较经治疗组与合适的对照来对数据进行了分析。
结果：
正如图3中所示，NRG-1β-ECD以剂量依赖型方式抑制精神分裂症动物模型中苯丙胺引起的机能亢进。
实验很明显的显示出NRG-1β-ECD的出色特性：
●图3中显示的效果在实验的后半部分(20分钟～40分钟)最强。在前20分钟中，仅仅可见较少的效果，这种延迟的效果表明蛋白的进一步加工。
●所用NRG-1β-ECD的有效浓度比所用经典的对照精神抑制药(如氟哌啶醇(125μg/kg))低了约200～1000倍。
●与氟哌啶醇、氯氮平，奥氮平等相反，未见NRG-1β-ECD存在负面作用，即将实验组动物活性降至媒质对照水平以下。
实施例4：精神分裂症：前冲动抑制
经敲除NRG1基因的啮齿动物显示出了显著受损的前冲动抑制(PPI)，而将NRG1与精神分裂症相联系。PPI破坏被认为是精神分裂症的内在表型，并被广泛的用作动物模型中精神病的替代测量标准。据报道，在精神分裂症与健康对照群中，在大量基因型分析后，有NRG1(rs3924999)上的非同义单核苷酸多态性的错义突变对PPI的神经生理学影响(Hong et al.2007)。我们测试了NRG-1β-ECD对于PPI的影响。目前得到的结果总结如下：
在105dB时，NRG-1β-ECD显示出重建PPI的总体趋势(在150ng/kg、300ng/kg和600ng/kg时分别为+26％、+23％和+36％)，尽管该效果为达到统计学显著，且并未在115dB时观察到。在150ng/kg或300ng/kg、缺乏刺激物时其对自发运动无影响，但在600ng/kg、缺乏刺激物时则显著降低自发运动(在平均强度和峰强度时分别为-20％和-29％，p＜0.05，其类似于阿立哌唑)。NRG-1β-ECD对仅前冲动的反应无影响。
截止目前的结果提示，在大鼠中进行的前冲动抑制(PPI)实验中，对于Propsy100而言，在药剂范围为150～300ng/kg时，对阿朴吗啡引起的PPI短缺无显著影响；在静脉注射600ng/kg时则会减弱自发运动，并趋于重建PPI(由阿朴吗啡引起短缺)。
在这组实验中，在腹膜内注射3mg/kg时，参照物阿立哌唑有着弱但显著的活性，而在同一测试中腹膜内注射10mg/kg时则并非如此。
总之，在所用条件下，NRG-1β-ECD在较高浓度的约600ng/kg表现出影响PPI。这些结果对最近的神经生物学研究中提出了新的解释，暗示(NRG1)可能为导致精神分裂症的重要候选基因之一。
实施例5：对阿尔茨海默氏症动物模型(APPPS dt小鼠)中的学 习和记忆
对脑淀粉样病变的转基因小鼠模型(APPPS小鼠(Meyer-Luehmann et al.2006；Radde et al.2006))重复了在上述对正常小鼠进行的Morris水迷宫测试中用和不用可溶性神经调节蛋白1β胞外结构域(NRG-1β-ECD)测试学习和记忆的动物实验。
同上，每日在训练前30分钟以日剂量的NRG-1β-ECD(在此腹膜内应用了200ng/kg)治疗的动物在与学习相关的参数上显著好于媒质治疗组。
神经调节蛋白不仅改善学习，且经治疗的动物还发展出更高级的搜索策略：更多经治疗的动物进入到水池的内区(12比7，p＝0.009)；更频繁地进入到内区(2.0比0.7次，p＝0.03)；在内区耗费更长时间并在内区移动更长距离(5.3秒钟对2.1秒钟，p＝0.09以及0.7m对0.3m，p＝0.025)。
在Morris水迷宫中用患脑淀粉样病变和阿尔茨海默氏症的APPPS小鼠模型进行的学习实验的结果在图4中总结。
实施例6：神经调节蛋白1-βMPTP帕金森氏症小鼠模型
方法：
使用10周龄的雄性C57Bl/6小鼠作为MPTP(1-甲基-4苯基-1，2，3，6-四氢吡啶)帕金森氏症的模型。
10周龄雄性C57Bl6小鼠(N＝10只/每组)在使用NaCl(对照组)或MPTP(急性以及亚慢性模型)处理后不同时间(0、1、3、7、21天)解剖脑组织(黑质、纹状体、皮质)。方法依照已发表的方法(Hoglinger et al.2007；Hoglinger et al.2004)。
Figure BPA00001161124700231
总计：N＝110
将MPTP粉末溶解于0.9％的NaCl中，腹膜内注射(急应用：4×20mg/kg，间隔时间2小时；慢应用：5×30mg/kg，间隔时间24小时)。注射过程约10秒钟，并在定义的时间点(见表)颈椎脱臼处死动物。实验按照已发表的步骤(Hoglinger et al.2007；Hoglinger et al.2004；Liberatore et al.1999；Przedborski and Vila 2003；Vila andPrzedborski 2003)进行。
最后一次施用MPTP后0天：纹状体多巴胺能神经缺失
最后一次施用MPTP后1天：开始小神经胶质细胞活化
最后一次施用MPTP后3天：小神经胶质细胞活化最大
最后一次施用MPTP后7天：星形胶质细胞活化最大
最后一次施用MPTP后21天：细胞死亡最大
在使用Alzet微型泵脑内输注NRG-1β-ECD和对照肽后21天，进行MPTP处理(急性与慢性)，按立体学原理进行中脑多巴胺能神经元的组织学定量。使用HPLC对纹状体中多巴胺及其代谢物进行生物化学定量。实验按照已发表的步骤(Hoglinger er et al.2007；Hoglinger et al.2004)进行。
  处理   输注  N
  MPTP，急性   NRG-1β-ECD  N＝10
  对照，急性   NRG-1β-ECD  N＝10
  MPTP，慢性   NRG-1β-ECD  N＝10
  对照，慢性   NRG-1β-ECD  N＝10
  MPTP，急性   对照肽  N＝10
  对照，急性   对照肽  N＝10
  MPTP，慢性   对照肽  N＝10
  对照，慢性   对照肽  N＝10
总计：N＝80
结果：
正如在图5所示，多巴胺及其代谢物的HPLC测定结果显示，在MPTP发作期间，对帕金森氏症模型施用NRG-1β-ECD的明显效果。
这些作用都是非经典的：不论在MPTP发作，还是急性或慢性施用NRG-1β-ECD的对照期间，对多巴胺水平均无显著的影响，但对DOPAC和HVA的浓度则表现出了显著而明显的影响。在无MPTP发作时，慢性施用NRG-1β-ECD导致其代谢物明显且显著降低，而在急性方案中，仅观测到轻微的下降。在MPTP发作的慢性情况期间，NRG-1β-ECD导致高香草酸(HVA)显著增加，而此作用在无MPTP发作的情况下更为明显。
这些结果可解释为施用NRG-1β-ECD期间MAO-B的下调和/或COMT的上调。在所应用的条件下观察到对多巴胺能神经元存活的巨大而显著的正面影响。NRG-1β-ECD在本模型中还有高度的神经保护性。由于本组实验使用腹膜内注射，故再次证明了NRG-1β-ECD具有高效的穿过血脑屏障的能力。
图6显示了似乎受了NRG-1β-ECD影响的代谢方案：多巴胺可经MAO-B转化为DOPAC，以及经COMT转化为3-MT；随即由COMT从DOPAC，及由MAO-B从3-MT这两种代谢物产生高香草酸；NRG-1β-ECD施用明显调节两种酶的活性。
更为重要的是图7中显示的，在MPTP帕金森氏症模型中，通过对中脑多巴胺能神经元的组织学定量，清晰的显示出NRG-1β-ECD在神经保护方面明显而显著的效果。立体学方法的描述见于(Liberatore et al.，1999，Przedborski & Vila，2003；Vila &Przedborski，2003；
Figure BPA00001161124700251
 et al.，2004；
Figure BPA00001161124700252
 et al.，2007)等文章。
总而言之，在MPTP帕金森氏症动物模型中有出奇明显而有益的神经保护功效：所述功效再次证明，以极低浓度腹膜内施用NRG-1β-ECD(如20ng/kg)足以达到功效，且NRG-1β-ECD穿过血脑屏障。此外，对多巴胺代谢物的复杂影响(HPLC结果；图5)表明了NRG-1和NRG-1β-ECD对MAO-B以及COMT的调节作用。
实施例7：鉴定NRG-1β-ECD的酸性翻译后亚型作为活性物质
我们已经发表了相关的证据，表明NRG-1β-ECD的特定的翻译后酸性亚型为学习和记忆中的活性形式(Schillo et al.2005a)。在阿尔茨海默氏症的动物模型和阿尔茨海默氏症及帕金森氏症患者的死后脑组织中发现了相似模式。我们得出了该酸性亚型为活性物质的结论。
方法：
为染色蛋白印迹，我们使用了如下抗体：抗-NRG1-ECD，兔多克隆(sc-28916 Lot：I 2905 Santa Cruz；H-210)神经调节蛋白-1(H-210)为兔多克隆抗体，抗人源神经调节蛋白-1亚型HRG-α的N端胞外结构域中21～230位氨基酸。神经调节蛋白-1(H-210)适用于通过蛋白印迹(初始稀释1∶200，稀释范围1∶100～1∶1000)，免疫沉淀[1～2μg/100～500μg的总蛋白(1ml细胞裂解液)]以及免疫荧光发(初始稀释1∶50，稀释范围1∶50～1∶500)来检测小鼠、大鼠及人源的神经调节蛋白-1亚型HRG-α、HRG-α1A、HRG-α2B、HRG-α3、HRG-β1、HRG-β2、HRG-β3(GGF)、GGF2以及SMDF。
第二抗体为：
抗山羊，HRP
sc-2922 Lot：C1405 Santa Cruz
抗兔，HRP
Sc-2054 Lot：G 2005 Santa Cruz
在免疫染色后，我们进行MALDI-TOF及Q-TOF质谱分析来确定NRG-1β-ECD。
如图8所示，我们在脑淀粉样病变以及阿尔茨海默氏症的APPPS小鼠模型中发现了非常相似的模式。在经治疗的APPPS小鼠中NRG-1β-ECD的特定酸性亚型(pI值约为5.0)的浓度显著更高，所述在经治疗的APPPS小鼠也同时是更好的学习者。。
在图8中的两个代表图显示了经治疗的、学习好的动物(上方)以及未经治疗的，学习表现差的动物(下方)。
图9显示了使用已死亡的9个阿尔茨海默氏症患者以及年龄相配的对照的皮质材料的蛋白印迹实验结果。其清楚地表明，NRG-1β-ECD片段在阿尔茨海默氏症病例中的丰度显著较低。作为内部对照，测量了不受疾病相关的记忆丧失影响的NRG-12的丰度。
图9中另一项通过对所用相同的死亡后人脑材料的2维凝胶蛋白印迹(2D-PAGE)来对这种特定的与阿尔茨海默氏症以及与记忆相关的NRG-1β-ECD亚型进行的研究如图10中的代表性实施例所示，其的确是在阿尔茨海默氏症中减少的NRG-1β-ECD的酸性亚型。
结论
我们在此第一次显示了nrg-1基因转录本的翻译后修饰(尤其是由蛋白水解切割产生的截短型)(包含NRG-1β胞外结构域，分子量15～35，pI为4～10)的体内作用的有效证据；更具体地，我们在精神分裂症动物模型中发现了可能基于MAO-B与COMT调节，在浓度为5～600ng/kg(静脉)的精神抑制活性。与以100～1000倍更高浓度使用的对照神经安定药相反，未观察到负面作用。
此外，我们发现在浓度3～300ng/kg(静脉)时，对于MPTP帕金森氏症模型的神经保护作用。
此外我们发现了在相应的学习、脑淀粉样病变以及阿尔茨海默氏症动物模型(Morris水迷宫)中对记忆与学习的正面效果。
鉴于许多现在使用的非典型抗精神病药物的负面影响(Haddadand Sharma 2007)，我们判断可溶性NRG-1-ECD片段(具有SMDF的EGF结构域，NRG-1α，但尤其为NRG-1β)可能作为单独施用或共同施用的，用于治疗精神分裂症、双相型障碍以及抑郁症的药物。
其还可以相同的方式被用于其他中枢神经系统疾病，例如神经退行性疾病，如阿尔茨海默氏症和帕金森氏症、肌萎缩侧索硬化症、多发性硬化、中风、创伤性脑损伤和脊髓损伤。
可溶性NRG-1-ECD蛋白具有如此众多的作用，主要由于其在神经信号转导过程(尤其是介导谷氨酸盐信号转导及兴奋性中毒(在上述提到的所有适应症中有起着中心作用))中所扮演着中心角色(Schrattenholz and Soskic 2006)。
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Claims (27)

1.重组的可溶性神经调节蛋白-1亚型用于制备治疗神经性疾病的药物的用途。
2.权利要求1的用途，用于治疗精神分裂症，特别是精神分裂症的认知相关方面、双相型障碍和抑郁症、帕金森氏症、阿尔茨海默氏症、癫痫、MS、ALS、中风、创伤性脑损伤以及脊髓损伤。
3.权利要求1或2的用途，其中所述神经调节蛋白-1亚型为重组的可溶性人神经调节蛋白-1亚型。
4.权利要求1～3中任一项的用途，其中所述神经调节蛋白-1亚型为神经调节蛋白-1β亚型、神经调节蛋白-1α亚型或SMDF亚型。
5.权利要求4的用途，其中所述神经调节蛋白-1亚型为神经调节蛋白-1β亚型。
6.权利要求1～5中任一项的用途，其中所述神经调节蛋白-1亚型至少包含胞外结构域的一部分。
7.权利要求1～6中任一项的用途，其中所述神经调节蛋白-1亚型具有通过SDS-PAGE测定的约15kD～约35kD的分子量。
8.权利要求1～7中任一项的用途，其中所述神经调节蛋白-1亚型的等电点(pI)为约4～约10，优选约4～约6。
9.权利要求1～8中任一项的用途，其中所述神经调节蛋白-1亚型为经修饰的多肽，其中所述修饰选自：磷酸化、糖基化、甲基化、十四烷基化、氧化及它们的任何组合。
10.权利要求1～9中任一项的用途，与其他药物联用。
11.权利要求10的用途，其中所述其他药物是用于治疗神经性疾病的药物。
12.权利要求11的用途，其中在治疗阿尔茨海默氏症和帕金森氏症、精神分裂症、双相型障碍、抑郁症或其他神经性疾病中的所述其他药物选自：影响儿茶酚胺代谢的化合物、乙酰胆碱酯酶抑制剂，MAO-B-或COMT-抑制剂，美金刚型通道阻断剂、多巴胺或血清素受体激动剂或拮抗剂、儿茶酚胺或血清素再摄取抑制剂或者任何类型的精神抑制药，如氯氮平或奥氮平或加巴喷丁类药物。
13.权利要求10或11的用途，其中所述其他药物是用于治疗精神障碍的药物，如奥氮平或氯氮平；所述精神障碍如精神分裂症、双相型障碍及抑郁症。
14.权利要求10或11的用途，其中所述其他药物是用于治疗帕金森氏症的药物。
15.权利要求10或11的用途，其中所述其他药物是用于治疗阿尔茨海默氏症的药物。
16.权利要求10或11的用途，其中所述其他药物是用于治疗多发性硬化(MS)的药物。
17.权利要求10或11的用途，其中所述其他药物是用于治疗肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的药物。
18.权利要求10或11的用途，其中所述其他药物是用于治疗癫痫的药物。
19.权利要求10或11的用途，其中所述其他药物是用于治疗中风的药物。
20.权利要求10或11的用途，其中所述其他药物是用于治疗创伤性脑损伤的药物。
21.权利要求10或11的用途，其中所述其他药物是用于治疗脊髓损伤的药物。
22.药物组合物或试剂盒，其包含：
(i)重组的可溶性神经调节蛋白-1亚型、以及
(ii)其他的尤其是用于治疗神经性疾病的药物。
23.重组的可溶性神经调节蛋白-1亚型用于制备增强记忆和认知的药物的用途。
24.权利要求21的用途，用于降低和/或抑制与神经性疾病有关的记忆及认知缺失，所述神经性疾病如阿尔茨海默氏症。
25.权利要求21或22的用途，其中所述神经调节蛋白-1亚型如权利要求1～9中任一项所定义。
26.治疗神经性疾病的方法，包括：给有需要的受试者施用药学有效量的重组的可溶性神经调节蛋白-1亚型。
27.增强记忆和认知的方法，包括：给有需要的受试者施用药学有效量的重组的可溶性神经调节蛋白-1亚型。
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