KR100828058B1 - Ｎｏｇｏ 수용체가 매개하는 축삭 성장의 차단 - Google Patents

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Abstract

Nogo 수용체 단백질과 생물학적으로 활성인 Nogo (리간드) 단백질 단편이 개시되어 있다. Nogo 및 Nogo 수용체 단백질의 발현 또는 활성을 조절하기 위한 조성물과 방법 또한 개시되어 있다. Nogo가 매개하는 축삭 신장의 억제를 차단하는 펩티드도 개시되어 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 두개 또는 대뇌 외상, 척수 손상, 뇌졸증 또는 수초탈락 질병의 치료에 유용하다.

Description

ＮＯＧＯ 수용체가 매개하는 축삭 성장의 차단{NOGO RECEPTOR-MEDIATED BLOCKADE OF AXONAL GROWTH}
관련 출원의 전후 참조
본 출원은 본 명세서에서 참고로 인용한 미국 가명세서 특허 출원 제60/175,707호(2000년 1월 12일 출원), 제60/207,366호(2000년 5월 26일 출원), 및 제60/236,378호(2000년 9월 29일 출원)와 관련되어 있다.
미국 정부 지원
본 발명은 부분적으로는 국립 보건원 허가번호 5-R01-NS33020 하에 정부 지원으로 이루어졌다.
발명의 분야
본 발명은 구체적으로 축삭 성장을 조절할 수 있는 Nogo 단백질에 대한 수용체를 암호화하는 신규한 인간 및 쥐 유전자에 관한 것이다. 이들 Nogo 수용체 유전자는 축삭 성장 과정에서 중추신경계의 뉴런의 축삭 및 수상돌기에서 선택적으로 발현된다. 또한 본 발명은 Nogo와 Nogo 수용체의 상호작용을 차단함으로써 Nogo 수용체가 매개하는 축삭 성장의 억제를 선택적으로 차단하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. Nogo와 이의 수용체의 상호작용을 차단하면 Nogo의 축삭 성장에 대한 억제 효과가 차단되어 축삭 성장이 증가하게 된다.
뉴런의 축삭 및 수상돌기는 뉴런으로부터 나온 긴 세포 신장물이다. 신장되는 축삭 또는 신경돌기의 원위 선단에는 생장원추라고 불리우는 분화된 영역이 있다. 생장원추는 국소 환경을 감지하여 뉴런의 표적 세포를 향해 이동하는 일을 담당한다. 생장원추는 손 형상으로서 배아 표면에 차등적으로 부착하는 몇 개의 긴 사상위족을 갖는다. 생장원추는 일부 유도 자극, 예컨대 표면 접착성, 성장 인자, 신경전달물질 및 전기장에 민감할 수 있다. 생장원추에서의 성장 유도는 유착 분자, 세포내 신호와 생장원추를 자극하고 억제하는 인자들에 따라 좌우된다. 생장원추는 다양한 속도(통상은 1∼2 mm/일의 속도)로 성장하고 있는 신경돌기 진행물의 말단에 위치한다. 생장원추는 스파이크(spike)와 같이 신장되는 여러 개의 긴 마이크로스파이크 또는 사상위족이 있는 넓고 평평한 신장물로 구성된다. 이들 사상위족은 연속적으로 활동한다. 일부 사상위족은 생장원추 내로 다시 들어가지만, 다른 사상위족들이 기층을 통해 계속 신장한다. 상이한 사상위족 사이에서의 신장물은 부채형의 막상물(lamellipodia)을 형성한다.
생장원추는 그 앞과 어느 한 측면에 있는 영역을 부채형의 막상물과 사상위족을 이용하여 탐색할 수 있다. 신장물이 불리한 표면과 접촉하게 되면, 생장원추는 움츠려든다. 신장물이 유리한 표면과 접촉하게 되면, 계속 신장하고 생장원추를 조작하여 그 방향으로 이동하게 할 수 있다. 따라서, 생장원추는 기층의 표면 특성의 사소한 차이에 의해서도 유도될 수 있다. 생장원추가 적절한 표적 세포에 도달하면 시냅스 연결이 생긴다.
외상 및 질병으로 인한 손상이 있은 후에 손상된 뉴런은 중추신경계(CNS)에서 재생되지 않는다. 손상 후에 축삭이 재생되지 않는 것은 축삭 성장 억제제가 존재하기 때문일 수 있다. 이들 억제제는 주로 수초와 관련이 있으며 재생에 대한 중요한 차단제를 구성한다. 축삭 성장 억제제는 CNS계 수초와, CNS에서 수초를 합성하는 희소돌기아교세포의 혈장막에 존재한다(Schwab 등, (1993) Ann.Rev.Neurosci. 16, 565-595).
CNS 수초는 희소돌기아교세포의 세포막의 정교한 신장물이다. 하나의 희소돌기아교세포는 30개의 다른 CNS 축삭 분절과 같이 많은 수초를 형성한다. 희소돌기아교세포 막 신장물은 동심원 방식으로 축삭 주변을 둘러싸서 수초(myelin sheath)를 형성한다. 치밀하게 밀집되어 있는 성숙 수초는 수화된 단백질층과 나란히 있는 평행 이분자 지질층으로 구성된다. 활성 수초 합성은 태내에서 개시되어 사람의 일생 중 처음 2년 동안 계속된다. 더욱 느린 활성 수초의 합성이 유년기와 사춘기에 지속되지만, 성숙 수초의 전환은 성인 일생을 통해 느린 속도로 계속된다. 발생중인 수초 형태 및 성숙 수초 형태는 질병이나 물리적 외상으로부터 손상받기 쉬워서, 축삭을 둘러싸고 있는 수초가 분해된다.
수초 관련 억제제가 축삭 연속성의 중단 후에 생체내에서 CNS 축삭 재생을 방해하는 주요 원인인 것으로 보이지만, CNS의 다른 비수초 관련 축삭 성장 억제제도 다소의 역할을 할 수 있다. 이들 억제제는 외상, 뇌졸증 또는 바이러스 감염으로 인한 뉴런 손상 후에 축삭 재생을 차단한다.
수초 유래의 다수의 축삭 성장 억제제가 특성 규명되어 있다(예컨대, David 등, (1999) W0995394547; Bandman 등, (1999) 미국 특허 제5,858,708호; Schwab, (1996) Neurochem. Res. 21, 755-761 참조). CNS 백질, NI35, NI250(Nogo) 및 수초 관련 당단백질(MAG)의 일부 성분이 개시되어 있으며, 이들 성분은 축삭 신장물에 대한 억제 활성을 갖는다(Schwab 등, (1990) W09005191; Schwab 등, (1997) 미국 특허 제5,684,133호 참조). 특히, Nogo는 250 kDa의 수초 관련 축삭 성장 억제제로서, 클로닝되고 특성 규명되었다(Nagase 등, (1998) DNA Res. 5, 355-364; Schwab, (1990) Exp. Neurol. 109, 2-5). Nogo cDNA는 뇌 cDNA의 무작위 분석으로 처음 동정되었으나, 기능은 제안된 바가 없다(Nagase 등, (1998) DNA Res. 5, 355-364).
Schwab 및 그 연구진들은 추정 소 NI250(Nogo) 단백질의 단백질 분해로부터 무작위적으로 유도된 6개의 펩티드 서열을 공개하였다(Spillmann 등, (1998) J. Biol. Chem. 273, 19283-19293). 이 단백질에 대해 가능한 전길이 cDNA 서열이 최근 젠뱅크에 기탁되었다. 4.1 kb의 인간 cDNA 클론인 KIAA0886은 무작위 고분자량 뇌 유래의 cDNA를 서열결정하려는 카주사 DNA 조사 연구소의 노력으로 얻어졌다(Nagase 등, (1998) DNA Res. 31, 355-364). 이 신규 cDNA 클론은 소 Nogo로부터 유도된 모두 6개의 펩티드 서열을 포함하는 135 kDa 단백질을 암호화한다.
인간 Nogo-A 서열은 그 카르복실 말단의 1/3에 걸쳐 레티쿨론(Rtn) 단백질과(科)와 높은 상동성을 공유한다. Rtn1은 신경내분비 세포에서만 발현되기 때문에 신경내분비 특이적 단백질(NSP)이라고 불려왔다(Van de Velde 등, (1994) J. Cell. Sci. 107, 2403-2416). 모든 Rtn 단백질은 단백질의 카르복실 말단에서 200개의 아미노산 잔기로된 서열 유사성 영역을 공유한다(Van de Velde 등., (1994) J. Cell. Sci. 107, 2403-2416; Roebroek 등, (1996) Genomics 32, 191-199; Roebroek 등, (1998) Genomics 51, 98-106; Moreira 등, (1999) Genomics 58, 73-81; Morris 등, (1991) Biochim. Biophys. Acta 1450, 68-76). 관련 서열이 파리와 연충 게놈에서 확인되었다(Moreira 등, (1999) Genomics 58, 73-81). 이 영역은 Rtn과와 약 70% 동일하다. 아미노 말단 영역은 서로 연관성이 없으며, 각종 대체 RNA 스플라이싱 사건으로부터 유도된다.
젠뱅크에 기탁된 서열 분석과 공개된 Rtn1 이소형과의 상동성으로부터, Nogo 단백질의 3가지 형태가 추정된다(Nogo-A, Nogo-B, Nogo-C). 37 kDa의 Nogo-B는 아마도 NI35에 해당하는 것으로 보이며, NI35 및 NI250 (Nogo-A) 축삭 성장(outgrowth) 억제 활성의 항원성 연관을 해명한다. Nogo-C-Myc는 SDS-PAGE에 의한 전기영동 이동성이 25 kDa으로서, 이전에 Rtn4 및 vp2015로서 개시된 바 있다. Nogo-A 단백질이 축삭 재생을 억제하는 능력은 최근에 와서야 인지되었다(GrandPre 등, (2000) Nature 403, 439-444; Chen 등, (2000) Nature 403, 434-439; Prinjha 등, (2000) Nature 403, 483-484).
손상 후에 CNS 병변에서 축삭이 재신장되지 않는 것이 외상, 뇌졸증 및 수초탈락 질병과 관련된 영구적인 유해 작용의 원인으로서 생각된다. NI250의 조절은, 외상, 경색 및 CNS의 퇴행성 질환(Schwab 등, (1994) W09417831; Tatagiba 등, (1997) Neurosurgery 40, 541-546), 뿐 아니라 신경교아종과 같은 CNS의 악성 종양(Schwab 등, (1993) 미국 특허 제5,250,414호; Schwab 등, (2000) 미국 특허 제6,025,333호)으로 손상된 뉴런의 재생 치료용 수단으로서 개시되어 있다.
NI250을 인식하는 항체는 외상, 경색 및 CNS의 퇴행성 질병으로부터 생긴 신경 손상의 진단 및 치료에 유용한 것으로 보고되어 있다(Schnell & Schwab, (1990) Nature 343, 269-272; Schwab 등, (1997) 미국 특허 제5,684,133호). 수초형성되는 축삭에서, 수초 발생과 Nogo의 출현 사이에는 상관관계가 있다. Nogo가 항체에 의해 차단된 후에, 신경 손상에 의해 유발된 병변에서 뉴런이 다시 신장될 수 있다(Varga 등, (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 10959-10963).
Nogo가 축삭 성장을 억제하는 작용 기전은 아직 해명되지 않았다. 이 작용 기전과 Nogo의 효과와 관련된 생화학적 경로의 확인 및 특성 규명은 축삭 손상 및 축삭 수초탈락과 관련된 질병 상태의 치료에 유용할 것이다.
본 발명은 Nogo 수용체 단백질 및 생물학적으로 활성인 Nogo 단백질 (리간드) 단편의 발견에 기초한 것이다. 본 발명은 서열 번호 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18 또는 20의 아미노산 서열을 암호화하는 분리된 핵산 분자; 서열 번호 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18 또는 20의 6개 이상, 예컨대 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 40개, 50개, 60개 또는 70개 아미노산의 단편을 암호화하는 분리된 핵산 분자; 고엄중 조건 하에서 서열 번호 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17 또는 19의 보체를 포함하는 핵산 분자에 하이브리드화하는 분리된 핵산 분자; 서열 번호 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17 또는 19와 적어도 75%, 예컨대 80%, 85%, 90% 또는 95% 아미노산 서열 동일성이 있는 분리된 핵산 분자로 구성된 군에서 선택된 분리된 핵산 분자를 제공한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 166 내지 1584 또는 서열 번호 3의 뉴클레오티드 178 내지 1596을 포함하는 분리된 핵산 분자를 포함한다.
본 발명은 분리된 핵산 분자를 포함하는 벡터를 비롯하여, 하나 이상의 발현 제어 성분에 작동가능하게 결합된 핵산 분자를 추가로 포함한다. 또한 본 발명은 본 발명의 핵산 분자를 포함하도록 형질전환된 숙주 세포와, 단백질이 발현되는 조건 하에서 본 발명의 핵산 분자로 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 단백질의 제조 방법을 포함한다.
본 발명은 서열 번호 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18 또는 20의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드; 서열 번호 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18 또는 20의 6개 이상, 예컨대 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 40개, 50개, 60개 또는 70개의 아미노산 단편을 포함하는 분리된 폴리펩티드; 1개 이상, 예컨대 5개, 10개, 15개 또는 20개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 서열 번호 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18 또는 20의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드; 1개 이상, 예컨대 5개, 10개, 15개 또는 20개의 자연 발생 아미노산 서열 치환을 포함하는 서열 번호 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18 또는 20의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드; 및 서열 번호 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18 또는 20과 적어도 75%, 예컨대 80%, 85%, 90% 또는 95% 아미노산 서열 동일성이 있는 분리된 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택된 분리된 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명은 서열 번호 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18 또는 20의 아미노산 서열을 포함하는 키메라 폴리펩티드도 포함한다.
본 발명은 Nogo 단백질에 결합하는 항체와 Nogo 수용체 단백질에 결합하는 항체를 추가로 제공한다. 항체는 모노클론 또는 폴리클론 항체일 수 있다. 또한, 항체는 인간화될 수 있다. 또한 본 발명은 항원 결합 활성을 나타내는 항체 단편을 포함한다.
본 발명은 Nogo 단백질 또는 Nogo 수용체 단백질을 발현하는 세포를 제공하는 단계; 세포를 후보 제제와 접촉시키는 단계; 및 후보 제제의 부재 하에 Nogo 단백질 또는 Nogo 수용체 단백질 발현 수준과 비교하여 후보 제제의 존재 하에 Nogo 단백질 또는 Nogo 수용체 단백질 발현 수준의 증가 또는 감소를 검측하는 단계를 포함하여 Nogo 단백질 또는 Nogo 수용체 단백질 발현을 조절하는 제제를 확인하는 방법을 포함한다.
또한 본 발명은 Nogo 단백질 또는 Nogo 수용체 단백질을 발현하는 세포를 제공하는 단계; 그 세포를 후보 제제와 접촉시키는 단계; 및 후보 제제의 부재 하에 Nogo 단백질 또는 Nogo 수용체 단백질의 활성 수준과 비교하여 후보 제제의 존재 하에 Nogo 단백질 또는 Nogo 수용체 단백질의 활성 수준의 증가 또는 감소를 검측하는 단계를 포함하여 Nogo 단백질 또는 Nogo 수용체 단백질의 1 이상의 활성을 조절하는 제제를 확인하는 방법을 포함한다. 본 발명의 일 구체예에서, 활성은 생장원추 이동이다. 다른 구체예에서, 제제는 Nogo 단백질 단편, 항-Nogo 항체 및 항-Nogo 수용체 항체로 구성된 군에서 선택된다.
또한 본 발명은 Nogo 수용체 단백질을 제공하는 단계; Nogo 수용체를 후보 결합 파트너와 접촉시키는 단계; 및 Nogo 수용체 단백질에 대한 후보 결합 파트너 의 결합을 검측하는 단계를 포함하는 Nogo 수용체 단백질에 대한 결합 파트너를 확인하는 방법을 포함한다. 일 구체예에서, 결합 파트너는 Nogo 단백질 단편, 항-Nogo 항체, 항-Nogo 수용체 항체 단편, 및 인간화된 항-Nogo 수용체 항체로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명은 Nogo 단백질 또는 Nogo 수용체 단백질의 발현을 조절하는 제제의 유효량을 투여하는 단계를 포함하여 포유류의 중추신경계 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 본 발명의 일부 구체예에서는 발현이 감소되지만, 다른 구체예에서는 발현이 증가된다.
또한, 본 발명은 Nogo 단백질 또는 Nogo 수용체 단백질의 활성을 조절하는 제제의 유효량을 투여하는 단계를 포함하여 포유류의 중추신경계 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 활성은 증가될 수도 있고 감소될 수도 있다. 활성이 감소되는 경우, 제제는, 예컨대 서열 번호 8, 10, 12, 18 또는 20의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 전길이 Nogo 수용체 단백질; Nogo 수용체 단백질 단편; 가용성 Nogo 수용체 단백질 단편; 또는 항-Nogo 수용체 항체 또는 이의 활성 단편일 수 있다. 활성이 증가된다면, 제제는 서열 번호 14 및 16으로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드이다.
가용성 Nogo 수용체 단백질은 서열 번호 2 또는 4의 6개 이상, 예컨대 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 40개, 50개, 60개 또는 70개의 아미노산 단편; 서열 번호 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18 또는 20의 아미노산 서열; 1개 이상, 예컨대 5개, 10개, 15개 또는 20개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 서열 번호 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18 또는 20의 아미노산 서열; 1개 이상, 예컨대 5개, 10개, 15개 또는 20개의 자연 발생 아미노산 서열 치환을 포함하는 서열 번호 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18 또는 20의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 중추신경계 질환은 두개골 또는 대뇌 외상, 척수 손상, 뇌졸증 또는 수초탈락 질병으로부터 생긴 것이다. 수초탈락 질병의 예로는 다발성 경화증, 단상성 수초탈락, 뇌척수염, 다병소성 백질뇌증, 범뇌염, 마르키아파바-비냐미병, 교탈수초증, 부신 백질 이영양증, 펠리체우스-메르츠바허병, 해면 변성(Sponge degeneration), 알렉산더병, 카나반병, 이염성 백질 이영양증 및 크라베병이 있다.
또한, 본 발명은 Nogo 수용체 단백질에 특이적으로 결합하는 분리된 펩티드를 포함한다. Nogo 수용체 단백질에 대한 펩티드의 특이적 결합은 바람직하게는 다음에 개시한 효과들 중 하나 이상의 효과를 나타낸다: Nogo 수용체 단백질에 대한 Nogo 단백질의 결합 억제, Nogo가 매개하는 축삭 성장의 억제 차단, Nogo 단백질 발현의 조절 또는 Nogo 수용체 단백질 발현의 조절. 일부 구체예에서, 분리된 펩티드는 서열 번호 8, 10, 12, 14, 16, 18 또는 20의 아미노산 서열, 또는 1개 이상, 예컨대 5개, 10개, 15개 또는 20개의 보존적 아미노산 치환이나 자연 발생 아미노산 치환을 보유한 전술한 서열 중 하나를 포함한다.
도 1- Nogo 도메인의 비교
(a)는 본 연구에 이용된 Nogo 단백질의 특징을 요약한 개략도이다. (b)는 아미노-Nogo 또는 GST-Nogo-66으로 코팅하거나 또는 단백질로 코팅하지 않은 표면에서 배양하고 섬유상 액틴으로 염색한 NIH-3T3 섬유아세포의 사진이다(눈금 막대, 40 ㎛). (c)는 아미노-Nogo 또는 GST-Nogo-66으로 코팅하거나 또는 단백질로 코팅하지 않은 표면(기질-결합형), 또는 100 nM Nogo 단백질로 코팅한 표면(가용성)에서 배양한 병아리 E12 배근 신경절의 사진이다(눈금 막대, 40 ㎛). (d)는 정제된 아미노-Nogo-Myc-His 단백질에 대해 SDS-PAGE를 실시하고 코마시 브릴리언트 블루(CBB)로 염색하거나 또는 항-Myc 항체(Myc)로 면역블롯한 겔 및 면역블롯의 사진이다(200, 116, 97, 65 및 45 kDa의 분자량 마커는 좌측에 있다). (e)는 면적이 1200 ㎛2(확산(spread))보다 큰 3T3 섬유아세포의 비율을 Nogo 코팅된 표면(빗금)에서 또는 가용성 100 nM Nogo 제제(흰색)를 이용하여 (b)에서와 같이 실험으로부터 측정한 실험 데이트를 나타낸 그래프이다(AM, 아미노-Nogo; AM+Myc, 항-Myc 항체와 함께 사전 배양한 아미노-Nogo; AM+Myc+Mo, 항-마우스 IgG 항체와 함께 사전 배양한 AM+Myc; Myc+Mo, 항-Myc 항체 + 항-쥐 IgG 항체). (f)는 Nogo 코팅된 표면에서 또는 가용성 100 nM Nogo 제제와 함께 배양한 후에 COS-7 세포의 확산 비율을 측정한 실험 데이타를 나타낸 그래프이다. (g)는 생장원추 형태에 대한 정제된 GST-Nogo-66 또는 아미노-Nogo 제제의 효과를 30분 후에 지정된 농도에서 E12 배근 신경절 배양물에서 평가한 실험 데이타를 나타낸 그래프이다. 이는 분석에서 GST-Nogo-66이 아미노-Nogo보다 2배 더 강력하다는 것을 입증한다. (h)는 E13 배근 신경절 배양물에서 세포당 신경돌기 성장을, Nogo-코팅된 표면에서 또는 가용성 100 nM Nogo 제제를 이용하여 (c)에서와 같은 실험으로부터 정량한 실험 데이타를 도시한 그래프이다. (i)는 소뇌 과립 뉴런에서 신경돌기 성장에 대한 Nogo 제제의 효과를 측정한 실험 데이타를 도시한 그래프이다.
도 2- Nogo 단편은 Nogo 및 CNS 수초 작용에 대해 길항작용을 한다
(a)는 도 4에 도시된 바와 같이 평가된 생장원추 수축(collapse)과 배양된 병아리 E 12 배근 신경절 외식편의 사진이다. 배양물을 하기에 개시된 제제에 30분 동안 노출시킨 다음 로다민-팔로이딘으로 고정 및 염색하였다: 완충액(대조군); 15 nM GST-Nogo(Nogo); Pepl, Pep2 및 Pep3 각각 1 μM(Pep); GST-Nogo 15 nM + Pep1, Pep2 및 Pep3 각각 1 μM(Nogo + Pep). Nogo에 의한 생장원추 수축은 펩티드를 첨가하면 차단된다는 점에 주목. Pep1, 세포외 도메인의 잔기 1-25; Pep2, 11-35; Pep3, 21-45. (b)는 (a)에서와 같이 생장원추 수축 분석으로부터 얻은 결과를 정량하는 그래프이다. 각각의 펩티드는 4 μM에서 배양하였고, 펩티드 1-3 혼합물은 각 펩티드 1 μM을 함유하였다. CNS 수초는 개시된 바와 같이 제조하였고 지정된 농도의 총 수초 단백질이 배양물 중에 포함되어 있었다. 모든 결과는 4∼7회 측정으로부터 계산된 평균 ±s.e.m.이다. 동일한 농도의 Nogo 또는 수초를 이용하지만 펩티드를 사용하지 않은 해당 값과는 상당히 다른 값이 주어진다(별표, p<0.05, 스튜던츠 2-테일드 t-테스트).
도 3- Nogo 길항제 Pep2-41
(a)는 병아리 E12 배근 신경절 생장원추 수축 분석 결과를 나타내는 그래프이다. 이들 분석은 문헌[GrandPre 등, (2000) Nature 403, 439-444]에 개시된 바와 같이 실시 및 정량하였다. 무첨가(대조군), 15 nM GST-Nogo(Nogo) 또는 15 nM GST- Nogo + 1 μM Pep2-41(Nogo+Pep)을 이용하여 분석을 실시하였다. 이 값은 4회 측정으로부터 계산된 평균 ±s.e.m.이다. (b)는 Pep2-41의 지정 농도를 첨가하여 도 4에 도시된 바와 같이 10 nM AP-Nogo의 병아리 E12 배근 신경절 뉴런에 대한 결합을 측정한 결합 실험의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4- Nogo Pep2-41은 Nogo 및 CNS 수초에 의한 신경돌기 성장의 억제를 방지한다
이 도면은 지정된 농도의 Pep-41, 정제된 GST-Nogo(GST-Nogo-66) 단백질 및 미정제 CNS 수초 단백질의 존재하에 뉴런을 배양한 성장 분석 결과를 도시하는 그래프이다. 병아리 E13 배근 신경절 뉴런을 표준 조건 하에 배양하였다. 성장 분석을 위해서, 지정된 농도의 Pep2-41, 정제된 GST-Nogo(GST-Nogo-66) 단백질 및 미정제 CNS 수초 단백질의 존재하에 뉴런을 배양하였다. 그 결과는 Pep2-41이 GST-Nogo 또는 총 CNS 수초에 의한 신경돌기 성장의 억제를 역전시킬 수 있음을 입증한다.
도 5- 축삭 Nogo 수용체에 대한 리간드 결합 분석
(a)는 His-AP-Nogo(66 아미노산) 단백질이 HEK293T 세포에서 발현되고, His 태그를 통해 니켈 함유 수지 상에서 컨디셔닝된 배지로부터 정제한 겔 및 면역블롯의 사진이다. 정제된 단백질에 대해 SDS-PAGE를 실시하고, CBB로 총 단백질을 염색하거나 또는 항-Nogo 항체(항-Nogo)로 면역블롯팅하였다. 분자량 마커 200, 116, 97, 65 및 45 kDa은 좌측에 도시되어 있고, AP-Nogo의 이동은 우측에 표시되어 있다. (b)는 10 nM AP-Nogo 또는 10 nM AP-Nogo + 160 nM GST-Nogo와 함께 23℃에서 60분 동안 항온배양한 분리된 병아리 E12 배근 신경절 뉴런의 사진이다. 세포를 세척하고, 고정하고, 60℃에서 배양하여 내인성 AP를 불활성화시켰다. 니트로 블루 테트라졸륨과 함께 항온배양하여 결합된 AP-Nogo를 검출하였다. 비표지된 리간드로 대체된 AP-Nogo에 의한 강한 뉴런 염색에 주목. (c)는 E12 병아리 배근 신경절 생장원추 수축 분석에서 AP-Nogo 및 GST-Nogo의 효능을 실시예 부분에서 설명한 바와 같이 평가한 실험 데이타를 나타내는 그래프이다. AP-Nogo의 EC50은 1 nM 이하로 측정되었다. 5∼8회의 측정으로부터 계산된 평균 ±s.e.m.이 예시되어 있다. (d)는 10 nM AP-Nogo의 병아리 E12 배근 신경절 뉴런에 대한 결합을 단독으로, 또는 100 nM GST-Nogo의 존재하에 또는 4 μM Pep2의 존재하에 평가하여, 실시예 부분에 개시된 방법으로 (b)에서와 같은 실험으로부터 정량한 실험 데이타를 나타내는 그래프이다. 8회 측정으로 계산된 평균 ±s.e.m.이 제시되어 있다. (e)는 AP-Nogo의 배근 신경절 뉴런에 대한 결합을 AP-Nogo 농도의 함수로서 측정한 실험 데이타를 나타내는 그래프이다. 이 그래프는 유사한 결과를 나타내는 6회 실험 결과중 하나이다. (f)는 Scatchard 분석을 위해 재플롯한 (e)로부터 얻은 데이타를 요약한 그래프이다. AP-Nogo의 E12 병아리 배근 신경절 뉴런에 대한 겉보기 Kd는 3 nM이다.
도 6- Nogo 수용체를 발현하는 COS-7에 대한 Nogo 결합
이 도면은 쥐 Nogo 수용체를 암호화하는 발현 벡터로 형질감염시킨 COS-7 세포의 사진이다. 형질감염 2일 후에, 배근 신경절 뉴런에 대해 실시예 부분에 개시된 바와 같이 AP-Nogo 또는 AP의 결합을 평가하였다. AP-Nogo의 Nogo 수용체를 발 현하는 세포에 대한 선택 결합에 주목하라. AP에 융합되지 않은 과량의 Nogo 펩티드가 존재하면 결합이 상당히 감소된다.
도 7- Nogo 수용체의 구조
이 개략도는 Nogo 수용체의 주요 구조 특징을 예시한다.
도 8- Nogo 수용체 mRNA의 분포
이 도면은 좌측의 지정된 쥐 조직으로부터 얻은 폴리A+RNA 샘플과 우측의 각종 래트 뇌 영역으로부터 얻은 총 RNA 샘플에 대한 Nogo 수용체 mRNA의 노던 블롯 사진이다. RNA 크기 마커의 이동은 좌측에 도시되어 있다.
도 9- Nogo-66 수용체 면역조직학
(a)는 지정된 세포 또는 병아리 조직으로부터 얻은 막 분획(10 ㎍ 단백질)을 항-Nogo-66 수용체 면역블롯으로 분석한 면역블롯의 사진이다(kD 단위의 분자량 마커는 우측에 있다). (b)는 항-Nogo-66 수용체, 항-Myc 또는 희소돌기아교세포 특이적 O4 항체로 염색된 병아리 E5 척수 외식편(시험관내 8일) 또는 Myc-Nogo-66 수용체를 발현하는 COS-7 세포의 사진이다. 아래 3개의 패널은 동일한 시계의 이중 표지 면역조직화학을 도시한다(눈금 막대, 상부 3개의 패널에 대해서는 40 ㎛이고 하부 3개의 패널에 대해서는 80 ㎛이다). (c)는 항-Nogo-66 수용체 제제로 염색한 성체의 뇌 또는 척수를 파라포름알데히드로 고정한 진동박편기(vibratome) 절편의 사진이다. 이는 뇌교와 척수 모두에서 축삭 프로필(화살표)의 염색을 입증한다. 염색은 10 ㎍/㎖ GST-Nogo-66 수용체 항원의 존재하에 급격히 감소된다.
도 10- Nogo-66 수용체는 Nogo-66에 의한 생장원추 수축을 매개한다
(a)는 PI-PLC 또는 완충액으로 사전 처리한 후에 Nogo-66에 노출된 병아리 E12 DRG 외식편의 사진이다. 축삭에서의 F-액틴의 염색이 예시되어 있다(눈금 막대, 40 ㎛). (b)는 3 nM AP 또는 AP-Nogo의 병아리 E12 배근 신경절 분리된 뉴런에 대한 결합의 실험 결과를 요약한 그래프이다. 지정된 곳에서 배양물을 PI-PLC로 사전처리하거나 또는 150 nM GST-Nogo-66을 AP-Nogo와의 배양물에 포함시켰다. (c)는 (a)에서와 같은 실험으로부터 생장원추 수축 측정을 요약한 그래프이다. 병아리 E12 DRG 배양물을 PI-PLC로 처리 또는 미처리한 후에 30 nM GST-Nogo-66 또는 100 pM Sema3A에 노출시켰다. (d)는 대조군 바이러스(HSV-PlexinA1) 또는 HSV-Myc-Nogo-66 수용체로 감염된 후 Nogo-66의 존재 또는 부재하에 항온배양된 E7 망막 신경절 세포 외식편의 사진이다. 축삭 생장원추의 팔로이딘 염색이 예시되어 있다(눈금 막대, 25 ㎛). (e)는 (d)에서와 같이 바이러스 감염된 E7 망막 뉴런, 또는 감염되지 않은 망막 뉴런에서의 생장원추 수축을 정량한 그래프이다.
도 11- Nogo-66 수용체의 구조-기능 분석
(a)는 상이한 Nogo-66 수용체 결실 돌연변이체의 개략도이다. 이들 돌연변이체를 면역블롯에 의한 발현 수준과 AP-Nogo 결합에 대해 분석하였다. 류신 풍부 반복부와 류신 풍부 반복 카르복시 말단이 Nogo 결합에 필요하지만 나머지 단백질은 필요하지 않다는 점에 주목해라. 정제 및 고정 후에 제2 단백질을 시험하였다. (b)는 Nogo-66 수용체의 처음 7개 류신 풍부 반복부에 대한 추정 입체 구조의 도면이다. 이는 류트로핀 수용체 중 관련된 류신 풍부 반복부의 추정 구조를 기초로 하여 컴퓨터 모델링으로부터 유도된다(Jiang 등, (1995) Structure 3, 1341-1353). 모델 링은 www.expasy.ch/spdbv.에서 스위스-모델로 실시된다. 베타 병풍 및 알파 나선 2차 구조를 갖는 영역이 지시되어 있다.
도 12- 가용성 Nogo 수용체는 Nogo-66을 차단한다
병아리 E13 DRG 뉴런을 표준 조건하에서 배양하였다. 생장원추 수축 분석에서, 쥐 Nogo 수용체의 1-348 아미노산 엑토도메인 단편을 분비하는 HEK 293T 세포의 조정 배지 또는 대조군 조정 배지를 100 nM Nogo-66과 함께 첨가하였다. 하부 좌측 패널에서 그래프의 데이타는 Nogo가 유도하는 수축이 가용성 수용체 단편에 의해 차단됨을 입증한다. 성장 분석에서, Nogo-66 단백질(50 nM) 또는 중추신경계 수초(15 ㎍ 총 단백질/㎖)와 함께 대조군 또는 Nogo 수용체 엑토도메인 조정 배지의 존재 하에 뉴런을 배양하였다. 상부 4개의 패널에는 중추신경계 수초가 성장을 억제하고 이것이 Nogo 수용체 엑토도메인 단백질의 존재에 의해 차단된다는 것을 입증하는 사진이 제시된다. 성장은 하부 우측 패널의 그래프에 정량되어 있다.
발명의 상세한 설명
I. 정의
달리 정의하지 않는다면, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 업자들에게 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 개시된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료를 본 발명의 실시 또는 시험에 사용할 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 기재되어 있다.
본 명세서에서 사용한 용어 "축삭"은 뉴런으로부터 나온 긴 세포 돌출부를 의미하는데, 이에 의한 도출성(외향성) 작용 퍼텐셜이 세포체를 표적 세포로 안내한다.
본 명세서에서 사용한 용어 "축삭 성장"은 세포체에서 기원하고 생장원추 뒤에 있는 축삭 또는 긴 돌기의 신장을 의미한다.
본 명세서에서 사용한 용어 "중추신경계 질환"은 중추신경계(CNS)의 이상 기능과 관련된 임의의 병리 상태를 의미한다. 이 용어는 뇌 조직에 대한 물리적 외상, 바이러스 감염, 자가면역 기전, 유전자 변이 및 신경변성 질병 또는 질환으로부터 생긴 변형된 CNS 기능을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용한 용어 "키메라 단백질"은 아미노산 수준에서 야생형 서열과의 상동성이 완전하지 않거나, 또는 2개의 별개의 핵산 공급원의 스플라이싱으로부터 유도된 핵산이 암호화하는 임의의 폴리펩티드를 나타낸다. 이 용어는 아미노산 서열이 야생형 서열과 구별되는 1개 이상의 아미노산 치환을 함유하도록 고안된 융합 단백질(들)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용한 용어 "수초탈락 질병"은 희소돌기아교세포막의 수초 분해를 특징으로 하는 병리 질환을 의미한다.
본 명세서에서 사용한 용어 "생장원추"는 국부 환경을 감지하여 축삭의 적절한 시냅스 표적 세포로의 이동을 담당하는 성장 신경돌기의 선단에 위치하는 분화된 영역을 말한다.
본 명세서에서 사용한 용어 "생장원추 이동"은 뉴런 표적 세포를 향한 생장 원추의 신장(extension) 또는 수축(collapse)을 의미한다.
본 명세서에서 사용한 용어 "신경돌기"는 뉴런으로부터 성장하는 돌기를 의미한다. 배양물에서 수상돌기를 축삭과 구별하기 어려울 때가 종종 있기 때문에, 신경돌기는 양자의 의미로 사용된다.
본 명세서에서 사용한 용어 "희소돌기아교세포"는 CNS 축삭의 수초형성 기능을 담당하는 CNS의 신경교 세포를 의미한다.
본 명세서에서 사용한 용어 "폴리펩티드"란 가수분해시 폴리펩티드에 포함된 아미노산 수에 따라서 트리펩티드, 테트라펩티드 등으로 불리우는, 2개 이상의 아미노산을 산출하는 펩티드를 말한다. 용어 "폴리펩티드"는 명세서 전반에 걸쳐 용어 "단백질" 및 "펩티드"와 유사어로 사용된다.
II. 구체적 양태들
A. Nogo 수용체 단백질과 Nogo 수용체 단백질용 펩티드 제제
본 발명은 분리된 단백질, 단백질의 대립유전자 변형체 및 단백질의 보존적 아미노산 치환체를 제공한다. 본 명세서에서 사용된 단백질 또는 폴리펩티드는 서열 번호 2에 제시된 인간 아미노산 서열 또는 서열 번호 4에 제시된 쥐 아미노산 서열을 갖는 Nogo 수용체 단백질을 의미한다. 단백질 또는 폴리펩티드는 서열 번호 8, 10, 12, 14, 16, 18 및 20에 제시된 아미노산 서열을 보유하는 Nogo 수용체 펩티드 제제로서 확인된 펩티드를 의미한다. 또한, 본 발명은 상기 구체적으로 인용한 것과 아미노산 서열이 약간 다른 자연 발생적 대립유전자 변형체 및 단백질을 포함한다. 대립유전자 변형체는 상기 인용한 것과 약간 다른 아미노산 서열을 보유 하더라도, 서열 번호 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18 및 20에 제시된 인간 및 쥐 Nogo 수용체 단백질 및 Nogo 수용체 펩티드 제제와 관련된 동일하거나 유사한 생물학적 기능을 여전히 보유한다.
본 명세서에서 사용된 Nogo 수용체 단백질과 관련된 단백질과는 인간 및 마우스 이외의 유기체로부터 분리된 단백질을 의미한다. Nogo 수용체 단백질과 관련된 단백질과의 다른 구성원을 동정 및 분리하는 데 사용되는 방법은 후술되어 있다.
본 발명의 Nogo 수용체 단백질 및 펩티드 제제는 분리형으로 존재하는 것이 바람직하다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 물리적, 기계적 또는 화학적 방법을 이용하여 단백질과 정상적으로 회합되어 있는 세포 구성성분들로부터 단백질을 제거한 경우, 단백질 또는 리간드는 분리되어 있는 것으로 간주된다. 당업자는 표준 정제 방법을 용이하게 사용하여 분리된 단백질 또는 리간드를 얻을 수 있다.
본 발명의 단백질은 본 명세서에 개시된 단백질 및 리간드의 보존적 변형체를 추가로 포함한다. 본 명세서에서 사용된 보존적 변형체란 단백질의 생물학적 기능에 불리한 영향을 주지 않는 아미노산 서열에서의 변형을 말한다. 변형된 서열이 단백질과 관련된 생물학적 기능을 방해하거나 파괴한 경우, 치환, 삽입 또는 결실은 단백질에 불리한 영향을 미친 것이다. 예를 들어, 생물학적 활성에 불리한 영향을 미치지 않고 단백질의 전체 전하, 구조 또는 소수성-친수성 특성을 변형시킬 수 있다. 따라서, 아미노산 서열을 변형시켜 단백질의 생물학적 활성에 불리한 영향을 미치지 않고, 예컨대 펩티드가 더욱 소수성이 되거나 또는 친수성이 되도록 할 수 있다.
통상, 대립유전자 변형체, 보존적 치환 변형체 및 단백질과의 구성원은 서열 번호 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18 및 20에 제시된 인간 및 쥐 서열과의 아미노산 서열 상동성이 75% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 더 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상인 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 서열에 대한 동일성 또는 상동성은, 최대 상동성율(%)을 얻도록 서열을 정렬하고 필요에 따라 갭을 도입한 후에, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환은 고려하지 않고 기지의 펩티드와 동일한 후보 서열에서의 아미노산 잔기의 비율(%)로서 정의된다. 펩티드 서열 내로의 N-말단, C-말단 또는 내부의 연장, 결실 또는 삽입이 상동성에 영향을 주는 것으로 해석해서는 안된다.
따라서, 본 발명의 단백질 및 펩티드는 서열 번호 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18 및 20의 아미노산 서열을 포함하는 분자; Nogo 수용체 단백질 및 펩티드 제제 중 적어도 약 3개, 4개, 5개, 6개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 보존적 서열을 보유하는 이의 단편; 1개 이상의 아미노산 잔기가 제시된 서열에 대한 N-말단 또는 C-말단에, 또는 그 내부에 삽입된 서열의 아미노산 서열 변형체; 또 다른 잔기로 치환된 제시된 서열의 아미노산 서열 변형체 또는 상기 정의된 바와 같은 이들의 단편을 포함한다. 예상되는 변형체는, 예컨대 상동성 재조합, 부위 지정 돌연변이유발 또는 PCR 돌연변이유발에 의한 소정의 돌연변이와 기타 동물 종[비제한적인 예로서, 토끼, 래트, 돼지, 소, 양, 말 및 인간 이외의 영장류 종]의 해당 단백질을 함유하는 것들, 단백질과의 대립유전자 또 는 기타 자연 발생적 변형체; 및 단백질이 치환, 화학적 수단, 효소적 수단 또는 기타 적절한 수단에 의해 자연 발생적 아미노산 이외의 부분(예, 효소 또는 방사성동위원소와 같은 검출가능한 부분)과 공유결합 변형된 유도체를 추가로 포함한다.
전술한 바와 같이, 단백질과의 구성원은 (1) 단백질의 1 이상의 활성을 조절하는 제제를 확인하기 위해서, (2) 단백질용 결합 파트너를 확인하는 방법에서, (3) 폴리클론 또는 모노클론 항체를 유발하는 항원으로서, 그리고 (4) 치료제로서 사용할 수 있다.
B. 핵산 분자
또한 본 발명은 본 명세서에 개시된 서열 번호 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18 및 20의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 및 펩티드를 암호화하는 핵산 분자 및 관련 단백질을, 바람직하게는 분리된 형태로 제공한다. 본 명세서에서 사용된 "핵산"은 게놈 DNA, cDNA, mRNA 및 안티센스 분자와, 다른 주쇄를 기초로 하거나 또는 천연원 또는 합성원 유래의 다른 염기를 포함하는 핵산을 포함한다.
상동성 또는 동일성은 서열 유사성 조사용으로 맞춤 제작된 프로그램 blastp, blastn, blastx, tblastn, 및 tblastx(Karlin 등, (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2264-2268 및 Altschul, (1993) J. Mol. Evol. 36, 290-300, 본 명세서에서 참고 인용함)에 의해 사용된 연산을 이용하여 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 분석으로 결정한다. BLAST 프로그램에 의해 사용된 방법은 먼저 의문 서열과 데이타베이스 서열 간의 유사한 분절을 관찰한 다음, 확인된 모든 정합의 통계학적 유의성을 평가하고, 마지막으로 미리 선택한 유의성 한계를 만 족하는 정합만을 요약하는 것이다. 서열 데이타베이스의 유사성 조사에 있어서 기본 쟁점에 관한 논의에 대해서는 문헌[Altschul 등, (1994) Nature Genetics 6, 119-129, 참고로 인용함]을 참조. 히스토그램, 기술, 정렬, 기대치(즉, 데이타베이스 서열에 대한 정합을 보고하기 위한 통계적 유의성 한계값), 컷오프, 행렬 및 필터에 대한 조사 매개변수는 디폴트 지정되어 있다. blastp, blastx, tblastn, 및 tblastx에 의해 이용된 디폴트 기록 행렬은 BLOSUM62 행렬이다(Henikoff 등, (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915-10919, 참고로 인용됨). 4개의 blastn 매개 변수를 다음과 같이 조정하였다: Q=10(갭 형성 벌점); R=10(갭 연장 벌점); wink=1 (의문 서열에 따라 모든 winkth 위치에서 단어 적중을 나타냄); 및 gapw=16(갭이 있는 정렬이 발생되는 윈도우 폭 설정). 등가의 Blastp 매개변수 설정은 Q=9; R=2; wink=1; 및 gap=32였다. GCG 패키지 버젼 10.0에서 이용가능한 서열 간의 Bestfit 비교는 DNA 매개변수 GAP=50(갭 형성 벌점) 및 LEN=3(갭 연장 벌점)을 이용하며, 단백질 비교에서의 해당 설정은 GAP=8 및 LEN=2이다.
본 명세서에서 사용된 "고엄중 조건"은 50% 포름아미드의 존재하에 42℃에서 하이브리드화시킨 후에, 1% 나트륨 SDS를 함유하는 2 ×SSC로 65℃에서 1차 세척하고 0.1 ×SSC로 65℃에서 2차 세척하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 핵산 분자는 핵산 분자가 핵산 공급원 유래의 기타 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 오염물로부터 실질적으로 분리되어 있을 때 "분리"된 것으로 간주한다.
또한 본 발명은 암호화 핵산 분자의 단편을 제공한다. 본 명세서에 개시된 암호화 핵산 분자의 단편이란 전체 단백질을 암호화하는 서열의 일부를 의미한다. 단편 크기는 목적하는 용도에 따라 결정한다. 예를 들어, 단백질의 활성 부분을 암호화하도록 단편을 선택하는 경우, 단편은 단백질의 작용 영역(들)을 암호화하기에 충분히 커야한다. 단편을 핵산 프로브 또는 PCR 프라이머로서 사용하고자 하는 경우에는, 프로빙/프라이밍 과정에서 위양성의 수가 비교적 적도록 단편 길이를 선택한다.
폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 대한 프로브 또는 특이적 프라이머로서 또는 본 발명의 단백질을 암호화하는 유전자 서열을 합성하는 데 사용되는 본 발명의 암호화 핵산 분자의 단편들(즉, 합성 올리고뉴클레오티드)은, Matteucci 등의 포스포트리에스테르 방법[J. Am. Chem. Soc. 103, 3185-3191 (1981)] 등의 화학적 방법 또는 자동 합성법을 이용하여 합성할 수 있다. 또한, 더 큰 DNA 분절은 유전자의 각종 모듈 분절을 한정하는 올리고뉴클레오티드군을 합성한 후 올리고뉴클레오티드를 결찰시켜 완전히 변형된 유전자를 만드는 방법과 같이, 잘 알려진 방법으로 쉽게 제조할 수 있다.
본 발명의 암호화 핵산 분자는 진단 및 프로브 용도로 검출가능한 표지를 포함하도록 추가로 변형시킬 수 있다. 각종 표지는 당업계에 공지되어 있으며, 본 명세서에 개시된 암호화 분자와 함께 쉽게 사용할 수 있다. 적절한 표지의 비제한적인 예로는 비오틴, 방사능표지된 뉴클레오티드 등이 있다. 당업자는 당업계에 공지된 임의의 표지를 사용하여 표지된 암호화 핵산 분자를 얻을 수 있다.
단백질의 활성을 파괴하지 않고 번역 과정에서 단백질 서열에 아미노산의 결실, 첨가 또는 변형을 도입하여 1차 구조를 변형시킬 수 있다. 이러한 치환 또는 기타 변형으로 본 발명의 범위에 속하는 핵산이 암호화하는 아미노산 서열을 갖는 단백질이 산출된다.
C. 기타 관련 핵산 분자의 분리
전술한 바와 같이, 당업자는 서열 번호 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17 및 19의 서열을 갖는 인간 핵산 분자를 확인하여 본 명세서에 개시된 서열 외에 Nogo 수용체 단백질과의 기타 구성원을 암호화하는 핵산 분자를 분리할 수 있다. 또한, 당업자는 현재 제시되어 있는 핵산 분자로부터 Nogo 수용체 단백질 및 펩티드 제제과(科)의 기타 구성원을 암호화하는 핵산 분자를 분리할 수 있다.
본질적으로, 당업자는 서열 번호 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18 및 20의 아미노산 서열 또는 이의 에피토프 함유 단편을 쉽게 이용하여 적절한 세포로부터 제조된 발현 라이브러리를 스크리닝하기 위한 항체 프로브를 형성할 수 있다. 통상, 정제된 단백질(후술됨) 또는 모노클론 항체로 면역화된 토끼와 같은 포유류에서 얻은 폴리클론 항혈청을 사용하여 포유류 cDNA 또는 게놈 발현 라이브러리(예, 람다 gtll 라이브러리)를 탐색하여 단백질과의 기타 구성원에 대한 적절한 암호화 서열을 얻을 수 있다. 클로닝된 cDNA 서열은 융합 단백질로서 발현되거나, 자신의 대조 서열을 사용하여 직접 발현되거나, 또는 효소의 발현용으로 이용되는 특정 숙주에 적절한 대조 서열을 사용하여 작제물에 의해 발현될 수 있다.
또는, 본 명세서에 개시된 암호화 서열의 일부를 합성하여 임의의 포유류 유 기체에서 유래한 단백질과의 구성원을 암호화하는 DNA를 검색하기 위한 프로브로서 사용할 수 있다. 예컨대 약 18∼20개의 뉴클레오티드(약 6∼7개의 아미노산 신장물을 암호화함)를 포함하는 올리고머를 제조하여 엄중 조건 또는 과도한 수준의 위양성 결과를 제거하기에 충분한 엄중 조건 하에서 하이브리드화시키기 위한 게놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리를 스크리닝할 수 있다.
또한, 암호화 핵산 분자를 선택적으로 클로닝하기 위해 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)용 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍을 제조할 수 있다. 이러한 PCR 프라이머를 사용하는 PCR 변성/어닐링/연장 사이클은 당업계에 공지되어 있으며, 다른 암호화 핵산 분자를 분리하는 데 사용하기 위해서 쉽게 변형시킬 수 있다.
D. 핵산 분자를 포함하는 재조합 DNA 분자
또한, 본 발명은 암호화 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자(rDNA)를 제공한다. 본 명세서에 사용된 rDNA 분자는 분자 조작을 실시한 DNA 분자이다. rDNA 분자의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 Sambrook 등, (1989) Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press 참조. 바람직한 rDNA 분자에서, 암호화 DNA 서열은 발현 제어 서열 및 벡터 서열에 작동가능하게 결합되어 있다.
본 발명의 단백질과(科) 암호화 서열 중 하나가 작동가능하게 결합된 벡터 및 발현 제어 서열의 선택은, 당업계에 공지된 바와 같이 목적하는 기능 특성(예, 단백질 발현 및 형질전환시키고자 하는 숙주 세포)에 직접적으로 좌우된다. 본 발명의 벡터는 적어도 rDNA 분자에 포함된 구조 유전자의 숙주 염색체내로의 복제 또 는 삽입과, 바람직하게는 발현을 유도할 수 있는 것일 수 있다.
작동가능하게 결합된 단백질 암호화 서열의 발현을 조절하는 데 이용되는 발현 제어 성분은 당업계에 공지되어 있으며, 그 비제한적인 예로는 유도성 프로모터, 구성성 프로모터, 분비 신호 및 기타 조절 성분 등이 있다. 유도성 프로모터는, 예컨대 숙주 세포 배지의 양분에 반응하는 것과 같이 쉽게 제어할 수 있는 것이 바람직하다.
일 구체예에서, 암호화 핵산 분자를 포함하는 벡터는 원핵 세포 레플리콘, 즉 이것으로 형질전환된 박테리아 숙주 세포 등의 원핵 숙주 세포는 염색체외에서 재조합 DNA 분자의 자발적인 복제 및 유지를 유도하는 능력을 갖게 되는 DNA 서열을 포함한다. 이러한 레플리콘은 당업계에 공지되어 있다. 또한, 원핵 세포 레플리콘을 포함하는 벡터는 발현되어 약물 내성 등의 검출가능한 마커를 부여하는 유전자를 포함할 수 있다. 전형적인 박테리아 약물 내성 유전자는 앰피실린 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하는 것들이다.
원핵 세포 레플리콘을 포함하는 벡터는 이.콜리와 같은 박테리아 숙주 세포에서 암호화 유전자 서열의 발현(전사 및 번역)을 유도할 수 있는 원핵 세포 또는 박테리오파지 프로모터를 추가로 포함할 수 있다. 프로모터는 RNA 폴리머라제의 결합 및 전사를 가능하게 하는 DNA 서열로 형성된 발현 제어 성분이다. 통상적으로 박테리아 숙주에 적합한 프로모터 서열은 본 발명의 DNA 분절의 삽입을 위해 편리한 제한 부위를 함유하는 플라스미드 벡터 내에 제공된다. 이러한 벡터 플라스미드의 예로는 pUC8, pUC9, pBR322 및 pBR329(바이오라드 래보러터리즈), pPL 및 pKK223(파마시아) 등이 있다. 임의의 적절한 원핵 숙주를 이용하여 본 발명의 단백질을 암호화하는 재조합 DNA 분자를 발현할 수 있다.
진핵 세포, 바람직하게는 척추동물 세포에 적합한 발현 벡터를 이용하여 암호화 서열을 함유하는 rDNA 분자를 형성할 수 있다. 진핵 세포 발현 벡터는 당업계에 공지되어 있으며, 일부 시판원으로부터 입수할 수 있다. 통상적으로, 이러한 벡터는 목적하는 DNA 분절을 삽입하기에 편리한 제한 부위를 포함하도록 제공된다. 이러한 벡터의 예로는 pSVL 및 pKSV-10(파마시아), pBPV-1, pML2d (인터내쇼날 바이오테크놀러지즈), pTDTl(ATCC 31255) 및 기타 진핵 세포 발현 벡터 등이 있다.
본 발명의 rDNA 분자를 작제하는 데 이용된 진핵 세포 발현 벡터는 진핵 세포에 효과적인 선별 마커, 바람직하게는 약물 내성 선별 마커를 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 약물 내성 마커는 발현되어 네오마이신 내성을 초래하는 유전자, 즉 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(neo) 유전자이다. (Southern 등, (1982) J. Mol. Anal. Genet. 1, 327-341). 혹은, 선별 마커는 별도의 플라스미드, 숙주 세포의 동시형질감염으로 도입된 2개의 벡터, 그리고 선별 마커용으로 적절한 약물에서 배양하여 선별한 형질전환체에 존재할 수 있다.
E. 외인성으로 제공된 암호화 핵산 분자를 함유하는 숙주 세포
나아가, 본 발명은 본 발명의 단백질을 암호화하는 핵산 분자로 형질감염된 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 원핵 세포이거나 또는 진핵 세포일 수 있다. 본 발명의 단백질 발현에 유용한 원핵 세포는, 세포주가 세포 배양법에 적합하고 발현 벡터의 증식 및 유전자 생성물의 발현에 적합하기만 하면, 제한되지 않는다. 바람직한 진핵 숙주 세포의 비제한적인 예로는 효모, 곤충 및 포유류 세포, 바람직하게는 마우스, 래트, 원숭이 또는 인간 세포주에서 유래한 세포 등의 척추동물 세포 등이 있다. 유용한 진핵 숙주 세포의 예로는 CCL61로서 ATCC로부터 입수가능한 중국산 햄스터 난소(CHO) 세포, CRL1658로서 ATCC로부터 입수가능한 NIH 스위스 마우스 배아 세포 NIH-3T3, 어린 햄스터 신장 세포(BHK) 등의 진핵 조직 배양 세포주를 들 수 있다.
본 발명의 rDNA 분자에 의한 적절한 세포 숙주의 형질전환은, 통상적으로 사용된 벡터의 종류와 사용된 숙주계에 따라 공지된 방법으로 실시한다. 원핵 숙주 세포의 형질 전환과 관련하여서는 일렉트로포레이션 및 염 처리법을 사용할 수 있다. (예컨대, Sambrook 등, (1989) Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cohen 등, (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110-2114 참조). rDNA를 함유하는 벡터를 이용한 척추동물 세포의 형질전환에는 일렉트로포레이션, 양이온 지질 또는 염 처리법을 사용할 수 있다(예컨대, Graham 등, (1973) Virology 52, 456-467; Wigler 등, (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 1373-1376 참조).
성공적으로 형질전환된 세포, 즉 본 발명의 rDNA 분자를 함유하는 세포는 선별 마커를 이용한 선별을 비롯한 공지된 기법으로 확인할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 rDNA를 도입하여 생긴 세포를 클로닝하여 단일 콜로니를 형성할 수 있다. 이들 콜로니로부터 얻은 세포를 수거하고, 세포용해한 다음 문헌[Southern, (1975) J.Mol. Biol. 98, 503-517]에 개시된 바와 같은 방법을 이용하여 rDNA의 존재에 대 해 DNA 내용물을 검사하거나 또는 면역학적 방법을 통해 분석된 세포로부터 단백질을 생성할 수 있다.
F. rDNA 분자를 이용한 재조합 단백질의 생성
또한 본 발명은 본 명세서에 개시된 핵산 분자를 이용하여 본 발명의 단백질을 제조하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 재조합 형태의 단백질 제조 방법은 통상 다음 단계를 포함한다.
먼저, 본 발명의 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 예컨대 서열 번호 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17 및 19에 제시된 핵산 분자 또는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 166-1584 및 서열 번호 3의 뉴클레오티드 178-1596을 얻는다. 암호화 서열 사이에 인트론이 개재되어 있지 않다면, 이 암호화 서열은 어떤 숙주에서의 발현용으로도 전적으로 적합하다.
이어서 전술한 바와 같이 핵산 분자를 적절한 제어 서열과 함께 작동가능한 연결로 배치하여 단백질 개방 해독틀을 함유하는 발현 단위를 형성하는 것이 바람직하다. 발현 단위를 이용하여 적절한 숙주를 형질전환시키고, 재조합 단백질을 생성하는 조건 하에서 형질전환된 숙주를 배양한다. 경우에 따라서 재조합 단백질을 배지 또는 세포로부터 분리한다. 약간의 불순물이 용인될 수 있는 일부 경우에는 단백질의 회수 및 정제 단계가 필요하지 않을 수 있다.
전술한 각 단계들은 각종 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 목적하는 암호화 서열을 게놈 단편으로부터 얻어서 적절한 숙주에 직접 사용할 수 있다. 각종 숙주에서 작동가능한 발현 벡터는 적절한 레플리콘과 제어 서열을 사용하여 전술한 바와 같이 작제할 수 있다. 제어 서열, 발현 벡터 및 형질전환법은 유전자를 발현하는 데 사용된 숙주 세포의 종류에 따라 달라지며, 앞서 상세히 논의하였다. 적절한 제한 부위를, 보통 이용가능하지 않더라도, 암호화 서열의 말단에 첨가하여 이들 벡터내로 삽입할 수 있는 절제가능한 유전자를 제공할 수 있다. 당업자는 재조합 단백질을 제조하는 데 본 발명의 핵산 분자와 함께 사용하기 위해서 당업계에 공지된 임의의 숙주/발현계를 쉽게 변형시킬 수 있다.
G. 결합 파트너의 확인 방법
본 발명은 본 발명의 단백질의 결합 파트너를 분리 및 확인하는 데 사용되는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 단백질과 가능한 결합 파트너의 회합을 가능하게 하는 조건 하에서 본 발명의 단백질을 가능한 결합 파트너 또는 세포 추출물 또는 분획과 혼합한다. 혼합 후에, 본 발명의 단백질과 회합된 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 기타 분자를 혼합물로부터 분리한다. 본 발명의 단백질에 결합한 결합 파트너를 제거한 다음 추가로 분석할 수 있다. 결합 파트너를 확인 및 분리하기 위해서, 전체 단백질, 예컨대 서열 번호 2 또는 4의 전체 Nogo 수용체 단백질 또는 서열 번호 6의 전체 Nogo 단백질을 사용할 수 있다. 대안적으로, 단백질 단편을 사용할 수 있다. 유용한 Nogo 수용체 단백질 단편의 예는 경막 도메인이 결여된 가용성 Nogo 수용체 폴리펩티드이다(도 7).
본 명세서에 사용된 세포 추출물이란 용해되거나 파괴된 세포로부터 제조된 제제 또는 분획을 의미한다. 세포 추출물의 바람직한 공급원은 인간 뇌 또는 척수 조직, 예컨대 인간 뇌 조직으로부터 유도된 세포이다. 또는, 세포 추출물은 임의의 뉴런 조직원 또는 이용가능한 뉴런 세포주, 특히 희소돌기아교세포 유래의 세포주로부터 제조할 수 있다.
각종 방법을 이용하여 세포 추출물을 얻을 수 있다. 물리적 또는 화학적 파괴법을 이용하여 세포를 파괴할 수 있다. 물리적 파괴법의 비제한적인 예로는 초음파 처리 및 기계적 전단 등이 있다. 화학적 용해법의 예로는 세제 용해 및 효소 용해가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 당업자는 세포 추출물의 제법을 쉽게 변형시켜 본 방법에 사용하기 위한 추출물을 얻을 수 있다.
일단 세포 추출물이 제조되면, 단백질과 결합 파트너의 회합이 일어날 수 있는 조건 하에서 추출물을 본 발명의 단백질과 혼합한다. 각종 조건이 사용될 수 있으며, 인간 세포의 세포질에서 발견되는 조건과 매우 유사한 조건이 가장 바람직하다. 삼투성, pH, 온도 및 사용된 세포 추출물의 농도와 같은 특징을 다양하게 하여 결합 파트너와 단백질의 회합을 최적화할 수 있다.
적절한 조건 하에서 혼합한 후에, 결합된 복합체를 혼합물로부터 분리한다. 각종 기술을 이용하여 혼합물을 분리할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 단백질에 특이적인 항체를 이용하여 결합 파트너 복합체를 면역침전시킬 수 있다. 또는, 크로마토그래피 및 밀도-침강 원심분리와 같은 표준 화학 분리법을 이용할 수 있다.
추출물 내에서 발견되는 회합되지 않은 세포 구성성분을 제거한 후에, 종래 방법을 이용하여 결합 파트너를 복합체로부터 해리시킨다. 예를 들어, 혼합물의 염 농도 또는 pH를 변경하여 해리시킬 수 있다.
혼합된 추출물로부터 회합된 결합 파트너 쌍을 분리하는 것을 보조하기 위해 서, 본 발명의 단백질을 고체 지지체 상에 고정시킬 수 있다. 예를 들어, 단백질을 니트로셀룰로스 매트릭스 또는 아크릴 비드에 부착시킬 수 있다. 단백질의 고체 지지체에의 결합은, 추출물 내에서 발견되는 다른 구성성분으로부터 펩티드-결합 파트너 쌍을 분리하는 데 조력한다. 확인된 결합 파트너는 단일 단백질이거나, 또는 2 이상의 단백질로 구성된 복합체일 수 있다. 대안적으로, 결합 파트너는 문헌[Flanagan & Vanderhaeghen (1998) Annu. Rev. Neurosci. 21, 309-345 또는 Takahashi 등, (1999) Cell 99, 59-69]에 개시된 절차에 따른 알칼리 포스파타제 융합 분석; 문헌[Takayama 등, (1997) Methods Mol. Biol. 69, 171-184 또는 Sauder 등, J. Gen. Virol. (1996) 77, 991-99]에 개시된 절차에 따른 Far-Western 분석을 이용하여 확인하거나, 또는 에피토프 태그된 단백질 또는 GST 융합 단백질을 이용하여 확인할 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 핵산 분자를 효소 2-하이브리드계에 사용할 수 있다. 효모 2-하이브리드계를 사용하여 다른 단백질 파트너쌍을 확인할 수 있으며, 본 명세서에 개시된 핵산 분자를 이용하도록 쉽게 변형시킬 수 있다(스트라타젠 Hybrizap(등록상표) 2-하이브리드계).
H. 발현을 조절하는 제제의 확인 방법
본 발명은 Nogo 수용체 단백질을 암호화하는 핵산의 발현을 조절하는 제제의 확인 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 Nogo 단백질을 암호화하는 핵산의 발현을 조절하는 제제의 확인 방법을 제공한다. 이러한 분석에서는 본 발명의 핵산의 발현 수준 변화를 모니터링하는 임의의 이용가능한 수단을 사용할 수 있다. 본 명세서에 서 사용된 바와 같이, 제제가 세포의 핵산 발현을 상향 조절 또는 하향 조절할 수 있다면, 제제는 본 발명의 핵산, 예컨대 서열 번호 2, 4 또는 6의 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 핵산의 발현을 조절하는 것으로 간주된다.
하나의 분석 형식에서, 서열 번호 1의 뉴클레오티드 166-1584 또는 서열 번호 3의 뉴클레오티드 178-1596, 또는 서열 번호 5의 뉴클레오티드 135-3713에 의해 한정되는 개방 해독틀과 임의의 분석가능한 결합 파트너 사이의 리포터 유전자 융합을 포함하는 세포주를 제조할 수 있다. 반딧불 루시퍼라제 유전자 및 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 유전자를 비롯하여 여러 가지 분석 가능한 융합 파트너가 공지되어 있으며 쉽게 입수할 수 있다(Alam 등, (1990) Anal. Biochem. 188, 245-254). 리포터 유전자 융합체를 함유하는 세포주를 적절한 조건하에서 적절한 시간 동안 시험하고자 하는 제제에 노출시킨다. 제제에 노출된 샘플과 대조군 샘플 간의 리포터 유전자의 발현 차이로 서열 번호 2, 4 또는 6의 서열을 보유한 단백질을 암호화하는 핵산의 발현을 조절하는 제제를 확인한다.
추가의 분석 형식을 이용하여 서열 번호 2 또는 4의 아미노산 서열을 갖는 단백질과 같은 본 발명의 Nogo 수용체 단백질 또는 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 Nogo 단백질을 암호화하는 핵산의 발현을 조절하는 제제의 능력을 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 핵산에 하이브리드화시켜 mRNA 발현을 직접 모니터링할 수 있다. 적절한 조건 및 시간 하에 세포주를 시험하고자 하는 제제에 노출시키고, 총 RNA 또는 mRNA를 문헌[Sambrook 등, (1989) Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press]에 개시된 표준 절차로 분리한다.
제제에 노출된 세포와 대조군 세포 간의 RNA 발현 수준의 차이를 검출하기 위한 프로브를 본 발명의 핵산으로부터 제조할 수 있다. 고엄중 조건 하에서 표적 핵산과만 하이브리드화하는 프로브를 고안하는 것이 바람직하지만, 반드시 그럴 필요는 없다. 고 엄중 조건 하에서 고도의 상보성 핵산 하이브리드만이 형성된다. 따라서, 분석 조건의 엄중도는 하이브리드를 형성하기 위해서 2개의 핵산 가닥 간에 존재해야 하는 상보성의 양을 결정한다. 프로브:표적 하이브리드와 가능한 프로브:비표적 하이브리드 간의 안정성 차이가 최대화되도록 엄중도를 선택해야 한다.
프로브는 당업계에 공지된 방법을 통하여 본 발명의 핵산으로부터 고안할 수 있다. 예를 들어, 프로브의 G+C 함량 및 프로브 길이는 표적 서열에 대한 프로브 결합에 영향을 미칠 수 있다. 프로브 특이성을 최적화시키는 방법은 보통 문헌[Sambrook 등, (1989) Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press 또는 Ausubel 등, (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing]에서 찾을 수 있다.
각 프로브에 대해 필요한 대로 문헌[Sambrook 등, (1989) 및 Ausubel 등, (1995)]에 개시된 바와 같은 공지된 방법을 사용하여 하이브리드화 조건을 변형시킨다. 총 세포 RNA 또는 폴리A + RNA가 풍부한 RNA의 하이브리드화는 임의의 이용가능한 형식으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 총 세포 RNA 또는 폴리A + RNA가 농축된 RNA를 고체 지지체에 고정시키고, 고체 지지체를 프로브가 특이적으로 하이브리드화하는 조건 하에서 본 발명의 1 이상의 서열 또는 하나의 서열 중 일부를 포 함하는 하나 이상의 프로브에 노출시킬 수 있다. 혹은, 본 발명의 1 이상의 서열, 또는 하나의 서열 중 일부를 포함하는 핵산 단편을 고체 지지체, 예컨대 규소계 웨이퍼 또는 다공성 유리 웨이퍼에 고정시킬 수 있다. 그 다음 고정된 서열이 특이적으로 하이브리드화하는 조건 하에서 웨이퍼를 샘플로부터의 총 세포 RNA 또는 폴리A + RNA에 노출시킬 수 있다. 이러한 웨이퍼 및 하이브리드화 방법은 널리 이용가능하며, 예컨대 문헌[Beattie, (1995) WO9511755]에 개시된 방법을 이용할 수 있다. 주어진 프로브가 미처리 세포군 유래의 RNA 샘플과 제제에 노출된 세포군 유래의 RNA 샘플에 특이적으로 하이브리드화하는 능력을 검사하여 서열 번호 2 또는 4의 서열을 보유한 Nogo 수용체 단백질을 암호화하는 핵산의 발현을 상향 또는 하향 조절하는 제제를 확인한다.
RNase 보호 분석(즉, RPA; Ma 등, Methods (1996) 10, 273-238 참조)을 이용하여 mRNA의 정성 및 정량 분석을 위한 하이브리드화를 실시할 수 있다. 간단히 요약하면, 유전자 산물을 암호화하는 cDNA와 파지 특이적 DNA 의존성 RNA 폴리머라제 프로모터(예, T7, T3 또는 SP6 RNA 폴리머라제)를 포함하는 발현 매개체를 파지 프로모터의 하류에 있는 cDNA의 3' 말단에서 선형화하고, 이렇게 선형화된 분자는 차후에 시험관내 전사에 의한 cDNA의 표지된 안티센스 전사체를 합성하기 위한 주형으로서 사용된다. 표지된 전사체를, 80% 포름아미드, 40 mM Pipes, pH 6.4, 0.4M NaCl 및 1 mM EDTA를 포함하는 완충액에서 밤새 45℃에서 항온배양하여 분리된 RNA(즉, 총 mRNA 또는 분획화된 mRNA)의 혼합물에 하이브리드화시킨다. 그 결과 생긴 하이브리드를 40 ㎍/㎖ 리보뉴클레아제 A 및 2 ㎍/㎖ 리보뉴클레아제를 포함하 는 완충액에서 분해한다. 외인성 단백질의 탈활성화 및 추출 후에, 분석을 위해 우레아-폴리아크릴아미드 겔에 샘플을 적재한다.
또 다른 분석 형식에서, 인스턴트 유전자 산물의 발현에 영향을 미치는 제제, 상기 유전자 산물을 생리적으로 발현하는 세포 또는 세포주를 먼저 확인한다. 이렇게 확인된 세포 및 세포주는 필수 세포 기구를 포함하여 적절한 표면 형질도입 기전 및 시토졸 케스케이드에 의한 제제의 외인성 접촉 측면에서 전사 기구의 조절 충실도를 유지할 것으로 예상된다. 또한, 이러한 세포 또는 세포주를, 인스턴트 유전자 산물에 특징적인 1 이상의 항원 단편에 융합된 인스턴트 유전자 산물을 암호화하는 구조 유전자의 작동가능한 비번역 5'-프로모터 함유 말단을 포함하는 발현 매개체(예, 플라스미드 또는 바이러스 벡터) 작제물로 형질도입 또는 형질감염시키며, 여기서 상기 단편은 상기 프로모터의 전사적 제어 하에 있고 자연 발생 폴리펩티드와는 분자량이 다른 폴리펩티드로서 발현되거나, 또는 면역학적으로 구별되는 태그를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 공정은 당업계에 공지되어 있다(Sambrook 등, (1989) Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press 참조).
앞서 요약한 바와 같이 형질도입되거나 형질감염된 세포 또는 세포주를 적절한 조건 하에 제제와 접촉시킨다. 예를 들어, 제제는 약학적 허용 부형제를 포함하며, 수성 생리 완충액, 예컨대 생리적 pH의 인산염 완충 염수(PBS), 생리적 pH의 이글 균형 염 용액(BSS), 혈청을 포함하는 PBS 또는 BSS 또는 37℃에서 항온배양된 혈청과 PBS 또는 BSS를 포함하는 조정 매체에서 세포와 접촉한다. 상기 조건은 당 업자가 필요한 대로 조정할 수 있다. 세포를 제제와 접촉시킨 후에, 상기 세포를 파괴하고 파괴물의 폴리펩티드를 분획화하여 폴리펩티드 분획을 모으고 면역학적 분석(예, ELISA, 면역침전 또는 웨스턴 블롯)으로 추가로 처리할 항체와 접촉시킨다. "제제와 접촉된" 샘플로부터 분리된 단백질 푸울을, 세포와 부형제만을 접촉시킨 대조군 샘플과 비교하고, 대조군에 비하여 "제제 접촉된" 샘플로부터 얻은 면역학적으로 생성된 신호의 증가 또는 감소를 이용하여 제제의 효과를 구별한다.
I. 활성을 조절하는 제제의 확인 방법
본 발명은 Nogo 수용체 단백질의 1 이상의 활성을 조절하는 제제의 확인 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 Nogo 단백질의 1 이상의 활성을 조절하는 제제의 확인 방법을 제공한다. 이러한 방법 또는 분석에서는 목적하는 활성을 모니터링 또는 검측하는 임의의 수단을 이용할 수 있다.
한 형식으로서, 비노출된 대조군 세포군과 비교하여 시험하고자 하는 제제에 노출된 세포군 간에 표준 단위로 정규화시킨 Nogo 수용체 단백질 또는 Nogo 단백질의 특이적 활성을 분석할 수 있다. 세포주 또는 세포군을 적절한 조건과 시간 하에 시험하고자 하는 제제에 노출시킨다. 노출된 세포주 또는 세포군과 대조군, 즉 노출되지 않은 세포주나 세포군으로부터 세포 용해물을 제조할 수 있다. 그 다음 프로브로 세포 용해물을 분석한다.
Nogo 수용체 단백질, Nogo 단백질, Nogo 수용체 펩티드 제제 또는 이의 임의의 항원 함유 단편을 이용한 적절한 면역화 프로토콜로 적절한 포유류 숙주를 면역화시켜 항체 프로브를 제조할 수 있다. 면역원성을 강화시키기 위해서, 이들 단백 질 또는 단편을 적절한 담체에 접합시킬 수 있다. 담체(예, BSA, KLH 또는 기타 담체 단백질)와의 면역원성 접합체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일부 환경에서, 예컨대 카르보디이미드 제제를 이용한 직접 접합법이 효과적이며, 다른 환경에서는 피어스 케미칼 캄파니가 공급한 것과 같은 결합 시약이 합텐(hapten)에 대한 접근성을 제공하는 데 바람직할 수 있다. 합텐 펩티드는, 예컨대 담체에 대한 결합을 용이하게 하기 위해서 시스테인 잔기로 아미노 또는 카르복시 말단에서 신장시키거나 또는 시스테인 잔기를 점재시킬 수 있다. 당업계에 일반적으로 알려진 바와 같이, 적절한 기간 동안 적절한 보조제를 사용하여 면역원을 주사로 투여하는 것이 일반적이다. 면역화 계획 중에, 항체 형성의 적합성을 결정하기 위해서 항체 역가를 구한다.
이러한 방식으로 제조된 폴리클론 항혈청은 일부 용도에는 만족스러울 수 있지만, 약학 조성물에는 모노클론 제제를 사용하는 것이 바람직하다. 목적하는 모노클론 항체를 분비하는 불사 세포주는, 일반적으로 당업계에 공지된 바와 같이 표준 방법[예컨대 Kohler & Milstein, (1992) Biotechnology 24, 524-526 참조] 또는 림프구나 비장 세포의 불사화에 영향을 주는 변형으로 제조할 수 있다. 목적하는 항체를 분비하는 불사 세포주는 항원이 펩티드 합텐, 폴리펩티드 또는 단백질인 면역 분석으로 스크리닝할 수 있다. 목적하는 항체를 분비하는 적절한 불사 세포 배양물이 확인되면, 세포를 시험관내 배양하거나 또는 복수액 내의 생성으로 배양할 수 있다.
목적하는 모노클론 항체를 배양물 상청액 또는 복수 상청액으로부터 회수할 수 있다. 면역학적으로 중요한 부분을 함유하는 완전한 항-Nogo 또는 항-Nogo 수용체 항체 또는 이의 단편을, 예컨대 Nogo (리간드)와 Nogo 수용체 간의 결합의 길항제로서 사용할 수 있다. 면역학적으로 반응성인 단편, 예컨대 F(ab')2 단편의 Fab, Fab'가 특히 치료 상황에서 종종 바람직한데, 그 이유는 이들 단편이 일반적으로 전체 면역글로불린보다 면역원성이 적기 때문이다.
현행 기술을 이용하여 재조합 수단으로 항체 또는 단편을 제조할 수 있다. 단백질의 목적하는 영역에 특이적으로 결합하는 항체 영역을 복수종 기원을 갖는 키메라로 제조할 수 있다.
단백질의 목적하는 영역에 특이적으로 결합하는 항체 영역은 복수 종 기원을 갖는 키메라, 예컨대 인간화된 항체로 제조할 수 있다. 따라서 항체는, 미국 특허 제5,585,089호 또는 Riechmann 등의 문헌[Nature 332, 323-327 (1988)]에 개시된 바와 같이, 인간화된 항체이거나 또는 인간 항체일 수 있다.
상기 방법으로 분석된 제제를 무작위적으로 선별하거나 또는 합리적으로 선별 또는 고안할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 회합된 기질, 결합 파트너 등과 함께, 또는 단독으로 본 발명의 단백질의 회합과 관련된 구체적 서열을 고려하지 않고 제제를 무작위적으로 선택하는 경우 제제를 무작위 선택한 것으로 간주한다. 무작위 선별된 제제의 일례는 화학 라이브러리 또는 펩티드 조합 라이브러리, 또는 유기체의 성장 브로스를 사용하는 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 제제의 작용과 관련된 표적 부위의 서열 또 는 그 구조를 고려하여 비무작위 방식으로 제제를 선택하는 경우에는 제제를 합리적으로 선택 또는 고안한 것으로 한다. 이들 부위를 구성하는 펩티드 서열을 이용하여 제제를 합리적으로 선택 또는 합리적으로 고안할 수 있다. 예를 들어, 합리적으로 선택된 펩티드 제제는, 아미노산 서열이 Nogo 수용체와 상호작용하는 Nogo의 결합 도메인(서열 번호 20)과 동일한 펩티드일 수 있다. 혹은, 합리적으로 선택된 펩티드는, 예컨대 서열 번호 8, 10, 12, 14, 16 및 18 등의 결합 도메인의 단편일 수 있다.
본 발명의 제제는, 예컨대 펩티드, 항체, 항체 단편, 소분자, 비타민 유도체와 탄수화물일 수 있다. 본 발명의 펩티드 제제는, 당업계에 공지된 바와 같이 표준 고상(또는 용액상) 펩티드 합성 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 또한, 시판용 올리고뉴클레오티드 합성 수단을 이용하여 이들 펩티드를 암호화하는 DNA를 합성하고 표준 재조합 제조 시스템을 이용하여 재조합 방식으로 제조할 수 있다. 유전자가 암호화하는 것이 아닌 아미노산이 포함되는 경우에는 고상 합성을 이용하여 제조해야 한다.
본 발명의 제제의 또 다른 종류는 Nogo 단백질 또는 Nogo 수용체 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 단편이다. 항체 제제는 항체에 의해 표적화시키고자 하는 단백질의 일부분을 항원성 영역으로서 포함하는 펩티드로 적절한 포유류 피험체를 면역화시켜 얻을 수 있다.
J. 고효율 분석
Nogo 수용체 단백질과 상호작용할 수 있는 신규 화합물을 검색하는 데 고효 율 스크리닝의 능력을 이용한다. 고효율 스크리닝에 대한 일반적인 정보에 대해서는, 예컨대 Devlin, (1998) High Throughput Screening, Marcel Dekker; 미국 특허 제5,763,263호 참조. 고효율 분석에서는 1 이상의 상이한 분석 기법을 이용한다.
면역진단 및 면역분석
이들 분석법은 생물학적 유체와 같은 복합 혼합물에서 통상 낮은 농도로 존재하고, 상보성 항원에 대해 적절히 제조되고 선별된 항체에 의해 확인되는 특이성 및 고 친화성에 따라서 달라지는 특정 생화학 물질의 측정에 이용되는 일군의 기법이다. 측정하고자 하는 물질은, 면역원성 거대분자이건 합텐 소분자이건, 당연히 항원성이어야 한다. 기지의 제한된 양의 특이적 항체를 각 샘플에 첨가하고, 방사성동위원소(방사성면역분석), 형광 분자(형광면역분석), 안정한 자유 라디칼(스핀 면역분석), 효소(효소 면역분석) 또는 쉽게 구별가능한 다른 표지로 표지된 항원의 형태를 지표로서 이용하여 항체와 결합하는 항원의 비율을 흔히 결합형:유리형의 비율로서 추정한다.
항체는 각종 방법, 예컨대 효소 결합형 면역흡착 분석(ELISA), 방사성면역분석(RIA); 형광 면역분석(FIA); 화학발광 면역분석(CLIA), 및 콜로이드 골드 입자(이뮤노골드)를 이용한 항체의 표지법으로 표지할 수 있다.
일반적인 분석 형식은 샌드위치 분석, 경합적 또는 경쟁 분석, 라텍스 응집소 분석, 동질성 분석, 미량역가판 형식 및 미립자계 분석을 포함한다.
효소 결합형 면역흡착 분석(ELISA)
ELISA는 방사성화학물질의 위해성과 형광 검출계의 비용 문제를 해소한 면역 화학적 기법이다. 대신에, 이 분석에서는 지표로서 효소를 이용한다. ELISA는 불용성 담체 표면에 결합된 항체(또는 항원)의 사용을 기초로 한 정량적 면역분석 형태로서, 테스트 용액에서 관련 항원(또는 항체)을 "포집"하는 데 사용된다. 항원-항체 복합체는, 이미 항원(또는 항체)에 공유 결합되어 있는 적절한 효소의 활성을 측정하여 검출한다.
EILSA 기법의 정보에 대해서는, 예컨대 Crowther, (1995) ELISA -Theory and Practice (Methods in Molecular Biology), Humana Press; Challacombe & Kemeny, (1998) ELISA and Other Solid Phase Immunoassays-Theoretical and Practical Aspects, John Wiley; Kemeny, (1991) A Practical Guide to ELISA, Pergamon Press; Ishikawa, (1991) Ultrasensitive and Rapid Enzyme Immunoassay (Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology) Elsevier 참조.
효소에 대한 비색 분석
비색법이란, 예컨대 비색계 또는 분광광도계를 사용하여 표준량의 화합물 및 시험량의 화합물을 제제와 반응시켜 형성된 색상을 비교함으로써 화합물의 농도 또는 양을 결정하는 정량적 화학 분석 방법이다.
베타-갈락토시다제 효소 활성의 표준 비색법이 당업계에 공지되어 있다(예컨대, Norton 등, (1985) Mol. Cell. Biol. 5, 281-290 참조). 비색 분석은, 표준 비색 베타-갈록토시다제 분석에서 기질로서 O-니트로페닐-베타-D-갈락토피라노시드(ONPG, 시그마)를 사용하여 전체 세포 용해물에서 실시할 수 있다(Sambrook 등, (1989) Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press). 베타-갈락토시다제 활성의 검출에 자동화된 비색 분석을 이용할 수 있다(예컨대 미국 특허 제5,733,720호 참조).
면역형광 분석
면역형광 또는 면역형광 현미경은, 항원 또는 항체를 형광 염료에 접합시켜 형광을 발하게 한 다음, 조직 절편 또는 표본에서 상보성 항체 또는 항원과 반응시키는 기법이다. 항원 또는 항체의 위치는 자외선 하에서 현미경으로 형광을 관찰하여 측정할 수 있다.
면역형광 기법에 대한 일반적인 정보에 관해서는, 예컨대 Knapp 등, (1978) Immunofluorescence and Related Staining Techniques, Elsevier; Allan, (1999) Protein Localization by Fluorescent Microscopy-A Practical Approach (The Practical Approach Series) Oxford University Press; Caul, (1993) Immunofluorescence Antigen Detection Techniques in Diagnostic Microbiology, Cambridge University Press 참조. 본 발명에 적용가능한 면역형광 기법의 상세한 설명에 대해서는, 미국 특허 제5,912,176호; 미국 특허 제5,869,264호; 미국 특허 제5,866,319호; 및 미국 특허 제5,861,259호 참조.
K. 활성을 조절하는 제제의 용도
실시예에 제시된 바와 같이, Nogo 및 Nogo 수용체 단백질과 핵산, 예컨대 서열 번호 2, 4 또는 6의 아미노산 서열을 보유한 단백질은 축삭 및 수상돌기로부터 유도된 수초에서 발현된다. Nogo 또는 Nogo 수용체 단백질의 발현을 상향 또는 하향 조절하는 제제, 또는 Nogo 또는 Nogo 수용체 단백질의 1 이상의 활성의 작동제 또는 길항제와 같은 제제를 사용하여 단백질의 기능 및 활성과 관련된 생물학적 및 병리학적 과정을 조절할 수 있다. 본 발명은 인간 피험체의 치료에 특히 유용하다.
병리 과정이란 유해한 효과를 초래하는 생물학적 과정의 카테고리를 말한다. 예를 들어, 본 발명의 단백질의 발현은 두개골, 뇌 또는 척추 손상, 뇌졸증 또는 수초탈락 질병 후에 생기는 축삭 재생 억제와 관련될 수 있다. 이러한 수초탈락 질병으로는 다발성 경화증, 단상성 수초탈락, 뇌척수염, 다병소성 백질뇌증, 범뇌염, 마르키아파바-비냐미병, 교탈수초증, 부신 백질 이영양증, 펠리체우스-메르츠바허병, 해면 변성, 알렉산더병, 카나반병, 이염성 백질 이영양증 및 크라베병이 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 제제가 과정의 정도 또는 심각도를 감소시키는 경우 제제가 병리 과정을 조절하는 것으로 간주된다. 예를 들어, 본 발명의 단백질의 발현 또는 1 이상의 활성을 일부 방식으로 감소, 촉진 또는 조절하는 제제를 투여하여 수초탈락 질병을 예방하거나 또는 질병 진행을 조절할 수 있다.
일례에서, 서열 번호 8, 10, 12, 14, 16, 18 및 20에 제시된 Nogo 펩티드 제제를 투여하면 Nogo 또는 Nogo 수용체 단백질과 관련된 수초탈락 질병을 치료할 수 있다. 또 다른 예에서, 본 발명의 펩티드 제제를 발현하는 세포를 척수 손상 부위로 이식하여 손상된 부위의 축삭 성장을 촉진할 수 있다. 이러한 이식된 세포는 손상 또는 외상 후에 척수 기능을 회복하는 수단을 제공한다.
또 다른 예에서, Nogo에 결합하는 가용성 Nogo 수용체 단백질을 투여하면 Nogo 또는 Nogo 수용체 단백질과 관련된 수초탈락 질병을 치료할 수 있다. 이 제제를 이용하면 Nogo가 세포 결합된 Nogo 수용체에 결합하는 것을 방지하고 Nogo의 길 항제로서 작용할 수 있다. 가용성 수용체를 시토킨 또는 기타 리간드를 결합시키는 데 사용하여 그 기능을 조절하여 왔다(Thomson, (1998) Cytokine Handbook, Academic Press). 가용성 수용체는 용액 내에서, 또는 막 외부에서 발생한다. 막에 걸쳐있거나 또는 막과 회합하는 분자의 분절이 없기 때문에 가용성 수용체가 생길 수 있다. 이러한 분절을 당업계에서는 보통 유전자의 경막 도메인 또는 단백질의 막 결합 분절이라고 한다. 따라서, 본 발명의 일부 구체예에서, 가용성 수용체는 막 결합 수용체의 단편 또는 유사체를 포함한다. 단편은 적어도 6개, 예컨대 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 40개, 50개, 60개 또는 70개 아미노산을 포함하는 것이 바람직하며, 단 이들 단편은 목적하는 활성을 보유해야 한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 막과 회합하는 분절의 구조를 변형시켜(예컨대 DNA 서열 다형성 또는 유전자의 돌연변이) 수용체가 막에 삽입되지 않게 하거나, 또는 수용체가 삽입되는 경우에는 막 내에 유지되지 않도록 한다. 따라서, 가용성 수용체는, 상응하는 막 결합 형태와는 대조적으로 막과 회합하는데 있어서 중요한 유전자 또는 수용체 단백질의 1 이상의 분절이 다르다.
본 발명의 제제는 단독으로, 또는 특정 병리 과정을 조절하는 기타 제제와 함께, 또는 이 제제와의 순차 조합으로 제공할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 제제는 추가의 뉴런 손상 및 축삭 재생의 억제를 차단하는 수단으로서 뇌졸증 후에 소염제와 함께 투여할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 2종의 제제를 동시에 투여하거나 또는 제제가 동시에 작용하는 방식으로 개별적으로 투여하는 경우, 2종의 제제를 조합 투여한 것으로 한다.
본 발명의 제제는 비경구, 피하, 정맥내, 근육내, 복강내, 경피 또는 협측 경로로 투여할 수 있다. 예를 들어, 미세주입을 통해 손상 부위에 국소적으로 제제를 투여할 수 있다. 통상적인 부위로는 손상으로부터 생긴 척수의 손상 부위 또는 뇌졸증으로부터 생긴 뇌의 손상 부위를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 대안적으로, 또는 동시에, 경구 경로로 투여할 수 있다. 투여되는 용량은 수용체의 연령, 건강 및 체중, 동시 치료를 하는 경우 그 종류, 치료 빈도 및 목적하는 효과의 특성에 따라 달라진다.
본 발명은 본 발명의 단백질의 발현 또는 그 단백질의 1 이상의 활성을 조절하는 1 이상의 제제를 포함하는 조성물을 추가로 제공한다. 개체별로 필요로 하는 유효량이 다르지만, 각 성분의 유효량의 최적 범위는 당업계에 알려져 있다. 통상적인 용량은 체중 1 kg당 1 pg∼100 ㎎을 포함한다. 전신 투여용으로 바람직한 용량은 체중 1 kg당 100 ng∼100 mg을 포함한다. 미세주입을 통해 부위로 직접 투여하기에 바람직한 용량은 체중 1 kg당 1 ng∼1 ㎍을 포함한다.
본 발명의 조성물은, 약학적 활성제 외에도, 작용 부위에 전달하기 위해 약학적으로 이용될 수 있는 제제 내로 활성 화합물의 가공을 용이하게 하는 부형제 및 보조제를 포함하는 적절한 약학적 허용 담체를 포함할 수 있다. 비경구 투여용으로 적절한 제제는 수용성 형태, 예컨대 수용성염의 활성 화합물의 수용액을 포함한다. 또한, 적절한 오일성 주사 현탁액으로서 활성 화합물의 현탁액을 투여할 수 있다. 적절한 친지성 용매 또는 부형제는 지방유, 예컨대 참깨유, 또는 합성 지방산 에스테르, 예컨대 에틸 올레이트 또는 트리글리세리드를 포함한다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 및 덱스트란을 포함할 수 있다. 경우에 따라, 현탁액은 안정화제를 포함할 수 있다. 리포좀을 사용하여 세포 내로 전달하기 위한 제제를 캡슐화할 수 있다.
본 발명의 전신 투여용 약학 제제는 장, 비경구 또는 국소 투여용으로 제형화할 수 있다. 실제로, 이들 3가지 종류의 제제를 모두 동시에 사용하여 활성 성분을 전신 투여할 수 있다. 경구 투여용으로 적절한 제제는 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐, 환제, 정제, 예컨대 코팅된 정제, 엘릭시르, 현탁액, 시럽 또는 흡입제와 이의 제어 방출 형태를 포함한다.
본 발명의 방법을 실시하는 데 있어서, 본 발명의 제제는 단독으로 또는 조합하여, 또는 기타 치료제 또는 진단제와 함께 투여할 수 있다. 일부 바람직한 구체예에서, 본 발명의 화합물은 일반적으로 허용되는 의료 업무에 따라 이들 증상에 통상적으로 처방되는 기타 화합물, 예컨대 소염제, 항응고제, 항혈전제, 예컨대 혈소판 응집 억제제, 조직 플라스미노겐 활성화제, 유로키나제, 프로유로키나제, 스르텝토키나제, 아스피린 및 헤파린과 함께 동시 투여할 수 있다. 본 발명의 화합물은 보통 인간, 양, 말, 소, 돼지, 개, 고양이, 래트 및 마우스와 같은 포유류의 생체내에서 또는 시험관 내에서 이용할 수 있다.
L. 펩티드 모의체
본 발명은 Nogo의 입체 구조를 모방하고 Nogo 수용체에서 Nogo 결합을 차단하는 펩티드 모의체에 관한 것이다. 이러한 펩티드 모의체는 자연 발생적 펩티드에 비해 상당한 장점을 나타낼 수 있다. 예를 들면, 더욱 경제적으로 제조할 수 있고, 화학적 안정성을 높일 수 있으며, 약리학적 특성(반감기, 흡수, 효능, 효험 등)이 향상되고, 특이성이 변경되고(예, 광범위한 생물학적 활성), 항원성이 감소하는 등의 장점을 나타낸다.
한 형태로서, 모의체는 단백질 2차 구조의 성분을 모방하는 펩티드 함유 분자이다. (예컨대 Johnson 등, (1993) Peptide Turn Mimetics, in Biotechnology and Pharmacy, Pezzuto 등, (editors) Chapman and Hall 참조). 펩티드 모의체의 사용의 바탕에 깔려있는 논리적 근거는, 단백질의 펩티드 골격은 단순히 항체 및 항원과 같이 분자 상호작용을 용이하게 하는 방식으로 아미노산 측쇄를 배향시키기 위해서 존재한다는 것이다. 펩티드 모의체는 천연 분자와 유사한 분자 상호작용을 가능하게 하는 것으로 추정된다.
또 다른 형태에서, 펩티드 유사체는 주형 펩티드의 특성과 유사한 특성을 갖는 비펩티드 약물로서 약학 산업에 통상 이용된다. 이들 종류의 비펩티드 화합물을 "펩티드 모의체" 또는 "펩티드모의체"라고 하며(Fauchere, (1986) Adv. Drug Res. 15, 29-69; Veber & Freidinger, (1985) Trends Neurosci. 8, 392-396; Evans 등, (1987) J. Med. Chem. 30, 1229-1239, 본 명세서에서 참고 인용한), 일반적으로 컴퓨터화된 분자 모델링을 이용하여 개발한다.
치료적으로 유용한 펩티드와 구조적 유사성이 있는 펩티드 모의체를 이용하여 등가의 치료 또는 예방 효과를 얻을 수 있다. 일반적으로 펩티드 모의체는 전형적인 폴리펩티드(즉, 생물학적 활성 또는 약리학적 활성을 갖는 폴리펩티드), 예컨 대 Nogo의 세포외 도메인과 구조적으로 유사하지만, 당업계에 공지되어 있고 하기 문헌에 추가로 개시된 방법으로 -CH2NH-,-CH2S-,-CH2-CH2-,-CH=CH-(시스 및 트랜스), -COCH2-,-CH(OH)CH2- 및 -CH2SO-로 구성된 군에서 선택된 결합으로 임의 치환된 1 이상의 결합을 갖는다: Weinstein, (1983) Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Marcel Dekker; Morley, (1980) Trends Pharmacol. Sci. 1, 463-468 (general review); Hudson 등, (1979) Int. J. Pept. Protein Res. 14, 177-185 (-CH2NH-, CH2CH2-); Spatola 등, (1986) Life Sci. 38, 1243-1249 (-CH2-S); Hann, (1982) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 307-314 (-CH-CH-, 시스 및 트랜스); Almquist 등, (1980) J. Med. Chem. 23, 1392-1398 (-COCH2-); Jennings-White 등, (1982) Tetrahedron Lett. 23, 2533 (-COCH2-); Holladay 등, (1983) Tetrahedron Lett. 24, 4401-4404 (-C(OH)CH2-); 및 Hruby, (1982) Life Sci. 31, 189-199 (-CH2S-); 각 문헌은 본 명세서에서 참고로 인용됨.
펩티드 모의체의 표지화는 일반적으로 1 이상의 표지를, 정량적 구조-활성 데이타 및 분자 모델링으로 추정되는 펩티드 모의체 상의 비간섭 위치(들)에 직접 또는 스페이서(예, 아미드기)를 통해서 공유 결합시키는 것을 포함한다. 이러한 비간섭 위치란 일반적으로 거대분자(들)와의 직접 접촉을 형성하지 않는(예컨대, Nogo-Nogo 수용체 복합체에서 접촉점이 없는) 위치로서, 펩티드 모의체가 결합하여 치료 효과를 생성하는 위치이다. 펩티드 모의체의 유도체화(예, 표지화)는 펩티드 모의체의 목적하는 생물학적 또는 약리학적 활성을 실질적으로 방해해서는 안된다.
Nogo 펩티드 모의체는 아미노산의 유기 부분으로의 대체를 통해 구조를 기초로 한 약물 고안에 의해 제작할 수 있다(예컨대 Hughes, (1980) Philos. Trans. R. Soc. Lond. 290, 387-394; Hodgson, (1991) Biotechnol. 9, 19-21; Suckling, (1991) Sci. Prog. 75, 323-359 참조).
펩티드 모의체의 사용은 약물 라이브러리를 형성하는 조합 화합의 사용을 통하여 개선시킬 수 있다. Nogo 수용체에서 Nogo의 결합을 증가 또는 감소시키는 아미노산 돌연변이를 확인함으로써 펩티드 모의체의 고안을 보조할 수 있다. 사용될 수 있는 방법은 효모 2 하이브리드 방법(Chien 등, (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 참조)과 파지 디스프레이 방법을 포함한다. 2 하이브리드 방법에서는 효모의 단백질-단백질 상호작용을 검출한다(Fields 등, (1989) Nature 340, 245-246). 파지 디스플레이 방법에서는 람다 및 M13과 같이 파지 표면에서 발현되는 단백질과 고정된 단백질 간의 상호작용을 검출한다(Amberg 등, (1993) Strategies 6, 2-4; Hogrefe 등, (1993) Gene 128, 119-126). 이들 방법은 단백질-단백질 상호작용과 이들 상호작용을 측정하는 서열의 확인을 위한 양성 및 음성 선별을 가능하게 한다.
펩티드 합성 및 펩티드 모의체에 대한 일반적인 정보에 관해서는, 예컨대 Jones, (1992) Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford University Press; Jung, (1997) Combinatorial Peptide and Nonpeptide Libraries: A Handbook, John Wiley; Bodanszky 등, (1993) Peptide Chemistry-A Practical Textbook, Springer Verlag 참조.
M. 유전자이식 동물
본 명세서에서 사용된 용어 "동물"은 인간을 제외한 모든 척추동물을 포함한다. 또한, 배아 및 태내 단계를 비롯하여 모든 발생 단계의 개개 동물을 포함한다. "유전자이식 동물"은 아세포 수준에서의 의도적인 유전자 조작, 예컨대 재조합 바이러스를 이용한 감염 또는 미세주입으로 직접 또는 간접적으로 수용한 유전 정보를 보유하는 1 이상의 세포를 함유하는 동물이다. 이렇게 도입된 DNA 분자를 염색체 내로 통합할 수 있거나, 또는 염색체 외에서 DNA를 복제할 수 있다. 용어 "배세포주 유전자이식 동물"이란 유전 정보를 배선 세포에 도입하여 정보를 자손에게 전달하는 능력을 부여받은 유전자 이식 동물이다. 실제로 자손이 그 정보의 일부 또는 전부를 보유한다면, 이들도 또한 유전자이식 동물이다. 서열 번호 1 또는 3의 cDNA 서열 또는 관련 서열에 해당하는 유전자를 과다발현하거나 또는 조절 발현하는 돌연변이, 넉아웃, 변형된 유전자 또는 유전자 작제물을 함유하는 유전자이식 동물은 본 발명에 포함된다.
유전 정보는 수용체가 속하는 동물의 종과 이질적인 것, 특정 개체 수용체에만 이질적인 것, 또는 수용체가 이미 보유한 유전 정보일 수 있다. 정보가 수용체가 이미 보유하고 있는 유전 정보인 경우, 도입된 유전자는 고유의 내인성 유전자와 비교하여 다르게 발현될 수 있다. 이 유전자는 분리된 RNA 주형로부터 cDNA를 제조하거나, 직접 합성하거나, 또는 이의 일부 조합으로 게놈원으로부터 분리하여 얻을 수 있다.
유전자를 발현시키기 위해서, 유전자는 조절 영역에 작동가능하게 결합되어야 한다. 프로모터와 같은 조절 영역을 이용하여 특정 조직 또는 특정 발생 단계로 유전자의 발현을 증가, 감소, 조절 또는 지정할 수 있다. 프로모터가 자연 발생적 프로모터일 필요는 없다. 본 발명의 "인간 이외의 유전자이식 동물"은 "이식유전자"를 인간 이외의 동물의 배선 내로 도입하여 생성한다. 세포 내로 DNA를 도입할 수 있는 방법을 일반적으로 이용할 수 있으며, 당업계에 공지되어 있다. 이식유전자를 도입하는 상이한 방법을 사용할 수 있다. 일반적으로, 접합자는 미세주입에 대한 최적의 표적이다. 마우스에서, 수컷 생식핵은 직경이 약 20 미크론 크기에 달하여, 1∼2 pℓ DNA 용액을 복제가능하게 주사할 수 있다. 유전자 전달용 표적으로서 접합자를 사용하면 중대한 잇점이 있다. 대부분의 경우, 제1 분해 전에 숙주 유전자로 주입된 DNA를 도입한다(Brinster 등, (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4438-4442). 결과적으로, 인간 이외의 유전자이식 동물의 거의 모든 세포는 도입된 이식유전자를 보유한다. 일반적으로, 이 방법은 배세포의 50%가 이식유전자를 보유하기 때문에 이식유전자를 창시자(founder)의 자손으로 효과적으로 전달할 수 있다. 접합자의 미세주입법은 본 발명을 실시하는데 있어서 이식유전자를 도입하는 바람직한 방법이다.
레트로바이러스 감염을 이용하여 인간 이외의 동물에게 이식유전자를 도입할 수 있다. 발생중인 인간 이외의 동물의 배아를 시험관 내에서 배반포 단계로 배양할 수 있다. 이 과정에서, 할구는 레트로바이러스 감염의 표적일 수 있다. 효소 처리로 투명대를 제거하여 할구를 효과적으로 감염시킬 수 있다. 이식유전자를 도입 하는 데 사용되는 바이러스 벡터계는 통상적으로 이식유전자를 보유하는 복제 결손 레트로바이러스이다(Jahner 등, (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6927-6931; Van der Putten 등, (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148-6152). 형질감염은 바이러스 생산 세포의 단층상에 할구를 배양하여 쉽고 효율적으로 실시할 수 있다(Van der Putten 등, (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148-6152; Stewart 등, (1987) EMBO J. 6, 383-388). 대안적으로, 더 나중 단계에서 감염시킬 수 있다. 바이러스 또는 바이러스 생산 세포를 포배강에 주입할 수 있다(Jahner 등, (1982) Nature 298, 623-628). 인간 이외의 유전자이식 동물을 형성하는 세포의 서브세트에서만 도입이 일어나기 때문에 창시자 동물 중 대부분이 이식유전자에 대해 모자이크일 것이다. 또한, 창시자 동물은 게놈 내의 각종 위치에서 이식유전자의 레트로바이러스 삽입을 포함할 수 있다. 이들은 일반적으로 자손에서 분리된다. 또한, 효율이 낮기는 하지만, 중기임신 배아의 자궁내 레트로바이러스 감염으로 이식유전자를 배선으로 도입하는 것도 가능하다(Jahner 등, (1982) Nature 298, 623-628).
이식유전자 도입을 위한 제3 종류의 표적 세포는 배아 간세포(ES)이다. ES 세포는 시험관 내에서 배양된 사전 이식 배아로부터 얻어진다(Evans 등, (1981) Nature 292, 154-156; Bradley 등, (1984) Nature 309, 255-256; Gossler 등, (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 9065-9069). DNA 형질감염으로 또는 레트로바이러스 매개의 형질 도입에 의해 이식유전자를 ES 세포 내로 효과적으로 도입할 수 있다. 그 결과 얻은 형질전환된 ES 세포를 인간 이외의 동물에서 얻은 배반 포와 조합할 수 있다. ES 세포는 배를 콜로니화하고 최종 키메라 동물의 배선을 제공한다.
도입된 DNA의 존재와 그 발현을 평가하는 방법을 쉽게 이용할 수 있으며 당업계에 공지되어 있다. 이러한 방법으로는 외인성 DNA를 검출하는 DNA (서던) 하이브리드화, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 및 DNA, RNA 및 단백질을 검출하기 위한 웨스턴 블롯을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이 방법들은 Nogo 수용체 유전자의 발현을 검출하는 면역학적 및 조직화학적 기법을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 "이식유전자"는 하기 실시예에 개시된 바와 같은 방법으로 인간이 개입하여 인간 이외의 동물의 배선으로 도입된 DNA 서열이다. 이 경우 서열 번호 1 또는 3의 형태인 이식유전자의 핵산 서열을, 특정 핵산 서열이 그 밖의 경우에는 정상적으로 발견되지 않는 게놈의 유전자좌 또는 이식유전자의 정상 유전자좌에 통합시킬 수 있다. 이식유전자는 동일한 종 또는 표적 동물의 종과 다른 종의 게놈으로부터 유도되는 핵산 서열로 구성될 수 있다. 예를 들어, Nogo가 결여된 마우스의 축삭 재생을 MAG가 결여된 마우스 또는 MAG와 Nogo가 모두 결여된 마우스와 비교할 수 있다. 항-Nogo 항체의 효과가 Nogo 차단에 기인하는 것인지를 결정하기 위해서, Nogo 발현이 결여된 동물에서 항체 효과를 연구할 수 있다.
전술한 바와 같이, 벡터를 사용하여 본 발명의 핵산을 숙주 세포 내로 형질감염시킬 수 있다. 바람직한 벡터는 플라스미드 및 바이러스 벡터(예, 레트로바이러스)이다. 바이러스 벡터를 사용하여 본 발명의 유전자이식 동물을 생성할 수 있 다. 바람직하게는, 바이러스 벡터는 복제 결손형으로서, 즉 표적 세포에서 자발적으로 복제할 수 없다. 일반적으로 본 발명의 범위내에서 이용되는 복제 결손 바이러스 벡터의 게놈에는 감염된 세포 내의 바이러스 복제에 필요한 1 이상의 영역이 결여되어 있다. 이들 영역을 (전체 또는 부분적으로) 제거하거나, 또는 당업계에 공지된 임의의 기술로 비작용성이 되게 할 수 있다. 이들 기법은 전체 제거, 치환(다른 서열, 특히 삽입된 핵산 서열에 의한 치환), 부분 결실 또는 (복제에) 필수적인 영역으로의 1 이상의 염기의 첨가를 포함한다. 유전자 조작 기법을 사용하거나 또는 돌연변이유발제로 처리하여 이러한 기술들을 시험관내(분리된 DNA 상에서) 또는 동일계에서 실시할 수 있다.
복제 결손 바이러스는 바이러스 입자의 캡시드화에 필요한 게놈 서열을 보유하는 것이 바람직하다. 레트로바이러스는 분열 세포를 감염시키는 통합 바이러스이다. 레트로바이러스 게놈은 2개의 LTR, 캡시드화 서열과 3개의 암호화 영역(gag, pol 및 env)을 포함한다. 재조합 레트로바이러스 벡터의 작제에 대해서는 이미 기술된 바 있다(예컨대, Bernstein 등, (1985) Genet. Eng. 7, 235; McCormick, (1985) Biotechnol. 3, 689-691). 재조합 레트로바이러스 벡터에서, 일반적으로 gag, pol 및 env 유전자는 전체적 또는 부분적으로 결실되어 있고, 해당 이종 핵산 서열로 치환되어 있다. 이들 벡터는 상이한 종류의 레트로바이러스, 예컨대 HIV, MoMuLV(쥐 몰로니 백혈병 바이러스), MSV(쥐 몰로니 육종 바이러스), HaSV(하베이 육종 바이러스), SNV(비장 괴사 바이러스), RSV(라우스 육종 바이러스) 및 Friend 바이러스로부터 작제할 수 있다.
일반적으로, 핵산 서열을 함유하는 재조합 레트로바이러스를 작제하기 위해서, LTR, 캡시드화 서열 및 암호화 서열을 포함하는 플라스미드를 작제한다. 이 작제물을 이용하여 패키징 세포주를 형질감염시키는데, 이 세포주는 플라스미드에 결여되어 있는 레트로바이러스 기능을 트랜스로 공급할 수 있다. 일반적으로 패키징 세포주는 gag, pol 및 env 유전자를 발현할 수 있다. 이러한 패키징 세포주, 특히 세포주 PA317(미국 특허 제4,861,719호); PsiCRIP 세포주(W09002806) 및 GP+envAm-12 세포주(W08907150)는 종래 기술로서 공지되어 있다. 또한, 재조합 레트로바이러스 벡터는 gag 유전자의 일부를 포함할 수 있는 광범위한 캡시드화 서열 뿐 아니라 전사 활성을 억제하는 LTR 내의 변형을 포함할 수 있다(Bender 등, (1987) J. Virol. 61, 1639-1646). 재조합 레트로바이러스 벡터는 당업자에게 공지된 표준 기법으로 정제한다.
일 측면에서, 핵산은 안티센스 RNA 분자를 암호화한다. 이 구체예에서, 핵산은 핵산 서열의 발현을 가능하게 하는 적절한 조절 영역(전술됨)에 작동가능하게 결합되어 있으며, 일단 벡터가 세포 내로 도입되면 안티센스 핵산을 발현하는, 바람직하게는 재조합 벡터 작제물을 이용하여 세포 내로 도입할 수 있다. 적절한 벡터의 예로는 플라스미드, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스(예컨대 미국 특허 제4,797,368호, 미국 특허 제5,139,941호), 레트로바이러스(전술한 바와 같음), 및 헤르페스 바이러스를 들 수 있다. 치료 유전자의 전달을 위해서 벡터는 아데노 관련 바이러스인 것이 바람직하다.
아데노바이러스는 각종 세포 종류에 본 발명의 핵산을 효과적으로 전달하도 록 변형시킬 수 있는 진핵 DNA 바이러스이다. 아데노바이러스의 다양한 혈청형이 존재한다. 이들 혈청형 중에서, 2형 또는 5형 인간 아데노바이러스(Ad2 또는 Ad5) 또는 동물 기원의 아데노바이러스(W09426914 참조)를 본 발명의 범위 내에서 우선적으로 이용한다. 본 발명의 범위 내에서 사용할 수 있는 동물 기원의 아데노바이러스는 개, 소, 쥐, 양, 돼지, 조류 및 유인원 기원의 아데노바이러스를 포함한다.
본 발명의 복제 결손 재조합 아데노바이러스는 당업자에게 잘 알려진 임의의 기법으로 제조할 수 있다. 특히, 본 발명의 복제 결손 재조합 아데노바이러스는 무엇보다도 해당 DNA 서열을 보유하는 플라스미드와 아데노바이러스 간의 상동성 재조합으로 제조할 수 있다. 상동성 재조합은 상기 아데노바이러스 및 플라스미드를 적절한 세포주 내로 동시 형질감염시킨 후에 실시한다. 사용되는 세포주는 바람직하게는 (i) 상기 성분으로 형질전환가능하고, (ii) 복제 결손 아데노바이러스의 게놈의 일부를 보충할 수 있는 서열을, 바람직하게는 통합된 형태로 포함하여 재조합 위험을 피할 수 있어야 한다. 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 재조합 아데노바이러스를 회수 및 정제하며, 이들 기술은 당업자들에게 공지되어 있다.
활성화된 종양유전자 서열을 발현하는 것(미국 특허 제4,736,866호); 유인원 SV 40 T-항원을 발현하는 것(미국 특허 제5,728,915호); 인터페론 조절 인자 1(IRF-1)이 결여된 것(미국 특허 제5,731,490호); 도파민작용성 장애를 나타내는 것(미국 특허 제5,723,719호); 혈압 제어에 관여하는 1 이상의 인간 유전자를 발현하는 것(미국 특허 제5,731,489호); 자연 발생적 알츠하이머병에 존재하는 증상에 대한 높은 유사성을 나타내는 것(미국 특허 제5,720,936호); 세포 유착을 매개하는 능력이 감소된 것(미국 특허 제5,602,307호); 소 성장 호르몬 유전자를 보유하는 것(Clutter 등, (1996) Genetics 143, 1753-1760) 또는 완전한 인간 항체 반응을 생성할 수 있는 것(Zou 등, (1993) Science 262, 1271-1274)을 비롯하여, 다수의 재조합 또는 유전자이식 마우스가 제조되어 왔다.
마우스 및 래트는 대부분의 유전자이식 실험용으로 선택되는 동물이지만, 일부 경우 다른 동물 종을 사용하는 것이 바람직하거나, 또는 다른 종을 사용해야 한다. 유전자이식 절차는 양, 염소, 닭, 햄스터, 토끼, 소 및 기니아 피그를 비롯하여 각종 쥐 이외의 동물에서 성공적으로 이용되어 왔다(Aigner 등, (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 257, 843-850; Castro 등, (1999) Genet. Anal. 15, 179-187; Brink 등, (2000) Theriogenology 53, 139-148; Colman, (1999) Genet. Anal. 15, 167-173; Eyestone, (1999) Theriogenology 51, 509-517; Baguisi 등, (1999) Nat. Biotechnol. 17, 456-461; Prather 등, (1999) Theriogenology 51, 487-498; Pain 등, (1999) Cells Tissues Organs 165, 212-219; Fernandez 등, (1999) Indian J. Exp. Biol. 37, 1085-1092; 미국 특허 제5,908,969호; 미국 특허 제5,792,902호; 미국 특허 제5,892,070호; 미국 특허 제6,025,540호 참조).
N. 진단법
본 발명의 핵산 분자 또는 단백질을 이용하여 수초탈락 질병을 진단하는 한 방법은 살아있는 피험체로부터 조직 샘플을 얻는 것을 포함한다. 살아있는 피험체로부터 조직 샘플을 얻는 것은 중추신경계의 조직과 같은 조직의 경우에는 문제가 된다. 수초탈락 질병을 앓고 있는 환자로부터 진단법에 사용하기 위한 조직 샘플을 덜 침입적인 절차로 얻을 수 있다. 예를 들어, 전혈 및 혈청으로부터 샘플을 얻을 수 있다.
분자 생물학 도구의 사용은 법의학 기술에서는 일상적인 것이 되었다. 예를 들어, 핵산 프로브를 사용하여 법의학 병리 표본 중 서열 번호 1의 서열의 전부 또는 적어도 일부를 포함하는 핵산 분자의 발현을 측정할 수 있다. 또한, 전사 프로파일링 분석을 실시하는 임의의 수단으로 핵산 분석을 수행할 수 있다. 핵산 분석 외에도, 본 발명의 법의학 방법은 서열 번호 1이 암호화하는 단백질을 표적화하여 유전자의 상향 조절 또는 하향 조절을 결정할 수 있다(Shiverick 등, (1975) Biochim. Biophys. Acta 393, 124-133).
본 발명의 방법은 콜라게나제 또는 기타 프로테아제로 조직을 처리하여 조직을 세포 용해되도록 하는 것을 포함한다(Semenov 등. (1987) Biull. Eksp. Biol. Med. 104, 113-116). 또한, 분석을 위해 뇌의 다른 영역으로부터 생검 샘플을 얻을 수 있다.
본 발명의 핵산 또는 단백질 분자를 검출하는 분석법은 임의의 이용가능한 형식일 수 있다. 핵산 분자에 대한 통상적인 분석은 하이브리드화 또는 PCR계 형식을 포함한다. 본 발명의 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드 검출에 대한 통상적인 분석은 동일계 결합 분석과 같은 임의의 이용가능한 형식으로 항체 프로브의 사용을 포함한다. Harlow & Lane, (1988) Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press 참조. 바람직한 구체예에서, 분석은 적절한 대조군과 함 께 실시한다.
추가의 상세한 설명 없이도, 당업자는 전술한 설명 및 하기 예시적 실시예를 이용하여 본 발명의 화합물을 제조 및 이용하고 청구된 발명을 실시할 수 있을 것이라 생각된다. 따라서 하기 작업 실시예는 본 발명의 바람직한 양태들을 구체적으로 나타낸 것으로서, 어떠한 방식으로도 개시된 내용을 제한하는 것으로 해석해서는 안된다.
실시예 1- 단백질 레티쿨론과의 구성원으로서 Nogo의 동정
성체 포유류 축삭 재생은 일반적으로 말초계에서는 성공적이지만, CNS에서는 매우 불량하다. 그러나, 여러 종류의 CNS 축삭은 말초신경 이식편에서 길게 신장될 수 있다(Benfy & Aguayo (1982) Nature 296, 150-152). CNS와 말초신경계(PNS)의 수초를 비교한 결과 CNS 백질이 축삭 성장을 선택적으로 억제한다는 것이 밝혀졌다(Schwab & Thoenen (1985) J. Neurosci. 5, 2415-2423). 축삭 신장에 대한 억제 활성을 갖는 CNS 백질, NI35, NI250(Nogo) 및 MAG의 일부 성분이 개시된 바 있다(Wang 등, (1999) Transduction of inhibitory signals by the axonal growth cone, in Neurobiology of Spinal Cord Injury, Kalb & Strittmatter(편집인) Humana Press; Caroni & Schwab, (1988) J. Cell Biol. 106, 1281-1288; Spillmann 등, (1998) J. Biol. Chem. 73, 19283-19293; McKerracher 등, (1994) Neuron 13, 805-811; Mukhopadhyay 등, (1994) Neuron 13, 757-767). NI35 및 NI250(Nogo)에 대해 유도된 IN-1 항체는 척수 손상 후에 축삭 재생 및 기능 회복 정도를 조절하게 하는 것으로 보고되었다(Bregman 등, (1995) Nature 378, 498-501; Thallmair 등, (1998) Nature Neurosci. 1, 24-31). 본 발명은 레티쿨론 단백질과의 구성원으로서 Nogo를 확인한다.
희소돌기아교세포는 Nogo를 발현하지만 쉬반 세포는 발현하지 않으며, Nogo는 소포체와 주로 관련되어 있다. Nogo의 66 아미노산 내강-세포외 도메인(서열 번호 20)은 축삭 신장을 억제하고 배근 신경절 생장원추를 수축시킨다. 다른 레티쿨론 단백질은 희소돌기아교세포에 의해 발현되지 않으며, 다른 레티쿨론 단백질로부터 유래한 66 아미노산 내강-세포외 도메인은 축삭 재생을 억제하지 않는다. 이들 데이타는 성체 CNS에서 축삭 재생 실패에 대한 Nogo의 기여도를 평가하는 분자 기초를 제공한다.
재조합 Nogo-A의 발현 및 단백질 정제를 위한 전길이 서열(KIAA0886)은 카주사 DNA 조사 연구소가 충분히 공급하였다. 전길이 암호화 서열은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)으로 증폭시키고 pCDNA3.1-MycHis 벡터(인비트로겐) 내로 결찰시켜 Myc 에피토프에 대한 카르복실 말단에 융합된 Nogo-A(Nogo-A-Myc)를 암호화하는 플라스미드를 형성하였다. 대안적으로, 제1 잔기의 바로 아미노 말단의 프레임내 Myc 에피토프와 카르복시 말단의 종지 코돈(Myc-Nogo-A)을 암호화하는 프라이머를 사용하여 암호화 서열을 증폭시켰다. Nogo-C-MycHis 및 Rtn1C-MycHis 발현 벡터는 동일한 방법으로 유도하였지만, 단 성체 래트 뇌 cDNA 라이브러리를 PCR 반응에 대한 주형으로 사용하였고 프라이머는 Nogo-C 또는 Rtn1C 서열을 기초로 하였다(Van de Velde 등, (1994) J. Cell. Sci. 107, 2403-2416). 이들 플라스미드를 리포펙타민( 기브코-BRL) 또는 FuGENE 6(뵈링거 만하임)법으로 COS-7 또는 HEK293T로 형질감염시켰다.
Nogo-A의 66 아미노산 내강-세포외 단편을 암호화하는 Nogo-A의 일부분을 PCR로 증폭시키고 pGEX-2T 플라스미드로 결찰시켜 GST-Nogo 융합 단백질에 대한 원핵 발현 벡터를 산출하였다. Rtn1, Rtn2 및 Rtn3의 유사한 영역을 주형으로서 성체 래트 뇌 cDNA 라이브러리를 사용하여 네스트형(nested) PCR로 증폭시키고 pGEX-2T에 결찰시켰다. 이들 플라스미도로 형질전환된 이.콜리를 IPTG로 유도하였다. 가용성의 천연 GST 융합 단백질은 글루타티온-수지를 사용하여 정제하였으며 약 75% GST 및 25% 전길이 GST-Nogo 또는 GST-Rtn 단백질을 함유하였다. GST-Nogo 단백질의 대부분은 비변성 조건 하에서 추출가능하지 않지만, PBS에 대해 투석한 8M 우레아 추출물은 98% 이상의 순수한 GST-Nogo를 함유하였다.
Myc 면역반응성은 환원 조건 하에서 225 kDa 범위 내의 겉보기 크기로 검출할 수 있다(데이타는 제시되지 않음). 따라서, cDNA는 적절한 전기영동 이동성과 인간 Nogo-A(hNogo-A)라고 불리우는 Nogo가 될 아미노산 서열을 갖는 단백질의 발현을 유도한다.
Rtn과 단백질의 보존된 카르복실 꼬리는 66 아미노산 잔기 친수성 분절로 분리된 2개의 소수성 도메인을 포함한다. 어떤 서열도 신호 펩티드를 포함하지 않는다. 이들 단백질에 대한 추정 토폴로지는 아미노 말단 및 카르복실 말단이 시토졸 내에 존재하고, 보존 영역이 지질 이층과 회합한다는 것이다. Rtn1-A에 대하여, 폴리펩티드가 내재막 단백질로서 작용하고, 보존된 도메인의 소수성 분절이 이러한 작용을 담당함을 입증하는 실험적 증거가 있다(Van de Velde 등, (1994) J. Cell. Sci. 107, 2403-2416). Myc-태그된 Nogo는 특정 분획들과 관련이 있으며, 이온 강도가 높지 않은 세제로 추출된다(데이타는 제시되지 않음).
Rtn1 단백질이 신장 세포에서 과발현되는 경우, 이 단백질은 미세하게 과립화된 패턴으로 소포체(ER)에 주로 배치되므로 레티쿨론(Reticulon)이라 불리운다(Van de Velde 등, (1994) J. Cell. Sci. 107, 2403-2416). Nogo와 대부분의 Rtn 단백질의 카르복실 말단에 2-리신 ER 보유 모티프가 있다(Van de Velde 등, (1994) J. Cell. Sci. 107, 2403-2416; Jackson 등, (1991) EMBO J. 9, 3153-3162). 뉴런에서 Rtn1은 돌기 전체에서 발현되어 생장원추에 집중된다(Senden 등, (1996) Eur. J. Cell. Biol. 69, 197-213). 형질감염된 신장 세포에서의 Rtn1의 위치로부터 Rtn1이 단백질 분류 또는 ER 기능의 다른 측면을 조절한다는 것을 제안하게 되었다(Van de Velde 등, (1994) J. Cell. Sci. 107, 2403-2416). Nogo의 A 및 C 스플라이스 형태는 COS-7 세포에서 발현되는 경우 망상 분포를 나타내며, 이는 Rtn1-C의 것과 유사하다.
실시예 2- Nogo에 대한 폴리클론 항체
Nogo의 2개의 소수성 도메인의 추정 막내 토폴로지는 이들 분절 사이의 66 아미노산 잔기가 막의 내강/세포외 면에 배치됨을 제시한다. 이를 추가로 연구하기 위해서, 66 아미노산 도메인에 대해 유도된 항혈청을 생성하였다.
항체 생성 및 면역조직학을 위해서 9E10 항체를 이용한 항-Myc 면역블롯 및 면역조직학을 문헌[Takahashi 등, (1998) Nature Neurosci., 1, 487-493 & Takahashi 등, (1999) Cell, 99, 59-69]에 개시된 바와 같이 얻었다. GST-Nogo 융합 단백질은 항-Nogo 토끼 항혈청을 생성하는 면역원으로서 사용하였다. 항체를 친화도 정제하고 면역조직학을 위해서 3 ㎍/㎖, 면역블롯을 위하여 1 ㎍/㎖를 사용하였다. 항혈청의 특이성을 평가하기 위해서, 0.1 ㎎/㎖의 GST-Nogo 단백질의 존재하에 염색을 실시하였다. 0.05% BSA 및 20 mM Na-Hepes(pH7.3)를 함유하는 행크스 균형 염용액에서 4℃에서 1시간 동안 1차 항체 희석액 중에서 세포를 배양하여 생세포 염색하였다. 고정 후에, 형광 표지된 2차 항체와 함께 배양하여 결합된 항체를 검출하였다.
항체는 이 에피토프의 표면 발현을 낮은 수준으로 검출하지만, 발현된 Nogo의 카르복실 말단에서 Myc 에피토프는 세포가 투과성이 되지 않으면 검출되지 않는다. 표면 염색은 ER 막보다는 혈장막과 회합된 소수의 Nogo 단백질에 기인한다. 이 데이타는 단백질의 아미노 및 카르복실 말단이 세포질에 존재하고 단백질의 66 아미노산이 ER막 또는 혈장막의 내강-세포외 측에 돌출된 토포그래피 모델을 뒷받침한다.
실시예 3- 중추신경계에서의 Nogo 발현
PNS 수초와 비교하여 CNS 수초의 축삭 성장 억제 특성의 주요 원인이 Nogo라면(Caroni & Schwab, (1988) J. Cell Biol. 106, 1281-1288; Spillmann 등, (1998) J. Biol. Chem. 73, 19283-19293; Bregman 등, (1995) Nature 378, 498-501), Nogo는 성체 CNS 수초에서는 발현되지만 PNS 수초에서는 발현되지 않아야 한다. 5' Nogo-A/B 특이적 영역으로부터 유도된 프로브와 cDNA의 3' Nogo 공통 영역으로부터 유도된 프로브를 사용하여 Nogo 발현의 노던 블롯 분석을 실시하였다. 성체 래트 시신경 총 RNA 샘플에서 5' 프로브를 이용한 경우에는 약 4.1 kb의 단일 밴드가 검출되었지만, 좌골 신경 샘플에서는 검출되지 않았다. 이 결과는 Nogo-A 클론이 전길이 cDNA이고 CNS-수초-특이적 축삭 성장 억제제로서 Nogo의 역할과 일치함을 시사한다. 3' 프로브를 이용한 노던 블롯 분석으로부터 시신경이 높은 수준의 Nogo-A mRNA와 휠씬 낮은 수준의 Nogo-B 및 Nogo-C를 발현함이 밝혀졌다. 전체 뇌는 Nogo-A와 Nogo-C를 모두 발현하지만, 다수의 말초 조직(좌골 신경 포함)은 Nogo를 거의 또는 전혀 발현하지 않는다. Nogo-C/Rtn4-C가 골격근 및 지방세포와 뇌에서 발현됨이 입증되었다(Morris 등, (1991) Biochim. Biophys. Acta 1450, 68-76). Rtn과에서, 시신경 발현은 Nogo에 대해 선택적인 것으로 보이며, Rtn1 또는 Rtn3의 발현은 검출되지 않는다. Rtn2는 검사하지 않았다.
동일계 하이브리드화는 성체 래트의 시신경 및 피라밋로에서 희소돌기아교세포의 형태를 갖는 세포에서 Nogo mRNA를 찾았다. 뇌의 일부 뉴런 군에서 Nogo 발현이 검출된다. Rtn1 및 Rtn3은 Nogo와는 대조적으로 시신경에서 발현되지 않지만, mRNA가 일부 뉴런군에서 검출된다. 항-Nogo 항체 및 희소돌기아교세포 특이적 O4 모노클론 항체를 이용하여, 희소돌기아교세포 분화를 유도하기 위해서 PDGF와 저 혈청으로 처리한 척수 배양물에서 Nogo 단백질 위치를 분석하였다. 생세포에서는 Nogo의 내강-세포외 66 아미노산 루프 및 O4 항원이 희소돌기아교세포의 표면에서 검출된다. 이들 배양물 중 O4 양성 세포의 약 1/2은 Nogo 표면 염색을 나타낸다.
실시예 4- Nogo 매개형 생장원추 수축
세포 배양을 비롯한 모든 실험에서 다음 방법을 사용하였다. 배아 병아리 E10 및 E12 배근 신경절 외식편과 분리된 뉴런의 배양에서는 E7 배근 신경절 배양에 대해 개시된 방법을 이용하였다(Takahashi 등, (1998) Nature Neurosci. 1, 487-493; Takahashi 등, (1999) Cell 99, 59-69; Goshima 등, (1995) Nature 376, 509-514; Jin & Strittmatter, (1997) J. Neurosci.7, 6256-6263). NGF-분화된 PC12 세포를 개시된 바와 같이 배양하였다(Strittmatter 등, (1994) J. Neurosci. 14, 2327-2338). 배아 척수 외식편(래트 E10 또는 병아리 E5)을 PDGF-AA의 존재하에 7∼14일 동안 배양하여 일부 세포의 성숙 희소돌기아교세포로의 분화를 유도하였다(Vartanian 등, (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 731-735). 생장원추 수축 분석에 대한 절차는 Sema3A 유도된 생장원추 수축의 분석에 대한 절차와 동일하다(Takahashi 등, (1998) Nature Neurosci. 1, 487-493; Takahashi 등, (1999) Cell 99, 59-69; Goshima 등, (1995) Nature 376, 509-514; Jin & Strittmatter, (1997) J. Neurosci. 17, 6256-6263). 총 신경돌기 성장의 분석 방법도 이미 개시된 바 있다(Goshima 등, (1995) Nature 376, 509-514; Jin & Strittmatter, (1997) J. Neurosci. 17, 6256-6263; Strittmatter 등, (1994) J. Neurosci. 14, 2327-2338). 성장 분석에서, 유착 세포의 전체 수에 미치는 임의의 영향을 최소화하기 위해서 평판 배양 1시간 후에 단백질과 펩티드를 첨가하였다. 기질-결합된 GST 또는 GST-Nogo의 효과를 시험하기 위해서, 단백질 용액을 폴리-L-리신으로 코팅된 유리 상에서 건조하고, 세척하고, 라미닌으로 코팅하였다. E12 배양물에서 세포의 뉴런의 존재는 항-신경세사 항체(2H3, 디벨로멘탈 스터디즈 하이브리도마 뱅크)로 염색하여 확인하고, 돌기 중 F-액틴의 로다민-팔로이딘 염색을 관찰하여 신경돌기를 찾아내었다.
HEK293T 세포에서의 재조합 Nogo의 발현으로 이 단백질이 축삭 성장 억제 효과를 갖는지 여부를 엄격히 시험할 수 있다. 벡터- 또는 hNogo-A-Myc-형질감염된 HEK293T 세포 유래의 세척된 막 분획을 병아리 E12 배근 신경절 외식편 배양물에 첨가하였다. 고정 및 로다민-팔로이딘 염색시켜 37℃에서 30분간 배양한 후에 생장원추 형태를 평가하였다.
대조군 HEK 막에는 생장원추 형태에 대한 검출가능한 효과가 없다. Nogo-A 함유 막 분획은 대부분의 배근 신경절 생장원추의 수축을 유도하였다. 이 생장원추 수축은 축삭 성장 억제 활성을 나타내며, 축삭 신장의 Nogo 억제가 나타날 수 있다(하기 참조). Nogo-C 형태는 수축 활성을 나타내는데, 이는 소수성 분절과 66 아미노산 내강-세포외 도메인을 포함하는 단백질의 공유된 카르복실 말단이 기능적으로 중요한 잔기를 포함함을 제시하는 것이다. Nogo-A의 아미노 말단 영역에서의 추가의 억제 활성은 이들 연구에서 배제되지 않는다. E10 병아리 배아 또는 E15 래트 배아에서 얻은 더욱 미성숙한 외식편 배양물의 감도(제시되지 않음)는 실질적으로 낮다. 감도의 발생 단계 조절은 부분적으로 정제된 Nogo를 이용한 실험 결과와 일치한다(Bandtlow 등, (1997) Eur. J. Neurosci. 9, 2743-2752).
생장원추를 수축시키는 Nogo-C 단백질에서, 친수성 66 내강-세포외 도메인은 막에 매립된 소수성 도메인에서보다 배근 신경절 뉴런의 표면과의 상호작용이 더욱 클 것으로 예상된다. 이 가설을 시험하기 위해서 hNogo의 66 아미노산 영역을 이. 콜리에서 발현시키고 정제하였다. GST-Nogo 융합 단백질의 대부분은 봉입체에 축적되지만, 우레아 추출로 회수할 수 있다. Nogo 중 제한된 영역은 병아리 E12 배근 신경절 뉴런에 대한 강력한(EC50= 50 nM) 생장원추 수축 활성을 보유한다(데이타는 제시되지 않음). 우레아로 추출된 단백질 제제는 활성 구조의 Nogo 서열의 작은 분획만을 제공할 것으로 생각된다. 따라서, 이.콜리 내에서 가용성인 GST-Nogo의 10%를 글루타티온-세파로스 수지로 정제하였다. 이 제제는 우레아로 추출한 단백질보다 수축 인자로서 더욱 강력하여, 1 nM 정도로 낮은 농도에서도 생장원추 형태를 결정적으로 변형시킨다.
나노몰 효능은 가장 잘 알려진 축삭 안내의 생리적 조절인자이다. 배근 신경절 뉴런과 NGF-분화된 PC12 세포에서 유래한 축삭 성장은 nM 농도의 가용성 GST-Nogo 단백질에 의해 차단된다(데이타는 제시되지 않음). GST-Nogo가 기질 표면에 결합하면, 배근 신경절 뉴런 또는 PC12 세포에서 유래한 축삭 외향 성장이 검출가능하지 않은 수준으로 감소한다. GST-Nogo는 신경세사-양성 유착 세포의 수를 감소시키지 않고(GST-처리된 배양물의 137 ±24%) DAPI 염색에 의해 확인되는 세포고사 핵의 수도 유의적으로 변화시키지 않기 때문에(대조군 배양물에서 4.0 ±1.7%, GST-Nogo 처리된 표본에서 5.2 ±1.1%), 이들은 세포 생존보다는 축삭 성장에 대한 선택적인 효과가 있다.
희소돌기아교세포는 Rtn 단백질 중에서 Nogo를 선택적으로 발현하는 것으로 보인다. 축삭 재생의 억제시 Nogo 역할의 선택성을 연구하기 위해서, 다른 Rtn 단백질의 축삭 성장 억제 활성을 고려하였다. Rtn1, Rtn2 및 Rtn3의 추정 내강-세포외 66 아미노산 단편을 GST 융합 단백질로서 발현시키고 천연 형태로 정제하였다. Nogo 단편이 대부분의 E12 배근 신경절 생장원추를 수축시키는 농도에서, 다른 Rtn 단백질은 생장원추 형태를 변형시키지 않는다(데이타는 제시되지 않음). 따라서, 축삭 재생 억제 활성은 Rtn과 중에서 Nogo에 대해 특이적이다.
실시예 5- Nogo 수용체 펩티드 제제
Nogo의 활성 도메인을 추가로 한정하기 위해서, 66 아미노산 서열의 분절에 해당하는 25 아미노산 잔기 펩티드를 합성하였다. Nogo의 세포외 단편 중 잔기 31-55에 해당하는 펩티드는 4 μM의 농도에서 생장원추 수축 활성(도 2)과 성장 억제 활성(데이타는 제시되지 않음)을 나타낸다. 이 서열은 억제 도메인의 중심부를 제공할 수 있지만, 66 아미노산 단편이 완전한 효능에 필요한 것은 명백하다. 흥미롭게도, 이것은 다른 Rtn 단백질에 대한 최소한의 유사성을 공유하는 66 아미노산 도메인 내의 영역이며, 다른 과의 구성원이 축삭 재생 억제제로서 불활성이라는 것과 일치한다. 실제로, Rtn1 31-55 아미노산 내강-세포외 펩티드는 생장원추 수축 활성을 나타내지 않는다(데이타는 도시되지 않음).
전술한 실험 데이타는 Nogo가 Rtn과의 희소돌기아교세포 특이적 구성원임을 확인하며, Nogo의 분리된 도메인이 축삭 성장을 억제할 수 있음을 입증한다. 다른 Rtn 단백질은 이러한 활성을 보유하지 않는다. Nogo가 쉬반 세포에서가 아니라 희소돌기아교세포에서 발현되기 때문에 성체 포유류 PNS와 비교하여 성체 포유류 CNS에서 축삭 재생이 되지 않는 것이다. 기타 CNS 수초 성분과 비교하여 CNS 백질의 비허용 특성에 대한 Nogo의 상대적인 기여도를 분자 수준에서 특성규명할 수 있다.
현재의 실험 데이타는 병리적 손상 후에 성체 CNS 축삭 재생을 차단하는 데 있어서 Nogo의 역할과 일치하는 것이지만, 비병리 상태에서의 Nogo의 생리적 역할과도 관련이 있을 수 있다. 위치 연구를 기초로, 다른 Rtn 단백질이 ER 기능에서 역할을 하는 것으로 생각된다(Van de Velde 등, (1994) J. Cell. Sci. 107, 2403-2416). 대부분의 Nogo는 COS-7 세포에서 망상 패턴으로 분포되어 있으며, 소수의 Nogo만이 세포 표면에 접근가능한 것으로 보인다.
실시예 6- Nogo 활성의 억제
앞의 실시예로부터 Nogo의 카르복실 말단 부근의 66 아미노산 영역이 축삭 성장을 억제하고 세표 표면에서 발현된다는 것을 확인하였다. 이 도메인의 더 짧은 25 아미노산 분절은 성장 억제제로서 불활성이거나 또는 효능이 휠씬 낮다(GrandPre 등, (2000) Nature 403, 439-444). 66 아미노산 분절 유래의 31-55 영역에서는 생장원추 수축과 축삭 성장 억제 활성이 약하다. 생체내 Nogo 작용을 차단하기 위해서는, 동일한 수용체 부위에 결합하지만 그 자체로는 생물학적 효과를 나타내지 않는 Nogo의 경쟁적 길항제가 매우 바람직하다. Nogo 매개형 축삭 성장 억제의 차단제로서 66 아미노산 영역의 각종 단편을 시험하였다. 이러한 목적으로 2가지의 분석을 사용하였다. 제1 분석은 생장원추 수축 분석이고, 제2 분석은 결합 분석이다.
생장원추 수축 분석에서는 각종 유효한 길항작용의 펩티드의 존재 하에 Nogo에 대한 반응을 측정하였다. 66 아미노산 영역에서 유래한 25개의 아미노산 펩티드 중 3개(1-25, 11-35 및 21-45)는 μM 농도에서 차단 활성을 보유한다(도 2). 3개 펩티드 모두를 조합하면 기본 조건 하에서 생장원추 형태를 변화시키지 않지만 15 nM GST-Nogo에 의한 수축은 전체적으로 방지한다. 펩티드의 동일 혼합물은 저용량의 CNS 수초가 유도하는 생장원추 수축을 차단할 수 있다. 이러한 차단은 Nogo가 CNS 수초의 주요 억제 성분이라는 가설을 뒷받침한다. 또한, 이러한 차단은 경쟁 길항작용에 대해 예상되는 특성으로서, 고용량의 CNS 수초에서는 효과가 없다.
특이성과 효능이 더욱 높은 길항제를 개발하기 위해서, Nogo의 더욱 긴 단편을 시험하였다. 이러한 펩티드 자체는 독립적으로 축삭 성장 억제 활성을 갖지는 않지만 Nogo 작용을 경쟁적으로 차단한다. Nogo의 2-41 단편은 카르복시 말단에서 아세틸화하고 아미노 말단에서 아미드화하며, 이는 현재까지 정의된 Nogo의 최대 강력한 차단제이다. Pep2-41은 GST-Nogo가 유도하는 생장원추 수축을 제거하고 결합 분석에서 겉보기 Ki가 150 nM이다(도 3). 또한 2-41 단편은 정제된 Nogo-66 단백질과 미정제 CNS 수초가 배양된 뉴런에서 신경돌기 성장을 억제하는 능력을 차단한다(도 4).
실시예 7- Nogo 수용체의 확인
세마포린 및 에프린 축삭 안내 기능을 검사하는 데 널리 사용되는 방법을 이용한 Nogo 결합 분석을 개발하였다(Flanagan & Vanderhaeghen, (1998) Annu. Rev. Neurosci. 21, 309-345; Takahashi 등, (1999) Cell 99, 59-69). 이 방법은 해당 리간드에 분비된 태반 알칼리 포스파타제(AP) 부분을 융합시켜 고감도 비색 분석으 로 검출할 수 있는 생물학적 활성 수용체 결합제를 제공하는 것을 포함한다. Nogo를 위해서, 신호 펩티드, 정제용 His6 태그, AP 및 Nogo의 66 아미노산 활성 도메인을 암호화하는 발현 벡터를 만들었다. 융합 단백질은 ㎍ 양으로 형질감염된 세포의 조정 배지로부터 정제할 수 있다(도 5). 이 단백질은 생장원추 수축제로서 생물학적 활성이 있으며, EC50은 1 nM이다. AP-Nogo는 GST-Nogo보다 실질적으로 약간 더 강력하며, 그 이유는 단백질이 원핵 세포보다는 진핵 세포에서 합성되기 때문인 것으로 추정된다. 초기 연구 결과 축삭 상에 포화가능하고 친화도가 높은 부위가 있다는 것이 밝혀졌다. 결합은 GST-Nogo와 길항작용의 25 아미노산 펩티드로 차단되는데, 이는 뉴런 수용체 부위에 대한 경쟁적 결합 결과와 일치하는 것이다. 수축 분석에서 이들 부위에 대한 겉보기 Kd(3 nM)가 AP-Nogo의 EC50과 밀접하기 때문에, 이 부위들이 생리학적으로 관련된 Nogo 수용체일 것으로 생각된다.
이 분석을 Nogo 수용체의 발현 클로닝에 이용하였다. 250,000 독립 클론을 제공하는 마우스 성체 뇌 cDNA 발현 라이브러리의 푸울을 비뉴런 COS-7 세포로 형질감염시켰다. 형질감염되지 않은 COS-7 세포는 AP-Nogo에 결합하지 않지만, 5,000 클론으로 이루어진 2개의 푸울로 형질감염시키면 강한 AP-Nogo 결합을 갖는 일부 세포가 생겼다. Nogo 결합 부위를 암호화하는 단일 cDNA 클론을 2개의 양성 푸울 각각으로부터 친계 선별하여 분리하였다. 하나의 클론에는 5' 비번역 영역의 100 bp 신장부가 있다는 것을 제외하고는 2개의 독립적으로 분리된 클론은 서로 동일하다. 이들 클론을 COS-7 세포 내로 형질감염시키면 E13 배근 신경절 뉴런에서 관찰 되는 것과 동일한 AP-Nogo에 대한 친화도를 갖는 결합 부위가 생긴다; 결합에 대한 Kd는 약 3 nM이다(도 6). AP는 단독으로 이들 형질감염된 세포에 임의의 검출가능한 친화도로 결합하지 않으며, 이는 친화도가 Nogo에서 유도된 66 아미노산으로부터 기인하는 것임을 시사한다. 또한, 이들 부위에서 GST-Nogo가 AP-Nogo를 대신한다.
이 cDNA는 신규 473 아미노산 단백질을 암호화한다. 젠뱅크에서 유의적인 상동성이 있는 cDNA를 보고한 바 없다. 추정 단백질은 단일 펩티드와 그 뒤에 8개의 류신 풍부 반복 영역, 고유 도메인 및 추정 GPI 고정 부위를 포함한다(도 7). 89% 아미노산 동일성을 공유하는 쥐 cDNA의 인간 상동체가 확인되었다. 이 cDNA의 존재는 쥐 cDNA 구조와 인간 서열결정 프로젝트의 일부로서 젠뱅크에 기탁된 인간 게놈 서열의 분석으로부터 추정하였다. 인간 cDNA의 엑손은 35 kb에 걸쳐 분포되어 있으며, 이 cDNA는 게놈 서열에서 이전에 인식되지 않았다. 단백질 구조는 Nogo를 결합시킬 수 있는 세포 표면 단백질과 일치한다. 단백질의 GPI 결합 특성은 혈장막에 걸쳐있고 Nogo 신호 변환을 매개하는 2차 수용체 서브유닛이 있을 수 있음을 제안한다.
실시예 8- Nogo 수용체의 조직 분포
Nogo 수용체에 대한 mRNA의 분포는 성체 CNS에서 축삭 재생과 적응성을 조절하는데 있어서 단백질의 역할과 일치한다. 노던 분석 결과 성체 뇌에서 2.3 kb의 단일 밴드가 확인되며, 이는 분리된 Nogo 수용체 클론이 전길이임을 시사하는 것이다(도 8). 낮은 수준의 mRNA가 심장 및 신장에서 관찰되지만 다른 말초 조직에서는 관찰되지 않는다. 뇌에서 발현은 보편적인 것이며, 회백질이 최대량으로 존재하는 영역에서는 최고 수준의 mRNA가 발현된다.
실시예 9- 상이한 Nogo 도메인의 생물학적 효과
Nogo-A 기능 분석은 생장원추 수축, 신경돌기 성장 및 기질 결합된 단백질 제제 및 가용성인 단백질 제제를 이용한 섬유아세포 확산을 포함한다(Caroni & Schwab, (1988) J. Cell Biol. 106, 1281-1288; GrandPre 등, (2000) Nature 403, 439-444; Chen 등, (2000) Nature 403, 434-439; Prinjha 등, (2000) Nature 403, 483-484). 3T3 섬유아세포 형태 분석에서, 기질 결합된 Nogo-66은 확산을 억제하지 않는다(도 1b, e). NI250 제제 및 전길이 Nogo-A는 3T3 확산에 대해 허용되지 않기 때문에, Nogo의 다른 도메인이 시험관내 활성에서 이를 조장하는 지를 고려할 필요가 있었다. 다른 Nogo-A 도메인의 비교를 용이하게 하기 위해서, 산성 아미노 말단 1040 아미노산 단편(아미노-Nogo)을 HEK293T 세포에서 Myc-his 태그된 단백질로서 발현시켰다(도 1d). Nogo 단백질은 시토졸 분획에 존재한다. 정제된 아미노-Nogo 단백질로 코팅된 표면은 3T3 섬유아세포 확산을 지탱하지 못한다(도 1b, e). 신장에서 유도된 세포주 COS-7에 대해서도 유사한 결과가 관찰되었다(도 1f). 따라서, 아미노 말단 도메인은 전길이 Nogo-A가 섬유아세포에 미치는 효과의 원인이 되는 것으로 보인다. Nogo-66 도메인은 뉴런에 대해 특이적이며, 비뉴런 세포에는 영향을 미치지 않는다.
배근 신경절 배양물을 아미노-Nogo 단백질에 노출시켰다(도 1c, g-i). 3T3 섬유아세포에 대하여, 배근 신경절 배양물 중 섬유아세포형 세포는 기질 상에서 확산되지 않는다. 또한, 축삭 성장은 아미노-Nogo 코팅된 표면 상에서는 낮은 수준으로 감소된다. 따라서, Nogo-66 작용이 신경 특이적인 반면, 아미노-Nogo 도메인의 억제 작용은 더욱 일반화되어 있다. Nogo-66 폴리펩티드가 100 nM에서 가용성 형태로 존재하는 경우, 전술한 바와 같이 이 폴리펩티드는 병아리 E12 배근 신경절 생장원추를 수축시키고 축삭 신장을 거의 제거한다(GrandPre 등, (2000) Nature 403, 439-444). 이와는 현저히 다르게, 가용성 아미노-Nogo 단백질은 불활성인 것으로 보이며, 배근 신경절 생장원추 형태 또는 배근 신경절 축삭 신장 또는 비뉴런 세포 확산을 유의적으로 조절하지 않는다(도 1c, g-i).
Walsh 및 그 연구진들의 실험(Prinjha 등, (2000) Nature 403, 483-484)에서, 소뇌 과립 뉴런을 연구하고 가용성 아미노-Nogo를, 아마도 이량체 형태의 Fc 융합 단백질로서 제공하였다. 따라서, 이들 차이가 가용성 아미노-Nogo의 불활성을 설명할 수 있는 지를 고려해야 한다. 마우스 P4 소뇌 과립 뉴런은 병아리 E13 배근 신경절 뉴런과 구별되지 않는 방식으로 Nogo 제제에 반응한다(도 1i). 항-Myc 항체로 이량체화된 아미노-Nogo는 3T3 및 COS-7 확산을 억제하며(도 1e, f) 소뇌 축삭 성장을 감소시키는 경향이 있다(도 1i). 아미노-Nogo가 항-마우스 IgG 항체의 첨가로 추가로 응집되는 경우, 아미노-Nogo는 배근 신경절 및 소뇌 축삭 성장을 상당히 감소시킨다(도 1h, i). 아미노-Nogo 단백질이 매우 산성이지만, 폴리-Asp가 세포 확산 또는 축삭 성장을 변화시키지 않기 때문에 정전하만으로는 억제 효과를 설명할 수 없다(도 1e, f, h). 따라서 Nogo-66 도메인은 강력한 뉴런 특이적 억제제이지만, 세포내 아미노-Nogo 도메인은 다수의 세포 종류를 억제하고 응집된 상태에서만 기능하는 것으로 보인다.
실시예 10- Nogo 수용체의 위치결정
Nogo-66 수용체 단백질의 발현을 추가로 특성규명하기 위해서, GST-Nogo 수용체 융합 단백질에 대한 항혈청을 개발하였다. 항혈청은 Nogo-66 수용체 발현 HEK293T 세포에서 선택적으로 85 kDa 단백질을 감지하고(도 9a), Nogo-66 수용체를 발현하는 COS-7 세포를 특이적으로 염색한다(도 9b). 병아리 배아 척수 배양물의 면역조직학적 염색이 축삭에 대한 단백질에 집중되는데, 이는 Nogo-66이 유도하는 축삭 성장 억제의 매개와 일치하는 것이다. Nogo-66 수용체 발현은 Nogo-66을 발현하는 O4-양성 희소돌기아교세포에서 발견되지 않는다. 면역반응성 85 kDa 단백질은 병아리 E13 배근 신경절로부터 얻은 Nogo-66-반응성 뉴런 제제에서 발현되지만, 병아리 E7 배근 신경절과 병아리 E7 망막에서 유래하는 약하게 반응하는 조직에서는 휠씬 적은 정도로 발현된다(도 9a). 전체적으로, Nogo-66 발현 패턴은 Nogo-66 축삭 억제를 매개하는 단백질과 일치한다.
이 항체는 조직 절편에서 Nogo-66 수용체 단백질의 위치를 결정하는 데 효과적이다(도 9c). 동일계 하이브리드화 연구로부터 단백질이 여러 종류의 뉴런에서 발현됨이 명백하지만, 면역조직학으로부터 단백질이 축삭과 일치하는 프로필의 CNS 백질에서 높은 수준으로 존재함이 밝혀졌다. 단백질은 뉴런 핵주체 및 신경막에서 낮은 수준으로 검출가능하다. 이러한 결과는 희소돌기아교세포와 상호작용을 매개하는 데 있어서 단백질의 제안된 기능을 추가로 지지한다.
실시예 11- Nogo 수용체는 Nogo-66 반응을 매개한다
Nogo-66 수용체 단백질은 단순히 축삭 성장의 억제와 관련없는 기능을 갖는 결합 부위에 대해서가 아니라 Nogo-66 작용에 필요하다. 제1 예측은 뉴런 표면으로부터 글리코포스파티딜이노시톨(GPI)-결합된 단백질을 제거하기 위해서 포스포이노시톨 특이적-포스포리파제 C(PI-PLC) 처리를 하여 뉴런을 Nogo-66에 대해 불감성이 되도록 할 수 있다는 것이다. 이러한 추측은 병아리 E13 배근 신경절 뉴런에 대해서는 성립한다; PI-PLC를 처리하면 AP-Nogo 결합과 GST-Nogo-66이 유도하는 생장원추 수축이 없어진다(도 10a-c). 대조군으로서, 평행 배양물 내 Sema3A 반응은 PI-PLC 처리로 변경되지 않는다. 물론, PI-PLC 처리는 축삭 표면으로부터 다수의 단백질을 제거하는 것으로 추정되며, 따라서 이러한 결과는 다른 GPI-결합된 단백질이 미처리된 배양물에서 Nogo-66 반응을 매개할 가능성을 열어두고 있다.
Nogo-66 수용체가 축삭 성장의 Nogo-66 억제를 매개할 수 있음을 입증하기 위해서, Nogo-66 반응이 결여된 뉴런에서 단백질을 발현시켰다. E7 병아리 배아에서 유래한 배근 신경절과 망막 뉴런을 검사하였다. 발육 단계로부터 얻은 배근 신경절 뉴런에서의 Nogo 반응은 약하지만, 일부 배양물에서 약간의 반응이 검출될 수 있다(데이타는 제시되지 않음). E7 망막 신경절 세포 생장원추는 Nogo-66이 유도하는 생장원추 수축에는 균일하게 불감성이지만(도 10e), AP-Nogo에는 결합하지 않고(데이타는 제시되지 않음) 85 kDa 항-Nogo-66 수용체 면역반응성 단백질을 나타내지 않는다(도 9a). 재조합 HSV 제제로 감염시킨 이들 뉴런에서의 NgR 발현으로 망막 신경절 세포 축삭 생장원추가 Nogo-66이 유도하는 수축에 감수성이 된다. 대조군 PlexinA1을 발현하는 대조군 HSV 제제로 감염시키면 Nogo 반응이 변하지 않는다. 이들 데이타는 여기서 확인된 Nogo 수용체가 Nogo-66의 축삭 재생 억제에 관여함을 제시한다.
실시예 12- Nogo-66 수용체의 구조 분석
Nogo-66 수용체 구조를 검사하여 어떤 영역이 Nogo-66 결합을 매개하는 지를 결정하였다. 단백질을 단순히 류신 풍부 반복부와 비-류신 풍부 반복부 영역으로 나눈다. 결실 분석은 류신 풍부 반복부가 Nogo-66 결합에 필요하지만 나머지 단백질은 필수적인 것은 아님을 명백히 보여준다(도 11). 류신 풍부 반복부 도메인 내의 2개의 도메인이 별도로 결실되어 있었다. 이것이 전체 류신 풍부 반복 도메인 구조를 유지하는 것으로 추정되며, 류트로핀 수용체에 대해서도 유사한 방법을 이용하였다. Nogo-66 결합은 모두 8개의 류신 풍부 반복부를 필요로 하는 것이 명백하며, 평면 구조의 중요한 분절이 류신 풍부 반복부의 선형 병풍 구조에 의해 형성됨을 제안한다. 류신 풍부 반복부의 각 말단에서 류신 풍부 반복부-아미노 말단과 류신 풍부 반복부-카르복시 말단 보존된 시스테인 풍부 영역이 Nogo-66 결합에 필요하며, 아마도 이들은 적절한 류신 풍부 반복부 구조를 형성하는 데 필요할 것이다.
실시예 13- 가용성 Nogo 수용체 엑토도메인 단백질에 의한 Nogo의 차단
Nogo 수용체에 Nogo-66이 결합하여 개시되는 신호 변환 캐스케이드를 차단하는 한 방법은 수용체의 과량의 가용성 엑토도메인을 제공하는 것이다. Nogo 수용체 단백질의 분비 단편을 HEK293T 세포에서 생성하였다. 쥐 Nogo 수용체의 아미노산 잔기 1-348을 암호화하는 cDNA를 진핵 발현 벡터에 결찰시키고 그 DNA를 HEK293T 세포로 형질감염시켰다. 이들 세포 유래의 조정 배지는 Nogo 수용체 단편(NgR-엑토)을 고 농도로 함유하였으며, 이는 항-NgR 항체와의 면역블롯으로 입증되었다. 조정 배지는 1ℓ당 NgR-엑토 단백질 약 1 ㎎을 함유한다. 전길이 Nogo 수용체를 발현하는 COS-7 세포 또는 배근 신경절 뉴런에 대한 AP-Nogo 결합 분석에서, NgR-엑토 조정 배지를 첨가하면 0.5 nM AP-Nogo-66 결합이 80% 감소한다. 가용성 NgR-엑토와 Nogo-66 간의 복합체 형성은 세포 표면 수용체에 결합하는 것을 막는다.
일부 수용체 시스템에서, 각 가용성 수용체 리간드 복합체는 무효한 상호작용을 형성함으로써 신호 전달을 차단할 수 있다. 예를 들어, Trk의 가용성 엑토도메인은 뉴로트로핀 신호전달을 차단하는 작용을 하며, 이러한 목적으로 널리 사용되어 왔다(Shelton 등, (1995) J. Neurosci. 15, 477-491). 한편, Nogo-66/NgR-엑토 가용성 복합체를 추정 제2 경막 Nogo 수용체 서브유닛에 결합시켜 이를 자극할 수 있다. GDNF과 수용체의 연구에서는 이러한 유형의 효과가 선행된다(Cacalano 등, (1998) Neuron 21, 53-62). Nogo-66/NgR-엑토 복합체는 Nogo-66 수용체가 결여되어 있지만 Nogo 신호전달 경로의 다른 성분을 함유하는 뉴런(병아리 E7 망막 신경절 세포)에서 생장원추 수축을 유발하지 않는다. 이는 NgR-엑토가 Nogo-66 신호전달 차단제로서 기능함을 제시하는 것이다.
직접 시험에서, NgR-엑토 단백질은 Nogo-66의 억제 효과로부터 축삭을 보호한다. NgR-엑토는 Nogo-66이 유도하는 생장원추 수축을 방지하고 Nogo-66이 유도하는 병아리 E13 DRG 뉴런 유래의 신경돌기 성장의 억제를 차단한다(도 12). 또한, NgR-엑토 단백질이 존재하면 CNS 수초가 시험관 내에서 축삭 성장을 억제하는 능력이 차단된다(도 12). 이들 데이타는 NgR-엑토 단백질이 생체내에서 축삭 재생을 촉진할 수 있음을 입증한다.
상기 실시예를 참조하여 본 발명을 상세히 설명하였지만, 본 발명의 취지 내에서 각종 변형이 적용될 수 있음이 명백하다. 따라서, 본 발명은 하기 청구범위에 의해서만 제한된다. 본 출원에서 언급한 인용된 모든 특허 및 공개 문헌은 그 전문을 참고로 인용한다. 본 명세서에 개시된 실험 부분의 결과는 참고 인용된 본 출원의 우선권인 미국 가명세서 출원 제60/175,707호의 출원일 후에 공개되었다(GrandPre 등, (2000) Nature 403, 439-444).
<110> Strittmatter, Stephen M. <120> Nogo Receptor-Mediated Blockade of Axonal Growth <130> 44574-5073-US <150> US 60/175,707 <151> 2000-01-12 <150> US 60/207,366 <151> 2000-05-26 <150> US 60/236,378 <151> 2000-09-29 <160> 20 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1719 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (166)..(1584) <223> Predicted human Nogo receptor gene <400> 1 agcccagcca gagccgggcg gagcggagcg cgccgagcct cgtcccgcgg ccgggccggg 60 gccgggccgt agcggcggcg cctggatgcg gacccggccg cggggagacg ggcgcccgcc 120 ccgaaacgac tttcagtccc cgacgcgccc cgcccaaccc ctacg atg aag agg 174 Met Lys Arg 1 gcg tcc gct gga ggg agc cgg ctg ctg gca tgg gtg ctg tgg ctg cag 222 Ala Ser Ala Gly Gly Ser Arg Leu Leu Ala Trp Val Leu Trp Leu Gln 5 10 15 gcc tgg cag gtg gca gcc cca tgc cca ggt gcc tgc gta tgc tac aat 270 Ala Trp Gln Val Ala Ala Pro Cys Pro Gly Ala Cys Val Cys Tyr Asn 20 25 30 35 gag ccc aag gtg acg aca agc tgc ccc cag cag ggc ctg cag gct gtg 318 Glu Pro Lys Val Thr Thr Ser Cys Pro Gln Gln 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ggacgcctg 1719 <210> 2 <211> 473 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Lys Arg Ala Ser Ala Gly Gly Ser Arg Leu Leu Ala Trp Val Leu 1 5 10 15 Trp Leu Gln Ala Trp Gln Val Ala Ala Pro Cys Pro Gly Ala Cys Val 20 25 30 Cys Tyr Asn Glu Pro Lys Val Thr Thr Ser Cys Pro Gln Gln Gly Leu 35 40 45 Gln Ala Val Pro Val Gly Ile Pro Ala Ala Ser Gln Arg Ile Phe Leu 50 55 60 His Gly Asn Arg Ile Ser His Val Pro Ala Ala Ser Phe Arg Ala Cys 65 70 75 80 Arg Asn Leu Thr Ile Leu Trp Leu His Ser Asn Val Leu Ala Arg Ile 85 90 95 Asp Ala Ala Ala Phe Thr Gly Leu Ala Leu Leu Glu Gln Leu Asp Leu 100 105 110 Ser Asp Asn Ala Gln Leu Arg Ser Val Asp Pro Ala Thr Phe His Gly 115 120 125 Leu Gly Arg Leu His Thr Leu His Leu Asp Arg Cys Gly Leu Gln Glu 130 135 140 Leu Gly Pro Gly Leu Phe Arg Gly Leu Ala Ala Leu Gln Tyr Leu Tyr 145 150 155 160 Leu Gln Asp Asn Ala Leu Gln Ala Leu Pro Asp Asp Thr Phe Arg Asp 165 170 175 Leu Gly Asn Leu Thr His Leu Phe Leu His Gly Asn Arg Ile Ser Ser 180 185 190 Val Pro Glu Arg Ala Phe Arg Gly Leu His Ser Leu Asp Arg Leu Leu 195 200 205 Leu His Gln Asn Arg Val Ala His Val His Pro His Ala Phe Arg Asp 210 215 220 Leu Gly Arg Leu Met Thr Leu Tyr Leu Phe Ala Asn Asn Leu Ser Ala 225 230 235 240 Leu Pro Thr Glu Ala Leu Ala Pro Leu Arg Ala Leu Gln Tyr Leu Arg 245 250 255 Leu Asn Asp Asn Pro Trp Val Cys Asp Cys Arg Ala Arg Pro Leu Trp 260 265 270 Ala Trp Leu Gln Lys Phe Arg Gly Ser Ser Ser Glu Val Pro Cys Ser 275 280 285 Leu Pro Gln Arg Leu Ala Gly Arg Asp Leu Lys Arg Leu Ala Ala Asn 290 295 300 Asp Leu Gln Gly Cys Ala Val Ala Thr Gly Pro Tyr His Pro Ile Trp 305 310 315 320 Thr Gly Arg Ala Thr Asp Glu Glu Pro Leu Gly Leu Pro Lys Cys Cys 325 330 335 Gln Pro Asp Ala Ala Asp Lys Ala Ser Val Leu Glu Pro Gly Arg Pro 340 345 350 Ala Ser Ala Gly Asn Ala Leu Lys Gly Arg Val Pro Pro Gly Asp Ser 355 360 365 Pro Pro Gly Asn Gly Ser Gly Pro Arg His Ile Asn Asp Ser Pro Phe 370 375 380 Gly Thr Leu Pro Gly Ser Ala Glu Pro Pro Leu Thr Ala Val Arg Pro 385 390 395 400 Glu Gly Ser Glu Pro Pro Gly Phe Pro Thr Ser Gly Pro Arg Arg Arg 405 410 415 Pro Gly Cys Ser Arg Lys Asn Arg Thr Arg Ser His Cys Arg Leu Gly 420 425 430 Gln Ala Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Asp Ser Glu Gly Ser Gly 435 440 445 Ala Leu Pro Ser Leu Thr Cys Ser Leu Thr Pro Leu Gly Leu Ala Leu 450 455 460 Val Leu Trp Thr Val Leu Gly Pro Cys 465 470 <210> 3 <211> 1866 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (178)..(1596) <223> Mouse Nogo receptor cDNA <400> 3 agccgcagcc cgcgagccca gcccggcccg gtagagcgga gcgccggagc ctcgtcccgc 60 ggccgggccg ggaccgggcc ggagcagcgg cgcctggatg cggacccggc cgcgcgcaga 120 cgggcgcccg ccccgaagcc gcttccagtg cccgacgcgc cccgctcgac cccgaag 177 atg aag agg gcg tcc tcc gga gga agc agg ctg ctg gca tgg gtg tta 225 Met Lys Arg Ala Ser Ser Gly Gly Ser Arg Leu Leu Ala Trp Val Leu 1 5 10 15 tgg cta cag gcc tgg agg gta gca aca cca tgc cct ggt gct tgt gtg 273 Trp Leu Gln Ala Trp Arg Val Ala Thr Pro Cys Pro Gly Ala Cys Val 20 25 30 tgc tac aat gag ccc aag gta aca aca agc tgc ccc cag cag ggt ctg 321 Cys Tyr Asn Glu Pro Lys Val Thr Thr Ser Cys Pro Gln Gln Gly Leu 35 40 45 cag gct gtg ccc act ggc atc cca gcc tct agc cag cga atc ttc ctg 369 Gln Ala Val Pro Thr Gly Ile Pro Ala Ser Ser Gln Arg Ile Phe Leu 50 55 60 cat ggc aac cga atc tct cac gtg cca gct gcg agc ttc cag tca tgc 417 His Gly Asn Arg Ile Ser His Val Pro Ala Ala Ser Phe Gln Ser Cys 65 70 75 80 cga aat ctc act atc ctg tgg ctg cac tct aat gcg ctg gct cgg atc 465 Arg Asn Leu Thr Ile Leu Trp Leu His Ser Asn Ala Leu Ala Arg Ile 85 90 95 gat gct gct gcc ttc act ggt ctg acc ctc ctg gag caa cta gat ctt 513 Asp Ala Ala Ala Phe Thr Gly Leu Thr Leu Leu Glu Gln Leu Asp Leu 100 105 110 agt gat aat gca cag ctt cat gtc gtg gac cct acc acg ttc cac ggc 561 Ser Asp Asn Ala Gln Leu His Val Val Asp Pro Thr Thr Phe His Gly 115 120 125 ctg ggc cac ctg cac aca ctg cac cta gac cga tgt ggc ctg cgg gag 609 Leu Gly His Leu His Thr Leu His Leu Asp Arg Cys Gly Leu Arg Glu 130 135 140 ctg ggt ccc ggc cta ttc cgt gga cta gca gct ctg cag tac ctc tac 657 Leu Gly Pro Gly Leu Phe Arg Gly Leu Ala Ala Leu Gln Tyr Leu Tyr 145 150 155 160 cta caa gac aac aat ctg cag gca ctc cct gac aac acc ttt cga gac 705 Leu Gln Asp Asn Asn Leu Gln Ala Leu Pro Asp Asn Thr Phe Arg Asp 165 170 175 ctg ggc aac ctc acg cat ctc ttt ctg cat ggc aac cgt atc ccc agt 753 Leu Gly Asn Leu Thr His Leu Phe Leu His Gly Asn Arg Ile Pro Ser 180 185 190 gtg cct gag cac gct ttc cgt ggc ctg cac agt ctt gac cgc ctc ctc 801 Val Pro Glu His Ala Phe Arg Gly Leu His Ser Leu Asp Arg Leu Leu 195 200 205 ttg cac cag aac cat gtg gct cgt gtg cac cca cat gcc ttc cgg gac 849 Leu His Gln Asn His Val Ala Arg Val His Pro His Ala Phe Arg Asp 210 215 220 ctt ggc cgc ctc atg acc ctc tac ctg ttt gcc aac aac ctc tcc atg 897 Leu Gly Arg Leu Met Thr Leu Tyr Leu Phe Ala Asn Asn Leu Ser Met 225 230 235 240 ctg cct gca gag gtc cta atg ccc ctg agg tct ctg cag tac ctg cga 945 Leu Pro Ala Glu Val Leu Met Pro Leu Arg Ser Leu Gln Tyr Leu Arg 245 250 255 ctc aat gac aac ccc tgg gtg tgt gac tgc cgg gca cgt cca ctc tgg 993 Leu Asn Asp Asn Pro Trp Val Cys Asp Cys Arg Ala Arg Pro Leu Trp 260 265 270 gcc tgg ctg cag aag ttc cga ggt tcc tca tca gag gtg ccc tgc aac 1041 Ala Trp Leu Gln Lys Phe Arg Gly Ser Ser Ser Glu Val Pro Cys Asn 275 280 285 ctg ccc caa cgc ctg gca gac cgt gat ctt aag cgc ctc gct gcc agt 1089 Leu Pro Gln Arg Leu Ala Asp Arg Asp Leu Lys Arg Leu Ala Ala Ser 290 295 300 gac cta gag ggc tgt gct gtg gct tca gga ccc ttc cgt ccc atc cag 1137 Asp Leu Glu Gly Cys Ala Val Ala Ser Gly Pro Phe Arg Pro Ile Gln 305 310 315 320 acc agt cag ctc act gat gag gag ctg ctg agc ctc ccc aag tgc tgc 1185 Thr Ser Gln Leu Thr Asp Glu Glu Leu Leu Ser Leu Pro Lys Cys Cys 325 330 335 cag cca gat gct gca gac aaa gcc tca gta ctg gaa ccc ggg agg cca 1233 Gln Pro Asp Ala Ala Asp Lys Ala Ser Val Leu Glu Pro Gly Arg Pro 340 345 350 gct tct gcc gga aac gcc ctc aag gga cgt gtg cct ccc ggt gac act 1281 Ala Ser Ala Gly Asn Ala Leu Lys Gly Arg Val Pro Pro Gly Asp Thr 355 360 365 cca cca ggc aat ggc tca ggc cct cgg cac atc aat gac tct cca ttt 1329 Pro Pro Gly Asn Gly Ser Gly Pro Arg His Ile Asn Asp Ser Pro Phe 370 375 380 gga act ttg ccc agc tct gca gag ccc cca ctg act gcc ctg cgg cct 1377 Gly Thr Leu Pro Ser Ser Ala Glu Pro Pro Leu Thr Ala Leu Arg Pro 385 390 395 400 ggg ggt tcc gag cca cca gga ctt ccc acc act ggt ccc cgc agg agg 1425 Gly Gly Ser Glu Pro Pro Gly Leu Pro Thr Thr Gly Pro Arg Arg Arg 405 410 415 cca ggt tgt tcc cgg aag aat cgc acc cgc agc cac tgc cgt ctg ggc 1473 Pro Gly Cys Ser Arg Lys Asn Arg Thr Arg Ser His Cys Arg Leu Gly 420 425 430 cag gcg gga agt ggg gcc agt gga aca ggg gac gca gag ggt tca ggg 1521 Gln Ala Gly Ser Gly Ala Ser Gly Thr Gly Asp Ala Glu Gly Ser Gly 435 440 445 gct ctg cct gct ctg gcc tgc agc ctt gct cct ctg ggc ctt gca ctg 1569 Ala Leu Pro Ala Leu Ala Cys Ser Leu Ala Pro Leu Gly Leu Ala Leu 450 455 460 gta ctt tgg aca gtg ctt ggg ccc tgc tgac cagccaccag ccaccaggtg 1620 Val Leu Trp Thr Val Leu Gly Pro Cys 465 470 tgtgtacata tggggtctcc ctccacgccg ccagccagag ccagggacag gctctgaggg 1680 gcaggccagg ccctccctga cagatgcctc cccaccagcc cacccccatc tccaccccat 1740 catgtttaca gggttccggg ggtggcggtt ggttcacaac cccaacttcc acccggatcg 1800 cggcatatag acatatgaaa tttattttac ttgcgtaaaa tatcggatga cgtggaataa 1860 acagct 1866 <210> 4 <211> 473 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Met Lys Arg Ala Ser Ser Gly Gly Ser Arg Leu Leu Ala Trp Val Leu 1 5 10 15 Trp Leu Gln Ala Trp Arg Val Ala Thr Pro Cys Pro Gly Ala Cys Val 20 25 30 Cys Tyr Asn Glu Pro Lys Val Thr Thr Ser Cys Pro Gln Gln Gly Leu 35 40 45 Gln Ala Val Pro Thr Gly Ile Pro Ala Ser Ser Gln Arg Ile Phe Leu 50 55 60 His Gly Asn Arg Ile Ser His Val Pro Ala Ala Ser Phe Gln Ser Cys 65 70 75 80 Arg Asn Leu Thr Ile Leu Trp Leu His Ser Asn Ala Leu Ala Arg Ile 85 90 95 Asp Ala Ala Ala Phe Thr Gly Leu Thr Leu Leu Glu Gln Leu Asp Leu 100 105 110 Ser Asp Asn Ala Gln Leu His Val Val Asp Pro Thr Thr Phe His Gly 115 120 125 Leu Gly His Leu His Thr Leu His Leu Asp Arg Cys Gly Leu Arg Glu 130 135 140 Leu Gly Pro Gly Leu Phe Arg Gly Leu Ala Ala Leu Gln Tyr Leu Tyr 145 150 155 160 Leu Gln Asp Asn Asn Leu Gln Ala Leu Pro Asp Asn Thr Phe Arg Asp 165 170 175 Leu Gly Asn Leu Thr His Leu Phe Leu His Gly Asn Arg Ile Pro Ser 180 185 190 Val Pro Glu His Ala Phe Arg Gly Leu His Ser Leu Asp Arg Leu Leu 195 200 205 Leu His Gln Asn His Val Ala Arg Val His Pro His Ala Phe Arg Asp 210 215 220 Leu Gly Arg Leu Met Thr Leu Tyr Leu Phe Ala Asn Asn Leu Ser Met 225 230 235 240 Leu Pro Ala Glu Val Leu Met Pro Leu Arg Ser Leu Gln Tyr Leu Arg 245 250 255 Leu Asn Asp Asn Pro Trp Val Cys Asp Cys Arg Ala Arg Pro Leu Trp 260 265 270 Ala Trp Leu Gln Lys Phe Arg Gly Ser Ser Ser Glu Val Pro Cys Asn 275 280 285 Leu Pro Gln Arg Leu Ala Asp Arg Asp Leu Lys Arg Leu Ala Ala Ser 290 295 300 Asp Leu Glu Gly Cys Ala Val Ala Ser Gly Pro Phe Arg Pro Ile Gln 305 310 315 320 Thr Ser Gln Leu Thr Asp Glu Glu Leu Leu Ser Leu Pro Lys Cys Cys 325 330 335 Gln Pro Asp Ala Ala Asp Lys Ala Ser Val Leu Glu Pro Gly Arg Pro 340 345 350 Ala Ser Ala Gly Asn Ala Leu Lys Gly Arg Val Pro Pro Gly Asp Thr 355 360 365 Pro Pro Gly Asn Gly Ser Gly Pro Arg His Ile Asn Asp Ser Pro Phe 370 375 380 Gly Thr Leu Pro Ser Ser Ala Glu Pro Pro Leu Thr Ala Leu Arg Pro 385 390 395 400 Gly Gly Ser Glu Pro Pro Gly Leu Pro Thr Thr Gly Pro Arg Arg Arg 405 410 415 Pro Gly Cys Ser Arg Lys Asn Arg Thr Arg Ser His Cys Arg Leu Gly 420 425 430 Gln Ala Gly Ser Gly Ala Ser Gly Thr Gly Asp Ala Glu Gly Ser Gly 435 440 445 Ala Leu Pro Ala Leu Ala Cys Ser Leu Ala Pro Leu Gly Leu Ala Leu 450 455 460 Val Leu Trp Thr Val Leu Gly Pro Cys 465 470 <210> 5 <211> 4053 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (135)..(3710) <223> Human mRNA for Nogo protein (KIAA0886, GenBank Accession No. AB020693) <400> 5 caccacagta ggtccctcgg ctcagtcggc ccagcccctc tcagtcctcc ccaaccccca 60 caaccgcccg cggctctgag acgcggcccc ggcggcggcg gcagcagctg cagcatcatc 120 tccaccctcc agcc atg gaa gac ctg gac cag tct cct ctg gtc tcg 167 Met Glu Asp Leu Asp Gln Ser Pro Leu Val Ser 1 5 10 tcc tcg gac agc cca ccc cgg ccg cag ccc gcg ttc aag tac cag ttc 215 Ser Ser Asp Ser Pro Pro Arg Pro Gln Pro Ala Phe Lys Tyr Gln Phe 15 20 25 gtg agg gag ccc gag gac gag gag gaa gaa gag gag gag gaa gag gag 263 Val Arg Glu Pro Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 30 35 40 gac gag gac gaa gac ctg gag gag ctg gag gtg ctg gag agg aag ccc 311 Asp Glu Asp Glu Asp Leu Glu Glu Leu Glu Val Leu Glu Arg Lys Pro 45 50 55 gcc gcc ggg ctg tcc gcg gcc cca gtg ccc acc gcc cct gcc gcc ggc 359 Ala Ala Gly Leu Ser Ala Ala Pro Val Pro Thr Ala Pro Ala Ala Gly 60 65 70 75 gcg ccc ctg atg gac ttc gga aat gac ttc gtg ccg ccg gcg ccc cgg 407 Ala Pro Leu Met Asp Phe Gly Asn Asp Phe Val Pro Pro Ala Pro Arg 80 85 90 gga ccc ctg ccg gcc gct ccc ccc gtc gcc ccg gag cgg cag ccg tct 455 Gly Pro Leu Pro Ala Ala Pro Pro Val Ala Pro Glu Arg Gln Pro Ser 95 100 105 tgg gac ccg agc ccg gtg tcg tcg acc gtg ccc gcg cca tcc ccg ctg 503 Trp Asp Pro Ser Pro Val Ser Ser Thr Val Pro Ala Pro Ser Pro Leu 110 115 120 tct gct gcc gca gtc tcg ccc tcc aag ctc cct gag gac gac gag cct 551 Ser Ala Ala Ala Val Ser Pro Ser Lys Leu Pro Glu Asp Asp Glu Pro 125 130 135 ccg gcc cgg cct ccc cct cct ccc ccg gcc agc gtg agc ccc cag gca 599 Pro Ala Arg Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ala Ser Val Ser Pro Gln Ala 140 145 150 155 gag ccc gtg tgg acc ccg cca gcc ccg gct ccc gcc gcg ccc ccc tcc 647 Glu Pro Val Trp Thr Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Pro Ser 160 165 170 acc ccg gcc gcg ccc aag cgc agg ggc tcc tcg ggc tca gtg gat gag 695 Thr Pro Ala Ala Pro Lys Arg Arg Gly Ser Ser Gly Ser Val Asp Glu 175 180 185 acc ctt ttt gct ctt cct gct gca tct gag cct gtg ata cgc tcc tct 743 Thr Leu Phe Ala Leu Pro Ala Ala Ser Glu Pro Val Ile Arg Ser Ser 190 195 200 gca gaa aat atg gac ttg aag gag cag cca ggt aac act att tcg gct 791 Ala Glu Asn Met Asp Leu Lys Glu Gln Pro Gly Asn Thr Ile Ser Ala 205 210 215 ggt caa gag gat ttc cca tct gtc ctg ctt gaa act gct gct tct ctt 839 Gly Gln Glu Asp Phe Pro Ser Val Leu Leu Glu Thr Ala Ala Ser Leu 220 225 230 235 cct tct ctg tct cct ctc tca gcc gct tct ttc aaa gaa cat gaa tac 887 Pro Ser Leu Ser Pro Leu Ser Ala Ala Ser Phe Lys Glu His Glu Tyr 240 245 250 ctt ggt aat ttg tca aca gta tta ccc act gaa gga aca ctt caa gaa 935 Leu Gly Asn Leu Ser Thr Val Leu Pro Thr Glu Gly Thr Leu Gln Glu 255 260 265 aat gtc agt gaa gct tct aaa gag gtc tca gag aag gca aaa act cta 983 Asn Val Ser Glu Ala Ser Lys Glu Val Ser Glu Lys Ala Lys Thr Leu 270 275 280 ctc ata gat aga gat tta aca gag ttt tca gaa tta gaa tac tca gaa 1031 Leu Ile Asp Arg Asp Leu Thr Glu Phe Ser Glu Leu Glu Tyr Ser Glu 285 290 295 atg gga tca tcg ttc agt gtc tct cca aaa gca gaa tct gcc gta ata 1079 Met Gly Ser Ser Phe Ser Val Ser Pro Lys Ala Glu Ser Ala Val Ile 300 305 310 315 gta gca aat cct agg gaa gaa ata atc gtg aaa aat aaa gat gaa gaa 1127 Val Ala Asn Pro Arg Glu Glu Ile Ile Val Lys Asn Lys Asp Glu Glu 320 325 330 gag aag tta gtt agt aat aac atc ctt cat aat caa caa gag tta cct 1175 Glu Lys Leu Val Ser Asn Asn Ile Leu His Asn Gln Gln Glu Leu Pro 335 340 345 aca gct ctt act aaa ttg gtt aaa gag gat gaa gtt gtg tct tca gaa 1223 Thr Ala Leu Thr Lys Leu Val Lys Glu Asp Glu Val Val Ser Ser Glu 350 355 360 aaa gca aaa gac agt ttt aat gaa aag aga gtt gca gtg gaa gct cct 1271 Lys Ala Lys Asp Ser Phe Asn Glu Lys Arg Val Ala Val Glu Ala Pro 365 370 375 atg agg gag gaa tat gca gac ttc aaa cca ttt gag cga gta tgg gaa 1319 Met Arg Glu Glu Tyr Ala Asp Phe Lys Pro Phe Glu Arg Val Trp Glu 380 385 390 395 gtg aaa gat agt aag gaa gat agt gat atg ttg gct gct gga ggt aaa 1367 Val Lys Asp Ser Lys Glu Asp Ser Asp Met Leu Ala Ala Gly Gly Lys 400 405 410 atc gag agc aac ttg gaa agt aaa gtg gat aaa aaa tgt ttt gca gat 1415 Ile Glu Ser Asn Leu Glu Ser Lys Val Asp Lys Lys Cys Phe Ala Asp 415 420 425 agc ctt gag caa act aat cac gaa aaa gat agt gag agt agt aat gat 1463 Ser Leu Glu Gln Thr Asn His Glu Lys Asp Ser Glu Ser Ser Asn Asp 430 435 440 gat act tct ttc ccc agt acg cca gaa ggt ata aag gat cgt tca gga 1511 Asp Thr Ser Phe Pro Ser Thr Pro Glu Gly Ile Lys Asp Arg Ser Gly 445 450 455 gca tat atc aca tgt gct ccc ttt aac cca gca gca act gag agc att 1559 Ala Tyr Ile Thr Cys Ala Pro Phe Asn Pro Ala Ala Thr Glu Ser Ile 460 465 470 475 gca aca aac att ttt cct ttg tta gga gat cct act tca gaa aat aag 1607 Ala Thr Asn Ile Phe Pro Leu Leu Gly Asp Pro Thr Ser Glu Asn Lys 480 485 490 acc gat gaa aaa aaa ata gaa gaa aag aag gcc caa ata gta aca gag 1655 Thr Asp Glu Lys Lys Ile Glu Glu Lys Lys Ala Gln Ile Val Thr Glu 495 500 505 aag aat act agc acc aaa aca tca aac cct ttt ctt gta gca gca cag 1703 Lys Asn Thr Ser Thr Lys Thr Ser Asn Pro Phe Leu Val Ala Ala Gln 510 515 520 gat tct gag aca gat tat gtc aca aca gat aat tta aca aag gtg act 1751 Asp Ser Glu Thr Asp Tyr Val Thr Thr Asp Asn Leu Thr Lys Val Thr 525 530 535 gag gaa gtc gtg gca aac atg cct gaa ggc ctg act cca gat tta gta 1799 Glu Glu Val Val Ala Asn Met Pro Glu Gly Leu Thr Pro Asp Leu Val 540 545 550 555 cag gaa gca tgt gaa agt gaa ttg aat gaa gtt act ggt aca aag att 1847 Gln Glu Ala Cys Glu Ser Glu Leu Asn Glu Val Thr Gly Thr Lys Ile 560 565 570 gct tat gaa aca aaa atg gac ttg gtt caa aca tca gaa gtt atg caa 1895 Ala Tyr Glu Thr Lys Met Asp Leu Val Gln Thr Ser Glu Val Met Gln 575 580 585 gag tca ctc tat cct gca gca cag ctt tgc cca tca ttt gaa gag tca 1943 Glu Ser Leu Tyr Pro Ala Ala Gln Leu Cys Pro Ser Phe Glu Glu Ser 590 595 600 gaa gct act cct tca cca gtt ttg cct gac att gtt atg gaa gca cca 1991 Glu Ala Thr Pro Ser Pro Val Leu Pro Asp Ile Val Met Glu Ala Pro 605 610 615 ttg aat tct gca gtt cct agt gct ggt gct tcc gtg ata cag ccc agc 2039 Leu Asn Ser Ala Val Pro Ser Ala Gly Ala Ser Val Ile Gln Pro Ser 620 625 630 635 tca tca cca tta gaa gct tct tca gtt aat tat gaa agc ata aaa cat 2087 Ser Ser Pro Leu Glu Ala Ser Ser Val Asn Tyr Glu Ser Ile Lys His 640 645 650 gag cct gaa aac ccc cca cca tat gaa gag gcc atg agt gta tca cta 2135 Glu Pro Glu Asn Pro Pro Pro Tyr Glu Glu Ala Met Ser Val Ser Leu 655 660 665 aaa aaa gta tca gga ata aag gaa gaa att aaa gag cct gaa aat att 2183 Lys Lys Val Ser Gly Ile Lys Glu Glu Ile Lys Glu Pro Glu Asn Ile 670 675 680 aat gca gct ctt caa gaa aca gaa gct cct tat ata tct att gca tgt 2231 Asn Ala Ala Leu Gln Glu Thr Glu Ala Pro Tyr Ile Ser Ile Ala Cys 685 690 695 gat tta att aaa gaa aca aag ctt tct gct gaa cca gct ccg gat ttc 2279 Asp Leu Ile Lys Glu Thr Lys Leu Ser Ala Glu Pro Ala Pro Asp Phe 700 705 710 715 tct gat tat tca gaa atg gca aaa gtt gaa cag cca gtg cct gat cat 2327 Ser Asp Tyr Ser Glu Met Ala Lys Val Glu Gln Pro Val Pro Asp His 720 725 730 tct gag cta gtt gaa gat tcc tca cct gat tct gaa cca gtt gac tta 2375 Ser Glu Leu Val Glu Asp Ser Ser Pro Asp Ser Glu Pro Val Asp Leu 735 740 745 ttt agt gat gat tca ata cct gac gtt cca caa aaa caa gat gaa act 2423 Phe Ser Asp Asp Ser Ile Pro Asp Val Pro Gln Lys Gln Asp Glu Thr 750 755 760 gtg atg ctt gtg aaa gaa agt ctc act gag act tca ttt gag tca atg 2471 Val Met Leu Val Lys Glu Ser Leu Thr Glu Thr Ser Phe Glu Ser Met 765 770 775 ata gaa tat gaa aat aag gaa aaa ctc agt gct ttg cca cct gag gga 2519 Ile Glu Tyr Glu Asn Lys Glu Lys Leu Ser Ala Leu Pro Pro Glu Gly 780 785 790 795 gga aag cca tat ttg gaa tct ttt aag ctc agt tta gat aac aca aaa 2567 Gly Lys Pro Tyr Leu Glu Ser Phe Lys Leu Ser Leu Asp Asn Thr Lys 800 805 810 gat acc ctg tta cct gat gaa gtt tca aca ttg agc aaa aag gag aaa 2615 Asp Thr Leu Leu Pro Asp Glu Val Ser Thr Leu Ser Lys Lys Glu Lys 815 820 825 att cct ttg cag atg gag gag ctc agt act gca gtt tat tca aat gat 2663 Ile Pro Leu Gln Met Glu Glu Leu Ser Thr Ala Val Tyr Ser Asn Asp 830 835 840 gac tta ttt att tct aag gaa gca cag ata aga gaa act gaa acg ttt 2711 Asp Leu Phe Ile Ser Lys Glu Ala Gln Ile Arg Glu Thr Glu Thr Phe 845 850 855 tca gat tca tct cca att gaa att ata gat gag ttc cct aca ttg atc 2759 Ser Asp Ser Ser Pro Ile Glu Ile Ile Asp Glu Phe Pro Thr Leu Ile 860 865 870 875 agt tct aaa act gat tca ttt tct aaa tta gcc agg gaa tat act gac 2807 Ser Ser Lys Thr Asp Ser Phe Ser Lys Leu Ala Arg Glu Tyr Thr Asp 880 885 890 cta gaa gta tcc cac aaa agt gaa att gct aat gcc ccg gat gga gct 2855 Leu Glu Val Ser His Lys Ser Glu Ile Ala Asn Ala Pro Asp Gly Ala 895 900 905 ggg tca ttg cct tgc aca gaa ttg ccc cat gac ctt tct ttg aag aac 2903 Gly Ser Leu Pro Cys Thr Glu Leu Pro His Asp Leu Ser Leu Lys Asn 910 915 920 ata caa ccc aaa gtt gaa gag aaa atc agt ttc tca gat gac ttt tct 2951 Ile Gln Pro Lys Val Glu Glu Lys Ile Ser Phe Ser Asp Asp Phe Ser 925 930 935 aaa aat ggg tct gct aca tca aag gtg ctc tta ttg cct cca gat gtt 2999 Lys Asn Gly Ser Ala Thr Ser Lys Val Leu Leu Leu Pro Pro Asp Val 940 945 950 955 tct gct ttg gcc act caa gca gag ata gag agc ata gtt aaa ccc aaa 3047 Ser Ala Leu Ala Thr Gln Ala Glu Ile Glu Ser Ile Val Lys Pro Lys 960 965 970 gtt ctt gtg aaa gaa gct gag aaa aaa ctt cct tcc gat aca gaa aaa 3095 Val Leu Val Lys Glu Ala Glu Lys Lys Leu Pro Ser Asp Thr Glu Lys 975 980 985 gag gac aga tca cca tct gct ata ttt tca gca gag ctg agt aaa act 3143 Glu Asp Arg Ser Pro Ser Ala Ile Phe Ser Ala Glu Leu Ser Lys Thr 990 995 1000 tca gtt 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Leu Val Asp Asp Leu 1100 1105 1110 1115 gtt gat tct ctg aag ttt gca gtg ttg atg tgg gta ttt acc tat gtt 3527 Val Asp Ser Leu Lys Phe Ala Val Leu Met Trp Val Phe Thr Tyr Val 1120 1125 1130 ggt gcc ttg ttt aat ggt ctg aca cta ctg att ttg gct ctc att tca 3575 Gly Ala Leu Phe Asn Gly Leu Thr Leu Leu Ile Leu Ala Leu Ile Ser 1135 1140 1145 ctc ttc agt gtt cct gtt att tat gaa cgg cat cag gca cag ata gat 3623 Leu Phe Ser Val Pro Val Ile Tyr Glu Arg His Gln Ala Gln Ile Asp 1150 1155 1160 cat tat cta gga ctt gca aat aag aat gtt aaa gat gct atg gct aaa 3671 His Tyr Leu Gly Leu Ala Asn Lys Asn Val Lys Asp Ala Met Ala Lys 1165 1170 1175 atc caa gca aaa atc cct gga ttg aag cgc aaa gct gaa tgaaaacgcc 3720 Ile Gln Ala Lys Ile Pro Gly Leu Lys Arg Lys Ala Glu 1180 1185 1190 caaaataatt agtaggagtt catctttaaa ggggatattc atttgattat acgggggagg 3780 gtcagggaag aacgaacctt gacgttgcag tgcagtttca cagatcgttg ttagatcttt 3840 atttttagcc atgcactgtt gtgaggaaaa attacctgtc ttgactgcca tgtgttcatc 3900 atcttaagta ttgtaagctg ctatgtatgg atttaaaccg taatcatatc tttttcctat 3960 ctgaggcact ggtggaataa aaaacctgta tattttactt tgttgcagat agtcttgccg 4020 catcttggca agttgcagag atggtggagc tag 4053 <210> 6 <211> 1192 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Glu Asp Leu Asp Gln Ser Pro Leu Val Ser Ser Ser Asp Ser Pro 1 5 10 15 Pro Arg Pro Gln Pro Ala Phe Lys Tyr Gln Phe Val Arg Glu Pro Glu 20 25 30 Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Asp 35 40 45 Leu Glu Glu Leu Glu Val Leu Glu Arg Lys Pro Ala Ala Gly Leu Ser 50 55 60 Ala Ala Pro Val Pro Thr Ala Pro Ala Ala Gly Ala Pro Leu Met Asp 65 70 75 80 Phe Gly Asn Asp Phe Val Pro Pro Ala Pro Arg Gly Pro Leu Pro Ala 85 90 95 Ala Pro Pro Val Ala Pro Glu Arg Gln Pro Ser Trp Asp Pro Ser Pro 100 105 110 Val Ser Ser Thr Val Pro Ala Pro Ser Pro Leu Ser Ala Ala Ala Val 115 120 125 Ser Pro Ser Lys Leu Pro Glu Asp Asp Glu Pro Pro Ala Arg Pro Pro 130 135 140 Pro Pro Pro Pro Ala Ser Val Ser Pro Gln Ala Glu Pro Val Trp Thr 145 150 155 160 Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Pro Ser Thr Pro Ala Ala Pro 165 170 175 Lys Arg Arg Gly Ser Ser Gly Ser Val Asp Glu Thr Leu Phe Ala Leu 180 185 190 Pro Ala Ala Ser Glu Pro Val Ile Arg Ser Ser Ala Glu Asn Met Asp 195 200 205 Leu Lys Glu Gln Pro Gly Asn Thr Ile Ser Ala Gly Gln Glu Asp Phe 210 215 220 Pro Ser Val Leu Leu Glu Thr Ala Ala Ser Leu Pro Ser Leu Ser Pro 225 230 235 240 Leu Ser Ala Ala Ser Phe Lys Glu His Glu Tyr Leu Gly Asn Leu Ser 245 250 255 Thr Val Leu Pro Thr Glu Gly Thr Leu Gln Glu Asn Val Ser Glu Ala 260 265 270 Ser Lys Glu Val Ser Glu Lys Ala Lys Thr Leu Leu Ile Asp Arg Asp 275 280 285 Leu Thr Glu Phe Ser Glu Leu Glu Tyr Ser Glu Met Gly Ser Ser Phe 290 295 300 Ser Val Ser Pro Lys Ala Glu Ser Ala Val Ile Val Ala Asn Pro Arg 305 310 315 320 Glu Glu Ile Ile Val Lys Asn Lys Asp Glu Glu Glu Lys Leu Val Ser 325 330 335 Asn Asn Ile Leu His Asn Gln Gln Glu Leu Pro Thr Ala Leu Thr Lys 340 345 350 Leu Val Lys Glu Asp Glu Val Val Ser Ser Glu Lys Ala Lys Asp Ser 355 360 365 Phe Asn Glu Lys Arg Val Ala Val Glu Ala Pro Met Arg Glu Glu Tyr 370 375 380 Ala Asp Phe Lys Pro Phe Glu Arg Val Trp Glu Val Lys Asp Ser Lys 385 390 395 400 Glu Asp Ser Asp Met Leu Ala Ala Gly Gly Lys Ile Glu Ser Asn Leu 405 410 415 Glu Ser Lys Val Asp Lys Lys Cys Phe Ala Asp Ser Leu Glu Gln Thr 420 425 430 Asn His Glu Lys Asp Ser Glu Ser Ser Asn Asp Asp Thr Ser Phe Pro 435 440 445 Ser Thr Pro Glu Gly Ile Lys Asp Arg Ser Gly Ala Tyr Ile Thr Cys 450 455 460 Ala Pro Phe Asn Pro Ala Ala Thr Glu Ser Ile Ala Thr Asn Ile Phe 465 470 475 480 Pro Leu Leu Gly Asp Pro Thr Ser Glu Asn Lys Thr Asp Glu Lys Lys 485 490 495 Ile Glu Glu Lys Lys Ala Gln Ile Val Thr Glu Lys Asn Thr Ser Thr 500 505 510 Lys Thr Ser Asn Pro Phe Leu Val Ala Ala Gln Asp Ser Glu Thr Asp 515 520 525 Tyr Val Thr Thr Asp Asn Leu Thr Lys Val Thr Glu Glu Val Val Ala 530 535 540 Asn Met Pro Glu Gly Leu Thr Pro Asp Leu Val Gln Glu Ala Cys Glu 545 550 555 560 Ser Glu Leu Asn Glu Val Thr Gly Thr Lys Ile Ala Tyr Glu Thr Lys 565 570 575 Met Asp Leu Val Gln Thr Ser Glu Val Met Gln Glu Ser Leu Tyr Pro 580 585 590 Ala Ala Gln Leu Cys Pro Ser Phe Glu Glu Ser Glu Ala Thr Pro Ser 595 600 605 Pro Val Leu Pro Asp Ile Val Met Glu Ala Pro Leu Asn Ser Ala Val 610 615 620 Pro Ser Ala Gly Ala Ser Val Ile Gln Pro Ser Ser Ser Pro Leu Glu 625 630 635 640 Ala Ser Ser Val Asn Tyr Glu Ser Ile Lys His Glu Pro Glu Asn Pro 645 650 655 Pro Pro Tyr Glu Glu Ala Met Ser Val Ser Leu Lys Lys Val Ser Gly 660 665 670 Ile Lys Glu Glu Ile Lys Glu Pro Glu Asn Ile Asn Ala Ala Leu Gln 675 680 685 Glu Thr Glu Ala Pro Tyr Ile Ser Ile Ala Cys Asp Leu Ile Lys Glu 690 695 700 Thr Lys Leu Ser Ala Glu Pro Ala Pro Asp Phe Ser Asp Tyr Ser Glu 705 710 715 720 Met Ala Lys Val Glu Gln Pro Val Pro Asp His Ser Glu Leu Val Glu 725 730 735 Asp Ser Ser Pro Asp Ser Glu Pro Val Asp Leu Phe Ser Asp Asp Ser 740 745 750 Ile Pro Asp Val Pro Gln Lys Gln Asp Glu Thr Val Met Leu Val Lys 755 760 765 Glu Ser Leu Thr Glu Thr Ser Phe Glu Ser Met Ile Glu Tyr Glu Asn 770 775 780 Lys Glu Lys Leu Ser Ala Leu Pro Pro Glu Gly Gly Lys Pro Tyr Leu 785 790 795 800 Glu Ser Phe Lys Leu Ser Leu Asp Asn Thr Lys Asp Thr Leu Leu Pro 805 810 815 Asp Glu Val Ser Thr Leu Ser Lys Lys Glu Lys Ile Pro Leu Gln Met 820 825 830 Glu Glu Leu Ser Thr Ala Val Tyr Ser Asn Asp Asp Leu Phe Ile Ser 835 840 845 Lys Glu Ala Gln Ile Arg Glu Thr Glu Thr Phe Ser Asp Ser Ser Pro 850 855 860 Ile Glu Ile Ile Asp Glu Phe Pro Thr Leu Ile Ser Ser Lys Thr Asp 865 870 875 880 Ser Phe Ser Lys Leu Ala Arg Glu Tyr Thr Asp Leu Glu Val Ser His 885 890 895 Lys Ser Glu Ile Ala Asn Ala Pro Asp Gly Ala Gly Ser Leu Pro Cys 900 905 910 Thr Glu Leu Pro His Asp Leu Ser Leu Lys Asn Ile Gln Pro Lys Val 915 920 925 Glu Glu Lys Ile Ser Phe Ser Asp Asp Phe Ser Lys Asn Gly Ser Ala 930 935 940 Thr Ser Lys Val Leu Leu Leu Pro Pro Asp Val Ser Ala Leu Ala Thr 945 950 955 960 Gln Ala Glu Ile Glu Ser Ile Val Lys Pro Lys Val Leu Val Lys Glu 965 970 975 Ala Glu Lys Lys Leu Pro Ser Asp Thr Glu Lys Glu Asp Arg Ser Pro 980 985 990 Ser Ala Ile Phe Ser Ala Glu Leu Ser Lys Thr Ser Val Val Asp Leu 995 1000 1005 Leu Tyr Trp Arg Asp Ile Lys Lys Thr Gly Val Val Phe Gly Ala Ser 1010 1015 1020 Leu Phe Leu Leu Leu Ser Leu Thr Val Phe Ser Ile Val Ser Val Thr 1025 1030 1035 1040 Ala Tyr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Ser Val Thr Ile Ser Phe Arg Ile 1045 1050 1055 Tyr Lys Gly Val Ile Gln Ala Ile Gln Lys Ser Asp Glu Gly His Pro 1060 1065 1070 Phe Arg Ala Tyr Leu Glu Ser Glu Val Ala Ile Ser Glu Glu Leu Val 1075 1080 1085 Gln Lys Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Gly His Val Asn Cys Thr Ile Lys 1090 1095 1100 Glu Leu Arg Arg Leu Phe Leu Val Asp Asp Leu Val Asp Ser Leu Lys 1105 1110 1115 1120 Phe Ala Val Leu Met Trp Val Phe Thr Tyr Val Gly Ala Leu Phe Asn 1125 1130 1135 Gly Leu Thr Leu Leu Ile Leu Ala Leu Ile Ser Leu Phe Ser Val Pro 1140 1145 1150 Val Ile Tyr Glu Arg His Gln Ala Gln Ile Asp His Tyr Leu Gly Leu 1155 1160 1165 Ala Asn Lys Asn Val Lys Asp Ala Met Ala Lys Ile Gln Ala Lys Ile 1170 1175 1180 Pro Gly Leu Lys Arg Lys Ala Glu 1185 1190 <210> 7 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: cDNA encoding receptor binding inhibitor Pep1 <400> 7 tttaggatat acaagggtgt gatccaagct atccagaaat cagatgaagg ccacccattc 60 agggcatatc tggaa 75 <210> 8 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Pep1- Nogo protein inhibitor <400> 8 Arg Ile Tyr Lys Gly Val Ile Gln Ala Ile Gln Lys Ser Asp Glu Gly 1 5 10 15 His Pro Phe Arg Ala Tyr Leu Glu Ser Glu Val Ala Ile Ser Glu Glu 20 25 30 Leu Val Gln Lys Tyr Ser Asn Ser 35 40 <210> 9 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: cDNA encoding receptor binding inhibitor Pep2 <400> 9 atccagaaat cagatgaagg ccacccattc agggcatatc tggaatctga agttgctata 60 tctgaggagt tggtt 75 <210> 10 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Pep2- Nogo protein inhibitor <400> 10 Ile Gln Lys Ser Asp Glu Gly His Pro Phe Arg Ala Tyr Leu Glu Ser 1 5 10 15 Glu Val Ala Ile Ser Glu Glu Leu Val 20 25 <210> 11 <211> 75 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: cDNA encoding receptor binding inhibitor Pep3 <400> 11 Ala Gly Gly Gly Cys Ala Thr Ala Thr Cys Thr Gly Gly Ala Ala Thr 1 5 10 15 Cys Thr Gly Ala Ala Gly Thr Thr Gly Cys Thr Ala Thr Ala Thr Cys 20 25 30 Thr Gly Ala Gly Gly Ala Gly Thr Thr Gly Gly Thr Thr Cys Ala Gly 35 40 45 Ala Ala Gly Thr Ala Cys Ala Gly Thr Ala Ala Thr Thr Cys Thr Gly 50 55 60 Cys Thr Cys Thr Thr Gly Gly Thr Cys Ala Thr 65 70 75 <210> 12 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Pep3- Nogo protein inhibitor <400> 12 Arg Ala Tyr Leu Glu Ser Glu Val Ala Ile Ser Glu Glu Leu Val Gln 1 5 10 15 Lys Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Gly His 20 25 <210> 13 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: cDNA encoding receptor binding inhibitor Pep4 <400> 13 tctgaggagt tggttcagaa gtacagtaat tctgctcttg gtcatgtgaa ctgcacgata 60 aaggaactca ggcgc 75 <210> 14 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Pep4- Nogo protein inhibitor <400> 14 Ser Glu Glu Leu Val Gln Lys Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Gly His Val 1 5 10 15 Asn Cys Thr Ile Lys Glu Leu Arg Arg 20 25 <210> 15 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: cDNA encoding receptor binding inhibitor Pep5 <400> 15 gctcttggtc atgtgaactg cacgataaag gaactcaggc gcctcttctt agttgatgat 60 ttagttgatt ctctg 75 <210> 16 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Pep5- Nogo protein inhibitor <400> 16 Ala Leu Gly His Val Asn Cys Thr Ile Lys Glu Leu Arg Arg Leu Phe 1 5 10 15 Leu Val Asp Asp Leu Val Asp Ser Leu 20 25 <210> 17 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: cDNA encoding receptor binding inhibitor Pep2-41 <400> 17 aggatataca agggtgtgat 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35 40 45 acg ata aag gaa ctc agg cgc ctc ttc tta gtt gat gat tta gtt gat 192 Thr Ile Lys Glu Leu Arg Arg Leu Phe Leu Val Asp Asp Leu Val Asp 50 55 60 tct ctg 198 Ser Leu 65 <210> 20 <211> 66 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Phe Arg Ile Tyr Lys Gly Val Ile Gln Ala Ile Gln Lys Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gly His Pro Phe Arg Ala Tyr Leu Glu Ser Glu Val Ala Ile Ser Glu 20 25 30 Glu Leu Val Gln Lys Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Gly His Val Asn Cys 35 40 45 Thr Ile Lys Glu Leu Arg Arg Leu Phe Leu Val Asp Asp Leu Val Asp 50 55 60 Ser Leu 65

Claims (87)

  1. 서열 번호 2의 1∼348번 아미노산으로 구성되는 폴리펩티드, 및 서열 번호 4의 1∼348번 아미노산으로 구성되는 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열로 구성되는 분리된 폴리뉴클레오티드로서, 상기 폴리펩티드는 NOGO-수용체 매개된 신경돌기 성장(neurite outgrowth) 억제를 억제하는 것인 분리된 폴리뉴클레오티드.
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  5. NOGO-수용체(NgR) 류신 풍부 반복부-아미노 말단(LRRNT) 영역, NgR 류신 풍부 반복부(LRR) 영역 및 NgR 류신 풍부 반복부-카르복시 말단(LRRCT) 영역으로 구성되는 NgR 폴리펩티드 단편을 암호화하는 핵산 서열로 구성되는 분리된 폴리뉴클레오티드로서, 상기 폴리펩티드 단편은 NOGO-수용체 매개된 신경돌기 성장 억제를 억제하는 것인 분리된 폴리뉴클레오티드.
  6. 제5항에 있어서, 상기 NgR 폴리펩티드 단편이 인간 NgR 폴리펩티드 단편인 폴리뉴클레오티드.
  7. 제5항에 있어서, 상기 NgR 폴리펩티드 단편이 마우스 NgR 폴리펩티드 단편인 폴리뉴클레오티드.
  8. 서열 번호 2의 1∼348번 아미노산으로 구성되는 폴리펩티드, 및 서열 번호 4의 1∼348번 아미노산으로 구성되는 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열로 구성되는 분리된 폴리뉴클레오티드로서, 상기 폴리펩티드는 이종성 폴리펩티드에 융합되고, NOGO-수용체 매개된 신경돌기 성장 억제를 억제하는 것인 분리된 폴리뉴클레오티드.
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  15. 제1항 및 제5항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 발현 제어 성분에 작동가능하게 결합되어 있는 것인 폴리뉴클레오티드.
  16. 제1항 및 제5항 내지 제8항 중 어느 하나의 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  17. 제15항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  18. 제1항 및 제5항 내지 제8항 중 어느 하나의 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 인간을 형성할 수 있는 세포를 제외한 숙주 세포.
  19. 제16항의 벡터를 포함하고, 인간을 형성할 수 있는 세포를 제외한 숙주 세포.
  20. 제17항의 벡터를 포함하고, 인간을 형성할 수 있는 세포를 제외한 숙주 세포.
  21. 제18항에 있어서, 진핵 세포인 숙주 세포.
  22. 제19항에 있어서, 진핵 세포인 숙주 세포.
  23. 제18항의 숙주 세포가 발현하는 NOGO 수용체 폴리펩티드.
  24. 제19항의 숙주 세포가 발현하는 NOGO 수용체 폴리펩티드.
  25. 제20항의 숙주 세포가 발현하는 NOGO 수용체 폴리펩티드.
  26. 제21항의 숙주 세포가 발현하는 NOGO 수용체 폴리펩티드.
  27. 제22항의 숙주 세포가 발현하는 NOGO 수용체 폴리펩티드.
  28. 서열 번호 2의 1∼348번 아미노산, 및 서열 번호 4의 1∼348번 아미노산으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열로 구성되는 분리된 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드는 NOGO-수용체 매개된 신경돌기 성장 억제를 억제하는 것인 분리된 폴리펩티드.
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  32. NgR LRRNT 영역, NgR LRR 영역 및 NgR LRRCT 영역으로 구성되고, NOGO-수용체 매개된 신경돌기 성장 억제를 억제하는 분리된 NgR 폴리펩티드 단편.
  33. 제32항에 있어서, 상기 NgR 폴리펩티드 단편은 인간 유래인 폴리펩티드.
  34. 제32항에 있어서, 상기 NgR 폴리펩티드 단편은 마우스 유래인 폴리펩티드.
  35. 이종성 폴리펩티드에 융합된, 서열 번호 2의 1∼348번 아미노산, 및 서열 번호 4의 1∼348번 아미노산으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열로 구성되는 분리된 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드는 NOGO-수용체 매개된 신경돌기 성장 억제를 억제하는 것인 분리된 폴리펩티드.
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  42. 제35항에 있어서, 상기 이종성 폴리펩티드는 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)인 폴리펩티드.
  43. 제35항에 있어서, 상기 이종성 폴리펩티드는 히스티딘 태그(His tag)인 폴리펩티드.
  44. 제35항에 있어서, 상기 이종성 폴리펩티드는 알칼리 포스파타제(AP)인 폴리펩티드.
  45. 제28항의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  46. 제45항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 키메라 항체, Fab 단편, Fab' 단편 및 F(ab')2 단편으로 구성된 군에서 선택되는 것인 항체 또는 이의 단편.
  47. 제1항 및 제5항 내지 제8항 중 어느 하나의 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물.
  48. 제15항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물.
  49. 제18항의 숙주 세포를 포함하는 조성물.
  50. 제22항의 숙주 세포를 포함하는 조성물.
  51. 제45항의 항체를 포함하는 조성물.
  52. 제47항에 있어서, 상기 조성물은 비경구 투여, 피하 투여, 정맥내 투여, 근내 투여, 복강내 투여, 경피 투여, 협측 투여, 경구 투여 및 미량주입 투여로 구성된 군에서 선택된 경로로 투여하기 위해 제형화되는 것인 조성물.
  53. 제48항 내지 제51항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 조성물은 비경구 투여, 피하 투여, 정맥내 투여, 근내 투여, 복강내 투여, 경피 투여, 협측 투여, 경구 투여 및 미량주입 투여로 구성된 군에서 선택된 경로로 투여하기 위해 제형화되는 것인 조성물.
  54. 제52항에 있어서, 담체를 더 포함하는 것인 조성물.
  55. 제53항에 있어서, 담체를 더 포함하는 것인 조성물.
  56. 뉴런을 제23항의 폴리펩티드와 접촉시키는 것을 포함하는, 신경돌기 성장을 촉진하는 시험관내 방법.
  57. 뉴런을 제45항의 항체와 접촉시키는 것을 포함하는, 신경돌기 성장을 촉진하는 시험관내 방법.
  58. 뉴런을 제47항의 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 신경돌기 성장을 촉진하는 시험관내 방법.
  59. 뉴런을 제53항의 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 신경돌기 성장을 촉진하는 시험관내 방법.
  60. 뉴런을 제23항의 폴리펩티드와 접촉시키는 것을 포함하는, 축삭 재생을 촉진하는 시험관내 방법.
  61. 뉴런을 제45항의 항체와 접촉시키는 것을 포함하는, 축삭 재생을 촉진하는 시험관내 방법.
  62. 뉴런을 제47항의 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 축삭 재생을 촉진하는 시험관내 방법.
  63. 뉴런을 제53항의 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 축삭 재생을 촉진하는 시험관내 방법.
  64. 제56항에 있어서, 상기 뉴런은 포유류로부터 유도된 것인 방법.
  65. 제60항에 있어서, 상기 뉴런은 포유류로부터 유도된 것인 방법.
  66. 제57항 내지 제59항 및 제61항 내지 제63항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 뉴런은 포유류로부터 유도된 것인 방법.
  67. 제64항 또는 제65항에 있어서, 상기 포유류는 인간인 방법.
  68. 제66항에 있어서, 상기 포유류는 인간인 방법.
  69. 제1항 및 제5항 내지 제8항 중 어느 하나의 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 포유류의 중추신경계(CNS) 질병, 장애 또는 손상 치료용 약학 조성물로서, 신경돌기 성장을 촉진하는 것인 약학 조성물.
  70. 제15항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 포유류의 중추신경계(CNS) 질병, 장애 또는 손상 치료용 약학 조성물로서, 신경돌기 성장을 촉진하는 것인 약학 조성물.
  71. 제45항의 항체를 포함하는, 포유류의 중추신경계(CNS) 질병, 장애 또는 손상 치료용 약학 조성물로서, 신경돌기 성장을 촉진하는 것인 약학 조성물.
  72. 제47항의 조성물을 포함하는, 포유류의 중추신경계(CNS) 질병, 장애 또는 손상 치료용 약학 조성물로서, 신경돌기 성장을 촉진하는 것인 약학 조성물.
  73. 제53항의 조성물을 포함하는, 포유류의 중추신경계(CNS) 질병, 장애 또는 손상 치료용 약학 조성물로서, 신경돌기 성장을 촉진하는 것인 약학 조성물.
  74. 제1항 및 제5항 내지 제8항 중 어느 하나의 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 포유류의 중추신경계(CNS) 질병, 장애 또는 손상 치료용 약학 조성물로서, 축삭 재생을 촉진하는 것인 약학 조성물.
  75. 제15항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 포유류의 중추신경계(CNS) 질병, 장애 또는 손상 치료용 약학 조성물로서, 축삭 재생을 촉진하는 것인 약학 조성물.
  76. 제45항의 항체를 포함하는, 포유류의 중추신경계(CNS) 질병, 장애 또는 손상 치료용 약학 조성물로서, 축삭 재생을 촉진하는 것인 약학 조성물.
  77. 제47항의 조성물을 포함하는, 포유류의 중추신경계(CNS) 질병, 장애 또는 손상 치료용 약학 조성물로서, 축삭 재생을 촉진하는 것인 약학 조성물.
  78. 제53항의 조성물을 포함하는, 포유류의 중추신경계(CNS) 질병, 장애 또는 손상 치료용 약학 조성물로서, 축삭 재생을 촉진하는 것인 약학 조성물.
  79. 제1항 및 제5항 내지 제8항 중 어느 하나의 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 포유류의 중추신경계(CNS) 질병, 장애 또는 손상 치료용 약학 조성물로서, NgR-매개된 신경돌기 성장 억제를 억제하거나 또는 축삭 재생을 촉진하는 것인 약학 조성물.
  80. 제15항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 포유류의 중추신경계(CNS) 질병, 장애 또는 손상 치료용 약학 조성물로서, NgR-매개된 신경돌기 성장 억제를 억제하거나 또는 축삭 재생을 촉진하는 것인 약학 조성물.
  81. 제45항의 항체를 포함하는, 포유류의 중추신경계(CNS) 질병, 장애 또는 손상 치료용 약학 조성물로서, NgR-매개된 신경돌기 성장 억제를 억제하거나 또는 축삭 재생을 촉진하는 것인 약학 조성물.
  82. 제47항의 조성물을 포함하는, 포유류의 중추신경계(CNS) 질병, 장애 또는 손상 치료용 약학 조성물로서, NgR-매개된 신경돌기 성장 억제를 억제하거나 또는 축삭 재생을 촉진하는 것인 약학 조성물.
  83. 제53항의 조성물을 포함하는, 포유류의 중추신경계(CNS) 질병, 장애 또는 손상 치료용 약학 조성물로서, NgR-매개된 신경돌기 성장 억제를 억제하거나 또는 축삭 재생을 촉진하는 것인 약학 조성물.
  84. 제79항에 있어서, 상기 CNS 질병, 장애 또는 손상은 두개 또는 대뇌 외상, 척수 손상, 뇌졸증 또는 수초탈락 질병으로 구성된 군에서 선택되는 것인 약학 조성물.
  85. 제80항 내지 제83항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 CNS 질병, 장애 또는 손상은 두개 또는 대뇌 외상, 척수 손상, 뇌졸증 또는 수초탈락 질병으로 구성된 군에서 선택되는 것인 약학 조성물.
  86. 제84항에 있어서, 상기 수초탈락 질병은 다발성 경화증, 단상성 수초탈락, 뇌척수염, 다병소성 백질뇌증, 범뇌염, 마르키아파바-비냐미병, 교탈수초증, 부신 백질 이영양증, 펠리체우스-메르츠바허병, 해면 변성(Sponge degeneration), 알렉산더병, 카나반병, 이염성 백질 이영양증 및 크라베병으로 구성된 군에서 선택되는 것인 약학 조성물.
  87. 제85항에 있어서, 상기 수초탈락 질병은 다발성 경화증, 단상성 수초탈락, 뇌척수염, 다병소성 백질뇌증, 범뇌염, 마르키아파바-비냐미병, 교탈수초증, 부신 백질 이영양증, 펠리체우스-메르츠바허병, 해면 변성, 알렉산더병, 카나반병, 이염성 백질 이영양증 및 크라베병으로 구성된 군에서 선택되는 것인 약학 조성물.
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