JP2023024669A - 癌ワクチン - Google Patents

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Abstract

【課題】本発明が解決しようとする課題は、目的とするほぼ任意の癌タンパク質またはその断片を産生するように体の細胞機構を安全に誘導することができるＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））のリボ核酸（ＲＮＡ）癌ワクチンを提供することである。【解決手段】本発明は、癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有し、脂質ナノ粒子において製剤化されたｍＲＮＡと、免疫チェックポイント調節因子をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡと、を含む、ワクチンに関する。【選択図】なし

Description

関連出願
本出願は、２０１５年１０月２２日出願の米国仮出願第６２／２４５，１２９号、２０１５年１０月２２日出願の米国仮出願第６２／２４５，０３１号、２０１５年１０月２８日出願の米国仮出願第６２／２４７，３１７号、２０１５年１０月２８日出願の米国仮出願第６２／２４７，４７２号、及び２０１６年７月２９日出願の米国仮出願第６２／３６８，８１０号に対する米国特許法１１９（ｅ）条に基づく優先権を主張するものであり、これらの文献のそれぞれの内容は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
癌ワクチンには、防止ワクチンまたは予防ワクチン（健康な人における癌の発症予防が意図される）、及び治療ワクチン（癌に対する体の自然防御力を強化することによる現存する癌の治療が意図される）が含まれる。癌防止ワクチンは、例えば、感染性疾患による癌の誘発を予防するために、癌の発症を誘発またはそれに寄与する感染病原体を標的とし得る。Ｇａｒｄａｓｉｌ（登録商標）及びＣｅｒｖａｒｉｘ（登録商標）は、市販の予防ワクチンの２つの例である。ワクチンはそれぞれ、ＨＰＶによる感染を防ぐものである。他の防止的な癌ワクチンは、未来において個体が癌を発症する可能性を増加させることが予測される宿主タンパク質または断片を標的とし得る。
市販または開発中のワクチンのほとんどが、微生物全体、タンパク質抗原、ペプチド、多糖、またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ワクチン、及びそれらの組み合わせに基づくものである。ＤＮＡのワクチン接種は、抗原に対する体液性及び細胞性の免疫応答を刺激するために使用される技術の１つである。遺伝子操作されたＤＮＡ（例えば、裸のプラスミドＤＮＡ）を生存宿主に直接注射することにより、少数の宿主細胞から抗原を直接産生し、防御性の免疫応答を生じさせる。しかしながら、この技術には、癌遺伝子の活性化または腫瘍抑制遺伝子の阻害をもたらし得る挿入変異誘発の可能性を含む、ワクチンのゲノムへのＤＮＡ組み込みの潜在的な問題がつきまとう。
目的とするほぼ任意の癌タンパク質またはその断片を産生するように体の細胞機構を安全に誘導することができるＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））のリボ核酸（ＲＮＡ）癌ワクチンが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、修飾ＲＮＡである。本開示のＲＮＡワクチンを使用すると、例えば、挿入変異誘発が生じ得るというリスクを冒さずに、細胞性免疫と体液性免疫との両方を含む、癌に対するバランスのとれた免疫応答を誘導することができる。
ＲＮＡワクチンは、癌の有病率またはアンメットメディカルニーズの程度もしくはレベルに応じてさまざまな状況において利用してよい。ＲＮＡワクチンは、さまざまなステージまたは転移度の癌を治療及び／または予防するために利用してよい。癌ワクチンを含む代替の抗癌治療と比較して、ＲＮＡワクチンは、はるかに高い抗体価を生じさせ、より早く応答を生成する点で優れた特性を有する。理論に束縛されるものではないが、ＲＮＡワクチンは天然の細胞機構を取り入れているため、ｍＲＮＡポリヌクレオチドであるＲＮＡワクチンは、翻訳時に適切なタンパク質の立体構造を生成するように良好に設計されると考えられる。エクスビボで製造され、望ましくない細胞応答を誘発する可能性のある従来型ワクチンとは異なり、ＲＮＡワクチンは、より自然な方法で細胞系に提示される。
本開示の実施形態のいくつかは、少なくとも１つの癌抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片（例えば、癌に対する免疫応答を誘導する能力を有する免疫原性断片）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む癌ワクチンを提供する。他の実施形態は、癌に対する免疫応答を誘導する能力を有する能力を有する２つ以上の抗原またはエピトープをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの態様では、本発明は、癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡと、免疫チェックポイント調節因子をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡと、のワクチンである。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント調節因子は、阻害性チェックポイントポリペプチドである。いくつかの実施形態では、阻害性チェックポイントポリペプチドは、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡ、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、及びＬＡＧ３からなる群から選択される分子に特異的に結合する抗体またはその断片である。いくつかの実施形態では、阻害性チェックポイントポリペプチドは、抗ＣＴＬＡ４抗体または抗ＰＤ１抗体である。ワクチンは、脂質ナノ粒子を任意選択で含む。いくつかの実施形態では、癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡのワクチンが対象に投与される。他の実施形態では、３～１０週間後にチェックポイント阻害剤が投与される。いくつかの実施形態では、４週間後にチェックポイント阻害剤が投与される。
他の態様では、本発明は、少なくとも２つの癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡ及び脂質ナノ粒子担体の個別化癌ワクチンであり、少なくとも２つの癌抗原は、患者特異的癌抗原である。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、５０～２００ｎｍの平均直径を有する。
さらに他の態様では、本発明は、少なくとも２つの癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡの個別化癌ワクチンであり、少なくとも２つの癌抗原は、患者の抗原の代表物である。いくつかの実施形態では、患者の抗原は、患者のエキソソームから同定された抗原である。いくつかの実施形態では、単一のｍＲＮＡが癌抗原をコードする。他の実施形態では、複数のｍＲＮＡが癌抗原をコードする。
他の実施形態では、それぞれのｍＲＮＡが、５～１０の癌抗原または単一の癌抗原をコードし得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、２～１００の癌抗原をコードする。他の実施形態では、ｍＲＮＡは、１０～１００、２０～１００、５０～１００、１００～２００、３００～４００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、９００～１，０００、または１，０００～１０，０００の癌抗原をコードする。
いくつかの実施形態では、
ａ）それぞれの癌抗原をコードするｍＲＮＡは、切断感受性部位が間に入ることによって散在し、
ｂ）それぞれの癌抗原をコードするｍＲＮＡは、リンカーなしで互いに直接連結され、
ｃ）それぞれの癌抗原をコードするｍＲＮＡは、単一のヌクレオチドリンカーで互いに連結され、
ｄ）それぞれの癌抗原は、２５～３５のアミノ酸を含み、かつ中央に位置するＳＮＰ変異を含み、
ｅ）癌抗原の少なくとも３０％が、対象に由来するクラスＩのＭＨＣ分子に対して最も高い親和性を有し、
ｆ）癌抗原の少なくとも３０％が、対象に由来するクラスＩＩのＭＨＣ分子に対して最も高い親和性を有し、
ｇ）癌抗原の少なくとも５０％が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及び／またはＤＲＢ１に対してＩＣ＞５００ｎＭの予測結合親和性を有し、
ｈ）ｍＲＮＡは、２０の癌抗原をコードし、
ｉ）癌抗原の５０％が、クラスＩのＭＨＣに対して結合親和性を有し、かつ癌抗原の５０％が、クラスＩＩのＭＨＣに対して結合親和性を有し、及び／または
ｊ）癌抗原をコードするｍＲＮＡは、癌抗原の順序が偽エピトープ（ｐｓｅｕｄｏ－ｅｐｉｔｏｐｅ）を最小化する順序になるように配置される。
いくつかの実施形態では、それぞれの癌抗原は、３１のアミノ酸を含み、かつ中央に位置するＳＮＰ変異を含み、ＳＮＰ変異の両側には１５の隣接アミノ酸が存在する。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、個別化癌ワクチンであり、癌抗原は、対象特異的癌抗原である。いくつかの実施形態では、対象特異的癌抗原は、対象の腫瘍試料のエクソームの代表物であり得るか、または対象の腫瘍試料のトランスクリプトームの代表物であり得る。いくつかの実施形態では、対象特異的癌抗原は、対象のエキソソームの代表物であり得る。
いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、１つまたは複数の従来型癌抗原をさらにコードする。いくつかの実施形態では、従来型癌抗原は、変異していない抗原である。いくつかの実施形態では、従来型癌抗原は、変異した抗原である。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、１つまたは複数の従来型癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡをさらに含む。
いくつかの実施形態では、単一のｍＲＮＡが癌抗原をコードする。他の実施形態では、複数のｍＲＮＡが癌抗原をコードする。いくつかの実施形態では、それぞれの癌抗原は、１０～５０のアミノ酸長である。他の実施形態では、それぞれの癌抗原は、１５～２０のアミノ酸長である。他の実施形態では、癌抗原は、２０～５０、２５～１００、１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～１，０００、または１，０００～１０，０００のアミノ酸長である。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、アジュバントをさらに含む。
本開示の実施形態のいくつかは、少なくとも１つの癌ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドと、少なくとも１つの５’末端キャップと、少なくとも１つの化学修飾と、を含み、脂質ナノ粒子に含めて製剤化される癌ワクチンを提供する。いくつかの実施形態では、５’末端キャップは、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐである。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの化学修飾は、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、Ｎ１－エチルシュードウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－シュードウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン、及び２’－Ｏ－メチルウリジンから選択される。いくつかの実施形態では、化学的に修飾されたヌクレオチドが組み込まれる度合いは、ワクチン製剤に対する免疫応答が改善するように最適化されている。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、ステロール、及び非カチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、イオン化可能なカチオン性脂質であり、非カチオン性脂質は、中性脂質であり、ステロールは、コレステロールである。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択される。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、ワクチン（製剤）の免疫原性を増進するために免疫増強剤（例えば、ＴＬＲアゴニスト）を含む。
いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームにおけるウラシルの１００％が化学修飾を有する。いくつかの実施形態では、化学修飾は、ウラシルの５位におけるものである。いくつかの実施形態では、化学修飾は、Ｎ１－メチルシュードウリジンである。
他の実施形態では、ＡＰＣ再プログラム化分子（ＡＰＣ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）をコードするｍＲＮＡがワクチンに含められるか、またはワクチンと共に同時投与される。ＡＰＣ再プログラム化分子は、ＣＩＩＴＡ、シャペロンタンパク質（ＣＬＩＰ、ＨＬＡ－ＤＯ、ＨＬＡ－ＤＭなど）、共刺激分子（ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６など）、ＣＩＩＴＡ断片（ＣＩＩＴＡのアミノ酸２６～１３７、またはＣＩＩＴＡに対して８０％の配列同一性を有するタンパク質など）であり得る。
他の態様では、対象の試料に由来する少なくとも２つの癌抗原の同定と、少なくとも２つの癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンの対象への投与と、による対象における免疫応答の誘発方法が提供され、少なくとも２つの癌抗原は、フレームシフト変異及び組換えからなる群から選択される変異を含む。
いくつかの実施形態では、癌抗原は、対象のエキソソームから同定される。いくつかの実施形態では、２～１００の抗原がエキソソームから同定される。他の実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、２～１００の抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する。単一のｍＲＮＡまたは複数のｍＲＮＡが抗原をコードし得る。
いくつかの実施形態では、抗原は、癌抗原である。癌抗原は、点変異、フレームシフト変異、及び組換えから選択される変異を有し得る。方法は、癌抗原が対象特異的であるということの、エクソーム解析による確認をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、癌抗原が対象特異的であるということの、トランスクリプトーム解析による確認をさらに含み得る。
いくつかの実施形態では、方法はまた、ｍＲＮＡワクチンの投与の少なくとも１ヶ月後に実施される、第２のセットの癌抗原を得るための、対象の試料に由来する少なくとも２つの癌抗原の同定と、対象に対する第２のセットの癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンの対象への投与と、も含む。他の実施形態では、対象の試料は、腫瘍試料である。
他の態様では、本発明は、第１のセットの癌抗原を得るための、対象の試料に由来する少なくとも２つの癌抗原の同定と、対象に対する第１のセットの癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンの対象への投与と、ｍＲＮＡワクチンの投与の少なくとも１ヶ月後に実施される、第２のセットの癌抗原を得るための、対象の試料に由来する少なくとも２つの癌抗原の同定と、対象に対する第２のセットの癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンの対象への投与と、による、対象における免疫応答の誘発方法を含む。
いくつかの実施形態では、第２のセットの抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンは、第１のセットの癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンの６ヶ月～１年後に対象に投与される。他の実施形態では、第２のセットの抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンは、第１のセットの癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンの１～２年後に対象に投与される。
いくつかの実施形態では、単一のｍＲＮＡが、癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する。他の実施形態では、複数のｍＲＮＡが抗原をコードする。いくつかの実施形態では、第２のセットの癌抗原は、２～１００の抗原を含む。他の実施形態では、癌抗原は、点変異、フレームシフト変異、及び組換えから選択される変異を有する。
他の態様では、本発明は、対象の試料に由来する少なくとも２つの癌抗原の同定と、少なくとも２つの癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡの対象への投与と、癌治療剤の対象への投与と、による、対象における免疫応答の誘発方法を含む。いくつかの実施形態では、癌治療剤は、標的治療である。標的治療は、ベムラフェニブ（ＰＬＸ４０３２）またはダブラフェニブなどのＢＲＡＦ阻害剤であり得る。
他の実施形態では、癌治療剤は、Ｔ細胞治療剤である。Ｔ細胞治療剤は、抗ＰＤ－１抗体または抗ＣＴＬＡ－４抗体などのチェックポイント阻害剤であり得る。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ＢＭＳ－９３６５５８（ニボルマブ）である。他の実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、イピリムマブである。他の実施形態では、Ｔ細胞治療剤は、ＯＸ４０Ｌである。さらに他の実施形態では、癌治療剤は、集団ベースの腫瘍特異的抗原を含むワクチンである。
他の実施形態では、癌治療剤は、１つまたは複数の従来型癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡを含むワクチンである。
いくつかの実施形態では、少なくとも２つの癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡは、癌治療剤と同時に対象に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡは、癌治療剤の投与の前に対象に投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡは、癌治療剤の投与の後に対象に投与される。
本発明の他の態様では、ｍＲＮＡ癌ワクチンを生成するための、癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡと脂質ナノ粒子製剤との混合と、混合の２４時間以内に実施されるｍＲＮＡ癌ワクチンの対象への投与と、を含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ癌ワクチンは、混合の１２時間以内に対象に投与される。他の実施形態では、ｍＲＮＡ癌ワクチンは、混合の１時間以内に対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ癌ワクチンは、２～１００の癌抗原または１０～１００の癌抗原をコードする。
いくつかの実施形態では、ワクチンは、個別化癌ワクチンであり、癌抗原は、対象特異的癌抗原である。
いくつかの実施形態では、単一のｍＲＮＡが癌抗原をコードする。他の実施形態では、複数のｍＲＮＡが癌抗原をコードする。他の実施形態では、それぞれのｍＲＮＡが、５～１０の癌抗原または単一の癌抗原をコードする。さらに他の実施形態では、それぞれの癌抗原は、１０～５０のアミノ酸長、または１５～２０のアミノ酸長である。
本発明の他の態様では、キットが提供される。キットは、脂質ナノ粒子製剤を収容する容器と、ワクチン製剤を収容する容器と、対象への投与までの２４時間以内に、個別化ｍＲＮＡ癌ワクチンをワクチン製剤に添加して個別化ｍＲＮＡ癌ワクチン製剤を生成し、個別化ｍＲＮＡ癌ワクチン製剤と脂質ナノ粒子製剤とを混合することについての説明と、を含む。いくつかの実施形態では、キットは、２～１００の癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡを含む。
対象における抗原特異的な免疫応答の誘導方法における使用を目的とする薬剤の製造における癌ワクチンの使用が本明細書でさらに提供され、方法は、抗原特異的な免疫応答の生成に有効な量での、癌ワクチンの対象への投与を含む。
他の態様では、対象から単離されたエキソソームに由来する少なくとも２つの癌抗原の同定と、抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンの、同定された抗原に基づく生成と、ｍＲＮＡワクチンの対象への投与と、による、癌の治療を必要とする対象におけるその方法が提供され、ｍＲＮＡワクチンは、対象において腫瘍特異的な免疫応答を誘導し、それによって対象における癌が治療される。
他の態様では、本発明は、対象から単離されたエキソソームに由来する少なくとも２つの癌抗原の同定と、抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンの、同定された抗原に基づく生成と、を含む方法に従って調製可能なＲＮＡワクチンである。
本発明の態様では、癌抗原に対する対象における免疫応答の誘発方法が提供される。方法は、少なくとも１つの抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含むＲＮＡワクチンの対象への投与と、それによる、抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片に特異的な免疫応答の対象における誘導と、を含み、癌に対する予防的に有効な用量の従来型ワクチンでのワクチン接種を受けた対象における抗抗原ポリペプチド抗体の力価と比較して、対象における抗抗原ポリペプチド抗体の力価はワクチン接種後に増加する。「抗抗原ポリペプチド抗体」は、抗原ポリペプチドに特異的に結合する血清抗体である。
予防的に有効な用量は、臨床的に許容されるレベルで癌の進行を阻止する治療的に有効な用量である。いくつかの実施形態では、治療的に有効な用量は、ワクチンの添付文書に記載の用量である。本明細書で使用される従来型ワクチンは、本発明のｍＲＮＡワクチン以外のワクチンを指す。例えば、従来型ワクチンには、限定はされないが、微生物生ワクチン、死滅微生物ワクチン、サブユニットワクチン、タンパク質抗原ワクチン、ＤＮＡワクチン等が含まれる。例示の実施形態では、従来型ワクチンは、規制当局の承認を得たワクチン及び／または例えば、米国の食品医薬品局（ＦＤＡ）もしくは欧州医薬品庁（ＥＭＡ．）などの国の薬物規制機関によって登録されたワクチンである。
いくつかの実施形態では、癌に対する予防的に有効な用量の従来型ワクチンでのワクチン接種を受けた対象における抗抗原ポリペプチド抗体の力価と比較して、対象における抗抗原ポリペプチド抗体の力価は、ワクチン接種後に１ｌｏｇ～１０ｌｏｇに増加する。
いくつかの実施形態では、癌に対する予防的に有効な用量の従来型ワクチンでのワクチン接種を受けた対象における抗抗原ポリペプチド抗体の力価と比較して、対象における抗抗原ポリペプチド抗体の力価は、ワクチン接種後に１ｌｏｇに増加する。
いくつかの実施形態では、癌に対する予防的に有効な用量の従来型ワクチンでのワクチン接種を受けた対象における抗抗原ポリペプチド抗体の力価と比較して、対象における抗抗原ポリペプチド抗体の力価は、ワクチン接種後に２ｌｏｇに増加する。
いくつかの実施形態では、癌に対する予防的に有効な用量の従来型ワクチンでのワクチン接種を受けた対象における抗抗原ポリペプチド抗体の力価と比較して、対象における抗抗原ポリペプチド抗体の力価は、ワクチン接種後に３ｌｏｇに増加する。
いくつかの実施形態では、癌に対する予防的に有効な用量の従来型ワクチンでのワクチン接種を受けた対象における抗抗原ポリペプチド抗体の力価と比較して、対象における抗抗原ポリペプチド抗体の力価は、ワクチン接種後に５ｌｏｇに増加する。
いくつかの実施形態では、癌に対する予防的に有効な用量の従来型ワクチンでのワクチン接種を受けた対象における抗抗原ポリペプチド抗体の力価と比較して、対象における抗抗原ポリペプチド抗体の力価は、ワクチン接種後に１０ｌｏｇに増加する。
本発明の他の態様では、癌抗原に対する対象における免疫応答の誘発方法が提供される。方法は、少なくとも１つの抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含むＲＮＡワクチンの対象への投与と、それによる、抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片に特異的な免疫応答の対象における誘導と、を含み、対象における免疫応答は、ＲＮＡワクチンと比較して２倍～１００倍の用量レベルで癌抗原に対する従来型ワクチンでのワクチン接種を受けた対象における免疫応答と同等である。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、ＲＮＡワクチンと比較して２倍の用量レベルで従来型ワクチンでのワクチン接種を受けた対象における免疫応答と同等である。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、ＲＮＡワクチンと比較して３倍の用量レベルで従来型ワクチンでのワクチン接種を受けた対象における免疫応答と同等である。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、ＲＮＡワクチンと比較して４倍の用量レベルで従来型ワクチンでのワクチン接種を受けた対象における免疫応答と同等である。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、ＲＮＡワクチンと比較して５倍の用量レベルで従来型ワクチンでのワクチン接種を受けた対象における免疫応答と同等である。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、ＲＮＡワクチンと比較して１０倍の用量レベルで従来型ワクチンでのワクチン接種を受けた対象における免疫応答と同等である。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、ＲＮＡワクチンと比較して５０倍の用量レベルで従来型ワクチンでのワクチン接種を受けた対象における免疫応答と同等である。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、ＲＮＡワクチンと比較して１００倍の用量レベルで従来型ワクチンでのワクチン接種を受けた対象における免疫応答と同等である。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、ＲＮＡワクチンと比較して１０倍～１０００倍の用量レベルで従来型ワクチンでのワクチン接種を受けた対象における免疫応答と同等である。
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、ＲＮＡワクチンと比較して１００倍～１０００倍の用量レベルで従来型ワクチンでのワクチン接種を受けた対象における免疫応答と同等である。
他の実施形態では、免疫応答は、対象における抗体価の決定によって評価される。
他の態様では、本発明は、少なくとも１つの癌抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含むＲＮＡワクチンの対象への投与と、それによる、抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片に特異的な免疫応答の対象における誘導と、による、癌抗原に対する対象における免疫応答の誘発方法を含み、癌抗原に対する予防的に有効な用量の従来型ワクチンでのワクチン接種を受けた対象において誘導される免疫応答と比較して、対象における免疫応答は、２日～１０週間早く誘導される。いくつかの実施形態では、対象における免疫応答は、予防的に有効な用量の従来型ワクチンでのワクチン接種をＲＮＡワクチンと比較して２倍～１００倍の用量レベルで受けた対象において誘導されるものに相当する。
いくつかの実施形態では、予防的に有効な用量の従来型ワクチンでのワクチン接種を受けた対象において誘導される免疫応答と比較して、対象における免疫応答は、２日早く誘導される。
いくつかの実施形態では、予防的に有効な用量の従来型ワクチンでのワクチン接種を受けた対象において誘導される免疫応答と比較して、対象における免疫応答は、３日早く誘導される。
いくつかの実施形態では、予防的に有効な用量の従来型ワクチンでのワクチン接種を受けた対象において誘導される免疫応答と比較して、対象における免疫応答は、１週間早く誘導される。
いくつかの実施形態では、予防的に有効な用量の従来型ワクチンでのワクチン接種を受けた対象において誘導される免疫応答と比較して、対象における免疫応答は、２週間早く誘導される。
いくつかの実施形態では、予防的に有効な用量の従来型ワクチンでのワクチン接種を受けた対象において誘導される免疫応答と比較して、対象における免疫応答は、３週間早く誘導される。
いくつかの実施形態では、予防的に有効な用量の従来型ワクチンでのワクチン接種を受けた対象において誘導される免疫応答と比較して、対象における免疫応答は、５週間早く誘導される。
いくつかの実施形態では、予防的に有効な用量の従来型ワクチンでのワクチン接種を受けた対象において誘導される免疫応答と比較して、対象における免疫応答は、１０週間早く誘導される。
第１の抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する癌ＲＮＡワクチンの対象への投与による、癌に対する対象における免疫応答の誘発方法であって、ＲＮＡポリヌクレオチドが安定化要素を含まず、ワクチンと共にアジュバントが同時製剤化または同時投与されない上記方法。
さらに他の態様では、本発明は、１０００～３０００のヌクレオチドを含むコンカテマー癌抗原をコードするｍＲＮＡの生成方法を含み、方法は、
（ａ）コンカテマー癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを含む第１のポリヌクレオチドと、５’－ＵＴＲを含む第２のポリヌクレオチドと、の固形担体に複合化したポリヌクレオチドへの結合と、
（ｂ）第２のポリヌクレオチドの３’末端の、第１のポリヌクレオチドの５’末端への適切な条件下でのライゲーションであって、適切な条件がＤＮＡリガーゼを含み、それによって第１のライゲーション産物が生成するライゲーションと、
（ｃ）３’－ＵＴＲを含む第３のポリヌクレオチドの５’末端の、第１のライゲーション産物の３’末端への、適切な条件下でのライゲーションであって、適切な条件がＲＮＡリガーゼを含み、それによって第２のライゲーション産物が生成するライゲーションと、
（ｄ）固形担体からの第２のライゲーション産物の遊離と、
によるものであり、
それによって、１０００～３０００のヌクレオチドを含むコンカテマー癌抗原をコードするｍＲＮＡが生成する。
提供される組成物または方法のいずれか１つの実施形態のいくつかでは、ｍＲＮＡは、１つまたは複数の反復多型をコードする。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の反復多型は、ｐ５３における反復体細胞癌変異（ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｓｏｍａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を含む。いくつかのそのような実施形態では、ｐ５３における１つまたは複数の反復体細胞癌変異は、
（１）コドン位置Ｔ１２５に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＡＶＳＰＣＩＳＦＶＷ（配列番号２）（ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５８：０１）、エピトープＨＰＬＡＳＣＱＣＦＦ（配列番号３）（ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１）、エピトープＦＶＷＮＦＧＩＰＬ（配列番号４）（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０６、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１）を含むペプチド配列ＴＡＫＳＶＴＣＴＶＳＣＰＥＧＬＡＳＭＲＬＱＣＬＡＶＳＰＣＩＳＦＶＷＮＦＧＩＰＬＨＰＬＡＳＣＱＣＦＦＩＶＹＰＬＮＶ（配列番号１）を有する保持型イントロンを誘導する変異、
（２）コドン位置３３１に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＬＱＶＬＳＬＧＴＳＹ（配列番号６）（ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１）、エピトープＦＱＳＮＴＱＮＡＶＦ（配列番号７）（ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１）を含むペプチド配列ＥＹＦＴＬＱＶＬＳＬＧＴＳＹＱＶＥＳＦＱＳＮＴＱＮＡＶＦＦＬＴＶＬＰＡＩＧＡＦＡＩＲＧＱ（配列番号５）を有する保持型イントロンを誘導する変異、
（３）コドン位置１２６に隣接する標準３’スプライス部位における変異であって、エピトープＣＴＭＦＣＱＬＡＫ（配列番号９）（ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１）、エピトープＫＳＶＴＣＴＭＦ（配列番号１０）（ＨＬＡ－Ｂ＊５８：０１）を含む新規のスパニングペプチド配列ＡＫＳＶＴＣＴＭＦＣＱＬＡＫ（配列番号８）を生成する潜在性の代替エクソン３’スプライス部位を誘導する変異、及び／または
（４）コドン位置２２４に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＶＰＹＥＰＰＥＶＷ（配列番号１２）（ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１）、エピトープＬＴＶＰＰＳＴＡＷ（配列番号１３）（ＨＬＡ－Ｂ＊５８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１）を含む新規のスパニングペプチド配列ＶＰＹＥＰＰＥＶＷＬＡＬＴＶＰＰＳＴＡＷＡＡ（配列番号１１）を生成する潜在性の代替イントロン５’スプライス部位を誘導する変異、
からなる群から選択され、
転写コドン位置は、Ｅｎｓｅｍｂｌのｖ８３のヒトゲノムアノテーションに由来する標準の全長ｐ５３転写物であるＥＮＳＴ０００００２６９３０５（配列番号１４）を参照したものである。
１つの実施形態では、本発明は、ネオ抗原ペプチド（１）～（４）の１つまたは複数をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードするｍＲＮＡを含む癌治療ワクチンを提供する。１つの実施形態では、本発明は、患者の腫瘍が上記の変異のいずれを含むかということに基づく、ペプチド（１）～（４）の１つまたは複数を含むか、またはコードするワクチンの選択投与を提供する。１つの実施形態では、本発明は、対象の腫瘍が上記の変異のいずれを含むか、及び対象の正常なＨＬＡ型が、得られるネオ抗原に結合すると予測される対応ＨＬＡ対立遺伝子を含むかという二重の判断基準に基づく、ワクチンの選択投与を提供する。
本発明の他の態様では、ｍＲＮＡ癌ワクチンの調製を目的とするキットが提供される。キットは、５’－ＯＲＦを含む１つまたは複数のポリヌクレオチドと、３’－ＯＲＦを含む１つまたは複数のポリヌクレオチドと、ポリ（Ａ）尾部を含む１つまたは複数のポリヌクレオチドと、リガーゼ酵素と、患者特異的エピトープをコードするＯＲＦを含む１つまたは複数のポリヌクレオチドの、５’－ＯＲＦ、３’－ＯＲＦ、及びポリ（Ａ）尾部を含む１つまたは複数のポリヌクレオチドへのライゲーションについての説明と、を収容する１つまたは複数の容器を有する。
本発明の他の態様では、対象からの試料の単離、患者特異的なミュータノーム（ｍｕｔａｎｏｍｅ）を生成するための、試料に由来する患者のトランスクリプトーム及び／または患者のエクソームの解析によるネオエピトープのセットの同定と、ＭＨＣとの結合強度、ＭＨＣとの結合多様性、免疫原性の予測度合い、自己反応性の低さ、及び／またはＴ細胞反応性に基づく、ワクチン向けネオエピトープのセットのミュータノームからの選択と、ネオエピトープのセットをコードするｍＲＮＡワクチンの調製と、対象からの試料の単離の２ヶ月以内に実施される、ｍＲＮＡワクチンの対象への投与と、による、個別化ｍＲＮＡ癌ワクチンでの対象の治療方法が提供される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、対象からの試料の単離の１ヶ月以内に対象に投与される。
他の態様では、本発明は、ネオエピトープのセットをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを有する個別化ｍＲＮＡ癌ワクチンにおける使用を目的とする、ネオエピトープのセットの同定方法を含み、方法は、
ａ．患者のトランスクリプトーム及び患者のエクソームの解析による患者特異的なミュータノームの同定と、
ｂ．患者のＲＮＡシークエンシングにおける遺伝子もしくは転写物レベルの発現評価、バリアントコール（ｖａｒｉａｎｔ ｃａｌｌ）信頼スコア、ＲＮＡシークエンシングに基づく対立遺伝子特異的発現、保存的アミノ酸置換と非保存的アミノ酸置換との比較、点変異の位置（ＴＣＲの関与増加についての中心スコア（Ｃｅｎｔｅｒｉｎｇ Ｓｃｏｒｅ））、点変異の位置（ＨＬＡとの結合の差異についての固定スコア（Ａｎｃｈｏｒｉｎｇ Ｓｃｏｒｅ））、独自性（Ｓｅｌｆｎｅｓｓ）：患者のＷＥＳデータとのコアエピトープ相同性（＜１００％）、８マー～１１マーについてはＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂに対するＩＣ５０、１５マー～２０マーについてはＨＬＡ－ＤＲＢ１に対するＩＣ５０、広範結合スコア（ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ Ｓｃｏｒｅ）（すなわち、結合すると予測される患者ＨＬＡの数）、８マー～１１マーについてはＨＬＡ－Ｃに対するＩＣ５０、１５マー～２０マーについてはＨＬＡ－ＤＲＢ３～５に対するＩＣ５０、１５マー～２０マーについてはＨＬＡ－ＤＱＢ１／Ａ１に対するＩＣ５０、１５マー～２０マーについてはＨＬＡ－ＤＰＢ１／Ａ１に対するＩＣ５０、クラスＩとクラスＩＩとの比率比較、患者においてカバーされるＨＬＡ－Ａアロタイプ、ＨＬＡ－Ｂアロタイプ、及びＨＬＡ－ＤＲＢ１アロタイプの多様性、点変異と複合エピトープ（例えば、フレームシフト）との比率比較、及び／または偽エピトープＨＬＡ結合スコア、のうちの少なくとも３つに基づく、ネオエピトープに対する加重値を使用する、ミュータノームからの１５～５００のネオエピトープのサブセットの選択と、
ｃ．最高加重値に基づく、サブセットからの、個別化ｍＲＮＡ癌ワクチンにおける使用を目的とするネオエピトープのセットの選択であって、ネオエピトープのセットが１５～４０のネオエピトープを含む選択と、
によるものである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸ワクチンは、化学的に修飾される。他の実施形態では、核酸ワクチンは、修飾されない。
さらに別の態様では、第１の抗原ポリペプチドまたはコンカテマーポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンの対象への投与を含む、対象のワクチン接種を目的とする組成物及び対象のワクチン接種方法が提供され、ＲＮＡポリヌクレオチドは安定化要素を含まず、ワクチンと共にアジュバントが同時製剤化または同時投与されることはない。
他の態様では、本発明は、第１の抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンの対象への投与を含む、対象のワクチン接種を目的とする組成物または対象のワクチン接種方法であり、対象に投与される核酸ワクチンの用量は、１０ｕｇ／ｋｇ～４００ｕｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドの用量は、用量当たり、１～５ｕｇ、５～１０ｕｇ、１０～１５ｕｇ、１５～２０ｕｇ、１０～２５ｕｇ、２０～２５ｕｇ、２０～５０ｕｇ、３０～５０ｕｇ、４０～５０ｕｇ、４０～６０ｕｇ、６０～８０ｕｇ、６０～１００ｕｇ、５０～１００ｕｇ、８０～１２０ｕｇ、４０～１２０ｕｇ、４０～１５０ｕｇ、５０～１５０ｕｇ、５０～２００ｕｇ、８０～２００ｕｇ、１００～２００ｕｇ、１２０～２５０ｕｇ、１５０～２５０ｕｇ、１８０～２８０ｕｇ、２００～３００ｕｇ、５０～３００ｕｇ、８０～３００ｕｇ、１００～３００ｕｇ、４０～３００ｕｇ、５０～３５０ｕｇ、１００～３５０ｕｇ、２００～３５０ｕｇ、３００～３５０ｕｇ、３２０～４００ｕｇ、４０～３８０ｕｇ、４０～１００ｕｇ、１００～４００ｕｇ、２００～４００ｕｇ、または３００～４００ｕｇである。いくつかの実施形態では、核酸ワクチンは、皮内注射または筋肉内注射によって対象に投与される。いくつかの実施形態では、核酸ワクチンは、０日目に対象に投与される。いくつかの実施形態では、第２の用量の核酸ワクチンは、２１日目に対象に投与される。
いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンに含まれるＲＮＡポリヌクレオチドの用量は、２５マイクログラムである。いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンに含まれるＲＮＡポリヌクレオチドの用量は、１００マイクログラムである。いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンに含まれるＲＮＡポリヌクレオチドの用量は、５０マイクログラムである。いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンに含まれるＲＮＡポリヌクレオチドの用量は、７５マイクログラムである。いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンに含まれるＲＮＡポリヌクレオチドの用量は、１５０マイクログラムである。いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンに含まれるＲＮＡポリヌクレオチドの用量は、４００マイクログラムである。いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンに含まれるＲＮＡポリヌクレオチドの用量は、２００マイクログラムである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、遠位リンパ節と比較して局所リンパ節に１００倍高いレベルで蓄積する。他の実施形態では、核酸ワクチンは、化学的に修飾され、他の実施形態では、核酸ワクチンは、化学的に修飾されない。
本発明の態様では、第１の抗原ポリペプチドまたはコンカテマーポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドと、薬学的に許容される担体または賦形剤と、を含む核酸ワクチンが提供され、ＲＮＡポリヌクレオチドは、安定化要素を含まず、ワクチンは、アジュバントを含まない。いくつかの実施形態では、安定化要素は、ヒストンステムループである。いくつかの実施形態では、安定化要素は、野生型配列と比較してＧＣ含量が高まった核酸配列である。
本発明の態様では、第１の抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンが提供され、ＲＮＡポリヌクレオチドは、宿主へのインビボ投与を目的とする製剤に存在し、この製剤は、最初の抗原に対する抗体保有率の判断基準としてヒト対象で許容される割合に勝る抗体価を与えるものである。いくつかの実施形態では、本発明のｍＲＮＡワクチンによって生成する抗体価は、中和抗体価である。いくつかの実施形態では、中和抗体価は、タンパク質ワクチンと比較して高い。他の実施形態では、本発明のｍＲＮＡワクチンによって生成する中和抗体価は、アジュバントを含むタンパク質ワクチンと比較して高い。さらに他の実施形態では、本発明のｍＲＮＡワクチンによって生成する中和抗体価は、１，０００～１０，０００、１，２００～１０，０００、１，４００～１０，０００、１，５００～１０，０００、１，０００～５，０００、１，０００～４，０００、１，８００～１０，０００、２０００～１０，０００、２，０００～５，０００、２，０００～３，０００、２，０００～４，０００、３，０００～５，０００、３，０００～４，０００、または２，０００～２，５００である。中和価は、典型的には、プラーク数の５０％低減達成に必要な最高血清希釈度として示される。
好ましい態様では、本発明のワクチン（例えば、ＬＮＰに封入されたｍＲＮＡワクチン）は、ワクチン接種を受けた対象の血液または血清において予防的及び／または治療的に効果的なレベル、濃度、及び／または力価の抗原特異的抗体を生成する。本明細書で定義される抗体価という用語は、例えばヒト対象などの対象において抗原特異的抗体が生成する量を指す。例示の実施形態では、抗体価は、依然として正の結果を与える最高希釈度（段階希釈におけるもの）の逆数として示される。例示の実施形態では、抗体価は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって決定または測定される。例示の実施形態では、抗体価は、例えばマイクロ中和アッセイなどの中和アッセイによって決定または測定される。ある特定の態様では、抗体価の測定値は、１：４０、１：１００などの比率として示される。
本発明の例示の実施形態では、効果的なワクチンは、１：４０超、１：１００超、１：４００超、１：１０００超、１：２０００超、１：３０００超、１：４０００超、１：５００超、１：６０００超、１：７５００超、１：１００００超の抗体価を生成する。例示の実施形態では、抗体価は、ワクチン接種後の１０日以内、ワクチン接種後の２０日以内、ワクチン接種後の３０日以内、ワクチン接種後の４０日以内、またはワクチン接種後の５０日以内もしくはそれを超える期間以内に生成または達成される。例示の実施形態では、力価は、単回用量のワクチンが対象に投与された後に生成または達成される。他の実施形態では、力価は、複数回用量の後に生成または達成され、例えば、第１の用量及び第２の用量（例えば、ブースター用量）の後に生成または達成される。
本発明の例示の態様では、抗原特異的抗体は、μｇ／ｍｌの単位で測定されるか、またはＩＵ／Ｌ（リットル当たりの国際単位）もしくはｍＩＵ／ｍｌ（ｍｌ当たりのミリ国際単位）の単位で測定される。本発明の例示の実施形態では、効果的なワクチンは、＞０．５μｇ／ｍｌ、＞０．１μｇ／ｍｌ、＞０．２μｇ／ｍｌ、＞０．３５μｇ／ｍｌ、＞０．５μｇ／ｍｌ、＞１μｇ／ｍｌ、＞２μｇ／ｍｌ、＞５μｇ／ｍｌ、または＞１０μｇ／ｍｌで生成する。本発明の例示の実施形態では、効果的なワクチンは、＞１０ｍＩＵ／ｍｌ、＞２０ｍＩＵ／ｍｌ、＞５０ｍＩＵ／ｍｌ、＞１００ｍＩＵ／ｍｌ、＞２００ｍＩＵ／ｍｌ、＞５００ｍＩＵ／ｍｌ、または＞１０００ｍＩＵ／ｍｌで生成する。例示の実施形態では、抗体のレベルまたは濃度は、ワクチン接種後の１０日以内、ワクチン接種後の２０日以内、ワクチン接種後の３０日以内、ワクチン接種後の４０日以内、またはワクチン接種後の５０日以内もしくはそれを超える期間以内に生成または達成される。例示の実施形態では、レベルまたは濃度は、単回用量のワクチンが対象に投与された後に生成または達成される。他の実施形態では、レベルまたは濃度は、複数回用量の後に生成または達成され、例えば、第１の用量及び第２の用量（例えば、ブースター用量）の後に生成または達成される。例示の実施形態では、抗体のレベルまたは濃度は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって決定または測定される。例示の実施形態では、抗体のレベルまたは濃度は、例えばマイクロ中和アッセイなどの中和アッセイによって決定または測定される。第１の抗原ポリペプチドまたはコンカテマーポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンも提供され、安定化要素を有するか、またはアジュバントと共に製剤化され、第１の抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡワクチンによって誘発される抗体価と比較して、ＲＮＡポリヌクレオチドは、より長く持続する高抗体価を誘発するために、宿主へのインビボ投与を目的とする製剤に存在する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、単回投与の１週間以内に中和抗体が生成するように製剤化される。いくつかの実施形態では、アジュバントは、カチオン性ペプチド及び免疫賦活性核酸から選択される。いくつかの実施形態では、カチオン性ペプチドは、プロタミンである。
いくつかの態様では、少なくとも１つの化学修飾を含むか、またはヌクレオチドの修飾を任意選択で含まないオープンリーディングフレームを有する１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドを含み、オープンリーディングフレームが第１の抗原ポリペプチドまたはコンカテマーポリペプチドをコードする核酸ワクチンが提供され、ＲＮＡポリヌクレオチドは、宿主へのインビボ投与を目的とする製剤に存在し、その結果、宿主における抗原の発現レベルは、安定化要素を有するか、またはアジュバントと共に製剤化され、第１の抗原ポリペプチドをコードするｍＲＮＡワクチンによって生成する抗原の発現レベルを顕著に上回る。
他の態様では、少なくとも１つの化学修飾を含むか、またはヌクレオチドの修飾を任意選択で含まないオープンリーディングフレームを有する１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドを含み、オープンリーディングフレームが第１の抗原ポリペプチドまたはコンカテマーポリペプチドをコードする核酸ワクチンが提供され、非修飾ｍＲＮＡワクチンが同等の抗体価を生成するために必要となるものと比較して、ワクチンで必要になるＲＮＡポリヌクレオチドは少なくとも１０倍少ない。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、２５～１００マイクログラムの用量で存在する。
本発明の態様では、使用ワクチン単位も提供され、当該単位は、少なくとも１つの化学修飾を含むか、またはヌクレオチドの修飾を任意選択で含まないオープンリーディングフレームを有し、オープンリーディングフレームが第１の抗原ポリペプチドまたはコンカテマーポリペプチドをコードする１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドを１０ｕｇ～４００ｕｇと、ヒト対象への送達を目的として製剤化された薬学的に許容される担体または賦形剤と、を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、カチオン性脂質ナノ粒子をさらに含む。
本発明の態様では、個体または個体集団における腫瘍に対する抗原記憶の創出方法、維持方法、または回復方法が提供され、方法は、抗原記憶ブースター核酸ワクチンの、上記個体または集団への投与を含み、抗原記憶ブースター核酸ワクチンは、（ａ）少なくとも１つの化学修飾を含むか、またはヌクレオチドの修飾を任意選択で含まず、２つ以上のコドン最適化オープンリーディングフレームを含み、当該オープンリーディングフレームが、参照抗原ポリペプチドのセットをコードする少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドと、（ｂ）任意選択の薬学的に許容される担体または賦形剤と、を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、筋肉内投与、皮内投与、及び皮下投与からなる群から選択される経路を介して個体に投与される。いくつかの実施形態では、投与段階は、対象の筋組織と、組成物の注射に適した機器との接触を含む。いくつかの実施形態では、投与段階は、対象の筋組織と、組成物の注射に適した機器との、電気穿孔と組み合わせた接触を含む。
本発明の態様では、対象のワクチン接種方法が提供され、方法は、第１の抗原ポリペプチドまたはコンカテマーポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドを対象のワクチン接種に有効な量で含む核酸ワクチンの、２５ｕｇ／ｋｇ～４００ｕｇ／ｋｇの単回用量での対象への投与を含む。
他の態様では、少なくとも１つの化学修飾を含むオープンリーディングフレームを有し、オープンリーディングフレームが第１の抗原ポリペプチドまたはコンカテマーポリペプチドをコードする１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンが提供され、非修飾ｍＲＮＡワクチンが同等の抗体価を生成するために必要となるものと比較して、ワクチンで必要になるＲＮＡポリヌクレオチドは少なくとも１０倍少ない。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、２５～１００マイクログラムの用量で存在する。
他の態様では、ヌクレオチドの修飾を含まない（非修飾の）オープンリーディングフレームを有し、オープンリーディングフレームが第１の抗原ポリペプチドまたはコンカテマーポリペプチドをコードするＬＮＰ製剤化ＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンが提供され、ＬＮＰにおいて製剤化されない非修飾ｍＲＮＡワクチンが同等の抗体価を生成するために必要となるものと比較して、ワクチンで必要になるＲＮＡポリヌクレオチドは少なくとも１０倍少ない。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、２５～１００マイクログラムの用量で存在する。
実施例に示されるデータは、本発明の製剤を使用すると免疫応答が顕著に増進することを示す。驚くべきことに、先行技術分野の報告ではワクチン生成を目的とする担体において化学的に非修飾のｍＲＮＡを製剤化して使用することが好ましいとされたのとは対照的に、化学的に修飾されたｍＲＮＡ－ＬＮＰワクチンでは、非修飾ｍＲＮＡと比較して、必要になる有効ｍＲＮＡ用量がはるかに少なく、すなわち、ＬＮＰ以外の担体において非修飾ｍＲＮＡが製剤化されたときと比較して、必要になる有効ｍＲＮＡ用量が１０倍少ないということが本明細書に記載される。本発明の化学的に修飾されたＲＮＡワクチンと非修飾のＲＮＡワクチンとは両方共、異なる脂質担体において製剤化されたｍＲＮＡワクチンと比較して良好な免疫応答を生成する。
他の態様では、本発明は、年齢が６０歳以上の高齢対象の治療方法を包含し、方法は、抗原ポリペプチドまたはコンカテマーポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドを対象のワクチン接種に有効な量で含む核酸ワクチンの、対象への投与を含む。
他の態様では、本発明は、年齢が１７歳以下の若年対象の治療方法を包含し、方法は、抗原ポリペプチドまたはコンカテマーポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドを対象のワクチン接種に有効な量で含む核酸ワクチンの、対象への投与を含む。
他の態様では、本発明は、成人対象の治療方法を包含し、方法は、抗原ポリペプチドまたはコンカテマーポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つまたは複数のＲＮＡポリヌクレオチドを対象のワクチン接種に有効な量で含む核酸ワクチンの、対象への投与を含む。
いくつかの態様では、本発明は、抗原をコードする少なくとも２つの核酸配列を含む混合ワクチンでの対象のワクチン接種方法を含み、ワクチンの用量は、混合された治療用量であり、抗原をコードするそれぞれの個々の核酸の用量は、部分的治療用量である。いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンにおけるＲＮＡポリヌクレオチドの混合用量は、２５マイクログラムである。いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンにおけるＲＮＡポリヌクレオチドの混合用量は、１００マイクログラムである。いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンにおけるＲＮＡポリヌクレオチドの混合用量は、５０マイクログラムである。いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンにおけるＲＮＡポリヌクレオチドの混合用量は、７５マイクログラムである。いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンにおけるＲＮＡポリヌクレオチドの混合用量は、１５０マイクログラムである。いくつかの実施形態では、対象に投与される核酸ワクチンにおけるＲＮＡポリヌクレオチドの混合用量は、４００マイクログラムである。いくつかの実施形態では、抗原をコードするそれぞれの個々の核酸の部分的治療用量は、１マイクログラム、２マイクログラム、３マイクログラム、４マイクログラム、５マイクログラム、６マイクログラム、７マイクログラム、８マイクログラム、９マイクログラム、１０マイクログラム、１１マイクログラム、１２マイクログラム、１３マイクログラム、１４マイクログラム、１５マイクログラム、１６マイクログラム、１７マイクログラム、１８マイクログラム、１９マイクログラム、または２０マイクログラムである。他の実施形態では、核酸ワクチンは、化学的に修飾され、他の実施形態では、核酸ワクチンは、化学的に修飾されない。
本発明のさまざまな実施形態の詳細は、下記の説明において示される。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、説明及び図面、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
前述及び他の目的、特徴、及び利点は、本発明の特定の実施形態の下記の説明から明らかになり、こうしたことは、添付の図面において例示され、こうした図面の中で同様の参照文字は異なる観点を通して同一の部分を指す。図面は、必ずしも寸法どおりではないが、代わりに、本発明のさまざまな実施形態の原理を例示することに重点が置かれている。
図１Ａ～１Ｄは、ｍＲＮＡワクチン抗原に特異的なＣＤ８応答を示すためのアッセイの結果を示す。 ｍＲＮＡワクチンが抗原特異的なエフェクター／メモリーＣＤ８Ｔ細胞応答を誘導したことを示すアッセイの結果を示す。 ｍＲＮＡに基づくネオエピトープの抗原設計の多元的考察を示す模式図である。 ｍＲＮＡに基づくネオエピトープの抗原設計の多元的考察を示す表である。 ｍＲＮＡがコードするエピトープをＭＣＦ７（ＨＬＡ＊２０１）においてＦＡＣＳに基づくアッセイによって検証した結果を示す。ＭＣＦ７細胞でのＭＨＣ１／変異ＭＡＲＴ１ペプチドの特異的な提示が抗変異ＭＡＲＴ１ＴＣＲマーによって検出された。配列は、上から下の順で、配列番号１５～１９に対応する。 図６Ａ及び図６Ｂは、ペプチドエピトープを例示した模式図である。図６Ａのポリペプチドは、２つ以上のエピトープを含む。エピトープは、同一の配列または異なる配列であり得、すべてがＴ細胞エピトープ、すべてがＢ細胞エピトープ、または両方の組み合わせであり得る。図６Ｂの模式図は、ペプチドのＭＨＣプロセシングを増進するためのさまざまな末端単位を有するペプチドエピトープを示す。 ２０のエピトープのコンカテマーをコードするｍＲＮＡで誘発された例示のＴ細胞応答を示す。ｍＲＮＡコンカテマーは、クラスＩとクラスＩＩとの両方のＴ細胞応答を誘導した。 異なる位置にエピトープを有するコンカテマーをコードするｍＲＮＡで誘発された例示のＴ細胞応答を示す。ＣＡ８０及びＣＡ８１は、Ｔ細胞応答を誘発することが知られる２０の同一エピトープをコードしており、クラスＩＩエピトープを５つ、マウスのクラスＩエピトープを１０、マウスの正の対照（ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２２）（卵白アルブミン由来））を１つ、及びヒトの（ＨＬＡ－Ａ２）エピトープを４つ含む（未掲載）。ＣＡ８０とＣＡ８１とでは、これらの異なるエピトープの相対位置のみが異なる。 インターフェロン－ガンマスポット形成単位（ＳＦＵ）とＣＤ８＋ＩＦＮ－γ＋応答との例示の相関を示す。 コンカテマーＣＡ－８０をコードするｍＲＮＡで誘発された例示の用量応答を示す。ワクチンの投与量が減少するにつれてヒットの減少が観測された。 コンカテマーＣＡ－８０をコードするｍＲＮＡで誘発された例示の用量応答を示す。ワクチンの投与量が減少するにつれてヒットの減少が観測された。 １つの２０マーと複数の５マーとで免疫化したときの、既知のエピトープに対するＴ細胞応答の例示比較を示す。１つの２０マーまたは３つの３マーとしてワクチン接種すると、既知のエピトープに対するＴ細胞応答は同等であった。複数の５マーで免疫化すると、Ｔ細胞応答が僅かに高くなる傾向が観測された。 クラスＩエピトープ単独の場合、またはクラスＩＩによる支援が存在する場合のＴ細胞応答の例示比較を示す。５つの既知のクラスＩエピトープを５マーとして単独投与（クラスＩＩによる支援なし）または５つの既知のクラスＩＩエピトープと共に投与（クラスＩＩによる支援あり）し、５つの既知のクラスＩエピトープに対するＴ細胞応答を比較した。後者の群には、既知のクラスＩエピトープの５マーも追加で含めた。既知のクラスＩエピトープに対するＴ細胞応答は、既知のクラスＩＩエピトープを含む５マーが存在すると強くなった。 ＭＣ３または化合物２５と共に製剤化されたコンカテマーワクチンでのワクチン接種で観測された例示のＴ細胞応答を示す。ＭＣ３及び化合物２５においてＣＡ－８１（１５の既知のマウスエピトープを含む）を製剤化した。ワクチンにおけるそれぞれのエピトープに対するＴ細胞応答を測定し、２つの製剤間で応答を比較した。 ｍＲＮＡ－１のｍＲＮＡ構成要素を例示した模式図である。 ｍＲＮＡ－１の一般的な分子配列を例示した模式図であり、この模式図では、患者特異的なコード領域は（Ｎ）として参照することよって示される。配列は、配列番号２０及び配列番号２１に対応する。 いくつかの実施形態では実行され得るコンピューターシステムを例示したブロック図である。 サイレント変異を除く、腫瘍型ごとのスプライス部位の変異頻度（上パネル）、及び位置ごとのｐ５３変異（下パネル）を示す模式図である。 保持型イントロン及び潜在性スプライシングの生成につながるホットスポットスプライス部位及びサイレント変異を示す模式図である。いくつかの変異部位が保持型イントロンまたは潜在性スプライシングを生成することがＲＮＡシークエンシングによって確認された。変異によって得られた２つの代表的なペプチドは、コードゲノムの他の箇所とは一致しないＨＬＡ－Ａ２結合エピトープを複数有していた。
詳細な説明
本開示の実施形態では、癌抗原をコードするポリヌクレオチドを含むＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンが提供される。本明細書で提供される癌ＲＮＡワクチンを使用すると、ＤＮＡでのワクチン接種と関連するリスクの多くを伴うことなく、細胞性免疫及び／または体液性免疫を含むバランスのとれた免疫応答を誘導することができる。いくつかの実施形態では、ワクチンは、癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
ｍＲＮＡ癌ワクチンを含む機能性ＲＮＡワクチンを生成するための試みがいくつもなされてきたが、こうしたＲＮＡワクチンの治療効果は、依然として完全には確立されていない。非常に驚くべきことに、Ｔ細胞応答の増進を含む、顕著に増進しており、多くの点で相乗的な免疫応答を引き起こす、ｍＲＮＡワクチンを送達するための製剤クラスを発明者らは発見した。本発明のワクチンには、従来型癌ワクチンならびに個別化癌ワクチンが含まれる。いくつかの態様では、本発明は、化学的に修飾及び非修飾のｍＲＮＡワクチンを含むｍＲＮＡワクチンの有効性を脂質ナノ粒子製剤が顕著に増進するという驚くべき知見を含む。
本明細書に記載の試験において使用した脂質ナノ粒子は、さまざまな動物モデルならびにヒトにおけるｓｉＲＮＡの送達に以前に使用されたものである。脂質ナノ粒子製剤によるｓｉＲＮＡの送達と関連して得られた知見を考慮すると、脂質ナノ粒子がワクチンにおいて有用であるという事実は非常に驚くべきものである。脂質ナノ粒子において製剤化されたｓｉＲＮＡの治療的な送達では、一過性のＩｇＭ応答と関連する望ましくない炎症応答が生じる結果として、典型的には、抗原産生が減少し、免疫応答が損なわれることが観測されている。ｓｉＲＮＡで観測された知見とは対照的に、脂質ナノ粒子－ｍＲＮＡワクチン製剤では、一過性のＩｇＭ応答ではなく、予防方法及び治療方法に十分となるＩｇＧレベルの増進が生じることが示されている。
ワクチン開発において標的ポリペプチド配列に対する所望の免疫応答（例えば、Ｔ細胞応答）を誘発する癌抗原の生成は、依然として難易度の高い課題である。本発明は、ワクチン開発と関連するハードルを克服する技術を含むものである。本発明の技術を使用することで、適切なＴ細胞癌エピトープまたはＢ細胞癌エピトープを選択し、インビボでの有効な送達に向けてエピトープまたは抗原を製剤化することによって、所望の免疫応答を整えて導くことが可能である。
したがって、本発明は、ｍＲＮＡワクチンに関する。ｍＲＮＡワクチンは、２０１５年４月２３日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２７４００号に記載されており、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
ｍＲＮＡ癌ワクチンは、ペプチドに基づくワクチンまたはＤＮＡワクチンの代わりとなる特有の治療選択肢を与えるものである。ｍＲＮＡ癌ワクチンが細胞に送達されると、ｍＲＮＡは、細胞内機構によって処理されることでポリペプチドを生成し、この細胞内機構による処理を受けることで、生成したポリペプチドは腫瘍に対する免疫応答を刺激する能力を有する免疫感受性断片となることができる。
本明細書に記載の癌ワクチンは、少なくとも１つの癌抗原ポリペプチドまたはその免疫原性断片（例えば、癌に対する免疫応答を誘導する能力を有する免疫原性断片）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。癌ワクチンは、従来型癌ワクチンまたは個別化癌ワクチンであり得る。従来型癌ワクチンは、癌もしくは腫瘍に一般に見られることが知られる癌抗原、または特定の型の癌もしくは腫瘍において見られることが知られる癌抗原を含むワクチンである。腫瘍細胞においてまたは腫瘍細胞によって発現する抗原は、「腫瘍関連抗原」と称される。特定の腫瘍関連抗原は、非癌性細胞に発現し得るか、または発現し得ないこともある。多くの腫瘍変異が当該技術分野において知られている。
個別化ワクチンは、例えば、それぞれの対象に特異的な腫瘍抗原または癌抗原に特異的な既知の癌抗原を１つまたは複数コードするＲＮＡを含み得、こうした抗原は、ネオエピトープまたは対象特異的エピトープもしくは対象特異的抗原と称される。「対象特異的癌抗原」は、特定の患者の腫瘍に発現することが同定された抗原である。対象特異的癌抗原は、典型的には、腫瘍試料に存在し得たり、または存在し得なかったりすることが一般的である。非癌性細胞では発現しないか、もしくはめったに発現しないか、または非癌性細胞におけるその発現が、癌性細胞におけるものと比較して顕著に減少しており、ワクチン接種時に誘導される免疫応答を誘導する腫瘍関連抗原は、ネオエピトープと称される。腫瘍関連抗原のようなネオエピトープは、体に対して完全に外来性であるため、健康な組織に対する免疫応答を生成しないか、または免疫系の防御成分によって遮蔽されると想定される。いくつかの実施形態では、ネオエピトープに基づく個別化ワクチンが望ましく、この理由は、そのようなワクチン製剤によって、患者特異的な腫瘍に対する特異性が最大化することになるためである。変異によって得られるネオエピトープは、タンパク質に異なるアミノ酸が生じる非同義変異である点変異、終止コドンが修飾または欠失し、Ｃ末端に新規の腫瘍特異的配列を有する長鎖化タンパク質の翻訳を引き起こすリードスルー変異、成熟ｍＲＮＡにイントロンが含められるために、特有の腫瘍特異的タンパク質配列が生じるスプライス部位変異、２つのタンパク質のジャンクションに腫瘍特異的配列を有するキメラタンパク質が生じる染色体再編（すなわち、遺伝子融合）、新規の腫瘍特異的タンパク質配列を有する新たなオープンリーディングフレームが生じるフレームシフト変異または欠失、及び転座から生じ得る。したがって、いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ癌ワクチンは、フレームシフト変異及び組換えまたは本明細書に記載の他の変異のいずれかからなる群から選択される変異を含む少なくとも２つの癌抗原を含む。
個別化癌ワクチンの生成方法は、一般に、例えば核酸またはタンパク質のディープシークエンシング技術を使用する変異の同定と、例えば有効なペプチド－ＭＨＣ結合予測アルゴリズム、または患者のＨＬＡ対立遺伝子に結合し得、腫瘍に存在する変異に基づく候補Ｔ細胞エピトープのセットを生成するための他の分析技術を適用するネオエピトープの同定と、選択されるネオエピトープを抗原特異的Ｔ細胞が標的とすることの任意選択の実証または候補ネオエピトープが腫瘍表面に存在するＨＬＡタンパク質に結合することの任意選択の実証と、ワクチンの開発と、を含む。本発明のｍＲＮＡ癌ワクチンは、単一のネオエピトープの複数のコピー、単一の型の変異、すなわち点変異に基づく複数の異なるネオエピトープ、さまざまな変異型に基づく複数の異なるネオエピトープ、腫瘍関連抗原またはリコール抗原などのネオエピトープ及び他の抗原を含み得る。
変異の同定技術の例には、限定はされないが、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）、マイクロプレートアレイダイアゴナルゲル電気泳動（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ａｒｒａｙ ｄｉａｇｏｎａｌ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）（ＭＡＤＧＥ）、パイロシークエンシング、オリゴヌクレオチド特異的ライゲーション、ＴａｑＭａｎシステム、ならびにさまざまなＤＮＡ「チップ」技術、すなわちＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＳＮＰチップ、ならびに浸潤性の切断によって小型シグナル分子を生成させた後、質量分析法、または固定化パドロックプローブ及びローリングサークル増幅を実施することに基づく方法が含まれる。
核酸またはタンパク質のディープシークエンシング技術は、当該技術分野において知られている。任意の型の配列解析方法を使用することができる。核酸シークエンシングは、全腫瘍ゲノム、腫瘍エクソーム（タンパク質コードＤＮＡ）、腫瘍トランスクリプトーム、またはエキソソームに対して実施してよい。合成ごとのリアルタイム１分子シークエンシング技術は、シークエンシングされる鋳型に相補的なＤＮＡ新生鎖に蛍光ヌクレオチドが組み込まれるたびにそれが検出されるということを利用するものである。迅速なハイスループットシークエンシング方法は他にも存在する。タンパク質シークエンシングは、腫瘍プロテオームに対して実施してよい。さらに、腫瘍細胞に存在するＭＨＣタンパク質に結合した変異ペプチドが存在することを同定または検証をするために、タンパク質質量分析法を使用してよい。ペプチドは、腫瘍細胞から酸によって溶出させるか、または腫瘍から免疫沈降させたＨＬＡ分子から酸によって溶出させた後、質量分析法を使用して同定することができる。シークエンシングの結果は、既知の対照セットと比較するか、または患者の正常組織に対して実施されたシークエンシング解析と比較してよい。
したがって、本発明は、Ｔ細胞エピトープなどの、抗原のネオエピトープの同定方法及び／または検出方法に関する。具体的には、本発明は、対象における腫瘍特異的免疫応答の誘導において有用な腫瘍特異的ネオエピトープの同定方法及び／または検出方法を提供する。任意選択で、こうしたネオエピトープは、野生型ペプチドと比較してクラスＩのＨＬＡタンパク質に強い親和性で結合し、及び／または抗腫瘍ＣＤ８Ｔ細胞を活性化する能力を有する。任意の特定の遺伝子において同一の変異が腫瘍にまたがって見つかることは稀である。
ＭＨＣクラスＩタンパク質は、ほとんどの腫瘍細胞を含む、体のほとんどすべての細胞の表面に存在する。内在性タンパク質または細胞内に存在する病原体に通常は起源を有する抗原は、ＭＨＣクラスＩタンパク質に負荷され、その後、こうした抗原は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に提示される。Ｔ細胞受容体は、ＭＨＣクラスＩ分子と複合化したペプチドを認識してそれに結合する能力を有する。細胞傷害性Ｔリンパ球はそれぞれ、ＭＨＣ／ペプチド複合体に特異的に結合する能力を有する特有のＴ細胞受容体を発現する。
コンピューターアルゴリズムを使用すると、Ｔ細胞エピトープなどの潜在的なネオエピトープを予測することが可能であり、こうしたネオエピトープは、すなわち、ペプチド提示複合体の形態のクラスＩまたはクラスＩＩのＭＨＣ分子が結合した後、この形態においてＴリンパ球のＴ細胞受容体によって認識されるペプチド配列である。ＭＨＣに結合することになるペプチドの同定に有用なプログラムの例には、例えば、Ｌｏｎｚａ Ｅｐｉｂａｓｅ、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，５０（１９９９），２１３－２１９）、及びＨＬＡ＿ＢＩＮＤ（Ｐａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２（１９９４），１６３－１７５）が含まれる。
推定ネオエピトープが選択されると、インビトロ及び／またはインビトロのアッセイを使用してそれをさらに試験することができる。それぞれの患者からの単離物を用いて、Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイなどの、研究室において実施される通常のインビトロアッセイを使用することで、アルゴリズムによる予測に基づいて選択されたネオエピトープのリストを洗練してよい。
本発明のｍＲＮＡ癌ワクチンは、医薬組成物を含む組成物である。本発明は、ｍＲＮＡ癌ワクチンの選択方法、設計方法、調製方法、製造方法、製剤化方法、及び／または使用方法も包含する。本明細書に記載のｍＲＮＡ癌ワクチンの選択、設計、及び／または利用を目的とするシステム、プロセス、機器、及びキットも提供される。
本発明のｍＲＮＡワクチンは、１つまたは複数の癌抗原を含み得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上の抗原から構成される。他の実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、１０００以下、９００以下、５００以下、１００以下、７５以下、５０以下、４０以下、３０以下、２０以下、または１００以下の癌抗原から構成される。さらに他の実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、３～１００、５～１００、１０～１００、１５～１００、２０～１００、２５～１００、３０～１００、３５～１００、４０～１００、４５～１００、５０～１００、５５～１００、６０～１００、６５～１００、７０～１００、７５～１００、８０～１００、９０～１００、５～５０、１０～５０、１５～５０、２０～５０、２５～５０、３０～５０、３５～５０、４０～５０、４５～５０、１００～１５０、１００～２００、１００～３００、１００～４００、１００～５００、５０～５００、５０～８００、５０～１，０００、または１００～１，０００の癌抗原を有する。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ癌ワクチン及びワクチン接種方法は、特定の変異に基づくエピトープまたは抗原（ネオエピトープ）及び癌－生殖系列遺伝子が発現するもの（複数の患者に見られる腫瘍に共通する抗原）を含む。
本明細書で使用されるエピトープは、抗原決定基としても知られ、適切な状況では免疫系によって認識される抗原の一部分であり、具体的には、抗体、Ｂ細胞、またはＴ細胞によって認識される抗原の一部分である。エピトープには、Ｂ細胞エピトープ及びＴ細胞エピトープが含まれる。Ｂ細胞エピトープは、特定の抗体産生Ｂ細胞による認識に必要なペプチド配列である。Ｂ細胞エピトープは、抗体によって認識される抗原の特定領域を指す。エピトープに結合する抗体の一部分は、パラトープと呼ばれる。エピトープは、構造及びパラトープとの相互作用に基づく立体構造エピトープまたは直線状エピトープであり得る。直線状または連続的なエピトープは、タンパク質の特定領域の一次アミノ酸配列によって定義される。抗体と相互作用する配列は、連続的に互いに隣り合ってタンパク質に位置しており、エピトープは、通常、単一のペプチドによって模倣することができる。立体構造エピトープは、天然のタンパク質の立体構造によって定義されるエピトープである。こうしたエピトープは、連続的または非連続的であり得、すなわち、エピトープの構成要素は、タンパク質の異なる部分に位置し得、こうした異なる部分は、折り畳まれた天然のタンパク質構造において互いに近接化している。
Ｔ細胞エピトープは、ＡＰＣに存在するタンパク質と会合し、特定のＴ細胞による認識に必要なペプチド配列である。Ｔ細胞エピトープは、細胞内でプロセシングを受けてからＡＰＣの表面に提示され、ＡＰＣ表面で、ＭＨＣクラスＩＩ及びＭＨＣクラスＩを含むＭＨＣ分子に結合する。ペプチドエピトープは、エピトープとして適切な任意の長さであり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープは、９～３０のアミノ酸である。他の実施形態では、長さは、９～２２、９～２９、９～２８、９～２７、９～２６、９～２５、９～２４、９～２３、９～２１、９～２０、９～１９、９～１８、１０～２２、１０～２１、１０～２０、１１～２２、２２～２１、１１～２０、１２～２２、１２～２１、１２～２０、１３～２２、１３～２１、１３～２０、１４～１９、１５～１８、または１６～１７のアミノ酸である。
いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープは、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、及び少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープを含む。いくつかの実施形態では、エピトープの少なくとも１０％は、ＭＨＣクラスＩエピトープである。いくつかの実施形態では、エピトープの少なくとも２０％は、ＭＨＣクラスＩエピトープである。いくつかの実施形態では、エピトープの少なくとも３０％は、ＭＨＣクラスＩエピトープである。いくつかの実施形態では、エピトープの少なくとも４０％は、ＭＨＣクラスＩエピトープである。いくつかの実施形態では、エピトープの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％は、ＭＨＣクラスＩエピトープである。いくつかの実施形態では、エピトープの少なくとも１０％は、ＭＨＣクラスＩＩエピトープである。いくつかの実施形態では、エピトープの少なくとも２０％は、ＭＨＣクラスＩＩエピトープである。いくつかの実施形態では、エピトープの少なくとも３０％は、ＭＨＣクラスＩＩエピトープである。いくつかの実施形態では、エピトープの少なくとも４０％は、ＭＨＣクラスＩＩエピトープである。いくつかの実施形態では、エピトープの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％は、ＭＨＣクラスＩＩエピトープである。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩエピトープとＭＨＣクラスＩＩエピトープとの比率は、約１０％：約９０％、約２０％：約８０％、約３０％：約７０％、約４０％：約６０％、約５０％：約５０％、約６０％：約４０％、約７０％：約３０％、約８０％：約２０％、約９０％：約１０％のＭＨＣクラス１エピトープ：ＭＨＣクラスＩＩエピトープから選択される比率である。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩエピトープとＭＨＣクラスＩエピトープとの比率は、約１０％：約９０％、約２０％：約８０％、約３０％：約７０％、約４０％：約６０％、約５０％：約５０％、約６０％：約４０％、約７０％：約３０％、約８０％：約２０％、約９０％：約１０％のＭＨＣクラスＩ１エピトープ：ＭＨＣクラスＩエピトープから選択される比率である。いくつかの実施形態では、癌ワクチンのペプチドエピトープの少なくとも１つは、Ｂ細胞エピトープである。いくつかの実施形態では、癌ワクチンのＴ細胞エピトープは、８～１１のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、癌ワクチンのＢ細胞エピトープは、１３～１７のアミノ酸を含む。
いくつかの態様では、本発明の癌ワクチンは、エピトープの間に単一のヌクレオチドスペーサーを挟んで配置されるか、またはエピトープの間にスペーサーを挟まずに互いに直接配置される複数のペプチドエピトープ抗原をコードするｍＲＮＡワクチンを含む。複数のエピトープ抗原には、ＭＨＣクラスＩエピトープとＭＨＣクラスＩＩエピトープとの混合物が含まれる。例えば、複数のペプチドエピトープ抗原は、
（Ｘ－Ｇ－Ｘ）１－１０（Ｇ－Ｙ－Ｇ－Ｙ）１－１０（Ｇ－Ｘ－Ｇ－Ｘ）０－１０（Ｇ－Ｙ－Ｇ－Ｙ）０－１０、（Ｘ－Ｇ）１－１０（Ｇ－Ｙ）１－１０（Ｇ－Ｘ）０－１０（Ｇ－Ｙ）０－１０、（Ｘ－Ｇ－Ｘ－Ｇ－Ｘ）１－１０（Ｇ－Ｙ－Ｇ－Ｙ）１－１０（Ｘ－Ｇ－Ｘ）０－１０（Ｇ－Ｙ－Ｇ－Ｙ）０－１０、（Ｘ－Ｇ－Ｘ）１－１０（Ｇ－Ｙ－Ｇ－Ｙ－Ｇ－Ｙ）１－１０（Ｘ－Ｇ－Ｘ）０－１０（Ｇ－Ｙ－Ｇ－Ｙ）０－１０、（Ｘ－Ｇ－Ｘ－Ｇ－Ｘ－Ｇ－Ｘ）１－１０（Ｇ－Ｙ－Ｇ－Ｙ）１－１０（Ｘ－Ｇ－Ｘ）０－１０（Ｇ－Ｙ－Ｇ－Ｙ）０－１０、（Ｘ－Ｇ－Ｘ）１－１０（Ｇ－Ｙ－Ｇ－Ｙ－Ｇ－Ｙ－Ｇ－Ｙ）１－１０（Ｘ－Ｇ－Ｘ）０－１０（Ｇ－Ｙ－Ｇ－Ｙ）０－１０、（Ｘ）１－１０（Ｙ）１－１０（Ｘ）０－１０（Ｙ）０－１０、（Ｙ）１－１０（Ｘ）１－１０（Ｙ）０－１０（Ｘ）０－１０、（ＸＸ）１－１０（Ｙ）１－１０（Ｘ）０－１０（Ｙ）０－１０、（ＹＹ）１－１０（ＸＸ）１－１０（Ｙ）０－１０（Ｘ）０－１０、（Ｘ）１－１０（ＹＹ）１－１０（Ｘ）０－１０（Ｙ）０－１０、（ＸＸＸ）１－１０（ＹＹＹ）１－１０（ＸＸ）０－１０（ＹＹ）０－１０、（ＹＹＹ）１－１０（ＸＸＸ）１－１０（ＹＹ）０－１０（ＸＸ）０－１０、（ＸＹ）１－１０（Ｙ）１－１０（Ｘ）１－１０（Ｙ）１－１０、（ＹＸ）１－１０（Ｙ）１－１０（Ｘ）１－１０（Ｙ）１－１０、（ＹＸ）１－１０（Ｘ）１－１０（Ｙ）１－１０（Ｙ）１－１０、（Ｙ－Ｇ－Ｙ）１－１０（Ｇ－Ｘ－Ｇ－Ｘ）１－１０（Ｇ－Ｙ－Ｇ－Ｙ）０－１０（Ｇ－Ｘ－Ｇ－Ｘ）０－１０、（Ｙ－Ｇ）１－１０（Ｇ－Ｘ）１－１０（Ｇ－Ｙ）０－１０（Ｇ－Ｘ）０－１０、（Ｙ－Ｇ－Ｙ－Ｇ－Ｙ）１－１０（Ｇ－Ｘ－Ｇ－Ｘ）１－１０（Ｙ－Ｇ－Ｙ）０－１０（Ｇ－Ｘ－Ｇ－Ｘ）０－１０、（Ｙ－Ｇ－Ｙ）１－１０（Ｇ－Ｘ－Ｇ－Ｘ－Ｇ－Ｘ）１－１０（Ｙ－Ｇ－Ｙ）０－１０（Ｇ－Ｘ－Ｇ－Ｘ）０－１０、（Ｙ－Ｇ－Ｙ－Ｇ－Ｙ－Ｇ－Ｙ）１－１０（Ｇ－Ｘ－Ｇ－Ｘ）１－１０（Ｙ－Ｇ－Ｙ）０－１０（Ｇ－Ｘ－Ｇ－Ｘ）０－１０、（Ｙ－Ｇ－Ｙ）１－１０（Ｇ－Ｘ－Ｇ－Ｘ－Ｇ－Ｘ－Ｇ－Ｘ）１－１０（Ｙ－Ｇ－Ｙ）０－１０（Ｇ－Ｘ－Ｇ－Ｘ）０－１０、（ＸＹ）１－１０（ＹＸ）１－１０（ＸＹ）０－１０（ＹＸ）０－１０、（ＹＸ）１－１０（ＸＹ）１－１０（Ｙ）０－１０（Ｘ）０－１０、（ＹＹ）１－１０（Ｘ）１－１０（Ｙ）０－１０（Ｘ）０－１０、（ＸＹ）１－１０（ＸＹ）１－１０（Ｘ）０－１０（Ｘ）０－１０、（Ｙ）１－１０（ＹＸ）１－１０（Ｘ）０－１０（Ｙ）０－１０、（ＸＹＸ）１－１０（ＹＸＸ）１－１０（ＹＸ）０－１０（ＹＹ）０－１０、または（ＹＹＸ）１－１０（ＸＸＹ）１－１０（ＹＸ）０－１０（ＸＹ）０－１０という構造を有するポリペプチドであり得、
Ｘは、１０～４０のアミノ酸長のＭＨＣクラスＩエピトープであり、Ｙは、１０～４０のアミノ酸長のＭＨＣクラスＩＩエピトープであり、Ｇは、グリシンである。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、例えば、非ＡＰＣから偽ＡＰＣ（ｐｓｅｕｄｏ－ＡＰＣ）への変換によって抗原提示細胞（ＡＰＣ）の産生を促進するための薬剤と組み合わせることができる。抗原提示は、免疫応答の開始、増幅、及び持続時間における重要な段階である。このプロセスでは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）を介して抗原の断片がＴ細胞に提示されることで、抗原特異的な免疫応答が推進される。免疫予防及び免疫治療については、この応答の増進が効果の改善に重要である。本発明のＲＮＡワクチンは、効率的な抗原提示を推進するために設計または増強してよい。ＡＰＣによるプロセシング及び提示の増進方法の１つは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）へのＲＮＡワクチンの標的指向性を向上させることである。別の手法は、免疫賦活性の製剤及び／または成分によるＡＰＣ細胞の活性化を含むものである。
あるいは、非ＡＰＣを再プログラム化してＡＰＣになりつつある状態にする方法を本発明のＲＮＡワクチンと共に使用してよい。重要なことに、ｍＲＮＡ製剤を取り込み、かつその治療作用の標的である細胞のほとんどがＡＰＣではない。それ故に、こうした細胞をＡＰＣに変換する方法を設計すれば、効果にとって有利なものとなるであろう。非ＡＰＣからＡＰＣへのシフトも促進しつつ、例えばｍＲＮＡワクチンなどのＲＮＡワクチンを細胞に送達する方法及び手法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ＡＰＣ再プログラム化分子をコードするｍＲＮＡは、ＲＮＡワクチンに含められるか、またはＲＮＡワクチンと共に同時投与される。
本明細書で使用されるＡＰＣ再プログラム化分子は、非ＡＰＣ細胞からＡＰＣ様フェノタイプへの移行を促進する分子である。ＡＰＣ様フェノタイプは、ＭＨＣクラスＩＩプロセシングを可能にする特性である。したがって、ＡＰＣ様フェノタイプを有するＡＰＣ細胞は、１つまたは複数の外来性分子（ＡＰＣ再プログラム化分子）を有さない同一の細胞と比較してＭＨＣクラスＩＩプロセシング能力が増進した、１つまたは複数の外来性分子を有する細胞である。いくつかの実施形態では、ＡＰＣ再プログラム化分子は、ＣＩＩＴＡ（ＭＨＣクラスＩＩ発現の中心制御因子）、ＣＬＩＰ、ＨＬＡ－ＤＯ、ＨＬＡ－ＤＭなどのシャペロンタンパク質（ＭＨＣクラスＩＩへの抗原断片負荷のエンハンサー）、及び／またはＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６等のような共刺激分子（Ｔ細胞の抗原認識及びＴ細胞活性化のエンハンサー）である。
ＣＩＩＴＡタンパク質は、クラスＩＩのプロモーター領域と会合するＤＮＡ結合タンパク質の保存されたセットと相互作用することによってＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の転写活性化を増進するトランス活性化因子である（Ｓｔｅｉｍｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃｅｌｌ ７５：１３５－１４６）。ＣＩＩＴＡの転写活性化機能は、アミノ末端の酸性ドメイン（アミノ酸２６～１３７）に位置するとされている。ＣＩＩＴＡと相互作用するタンパク質は、ＣＩＩＴＡ相互作用タンパク質１０４（本明細書ではＣＩＰ１０４とも称される）と呼ばれ、核酸分子にコードされる。ＣＩＴＴＡとＣＩＰ１０４との両方が、ＭＨＣクラスＩＩのプロモーターからの転写を増進することが示されており、したがって本発明のＡＰＣ再プログラム化分子として有用である。いくつかの実施形態では、ＡＰＣ再プログラム化分子は、全長のＣＩＩＴＡ、ＣＩＰ１０４、もしくは他の関連分子、またはその活性断片であり、こうした活性断片は、ＣＩＩＴＡのアミノ酸２６～１３７、またはそれとの配列同一性が少なくとも８０％であり、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の転写活性化を増進する能力を維持するアミノ酸などである。
好ましい実施形態では、ＡＰＣ再プログラム化分子は、ＡＰＣ再プログラム化分子をコードするｍＲＮＡの形態で対象に送達される。したがって、本発明のＲＮＡワクチンは、ＡＰＣ再プログラム化分子をコードするｍＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、モノシストロニックである。他の実施形態では、ｍＲＮＡは、ポリシストロニックである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の抗原をコードするｍＲＮＡは、ＡＰＣ再プログラム化分子をコードするｍＲＮＡとは別の製剤に存在する。他の実施形態では、１つまたは複数の抗原をコードするｍＲＮＡは、ＡＰＣ再プログラム化分子をコードするｍＲＮＡと同一の製剤に存在する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の抗原をコードするｍＲＮＡは、ＡＰＣ再プログラム化分子をコードするｍＲＮＡと同一回数、対象に投与される。他の実施形態では、１つまたは複数の抗原をコードするｍＲＮＡは、ＡＰＣ再プログラム化分子をコードするｍＲＮＡとは異なる回数、対象に投与される。例えば、ＡＰＣ再プログラム化分子をコードするｍＲＮＡは、１つまたは複数の抗原をコードするｍＲＮＡの前に投与してよい。ＡＰＣ再プログラム化分子をコードするｍＲＮＡは、抗原をコードするｍＲＮＡの直前、少なくとも１時間前、少なくとも１日前、少なくとも１週間前、または少なくとも１ヶ月前に投与してよい。
あるいは、ＡＰＣ再プログラム化分子をコードするｍＲＮＡは、１つまたは複数の抗原をコードするｍＲＮＡの後に投与してよい。ＡＰＣ再プログラム化分子をコードするｍＲＮＡは、抗原をコードするｍＲＮＡの直後、少なくとも１時間後、少なくとも１日後、少なくとも１週間後、または少なくとも１ヶ月後に投与してよい。いくつかの実施形態では、抗原は、患者特異的な抗原などの癌抗原である。他の実施形態では、抗原は、感染性疾患の抗原である。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡワクチンは、リコール抗原を含み得、リコール抗原は、メモリー抗原と称されることもある。リコール抗原は、個体が以前に遭遇したことのある抗原であり、その個体には、メモリーリンパ球が既に存在する。いくつかの実施形態では、リコール抗原は、インフルエンザ抗原などの、個体が遭遇した可能性のある感染性疾患抗原であり得る。リコール抗原は、より強固な免疫応答の促進に役立つ。
ｍＲＮＡワクチンに含めるために選択される抗原またはネオエピトープとしては、典型的には、高親和性を有する結合ペプチドを選択することになる。いくつかの態様では、抗原またはネオエピトープは、野生型ペプチドと比較して高親和性でＨＬＡタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、抗原またはネオエピトープが有するＩＣ５０は、少なくとも５０００ｎＭ未満、少なくとも５００ｎＭ未満、少なくとも２５０ｎＭ未満、少なくとも２００ｎＭ未満、少なくとも１５０ｎＭ未満、少なくとも１００ｎＭ未満、少なくとも５０ｎＭ、またはそれ未満である。典型的には、予測ＩＣ５０が５０ｎＭ未満であるペプチドは、中程度から高度の親和性を有する結合ペプチドであると一般に考えられ、ＨＬＡ結合の生化学的アッセイを使用してその親和性を実験的に試験するために選択されることになる。
個別化癌ワクチンでは、対象特異的癌抗原は、患者の試料において同定してよい。例えば、試料は、組織試料または腫瘍試料であり得る。例えば、１つまたは複数の腫瘍細胞の試料において対象特異的癌抗原の存在を調べてよい。腫瘍試料は、対象特異的癌抗原を同定するために、全ゲノム、エクソーム、またはトランスクリプトームの解析を使用して調べてよい。
あるいは、対象特異的癌抗原は、対象のエキソソームにおいて同定してよい。ワクチン向けの抗原が、対象のエキソソームにおいて同定されると、そのような抗原は、対象のエキソソーム抗原の代表物であると言われる。
エキソソームは、細胞によって分泌される小さなマイクロベシクルであり、典型的には、およそ３０～１００ｎｍの直径を有する。エキソソームは、古典的には内向きの陥入から形成され、最後のエンドソーム膜がくびれて切り離される結果、脂質二重層を有する小ベシクルを多く含む多胞体（ＭＶＢ）が形成され、こうした小ベシクルのそれぞれが、親細胞の細胞質の試料を含む。ＭＶＢが細胞膜と融合すると、こうしたエキソソームが細胞から放出され、放出されたエキソソームは、血液、尿、脳脊髄液、または他の体液へと送達される。エキソソームは、こうした生体液のいずれからでも、さらなる分析に向けて回収することができる。
エキソソーム内の核酸は、腫瘍抗原のバイオマーカーとしての役割を有する。対象特異的癌抗原を同定するためのエキソソーム分析の利点は、この方法によれば生検を実施する必要がなくなることである。このことは、癌抗原の同定及びワクチン接種を含む数ラウンドの治療を患者が受ける必要があるときに特に有益であり得る。
生体試料からのエキソソームの単離方法については、当該技術分野において多くのものが説明されてきた。例えば、下記の方法を使用することができる：分画遠心、低速遠心、アニオン交換、及び／またはゲル浸透クロマトグラフィー、スクロース密度勾配もしくはオルガネラ電気泳動、磁気活性化細胞選別（ｍａｇｎｅｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＭＡＣＳ）、ナノ膜限外濾過遠心、パーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）を用いた密度勾配による単離、及びマイクロ流体デバイスの使用。方法の例は、例えば、米国特許公開第２０１４／０２１２８７１号に記載されている。
「生体試料」という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質などの生体材料を含む試料を指す。いくつかの実施形態では、生体試料は、対象に由来する体液を適切に含み得る。体液は、対象の体の任意の位置、好ましくは末梢位置から単離される液体であり得、こうした液体には、限定はされないが、例えば、血液、血漿、血清、尿、痰、髄液、脳脊髄液、胸水、乳頭吸引液、リンパ液、気道、腸管、及び尿生殖器に由来する液体、涙液、唾液、母乳、リンパ系に由来する液体、精液、脳脊髄液、臓器内系液、腹水、腫瘍嚢胞液（ｔｕｍｏｒ ｃｙｓｔ ｆｌｕｉｄ）、羊水、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。
いくつかの実施形態では、発現抗原の変化を同定するために癌の進行を監視することができる。したがって、いくつかの実施形態では、方法ではさらに、第２のセットの癌抗原を得るための、対象の試料に由来する少なくとも２つの癌抗原の同定と、対象に対する第２のセットの癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンの対象への投与とが、癌ｍＲＮＡワクチンの投与から少なくとも１ヶ月後に実施される。いくつかの実施形態では、第２のセットの抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンは、第１のセットの癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンの２ヶ月後、３ヶ月後、４ヶ月後、５ヶ月後、６ヶ月後、８ヶ月後、１０ヶ月後、または１年後に対象に投与される。他の実施形態では、第２のセットの抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンは、第１のセットの癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンの１年半後、２年後、２年半後、３年後、３年半後、４年後、４年半後、または５年後に対象に投与される。
ネオ抗原としてのホットスポット変異
癌の集団解析では、偶発するであろうと予測されるより高い割合の患者にある特定の変異が生じる。こうした「反復」変異または「ホットスポット」変異は、腫瘍において「ドライバー」の役割を有すると示されたことが多く、腫瘍の開始、維持、または転移に重要な癌細胞機能に何らかの変化をもたらし、それ故に、腫瘍が進化するために選択されるものである。腫瘍の生物学及び治療におけるその重要性に加えて、反復変異からは精密医療の機会が得られ、こうした精密医療では、患者集団は特定の治療に応答する可能性が高い群へと分類される。こうした特定の治療には、限定はされないが、変異タンパク質自体を標的とするものが含まれる。
反復変異については、非同義（または「ミスセンス」）の単一ヌクレオチド変異体（ＳＮＶ）に重点が置かれ、多大な努力及び研究がなされてきたが、同義（または「サイレント」）、スプライス部位、複数ヌクレオチド変異体、挿入、及び欠失などの、さまざまな複雑性の高い（非ＳＮＶ）変異分類のものも高頻度で生じ得ることが集団解析によって明らかになってきた。
ｐ５３遺伝子（正式記号ＴＰ５３）は、ヒトの癌において他のどの遺伝子よりも高い頻度で変異する。ｐ５３に生じる変異のほとんどで、そのゲノム位置は１人または少数の患者のみに特有であるため、こうした変異は、特定の患者集団向けに設計される治療ワクチンのための反復ネオ抗原として使用できないことが大規模コホート研究によって示された。驚くべきことに、しかしながら、ｐ５３遺伝子座の小サブセットは実に「ホットスポット」のパターンを示しており、そこでは、遺伝子のいくつかの位置が相対的に高い頻度で変異するのである。際だったことに、反復して変異するこうした領域の大部分が、エクソンとイントロンとの境界付近に存在し、ｍＲＮＡのスプライシング機構によって認識される標準のヌクレオチド配列モチーフを破壊する。スプライシングモチーフが変異すると、局所的なアミノ酸配列には変化が生じない（すなわち、同義変異またはイントロン変異）と予測されるとしても、最終的なｍＲＮＡ配列には変化が生じ得る。それ故に、こうした変異によって予測不可能な様式でｍＲＮＡのスプライシングに変化が生じ得、翻訳されるタンパク質が著しい機能的影響を受け得るにもかかわらず、こうした変異は、一般的なアノテーションツールによって「ノンコーディング」として注解されてしまい、さらに解析されることなく無視されることが多い。代替的にスプライシングを受けたアイソフォームにインフレームの配列変化が生じる（すなわち、ＰＴＣが生じない）のであれば、こうしたアイソフォームはＮＭＤによる排除を免れることができ、速やかに発現し、プロセシングを受けてＨＬＡ系によって細胞表面に提示される。さらに、変異に由来する代替的なスプライシングは、通常、「潜在性」であって、すなわち、正常組織では発現しないものであり、それ故に、Ｔ細胞によって非自己のネオ抗原として認識され得る。
いくつかの態様では、本発明は、ｐ５３におけるある特定の反復体細胞癌変異（限定はされないが、ミスセンスＳＮＶ）から得られ、代替のスプライシングを引き起こすことが多いネオ抗原ペプチド配列を提供し、こうしたネオ抗原ペプチド配列は、治療的なワクチン接種のための標的としての使用を目的とする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡのスプライシング事象でネオ抗原ペプチド及び／またはＨＬＡ拘束性エピトープを生じさせる変異には、コドン位置Ｔ１２５に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＡＶＳＰＣＩＳＦＶＷ（配列番号２）（ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５８：０１）、エピトープＨＰＬＡＳＣＱＣＦＦ（配列番号３）（ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１）、エピトープＦＶＷＮＦＧＩＰＬ（配列番号４）（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０６、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１）を含むペプチド配列ＴＡＫＳＶＴＣＴＶＳＣＰＥＧＬＡＳＭＲＬＱＣＬＡＶＳＰＣＩＳＦＶＷＮＦＧＩＰＬＨＰＬＡＳＣＱＣＦＦＩＶＹＰＬＮＶ（配列番号１）を有する保持型イントロンを誘導する変異が含まれる。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡのスプライシング事象でネオ抗原ペプチド及び／またはＨＬＡ拘束性エピトープを生じさせる変異には、コドン位置３３１に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＬＱＶＬＳＬＧＴＳＹ（配列番号６）（ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１）、エピトープＦＱＳＮＴＱＮＡＶＦ（配列番号７）（ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１）を含むペプチド配列ＥＹＦＴＬＱＶＬＳＬＧＴＳＹＱＶＥＳＦＱＳＮＴＱＮＡＶＦＦＬＴＶＬＰＡＩＧＡＦＡＩＲＧＱ（配列番号５）を有する保持型イントロンを誘導する変異が含まれる。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡのスプライシング事象でネオ抗原ペプチド及び／またはＨＬＡ拘束性エピトープを生じさせる変異には、コドン位置１２６に隣接する標準３’スプライス部位における変異であって、エピトープＣＴＭＦＣＱＬＡＫ（配列番号９）（ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１）、エピトープＫＳＶＴＣＴＭＦ（配列番号１０）（ＨＬＡ－Ｂ＊５８：０１）を含む新規のスパニングペプチド配列ＡＫＳＶＴＣＴＭＦＣＱＬＡＫ（配列番号８）を生成する潜在性の代替エクソン３’スプライス部位を誘導する変異が含まれる。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡのスプライシング事象でネオ抗原ペプチド及び／またはＨＬＡ拘束性エピトープを生じさせる変異には、コドン位置２２４に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＶＰＹＥＰＰＥＶＷ（配列番号１２）（ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１）、エピトープＬＴＶＰＰＳＴＡＷ（配列番号１３）（ＨＬＡ－Ｂ＊５８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１）を含む新規のスパニングペプチド配列ＶＰＹＥＰＰＥＶＷＬＡＬＴＶＰＰＳＴＡＷＡＡ（配列番号１１）を生成する潜在性の代替イントロン５’スプライス部位を誘導する変異が含まれる。
前述の配列では、転写コドン位置は、Ｅｎｓｅｍｂｌのｖ８３のヒトゲノムアノテーションに由来する標準の全長ｐ５３転写物であるＥＮＳＴ０００００２６９３０５（配列番号１４）を参照したものである。
１つの実施形態では、本発明は、ネオ抗原ペプチド１～４をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むコンカテマーポリエピトープ構築物または個々のエピトープ構築物のセットを含むｍＲＮＡワクチンを提供する。
１つの実施形態では、本発明は、患者の腫瘍が上記の変異のいずれを含むかということに基づく、ペプチド１～４を含むか、またはコードするワクチンの選択投与を提供する。
１つの実施形態では、本発明は、１）患者の腫瘍が上記の変異のいずれを含むか、及び２）患者の正常なＨＬＡ型が、得られるネオ抗原に結合すると予測される対応ＨＬＡ対立遺伝子を含むか、という二重の判断基準に基づく、ワクチンの選択投与を提供する。
本明細書に記載のｍＲＮＡワクチンは、現在のワクチンと比較していくつかの点で優れていることが発見された。第１に、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）による送達は、文献に記載のリポソームまたはプロタミンに基づく手法を含む他の製剤より優れており、追加のアジュバントが必要になることはない。ＬＮＰを使用すると、化学的に修飾または非修飾のｍＲＮＡワクチンを効率的に送達することが可能になる。修飾及び非修飾のＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡワクチンは両方共、通常のワクチンより顕著に優れている。いくつかの実施形態では、本発明のｍＲＮＡワクチンは、通常のワクチンと比較して、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、または少なくとも１，０００倍優れている。
ｍＲＮＡワクチン及び自己複製ＲＮＡワクチンを含む機能性ＲＮＡワクチンを生成するための試みがいくつもなされてきたが、こうしたＲＮＡワクチンの治療効果は、依然として完全には確立されていない。非常に驚くべきことに、抗原産生の増進及び中和能力を有する機能性抗体の産生を含む、顕著に増進しており、多くの点で相乗的な免疫応答を引き起こす、インビボでｍＲＮＡワクチンを送達するための製剤クラスを、本発明の態様に従って発明者らは発見した。こうした結果は、脂質に基づく他のクラスの製剤において使用されるｍＲＮＡ用量と比較して顕著に低い用量のｍＲＮＡが投与されるときでさえ達成することができる。本発明の製剤は、予防剤及び治療剤としての機能性ｍＲＮＡワクチンの効果を確立するために十分な、顕著な免疫応答をインビボで予想外に引き起こすことが示された。さらに、自己複製ＲＮＡワクチンでは、細胞に十分なＲＮＡを送達するためにウイルスの複製経路を利用することで免疫応答が生成する。本発明の製剤では、ウイルス複製を必要とすることなく、強力な免疫応答の誘発に十分なタンパク質が産生する。したがって、本発明のｍＲＮＡは、自己複製ＲＮＡではなく、ウイルス複製に必要な要素を含まない。
いくつかの態様では、本発明は、化学的に修飾及び非修飾のｍＲＮＡワクチンを含むｍＲＮＡワクチンの有効性を脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤が顕著に増進するという驚くべき知見を含む。ＬＮＰにおいて製剤化されたｍＲＮＡワクチンの効果を、異なる腫瘍抗原をいくつか使用してインビボで調べた。免疫応答の増進誘発に加えて、本発明の製剤は、他の試験ワクチンと比較して少ない用量の抗原で、より迅速に免疫応答を生成する。さらに、異なる担体において製剤化されたワクチンと比較して、本発明のｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤は、量的かつ質的に優れた免疫応答を生成する。さらに、本発明のｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤は、他のワクチンと比較してｍＲＮＡの用量が少ないときでさえ、他のワクチンより優れている。
本明細書に記載の試験において使用したＬＮＰは、さまざまな動物モデルならびにヒトにおけるｓｉＲＮＡの送達に以前に使用されたものである。ＬＮＰ製剤によるｓｉＲＮＡの送達と関連して得られた知見を考慮すると、ＬＮＰがワクチンにおいて有用であるという事実は非常に驚くべきものである。ＬＮＰにおいて製剤化されたｓｉＲＮＡの治療的な送達では、一過性のＩｇＭ応答と関連する望ましくない炎症応答が生じる結果として、典型的には、抗原産生が減少し、免疫応答が損なわれることが観測されている。ｓｉＲＮＡで観測された知見とは対照的に、本発明のＬＮＰ－ｍＲＮＡ製剤では、一過性のＩｇＭ応答ではなく、予防方法及び治療方法に十分となるＩｇＧレベルの増進が生じることが本明細書に示されている。
核酸／ポリヌクレオチド
本明細書で提供される癌ワクチンは、少なくとも１つの癌抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つ（１つまたは複数）のリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。「核酸」という用語は、その最も広い意味では、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び／または物質を含む。こうしたポリマーは、ポリヌクレオチドと称される。
核酸（ポリヌクレオチドとも称される）は、例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（β－Ｄ－リボ配置を有するＬＮＡ、α－Ｌ－リボ配置を有するα－ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’－アミノ官能化された２’－アミノ－ＬＮＡ、及び２’－アミノ官能化された２’－アミノ－α－ＬＮＡを含むＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）、またはそのキメラもしくは組み合わせであり得るか、またはそれを含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）として機能する。「メッセンジャーＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）は、（少なくとも１つの）ポリペプチド（天然起源のアミノ酸ポリマー、非天然起源のアミノ酸ポリマー、または修飾されたアミノ酸ポリマー）をコードし、翻訳されることで、コードされるポリペプチドをインビトロ、インビボ、インサイチュ、またはエクスビボで生成することができる任意のポリヌクレオチドを指す。
ｍＲＮＡ分子の基本構成要素には、典型的には、少なくとも１つのコード領域、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ、５’キャップ、及びポリＡ尾部が含まれる。本開示のポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡとして機能し得るが、核酸に基づく治療剤を使用してポリペプチドを効率的に発現させるという現存する問題の克服に役立つ機能的特徴及び／または構造設計特徴をそれが有している点において野生型ｍＲＮＡとは区別することができる。
いくつかの実施形態では、癌ワクチンのＲＮＡポリヌクレオチドは、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、２～３、３～１０、３～９、３～８、３～７、３～６、３～５、３～４、４～１０、４～９、４～８、４～７、４～６、４～５、５～１０、５～９、５～８、５～７、５～６、６～１０、６～９、６～８、６～７、７～１０、７～９、７～８、８～１０、８～９、または９～１０の抗原ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、癌ワクチンのＲＮＡポリヌクレオチドは、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、または少なくとも１００の抗原ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、癌ワクチンのＲＮＡポリヌクレオチドは、少なくとも１００または少なくとも２００の抗原ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、癌ワクチンのＲＮＡポリヌクレオチドは、１～１０、５～１５、１０～２０、１５～２５、２０～３０、２５～３５、３０～４０、３５～４５、４０～５０、１～５０、１～１００、２～５０、または２～１００の抗原ポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、コドンが最適化される。コドンの最適化方法は、当該技術分野において知られており、本明細書で提供されるように使用してよい。いくつかの実施形態では、適切な折り畳みを維持するための、標的のコドン頻度と宿主生物のコドン頻度との整合、ｍＲＮＡの安定性の向上もしくは二次構造の低減のためのＧＣ含量の偏向化、遺伝子の構築もしくは発現を損ない得るタンデムリピートコドン及び塩基配列の最小化、転写制御領域及び翻訳制御領域のカスタマイズ、タンパク質輸送配列の挿入もしくは除去、コードされるタンパク質における翻訳後修飾部位（例えば、グリコシル化部位）の除去／付加、タンパク質ドメインの付加、除去、もしくはシャッフル、制限酵素部位の挿入もしくは除去、リボソーム結合部位及びｍＲＮＡ分解部位の修飾、タンパク質のさまざまなドメインの適切な折り畳みを可能にするための翻訳速度の調節、またはポリヌクレオチド内の問題の二次構造の低減もしくは除外、を目的としてコドンの最適化を使用してよい。コドンの最適化するツール、アルゴリズム、及びサービスは、当該技術分野において知られており、例には限定はされないが、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から提供されるサービス、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ ＣＡ）、及び／または独自の方法が含まれる。いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列は、最適化アルゴリズムを使用して最適化される。
いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然起源または野生型の配列（例えば、目的とするポリペプチドまたはタンパク質（例えば、抗原性のタンパク質またはポリペプチド）をコードする天然起源または野生型のｍＲＮＡ配列）と９５％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然起源または野生型の配列（例えば、目的とするポリペプチドまたはタンパク質（例えば、抗原性のタンパク質またはポリペプチド）をコードする天然起源または野生型のｍＲＮＡ配列）と９０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然起源または野生型の配列（例えば、目的とするポリペプチドまたはタンパク質（例えば、抗原性のタンパク質またはポリペプチド）をコードする天然起源または野生型のｍＲＮＡ配列）と８５％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然起源または野生型の配列（例えば、目的とするポリペプチドまたはタンパク質（例えば、抗原性のタンパク質またはポリペプチド）をコードする天然起源または野生型のｍＲＮＡ配列）と８０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然起源または野生型の配列（例えば、目的とするポリペプチドまたはタンパク質（例えば、抗原性のタンパク質またはポリペプチド）をコードする天然起源または野生型のｍＲＮＡ配列）と７５％未満の配列同一性を共有する。
いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然起源または野生型の配列（例えば、目的とするポリペプチドまたはタンパク質（例えば、抗原性のタンパク質またはポリペプチド）をコードする天然起源または野生型のｍＲＮＡ配列）と６５％～８５％（例えば、約６７％～約８５％または約６７％～約８０％）の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然起源または野生型の配列（例えば、目的とするポリペプチドまたはタンパク質（例えば、抗原性のタンパク質またはポリペプチド）をコードする天然起源または野生型のｍＲＮＡ配列）と６５％～７５または約８０％の配列同一性を共有する。
いくつかの実施形態では、コドン最適化ＲＮＡは、例えば、Ｇ／Ｃのレベルが増強されたものであり得る。核酸分子のＧ／Ｃ含量は、ＲＮＡの安定性に影響を与え得る。グアニン（Ｇ）残基及び／またはシトシン（Ｃ）残基の量が増加したＲＮＡは、アデニン（Ａ）ヌクレオチド及びチミン（Ｔ）ヌクレオチドまたはウラシル（Ｕ）ヌクレオチドを大量に含む核酸と比較して機能的により安定であり得る。ＷＯ０２／０９８４４３では、翻訳領域の配列改変によって安定化したｍＲＮＡを含む医薬組成物が開示されている。遺伝コードは縮重しているため、得られるアミノ酸を変えることなくＲＮＡの安定性向上を促進するコドンで現存コドンを置換することによって改変は機能する。この手法は、ＲＮＡのコード領域に限ったものではない。
抗原／抗原ポリペプチド
いくつかの実施形態では、癌抗原ポリペプチドは、２５のアミノ酸より長く、かつ５０のアミノ酸より短い。したがって、ポリペプチドには、遺伝子産物、天然起源のポリペプチド、合成ポリペプチド、前述のもののホモログ、オルソログ、パラログ、断片及び他の同等形態、変異体、ならびに類似体が含まれる。ポリペプチドは、単一分子であり得るか、または二量体、三量体、もしくは四量体などの複数分子の複合体であり得る。ポリペプチドには、一本鎖のポリペプチド、または抗体もしくはインスリンなどの複数鎖のポリペプチドも含まれ得、ポリペプチドは、会合し得るか、または連結され得る。最も一般的には、複数鎖のポリペプチドにはジスルフィド結合が見られる。ポリペプチドという用語は、少なくとも１つのアミノ酸残基が、対応する天然起源のアミノ酸の人工的な化学類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用され得る。
「ポリペプチド変異体」という用語は、天然配列または参照配列とはそのアミノ酸配列が異なる分子を指す。アミノ酸配列変異体は、天然配列または参照配列と比較して、アミノ酸配列内のある特定の位置に置換、欠失、及び／または挿入を有し得る。通常、変異体は、天然配列または参照配列に対して少なくとも５０％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、変異体は、天然配列または参照配列と少なくとも８０％または少なくとも９０％の同一性を共有する。
いくつかの実施形態では、「変異体模倣体」が提供される。本明細書で使用される「変異体模倣体」という用語は、活性化配列を模倣すると想定される少なくとも１つのアミノ酸を含むものである。例えば、グルタメートは、ホスホロ－スレオニン及び／またはホスホロ－セリンの模倣体として働き得る。あるいは、変異体模倣体は、活性を失うか、またはその模倣体を含む不活性化産物となり得るものであり、例えば、フェニルアラニンは、チロシンの不活性化置換として働き得、またはアラニンは、セリンの不活性化置換として働き得る。
「オルソログ」は、種分化によって共通の先祖遺伝子から進化した異なる種の遺伝子を指す。通常、オルソログは、進化の過程において同一の機能を保持する。オルソログの同定は、シークエンシングが新たに実施されたゲノムにおいて信頼できる遺伝子機能予測を実施するために極めて重要である。
「類似体」は、１つまたは複数のアミノ酸の変更によって異なるポリペプチド変異体を含むことが意図され、こうしたアミノ酸の変更は、例えば、親ポリペプチドまたは出発ポリペプチドの特性の１つまたは複数を依然として維持する、アミノ酸残基の置換、付加、または欠失である。
本開示は、変異体及び誘導体を含むポリヌクレオチドまたはポリペプチドに基づくいくつかの型の組成物を提供する。こうしたものには、例えば、置換、挿入、欠失、及び共有結合を有する変異体及び誘導体が含まれる。「誘導体」という用語は、「変異体」という用語と同義的に使用されるが、一般に、参照分子または出発分子と比較して任意の様式で修飾及び／または変更された分子を指す。
したがって、参照配列、具体的には、本明細書に開示のポリペプチド配列に関して置換、挿入、及び／または付加、欠失、ならびに共有結合修飾を含むペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本開示の範囲内に含まれる。例えば、配列タグまたは１つもしくは複数のリジンなどのアミノ酸を（例えば、Ｎ末端またはＣ末端で）ペプチド配列に付加することができる。配列タグは、ペプチドの検出、精製、または位置決めに使用することができる。リジンは、ペプチドの溶解性の向上またはビオチン標識の実現に使用することができる。あるいは、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシ末端領域及びアミノ末端領域に位置するアミノ酸残基を任意選択で欠失させることで切断型配列としてよい。例えば、可溶性のより長い配列の一部としての配列の発現または固形担体に連結されるより長い配列の一部としての配列の発現などの、配列の用途に応じて、ある特定のアミノ酸（例えば、Ｃ末端残基またはＮ末端残基）を代替的に欠失させてよい。
ポリペプチドを指すとき、「置換変異体」は、天然配列または出発配列におけるアミノ酸残基の少なくとも１つが除去され、それが存在した位置と同一の位置に異なるアミノ酸が挿入されたものである。置換は、単一であり得、この場合、分子における１つのアミノ酸のみが置換されており、または置換は、複数であり得、この場合、２つ以上のアミノ酸が同一分子において置換されている。
本明細書で使用される「保存的アミノ酸置換」という用語は、配列に通常存在するアミノ酸と、同様のサイズ、電荷、または極性を有する異なるアミノ酸と、の置換を指す。保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、及びロイシンなどの非極性（疎水性）残基と、別の非極性残基との置換が含まれる。同様に、保存的置換の例には、アルギニンとリジンとの置換、グルタミンとアスパラギンとの置換、及びグリシンとセリンとの置換などの、ある極性（親水性）残基と別のものとの置換が含まれる。さらに、リジン、アルギニン、もしくはヒスチジンなどの塩基性残基と別のものとの置換、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸などの、ある酸性残基と別の酸性残基との置換が保存的置換の追加の例である。非保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、メチオニンなどの非極性（疎水性）アミノ酸残基と、システイン、グルタミン、グルタミン酸、もしくはリジンなどの極性（親水性）残基と、の置換、及び／または極性残基と非極性残基との置換が含まれる。
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指すとき、「特徴」は、それぞれ異なるアミノ酸配列に基づく分子構成要素または異なるヌクレオチドに基づく分子構成要素として定義される。ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの特徴には、表面出現部、局所的な立体構造形状、折り畳み、ループ、ハーフループ、ドメイン、ハーフドメイン、部位、末端、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。
ポリペプチドを指すとき、本明細書で使用される「ドメイン」という用語は、１つまたは複数の同定可能な構造的または機能的な特徴または特性（例えば、タンパク質－タンパク質相互作用のための部位として働く結合能力）を有するポリペプチドのモチーフを指す。
ポリペプチドを指すとき、アミノ酸に基づく実施形態に関して本明細書で使用される「部位」という用語は、「アミノ酸残基」及び「アミノ酸側鎖」と同義的に使用される。ポリヌクレオチドを指すとき、ヌクレオチドに基づく実施形態に関して本明細書で使用される「部位」という用語は、「ヌクレオチド」と同義的に使用される。部位は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに基づく分子内で修飾、操作、改変、誘導体化、または変更され得るペプチド内またはポリペプチド内またはポリヌクレオチド内の位置に相当する。
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指すとき、本明細書で使用される「ｔｅｒｍｉｎｉ（末端）」または「ｔｅｒｍｉｎｕｓ（末端）」という用語は、それぞれポリペプチドまたはポリヌクレオチドの末端を指す。そのような末端は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの最初の部位または最後の部位のみに限定されず、末端領域のアミノ酸またはヌクレオチドを追加で含み得る。ポリペプチドに基づく分子は、Ｎ末端（遊離のアミノ基（ＮＨ２）を有するアミノ酸によって終結する）とＣ末端（遊離のカルボキシル基（ＣＯＯＨ）を有するアミノ酸によって終結する）との両方を有するものとして特徴付けることができる。場合によっては、タンパク質は、ジスルフィド結合または非共有結合性の力によって共にまとまった複数のポリペプチド鎖から構成される（多量体、オリゴマー）。こうしたタンパク質は、複数のＮ末端及びＣ末端を有する。あるいは、ポリペプチドの末端は、修飾され得る結果として、場合によっては、有機複合体などの非ポリペプチドに基づく部分から始まるか、またはそれで終結し得る。
当業者によって認識されるタンパク質断片、機能性タンパク質ドメイン、及び相同タンパク質もまた、目的とするポリペプチドの範囲に含まれると考えられる。例えば、アミノ酸長が１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１００を超える参照タンパク質の任意のタンパク質断片（参照ポリペプチド配列と比較してアミノ酸残基が少なくとも１つ少ない分短いということ以外は同一であるポリペプチド配列を意味する）が本明細書で提供される。別の例では、本明細書に記載の配列のいずれかに対する同一性が４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％である２０、３０、４０、５０、または１００のアミノ酸のストレッチを含む任意のタンパク質を本開示に従って利用することができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、本明細書で提供または参照される配列のいずれかに示される変異を２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、または１１以上含む。別の例では、本明細書に記載の配列のいずれかに対する同一性が８０％超、９０％超、９５％超、または１００％である２０、３０、４０、５０、または１００のアミノ酸のストレッチを含む任意のタンパク質であって、本明細書に記載の配列のいずれかに対する同一性が８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、または６０％未満である５、１０、１５、２０、２５、または３０のアミノ酸のストレッチを有するタンパク質を本開示に従って利用することができる。
本開示のポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子は、例えば、当該技術分野において説明される分子（例えば、操作もしくは設計された分子または野生型分子）などの参照分子（例えば、参照ポリペプチドまたは参照ポリヌクレオチド）とある程度の配列類似性または配列同一性を共有し得る。当該技術分野において知られる「同一性」という用語は、２つ以上のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列間の関連性を指し、こうした関連性は、配列比較によって決定される。当該技術分野では、同一性は、それらの間の配列関連度も意味し、こうした関連度は、２つ以上のアミノ酸残基または核酸残基のストリング間の一致数によって決定される。同一性は、特定の数学モデルまたはコンピュータープログラム（例えば、「アルゴリズム」）によって実行されるアライメントでギャップ（存在する場合）を少なくした２つの配列間の同一一致パーセントの尺度である。関連ペプチドの同一性は、既知の方法によって容易に計算することができる。ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列に適用される「同一性％」は、最大同一性パーセントを達成するために配列のアライメント及び必要であればギャップの導入が実施された後に、候補アミノ酸配列または候補核酸配列における残基（アミノ酸残基または核酸残基）が、第２の配列のアミノ酸配列または核酸配列における残基と同一である割合として定義される。アライメントを目的とする方法及びコンピュータープログラムは、当該技術分野においてよく知られている。同一性は、同一性パーセントの計算に依存するが、計算で導入されるギャップ及びペナルティに起因して値が変わり得ると理解される。一般に、特定のリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は、特定の参照ポリヌクレオチドまたは参照ポリペプチドに対して、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％であるが１００％未満の配列同一性を有し、こうした配列同一性は、本明細書に記載及び当業者に知られる配列アライメントのプログラム及びパラメーターによって決定される。そのようなアライメントツールには、ＢＬＡＳＴスイートのもの（Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ（１９９７），“Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２）が含まれる。別の一般的な局所アライメント技術は、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｓ．（１９８１）“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５－１９７）に基づくものである。動的プログラミングに基づく一般的なグローバルアライメント技術は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）“Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３．）である。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを含む他の最適グローバルアライメント方法と比較してヌクレオチド配列及びタンパク質配列のグローバルアライメントを高速で実施するとされる高速最適グローバル配列アライメントアルゴリズム（ＦＯＧＳＡＡ）がごく最近開発された。ツールは、本明細書で他にも記載され、特に、下記の「同一性」の定義に記載される。
本明細書に記載の「相同性」という用語は、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）及び／またはポリペプチド分子などのポリマー分子の間の全体的な関連性を指す。残基の一致を見出すアライメントによって決定される類似性または同一性を許容限界レベルで共有するポリマー分子（例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）及び／またはポリペプチド分子）は、相同的であると呼ばれる。相同性は、分子間の関連性を説明する定性的な用語であり、定量的な類似性または同一性に基づくことができる。類似性または同一性は、２つの比較配列の間の配列一致度を定義する定量的な用語である。いくつかの実施形態では、ポリマー分子は、それらの配列が少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一または類似しているのであれば、互いに「相同的」であると考えられる。「相同的」という用語は、必然的に、少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列）の間の比較を指す。２つのポリヌクレオチド配列がコードするポリペプチドが、少なくとも２０のアミノ酸を含む少なくとも１つのストレッチについて、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または９９％でさえも同一であるならば、２つのポリヌクレオチド配列は相同的であると考えられる。いくつかの実施形態では、相同的ポリヌクレオチド配列は、一意的に特定されたアミノ酸を少なくとも４～５つ含むストレッチをコードする能力によって特徴付けられる。ヌクレオチド長が６０未満のポリヌクレオチド配列については、相同性は、一意的に特定されたアミノ酸を少なくとも４～５つ含むストレッチをコードする能力によって決定される。少なくとも２０のアミノ酸を含む少なくとも１つのストレッチについて、タンパク質が少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％同一であるならば、２つのタンパク質配列は、相同的であると考えられる。
相同性は、比較される配列が共通の起源からの進化において分岐したことを暗示する。「ホモログ」という用語は、共通の祖先配列に由来する系統によって第２のアミノ酸配列または核酸配列と関連する第１のアミノ酸配列または核酸配列（例えば、遺伝子（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）配列またはタンパク質配列）を指す。「ホモログ」という用語は、種分化の事象によって別れた遺伝子及び／またはタンパク質の間の関連性、または遺伝子重複の事象によって別れた遺伝子及び／またはタンパク質の間の関連性にも適用され得る。「オルソログ」は、種分化によって共通の先祖遺伝子（またはタンパク質）から進化した異なる種の遺伝子（またはタンパク質）である。典型的には、オルソログは、進化の過程において同一の機能を保持する。「パラログ」は、ゲノム内での重複によって関連する遺伝子（またはタンパク質）である。オルソログは、進化の過程において同一の機能を保持する一方で、パラログは、例え起源のものとの関連性が存在するとしても、新しい機能を発達させる。
「同一性」という用語は、例えば、ポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）及び／またはポリペプチド分子などのポリマー分子の間の全体的な関連性を指す。２つのポリ核酸配列の同一性パーセントの計算は、例えば、比較の最適化を目的として２つの配列のアライメントをとることによって実施することができる（例えば、アライメントが最適化するように第１の核酸配列及び第２の核酸配列の１つまたは両方にギャップを導入することができ、比較を目的として同一でない配列は無視することができる）。ある特定の実施形態では、比較を目的としてアライメントされる配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。続いて、対応するヌクレオチド位置でヌクレオチドが比較される。第１の配列における位置が、第２の配列において対応する位置のものと同一のヌクレオチドによって占有されているとき、分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列のアライメントが最適化するように導入する必要があるギャップの数及びそれぞれのギャップの長さを考慮すると、配列が共有する同一位置の数の関数となる。２つの配列間の配列比較及び同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。例えば、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４、及びＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１に記載されるものなどの方法を使用して２つの核酸配列の間の同一性パーセントを決定することができ、これらの文献はそれぞれ、参照によって本明細書に組み込まれる。例えば、２つの核酸配列の間の同一性パーセントは、Ｍｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，１９８９，４：１１－１７）のアルゴリズムを使用して決定することができ、このアルゴリズムは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれており、ＰＡＭ１２０加重残基表、１２のギャップ長ペナルティ、及び４のギャップペナルティが使用される。あるいは、２つの核酸配列の間の同一性パーセントは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを使用し、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用して決定することができる。配列間の同一性パーセントを決定するために一般に用いられる方法には、限定はされないが、Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に開示されるものが含まれ、当該文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。同一性の決定技術は、公的に利用可能なコンピュータープログラムに組み込まれている。２つの配列間の相同性を決定するためのコンピューターソフトウェアの例には、限定はされないが、ＧＣＧプログラムパッケージ、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２（１），３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０））が含まれる。
化学修飾
いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、少なくとも１つの呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）抗原ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含み、上記ＲＮＡは、少なくとも１つの化学修飾を含む。
「化学修飾」及び「化学的に修飾された」という用語は、アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、ウリジン（Ｕ）、チミジン（Ｔ）、またはシチジン（Ｃ）を含むリボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオシドに関する、その位置、パターン、パーセント、または集団の少なくとも１つにおける修飾を指す。一般に、こうした用語は、ｍＲＮＡの５’末端に天然に生じるキャップ部分におけるリボヌクレオチド修飾は指さない
ポリヌクレオチドの修飾には、限定はされないが、本明細書に記載のものが含まれ、明確に限定されるわけではないが、化学修飾を含む修飾が含まれる。ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、天然起源、非天然起源の修飾を含み得るか、またはポリヌクレオチドは、天然起源の修飾と非天然起源の修飾とを組み合わせて含み得る。ポリヌクレオチドは、例えば、糖、核酸塩基、またはヌクレオシド間結合の任意の有用な修飾（例えば、連結ホスフェート、ホスホジエステル結合、またはホスホジエステル骨格に対するもの）を含み得る。
ポリペプチドに関する「修飾」という用語は、標準セットの２０のアミノ酸に対する修飾を指す。本明細書で提供されるポリペプチドは、それがアミノ酸の置換、挿入、または置換と挿入との組み合わせを含むこともまた、「修飾された」と考えられる。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、さまざまな（複数の）異なる修飾を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの特定領域は、１つ、２つ、またはそれを超える数の（任意選択で異なる）ヌクレオシド修飾またはヌクレオチド修飾を含む。いくつかの実施形態では、細胞または生物に導入される修飾ＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、修飾ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、非修飾ポリヌクレオチドと比較して、それぞれ細胞または生物における分解の低減を示す。いくつかの実施形態では、細胞または生物に導入される修飾ＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、修飾ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、それぞれ細胞または生物における免疫原性の低減（例えば、自然応答の低減）を示し得る。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、所望の機能または特性を達成するためにポリヌクレオチドの合成中または合成後に導入される非天然の修飾ヌクレオチドを含む。修飾は、ヌクレオチド間結合、プリン塩基もしくはピリミジン塩基、または糖に存在し得る。修飾は、鎖の末端または鎖の他の任意の場所に化学合成またはポリメラーゼ酵素を用いて導入してよい。ポリヌクレオチドの領域はいずれも、化学的に修飾してよい。
本開示は、修飾されたヌクレオシド及びヌクレオチドのポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）を提供する。「ヌクレオシド」は、有機塩基（例えば、プリンもしくはピリミジン）またはその誘導体（本明細書では「核酸塩基」とも称される）と組み合わせて糖分子（例えば、ペントースもしくはリボース）またはその誘導体を含む化合物を指す。「ヌクレオチド」は、ホスフェート基を含むヌクレオシドを指す。修飾ヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾または非天然のヌクレオシドを含めるための、例えば、化学的、酵素的、または組換え的なものなどの任意の有用な方法によって合成してよい。ポリヌクレオチドは、ヌクレオシドが連結された領域を１つまたは複数含み得る。そのような領域は、さまざまな骨格結合を有し得る。結合は、標準的なホスホジエステル結合であり得、この場合、ポリヌクレオチドはヌクレオチドの領域を含むと想定される。
修飾ヌクレオチド塩基対形成は、標準的なアデノシン－チミン、アデノシン－ウラシル、またはグアノシン－シトシンという塩基対だけでなく、非標準塩基または修飾塩基を含むヌクレオチド及び／または修飾ヌクレオチドの間に形成される塩基対も包含し、水素結合ドナーと水素結合アクセプターとの配置によって、非標準塩基と標準塩基との間での水素結合、または例えば少なくとも１つの化学修飾を有するポリヌクレオチドなどにおける２つの相補的非標準塩基構造の間での水素結合が可能になる。非標準塩基のそのような対形成の例の１つは、修飾ヌクレオチドであるイノシンと、アデニン、シトシン、またはウラシルとの間の塩基対形成である。塩基／糖またはリンカーの任意の組み合わせを本開示のポリヌクレオチドに組み込んでよい。
本開示の組成物、ワクチン、方法、及び合成プロセスにおいて有用な、限定はされないが、化学修飾を含む、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）の修飾には、限定はされないが、下記のものが含まれる：２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－メチルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、１，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン、１－メチルアデノシン、２’－Ｏ－メチルアデノシン、２’－Ｏ－リボシルアデノシン（ホスフェート）、２－メチルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６イソペンテニルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン、２’－Ｏ－メチルアデノシン、２’－Ｏ－リボシルアデノシン（ホスフェート）、イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン、Ｎ６，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６，２’－Ｏ－トリメチルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン、Ｎ６－アセチルアデノシン、Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－メチル－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、２－メチルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、７－デアザ－アデノシン、Ｎ１－メチル－アデノシン、Ｎ６，Ｎ６（ジメチル）アデニン、Ｎ６－シス－ヒドロキシ－イソペンテニル－アデノシン、α－チオ－アデノシン、２（アミノ）アデニン、２（アミノプロピル）アデニン、２（メチルチオ）Ｎ６（イソペンテニル）アデニン、２－（アルキル）アデニン、２－（アミノアルキル）アデニン、２－（アミノプロピル）アデニン、２－（ハロ）アデニン、２－（ハロ）アデニン、２－（プロピル）アデニン、２’－アミノ－２’－デオキシ－ＡＴＰ、２’－アジド－２’－デオキシ－ＡＴＰ、２’－デオキシ－２’－ａ－アミノアデノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ａ－アジドアデノシンＴＰ、６（アルキル）アデニン、６（メチル）アデニン、６－（アルキル）アデニン、６－（メチル）アデニン、７（デアザ）アデニン、８（アルケニル）アデニン、８（アルキニル）アデニン、８（アミノ）アデニン、８（チオアルキル）アデニン、８－（アルケニル）アデニン、８－（アルキル）アデニン、８－（アルキニル）アデニン、８－（アミノ）アデニン、８－（ハロ）アデニン、８－（ヒドロキシル）アデニン、８－（チオアルキル）アデニン、８－（チオール）アデニン、８－アジド－アデノシン、アザアデニン、デアザアデニン、Ｎ６（メチル）アデニン、Ｎ６－（イソペンチル）アデニン、７－デアザ－８－アザ－アデノシン、７－メチルアデニン、１－デアザアデノシンＴＰ、２’フルオロ－Ｎ６－Ｂｚ－デオキシアデノシンＴＰ、２’－ＯＭｅ－２－アミノ－ＡＴＰ、２’Ｏ－メチル－Ｎ６－Ｂｚ－デオキシアデノシンＴＰ、２’－ａ－エチニルアデノシンＴＰ、２－アミノアデニン、２－アミノアデノシンＴＰ、２－アミノ－ＡＴＰ、２’－ａ－トリフルオロメチルアデノシンＴＰ、２－アジドアデノシンＴＰ、２’－ｂ－エチニルアデノシンＴＰ、２－ブロモアデノシンＴＰ、２’－ｂ－トリフルオロメチルアデノシンＴＰ、２－クロロアデノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’，２’－ジフルオロアデノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ａ－メルカプトアデノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ａ－チオメトキシアデノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－アミノアデノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－アジドアデノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－ブロモアデノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－クロロアデノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－フルオロアデノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－ヨードアデノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－メルカプトアデノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－チオメトキシアデノシンＴＰ、２－フルオロアデノシンＴＰ、２－ヨードアデノシンＴＰ、２－メルカプトアデノシンＴＰ、２－メトキシ－アデニン、２－メチルチオ－アデニン、２－トリフルオロメチルアデノシンＴＰ、３－デアザ－３－ブロモアデノシンＴＰ、３－デアザ－３－クロロアデノシンＴＰ、３－デアザ－３－フルオロアデノシンＴＰ、３－デアザ－３－ヨードアデノシンＴＰ、３－デアザアデノシンＴＰ、４’－アジドアデノシンＴＰ、４’－炭素環式アデノシンＴＰ、４’－エチニルアデノシンＴＰ、５’－ホモ－アデノシンＴＰ、８－アザ－ＡＴＰ、８－ブロモ－アデノシンＴＰ、８－トリフルオロメチルアデノシンＴＰ、９－デアザアデノシンＴＰ、２－アミノプリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－アデニン，７－デアザ－２－アミノプリン、２－チオシチジン、３－メチルシチジン、５－ホルミルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－メチルシチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、２’－Ｏ－メチルシチジン、２’－Ｏ－メチルシチジン、５，２’－Ｏ－ジメチルシチジン、５－ホルミル－２’－Ｏ－メチルシチジン、ライシジン、Ｎ４，２’－Ｏ－ジメチルシチジン、Ｎ４－アセチル－２’－Ｏ－メチルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、Ｎ４，Ｎ４－ジメチル－２’－ＯＭｅ－シチジンＴＰ、４－メチルシチジン、５－アザ－シチジン、シュード－イソ－シチジン、ピロロ－シチジン、α－チオ－シチジン、２－（チオ）シトシン、２’－アミノ－２’－デオキシ－ＣＴＰ、２’－アジド－２’－デオキシ－ＣＴＰ、２’－デオキシ－２’－ａ－アミノシチジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ａ－アジドシチジンＴＰ、３（デアザ）５（アザ）シトシン、３（メチル）シトシン、３－（アルキル）シトシン、３－（デアザ）５（アザ）シトシン、３－（メチル）シチジン、４，２’－Ｏ－ジメチルシチジン、５（ハロ）シトシン、５（メチル）シトシン、５（プロピニル）シトシン、５（トリフルオロメチル）シトシン、５－（アルキル）シトシン、５－（アルキニル）シトシン、５－（ハロ）シトシン、５－（プロピニル）シトシン、５－（トリフルオロメチル）シトシン、５－ブロモ－シチジン、５－ヨード－シチジン、５－プロピニルシトシン、６－（アゾ）シトシン、６－アザ－シチジン、アザシトシン、デアザシトシン、Ｎ４（アセチル）シトシン、１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン、１－メチル－シュードイソシチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、２－メトキシ－シチジン、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－１－メチル－シュードイソシチジン、４－メトキシ－シュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル－シュードイソシチジン、４－チオ－シュードイソシチジン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、ピロロ－シュードイソシチジン、ゼブラリン、（Ｅ）－５－（２－ブロモ－ビニル）シチジンＴＰ、２，２’－アンヒドロ－シチジンＴＰ塩酸塩、２’フルオロ－Ｎ４－Ｂｚ－シチジンＴＰ、２’フルオロ－Ｎ４－アセチル－シチジンＴＰ、２’－Ｏ－メチル－Ｎ４－アセチル－シチジンＴＰ、２’Ｏ－メチル－Ｎ４－Ｂｚ－シチジンＴＰ、２’－ａ－エチニルシチジンＴＰ、２’－ａ－トリフルオロメチルシチジンＴＰ、２’－ｂ－エチニルシチジンＴＰ、２’－ｂ－トリフルオロメチルシチジンＴＰ、２’－デオキシ－２’，２’－ジフルオロシチジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ａ－メルカプトシチジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ａ－チオメトキシシチジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－アミノシチジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－アジドシチジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－ブロモシチジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－クロロシチジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－フルオロシチジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－ヨードシチジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－メルカプトシチジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－チオメトキシシチジンＴＰ、２’－Ｏ－メチル－５－（１－プロピニル）シチジンＴＰ、３’－エチニルシチジンＴＰ、４’－アジドシチジンＴＰ、４’－炭素環式シチジンＴＰ、４’－エチニルシチジンＴＰ、５－（１－プロピニル）アラ－シチジンＴＰ、５－（２－クロロ－フェニル）－２－チオシチジンＴＰ、５－（４－アミノ－フェニル）－２－チオシチジンＴＰ、５－アミノアリル－ＣＴＰ、５－シアノシチジンＴＰ、５－エチニルアラ（Ｅｔｈｙｎｙｌａｒａ）－シチジンＴＰ、５－エチニルシチジンＴＰ、５’－ホモ－シチジンＴＰ、５－メトキシシチジンＴＰ、５－トリフルオロメチル－シチジンＴＰ、Ｎ４－アミノ－シチジンＴＰ、Ｎ４－ベンゾイル－シチジンＴＰ、シュードイソシチジン、７－メチルグアノシン、Ｎ２，２’－Ｏ－ジメチルグアノシン、Ｎ２－メチルグアノシン、ワイオシン、１，２’－Ｏ－ジメチルグアノシン、１－メチルグアノシン、２’－Ｏ－メチルグアノシン、２’－Ｏ－リボシルグアノシン（ホスフェート）、２’－Ｏ－メチルグアノシン、２’－Ｏ－リボシルグアノシン（ホスフェート）、７－アミノメチル－７－デアザグアノシン、７－シアノ－７－デアザグアノシン、アルカエオシン、メチルワイオシン、Ｎ２，７－ジメチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２，２’－Ｏ－トリメチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２，７－トリメチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、Ｎ２，７，２’－Ｏ－トリメチルグアノシン、６－チオ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、α－チオ－グアノシン、２（プロピル）グアニン、２－（アルキル）グアニン、２’－アミノ－２’－デオキシ－ＧＴＰ、２’－アジド－２’－デオキシ－ＧＴＰ、２’－デオキシ－２’－ａ－アミノグアノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ａ－アジドグアノシンＴＰ、６（メチル）グアニン、６－（アルキル）グアニン、６－（メチル）グアニン、６－メチル－グアノシン、７（アルキル）グアニン、７（デアザ）グアニン、７（メチル）グアニン、７－（アルキル）グアニン、７－（デアザ）グアニン、７－（メチル）グアニン、８（アルキル）グアニン、８（アルキニル）グアニン、８（ハロ）グアニン、８（チオアルキル）グアニン、８－（アルケニル）グアニン、８－（アルキル）グアニン、８－（アルキニル）グアニン、８－（アミノ）グアニン、８－（ハロ）グアニン、８－（ヒドロキシル）グアニン、８－（チオアルキル）グアニン、８－（チオール）グアニン、アザグアニン、デアザグアニン、Ｎ（メチル）グアニン、Ｎ－（メチル）グアニン、１－メチル－６－チオ－グアノシン、６－メトキシ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、１－Ｍｅ－ＧＴＰ、２’フルオロ－Ｎ２－イソブチル－グアノシンＴＰ、２’Ｏ－メチル－Ｎ２－イソブチル－グアノシンＴＰ、２’－ａ－エチニルグアノシンＴＰ、２’－ａ－トリフルオロメチルグアノシンＴＰ、２’－ｂ－エチニルグアノシンＴＰ、２’－ｂ－トリフルオロメチルグアノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’，２’－ジフルオログアノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ａ－メルカプトグアノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ａ－チオメトキシグアノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－アミノグアノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－アジドグアノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－ブロモグアノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－クロログアノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－フルオログアノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－ヨードグアノシンＴＰ、２’－デオ
キシ－２’－ｂ－メルカプトグアノシンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－チオメトキシグアノシンＴＰ、４’－アジドグアノシンＴＰ、４’－炭素環式グアノシンＴＰ、４’－エチニルグアノシンＴＰ、５’－ホモ－グアノシンＴＰ、８－ブロモ－グアノシンＴＰ、９－デアザグアノシンＴＰ、Ｎ２－イソブチル－グアノシンＴＰ、１－メチルイノシン、イノシン、１，２’－Ｏ－ジメチルイノシン、２’－Ｏ－メチルイノシン、７－メチルイノシン、２’－Ｏ－メチルイノシン、エポキシキューオシン、ガラクトシル－キューオシン、マンノシルキューオシン、キューオシン、アリアミノ（ａｌｌｙａｍｉｎｏ）－チミジン、アザチミジン、デアザチミジン、デオキシ－チミジン、２’－Ｏ－メチルウリジン、２－チオウリジン、３－メチルウリジン、５－カルボキシメチルウリジン、５－ヒドロキシウリジン、５－メチルウリジン、５－タウリノメチル－２－チオウリジン、５－タウリノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、シュードウリジン、（３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン、１－メチル－３－（３－アミノ－５－カルボキシプロピル）シュードウリジン、１－メチルシュードウリジン、１－エチル－シュードウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジン、２’－Ｏ－メチルシュードウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジン、２－チオ－２’－Ｏ－メチルウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン、３，２’－Ｏ－ジメチルウリジン、３－メチル－シュード－ウリジンＴＰ、４－チオウリジン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル、５，２’－Ｏ－ジメチルウリジン、５，６－ジヒドロ－ウリジン、５－アミノメチル－２－チオウリジン、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－カルバモイルメチルウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチルウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチルウリジンメチルエステル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウリジン、５－カルバモイルメチルウリジンＴＰ、５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン、５－メトキシカルボニルメチルウリジン、５－メチルウリジン、）、５－メトキシウリジン、５－メチル－２－チオウリジン、５－メチルアミノメチル－２－セレノウリジン、５－メチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－メチルアミノメチルウリジン、５－メチルジヒドロウリジン、５－オキシ酢酸－ウリジンＴＰ、５－オキシ酢酸－メチルエステル－ウリジンＴＰ、Ｎ１－メチル－シュード－ウラシル、Ｎ１－エチル－シュード－ウラシル、ウリジン５－オキシ酢酸、ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）－ウリジンＴＰ、５－（イソ－ペンテニルアミノメチル）－２－チオウリジンＴＰ、５－（イソ－ペンテニルアミノメチル）－２’－Ｏ－メチルウリジンＴＰ、５－（イソ－ペンテニルアミノメチル）ウリジンＴＰ、５－プロピニルウラシル、α－チオ－ウリジン、１（アミノアルキルアミノ－カルボニルエチレニル）－２（チオ）－シュードウラシル、１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）－２，４－（ジチオ）シュードウラシル、１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）－４（チオ）シュードウラシル、１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）－シュードウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）－２（チオ）－シュードウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）－２，４－（ジチオ）シュードウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）－４（チオ）シュードウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）－シュードウラシル、１置換２（チオ）－シュードウラシル、１置換２，４－（ジチオ）シュードウラシル、１置換４（チオ）シュードウラシル、１置換シュードウラシル、１－（アミノアルキルアミノ－カルボニルエチレニル）－２－（チオ）－シュードウラシル、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュードウリジンＴＰ、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュード－ＵＴＰ、１－メチル－シュード－ＵＴＰ、１－エチル－シュード－ＵＴＰ、２（チオ）シュードウラシル、２’デオキシウリジン、２’フルオロウリジン、２－（チオ）ウラシル、２，４－（ジチオ）シュードウラシル、２’メチル、２’アミノ、２’アジド、２’フルロ－グアノシン、２’－アミノ－２’－デオキシ－ＵＴＰ、２’－アジド－２’－デオキシ－ＵＴＰ、２’－アジド－デオキシウリジンＴＰ、２’－Ｏ－メチルシュードウリジン、２’デオキシウリジン、２’フルオロウリジン、２’－デオキシ－２’－ａ－アミノウリジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ａ－アジドウリジンＴＰ、２－メチルシュードウリジン、３（３アミノ－３カルボキシプロピル）ウラシル、４（チオ）シュードウラシル、４－（チオ）シュードウラシル、４－（チオ）ウラシル、４－チオウラシル、５（１，３－ジアゾール－１－アルキル）ウラシル、５（２－アミノプロピル）ウラシル、５（アミノアルキル）ウラシル、５（ジメチルアミノアルキル）ウラシル、５（グアニジニウムアルキル）ウラシル、５（メトキシカルボニルメチル）－２－（チオ）ウラシル、５（メトキシカルボニル－メチル）ウラシル、５（メチル）２（チオ）ウラシル、５（メチル）２，４（ジチオ）ウラシル、５（メチル）４（チオ）ウラシル、５（メチルアミノメチル）－２（チオ）ウラシル、５（メチルアミノメチル）－２，４（ジチオ）ウラシル、５（メチルアミノメチル）－４（チオ）ウラシル、５（プロピニル）ウラシル、５（トリフルオロメチル）ウラシル、５－（２－アミノプロピル）ウラシル、５－（アルキル）－２－（チオ）シュードウラシル、５－（アルキル）－２，４（ジチオ）シュードウラシル、５－（アルキル）－４（チオ）シュードウラシル、５－（アルキル）シュードウラシル、５－（アルキル）ウラシル、５－（アルキニル）ウラシル、５－（アリルアミノ）ウラシル、５－（シアノアルキル）ウラシル、５－（ジアルキルアミノアルキル）ウラシル、５－（ジメチルアミノアルキル）ウラシル、５－（グアニジニウムアルキル）ウラシル、５－（ハロ）ウラシル、５－（１，３－ジアゾール－１－アルキル）ウラシル、５－（メトキシ）ウラシル、５－（メトキシカルボニルメチル）－２－（チオ）ウラシル、５－（メトキシカルボニル－メチル）ウラシル、５－（メチル）２（チオ）ウラシル、５－（メチル）２，４（ジチオ）ウラシル、５－（メチル）４（チオ）ウラシル、５－（メチル）－２－（チオ）シュードウラシル、５－（メチル）－２，４（ジチオ）シュードウラシル、５－（メチル）－４（チオ）シュードウラシル、５－（メチル）シュードウラシル、５－（メチルアミノメチル）－２（チオ）ウラシル、５－（メチルアミノメチル）－２，４（ジチオ）ウラシル、５－（メチルアミノメチル）－４－（チオ）ウラシル、５－（プロピニル）ウラシル、５－（トリフルオロメチル）ウラシル、５－アミノアリル－ウリジン、５－ブロモ－ウリジン、５－ヨード－ウリジン、５－ウラシル、６（アゾ）ウラシル、６－（アゾ）ウラシル、６－アザ－ウリジン、アリアミノ（ａｌｌｙａｍｉｎｏ）－ウラシル、アザウラシル、デアザウラシル、Ｎ３（メチル）ウラシル、シュード－ＵＴＰ－１－２－エタン酸、シュードウラシル、４－チオ－シュード－ＵＴＰ、１－カルボキシメチル－シュードウリジン、１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、１－プロピニル－ウリジン、１－タウリノメチル－１－メチル－ウリジン、１－タウリノメチル－４－チオ－ウリジン、１－タウリノメチル－シュードウリジン、２－メトキシ－４－チオ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－シュードウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、（±）１－（２－ヒドロキシプロピル）シュードウリジンＴＰ、（２Ｒ）－１－（２－ヒドロキシプロピル）シュードウリジンＴＰ、（２Ｓ）－１－（２－ヒドロキシプロピル）シュードウリジンＴＰ、（Ｅ）－５－（２－ブロモ－ビニル）アラ－ウリジンＴＰ、（Ｅ）－５－（２－ブロモ－ビニル）ウリジンＴＰ、（Ｚ）－５－（２－ブロモ－ビニル）アラ－ウリジンＴＰ、（Ｚ）－５－（２－ブロモ－ビニル）ウリジンＴＰ、１－（２，２，２－トリフルオロエチル）－シュード－ＵＴＰ、１－（２，２，３，３，３－ペンタフルオロプロピル）シュードウリジンＴＰ、１－（２，２－ジエトキシエチル）シュードウリジンＴＰ、１－（２，４，６－トリメチルベンジル）シュードウリジンＴＰ、１－（２，４，６－トリメチル－ベンジル）シュード－ＵＴＰ、１－（２，４，６－トリメチル－フェニル）シュード－ＵＴＰ、１－（２－アミノ－２－カルボキシエチル）シュード－ＵＴＰ、１－（２－アミノ－エチル）シュード－ＵＴＰ、１－（２－ヒドロキシエチル）シュードウリジンＴＰ、１－（２－メトキシエチル）シュードウリジンＴＰ、１－（３，４－ビス－トリフルオロメトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ、１－（３，４－ジメトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ、１－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュード－ＵＴＰ、１－（３－アミノ－プロピル）シュード－ＵＴＰ、１－（３－シクロプロピル－プロパ－２－イニル）シュードウリジンＴＰ、１－（４－アミノ－４－カルボキシブチル）シュード－ＵＴＰ、１－（４－アミノ－ベンジル）シュード－ＵＴＰ、１－（４－アミノ－ブチル）シュード－ＵＴＰ、１－（４－アミノ－フェニル）シュード－ＵＴＰ、１－（４－アジドベンジル）シュードウリジンＴＰ、１－（４－ブロモベンジル）シュードウリジンＴＰ、１－（４－クロロベンジル）シュードウリジンＴＰ、１－（４－フルオロベンジル）シュードウリジンＴＰ、１－（４－ヨードベンジル）シュードウリジンＴＰ、１－（４－メタンスルホニルベンジル）シュードウリジンＴＰ、１－（４－メトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ、１－（４－メトキシ－ベンジル）シュード－ＵＴＰ、１－（４－メトキシ－フェニル）シュード－ＵＴＰ、１－（４－メチルベンジル）シュードウリジンＴＰ、１－（４－メチル－ベンジル）シュード－ＵＴＰ、１－（４－ニトロベンジル）シュードウリジンＴＰ、１－（４－ニトロ－ベンジル）シュード－ＵＴＰ、１（４－ニトロ－フェニル）シュード－ＵＴＰ、１－（４－チオメトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ、１－（４－トリフルオロメトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ、１－（４－トリフルオロメチルベンジル）シュードウリジンＴＰ、１－（５－アミノ－ペンチル）シュード－ＵＴＰ、１－（６－アミノ－ヘキシル）シュード－ＵＴＰ、１，６－ジメチル－シュード－ＵＴＰ、１－［３－（２－｛２－［２－（２－アミノエトキシ）－エトキシ］－エトキシ｝－エトキシ）－プロピオニル］シュードウリジンＴＰ、１－｛３－［２－（２－アミノエトキシ）－エトキシ］－プロピオニル｝シュードウリジンＴＰ、１－アセチルシュードウリジンＴＰ、１－アルキル－６－（１－プロピニル）－シュード－ＵＴＰ、１－アルキル－６－（２－プロピニル）－シュード－ＵＴＰ、１－アルキル－６－アリル－シュード－ＵＴＰ、１－アルキル－６－エチニル－シュード－ＵＴＰ、１－アルキル－６－ホモアリル－シュード－ＵＴＰ、１－アルキル－６－ビニル－シュード－ＵＴＰ、１－アリルシュードウリジンＴＰ、１－アミノメチル－シュード－ＵＴＰ、１－ベンゾイルシュードウリジンＴＰ、１
－ベンジルオキシメチルシュードウリジンＴＰ、１－ベンジル－シュード－ＵＴＰ、１－ビオチニル－ＰＥＧ２－シュードウリジンＴＰ、１－ビオチニルシュードウリジンＴＰ、１－ブチル－シュード－ＵＴＰ、１－シアノメチルシュードウリジンＴＰ、１－シクロブチルメチル－シュード－ＵＴＰ、１－シクロブチル－シュード－ＵＴＰ、１－シクロヘプチルメチル－シュード－ＵＴＰ、１－シクロヘプチル－シュード－ＵＴＰ、１－シクロヘキシルメチル－シュード－ＵＴＰ、１－シクロヘキシル－シュード－ＵＴＰ、１－シクロオクチルメチル－シュード－ＵＴＰ、１－シクロオクチル－シュード－ＵＴＰ、１－シクロペンチルメチル－シュード－ＵＴＰ、１－シクロペンチル－シュード－ＵＴＰ、１－シクロプロピルメチル－シュード－ＵＴＰ、１－シクロプロピル－シュード－ＵＴＰ、１－エチル－シュード－ＵＴＰ、１－ヘキシル－シュード－ＵＴＰ、１－ホモアリルシュードウリジンＴＰ、１－ヒドロキシメチルシュードウリジンＴＰ、１－イソ－プロピル－シュード－ＵＴＰ、１－Ｍｅ－２－チオ－シュード－ＵＴＰ、１－Ｍｅ－４－チオ－シュード－ＵＴＰ、１－Ｍｅ－アルファ－チオ－シュード－ＵＴＰ、１－メタンスルホニルメチルシュードウリジンＴＰ、１－メトキシメチルシュードウリジンＴＰ、１－メチル－６－（２，２，２－トリフルオロエチル）シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－（４－モルホリノ）－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－（４－チオモルホリノ）－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－（置換フェニル）シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－アミノ－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－アジド－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－ブロモ－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－ブチル－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－クロロ－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－シアノ－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－ジメチルアミノ－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－エトキシ－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－エチルカルボキシレート－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－エチル－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－フルオロ－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－ホルミル－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－ヒドロキシアミノ－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－ヒドロキシ－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－ヨード－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－イソ－プロピル－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－メトキシ－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－メチルアミノ－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－フェニル－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－プロピル－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－ｔｅｒｔ－ブチル－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－トリフルオロメトキシ－シュード－ＵＴＰ、１－メチル－６－トリフルオロメチル－シュード－ＵＴＰ、１－モルホリノメチルシュードウリジンＴＰ、１－ペンチル－シュード－ＵＴＰ、１－フェニル－シュード－ＵＴＰ、１－ピバロイルシュードウリジンＴＰ、１－プロパルギルシュードウリジンＴＰ、１－プロピル－シュード－ＵＴＰ、１－プロピニル－シュードウリジン、１－ｐ－トリル－シュード－ＵＴＰ、１－ｔｅｒｔ－ブチル－シュード－ＵＴＰ、１－チオメトキシメチルシュードウリジンＴＰ、１－チオモルホリノメチルシュードウリジンＴＰ、１－トリフルオロアセチルシュードウリジンＴＰ、１－トリフルオロメチル－シュード－ＵＴＰ、１－ビニルシュードウリジンＴＰ、２，２’－アンヒドロ－ウリジンＴＰ、２’－ブロモ－デオキシウリジンＴＰ、２’－Ｆ－５－メチル－２’－デオキシ－ＵＴＰ、２’－ＯＭｅ－５－Ｍｅ－ＵＴＰ、２’－ＯＭｅ－シュード－ＵＴＰ、２’－ａ－エチニルウリジンＴＰ、２’－ａ－トリフルオロメチルウリジンＴＰ、２’－ｂ－エチニルウリジンＴＰ、２’－ｂ－トリフルオロメチルウリジンＴＰ、２’－デオキシ－２’，２’－ジフルオロウリジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ａ－メルカプトウリジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ａ－チオメトキシウリジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－アミノウリジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－アジドウリジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－ブロモウリジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－クロロウリジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－フルオロウリジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－ヨードウリジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－メルカプトウリジンＴＰ、２’－デオキシ－２’－ｂ－チオメトキシウリジンＴＰ、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、２－メトキシウリジン、２’－Ｏ－メチル－５－（１－プロピニル）ウリジンＴＰ、３－アルキル－シュード－ＵＴＰ、４’－アジドウリジンＴＰ、４’－炭素環式ウリジンＴＰ、４’－エチニルウリジンＴＰ、５－（１－プロピニル）アラ－ウリジンＴＰ、５－（２－フラニル）ウリジンＴＰ、５－シアノウリジンＴＰ、５－ジメチルアミノウリジンＴＰ、５’－ホモ－ウリジンＴＰ、５－ヨード－２’－フルオロ－デオキシウリジンＴＰ、５－フェニルエチニルウリジンＴＰ、５－トリジュウテロメチル－６－ジュウテロウリジンＴＰ、５－トリフルオロメチル－ウリジンＴＰ、５－ビニルアラウリジンＴＰ、６－（２，２，２－トリフルオロエチル）－シュード－ＵＴＰ、６－（４－モルホリノ）－シュード－ＵＴＰ、６－（４－チオモルホリノ）－シュード－ＵＴＰ、６－（置換－フェニル）－シュード－ＵＴＰ、６－アミノ－シュード－ＵＴＰ、６－アジド－シュード－ＵＴＰ、６－ブロモ－シュード－ＵＴＰ、６－ブチル－シュード－ＵＴＰ、６－クロロ－シュード－ＵＴＰ、６－シアノ－シュード－ＵＴＰ、６－ジメチルアミノ－シュード－ＵＴＰ、６－エトキシ－シュード－ＵＴＰ、６－エチルカルボキシレート－シュード－ＵＴＰ、６－エチル－シュード－ＵＴＰ、６－フルオロ－シュード－ＵＴＰ、６－ホルミル－シュード－ＵＴＰ、６－ヒドロキシアミノ－シュード－ＵＴＰ、６－ヒドロキシ－シュード－ＵＴＰ、６－ヨード－シュード－ＵＴＰ、６－イソ－プロピル－シュード－ＵＴＰ、６－メトキシ－シュード－ＵＴＰ、６－メチルアミノ－シュード－ＵＴＰ、６－メチル－シュード－ＵＴＰ、６－フェニル－シュード－ＵＴＰ、６－フェニル－シュード－ＵＴＰ、６－プロピル－シュード－ＵＴＰ、６－ｔｅｒｔ－ブチル－シュード－ＵＴＰ、６－トリフルオロメトキシ－シュード－ＵＴＰ、６－トリフルオロメチル－シュード－ＵＴＰ、アルファ－チオ－シュード－ＵＴＰ、シュードウリジン１－（４－メチルベンゼンスルホン酸）ＴＰ、シュードウリジン１－（４－メチル安息香酸）ＴＰ、シュードウリジンＴＰ１－［３－（２－エトキシ）］プロピオン酸、シュードウリジンＴＰ１－［３－｛２－（２－［２－（２－エトキシ）－エトキシ］－エトキシ）－エトキシ｝］プロピオン酸、シュードウリジンＴＰ１－［３－｛２－（２－［２－｛２（２－エトキシ）－エトキシ｝－エトキシ］－エトキシ）－エトキシ｝］プロピオン酸、シュードウリジンＴＰ１－［３－｛２－（２－［２－エトキシ］－エトキシ）－エトキシ｝］プロピオン酸、シュードウリジンＴＰ１－［３－｛２－（２－エトキシ）－エトキシ｝］プロピオン酸、シュードウリジンＴＰ１－メチルホスホン酸、シュードウリジンＴＰ１－メチルホスホン酸ジエチルエステル、シュード－ＵＴＰ－Ｎ１－３－プロピオン酸、シュード－ＵＴＰ－Ｎ１－４－ブタン酸、シュード－ＵＴＰ－Ｎ１－５－ペンタン酸、シュード－ＵＴＰ－Ｎ１－６－ヘキサン酸、シュード－ＵＴＰ－Ｎ１－７－ヘプタン酸、シュード－ＵＴＰ－Ｎ１－メチル－ｐ－安息香酸、シュード－ＵＴＰ－Ｎ１－ｐ－安息香酸、ワイブトシン、ヒドロキシワイブトシン、イソワイオシン、ペルオキシワイブトシン、中間体ヒドロキシワイブトシン、４－デメチルワイオシン、２，６－（ジアミノ）プリン、１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン－１－イル：１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェンチアジン（ｐｈｅｎｔｈｉａｚｉｎ）－１－イル、１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル、１，３，５－（トリアザ）－２，６－（ジオキサ）－ナフタレン、２（アミノ）プリン、２，４，５－（トリメチル）フェニル、２’メチル、２’アミノ、２’アジド、２’フルロ－シチジン、２’メチル、２’アミノ、２’アジド、２’フルロ－アデニン、２’メチル、２’アミノ、２’アジド、２’フルロ－ウリジン、２’－アミノ－２’－デオキシリボース、２－アミノ－６－クロロ－プリン、２－アザ－イノシニル、２’－アジド－２’－デオキシリボース、２’フルオロ－２’－デオキシリボース、２’－フルオロ－修飾塩基、２’－Ｏ－メチル－リボース、２－オキソ－７－アミノピリドピリミジン－３－イル、２－オキソ－ピリドピリミジン－３－イル、２－ピリジノン、３ニトロピロール、３－（メチル）－７－（プロピニル）イソカルボスチリル、３－（メチル）イソカルボスチリル、４－（フルオロ）－６－（メチル）ベンゾイミダゾール、４－（メチル）ベンゾイミダゾール、４－（メチル）インドリル、４，６－（ジメチル）インドリル、５ニトロインドール、５置換ピリミジン、５－（メチル）イソカルボスチリル、５－ニトロインドール、６－（アザ）ピリミジン、６－（アゾ）チミン、６－（メチル）－７－（アザ）インドリル、６－クロロ－プリン、６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェンチアジン（ｐｈｅｎｔｈｉａｚｉｎ）－１－イル、７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン－１－イル、７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル、７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェンチアジン（ｐｈｅｎｔｈｉａｚｉｎ）－１－イル、７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル、７－（アザ）インドリル、７－（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジニル（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｌ）－イル、７－（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェンチアジン（ｐｈｅｎｔｈｉａｚｉｎ）－１－イル、７－（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン－１－イル、７－（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル、７－（グアニジニウムアルキル－ヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェンチアジン（ｐｈｅｎｔｈｉａｚｉｎ）－１－イル、７－（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル、７－（プロピニル）イソカルボスチリル、７－（プロピニル）イソカルボスチリル、プロピニル－７－（アザ）インドリル、７－デアザ－イノシニル、７－置換１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン－１－イル、７－置換１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル、９－（メチル）－イミジゾピリジニル、アミノインドリル、アントラセニル、ビス－オルト－（アミノアルキルヒドロキシ）－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、ビス－オルト－置換－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、ジフルオロトリル、ヒポキサンチン、イミジゾピリジニル、イノシニル、イソカルボスチリル、イソグアニシン（Ｉｓｏｇｕａｎｉｓｉｎｅ）、Ｎ２－置換プリン、Ｎ６－メチル－２－アミノ－プリン、Ｎ６－置換プリン、Ｎ－アルキル化誘導体、ナフタレニル、ニトロベンゾイミダゾリル、ニトロイミダゾリル、ニトロインダゾリル、ニトロピラゾリル、ヌブラリン（Ｎｕｂｕｌａｒｉｎｅ）、Ｏ６－置換プリン、Ｏ－アルキル化誘導体、オルト－（アミノアルキルヒドロキシ）－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、オルト－置換－
６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、オキソホルマイシンＴＰ、パラ－（アミノアルキルヒドロキシ）－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、パラ－置換－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、ペンタセニル、フェナントラセニル（Ｐｈｅｎａｎｔｈｒａｃｅｎｙｌ）、フェニル、プロピニル－７－（アザ）インドリル、ピレニル、ピリドピリミジン－３－イル、ピリドピリミジン－３－イル、２－オキソ－７－アミノ－ピリドピリミジン－３－イル、ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、ピロロピリミジニル、ピロロピリジニル、スチルベンジル（Ｓｔｉｌｂｅｎｚｙｌ）、置換１，２，４－トリアゾール、テトラセニル、ツベルシジン（Ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎｅ）、キサンチン、キサントシン－５’－ＴＰ、２－チオ－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、７－デアザ－２－アミノ－プリン、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、２－アミノ－リボシド－ＴＰ、ホルマイシンＡ ＴＰ、ホルマイシンＢ ＴＰ、ピロロシン（Ｐｙｒｒｏｌｏｓｉｎｅ）ＴＰ、２’－ＯＨ－アラ－アデノシンＴＰ、２’－ＯＨ－アラ－シチジンＴＰ、２’－ＯＨ－アラ－ウリジンＴＰ、２’－ＯＨ－アラ－グアノシンＴＰ、５－（２－カルボメトキシビニル）ウリジンＴＰ、及びＮ６－（１９－アミノ－ペンタオキサノナデシル）アデノシンＴＰ。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、前述の修飾核酸塩基の少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれを超える数）の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）における修飾核酸塩基は、シュードウリジン（ψ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－シュードウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジン、１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）、１－エチル－シュードウリジン（ｅ１ψ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、α－チオ－グアノシン、α－チオ－アデノシン、５－シアノウリジン、４’－チオウリジン７－デアザ－アデニン、１－メチル－アデノシン（ｍ１Ａ）、２－メチル－アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６－メチル－アデノシン（ｍ６Ａ）、及び２，６－ジアミノプリン，（Ｉ）、１－メチル－イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、７－デアザ－グアノシン、７－シアノ－７－デアザ－グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７－アミノメチル－７－デアザ－グアノシン（ｐｒｅＱ１）、７－メチル－グアノシン（ｍ７Ｇ）、１－メチル－グアノシン（ｍ１Ｇ）、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、２，８－ジメチルアデノシン、２－ゲラニルチオウリジン、２－ライシジン、２－セレノウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）－５，６－ジヒドロウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュードウリジン、３－メチルシュードウリジン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）－２’－Ｏ－メチルウリジンメチルエステル、５－アミノメチル－２－ゲラニルチオウリジン、５－アミノメチル－２－セレノウリジン、５－アミノメチルウリジン、５－カルバモイルヒドロキシメチルウリジン、５－カルバモイルメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－ゲラニルチオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－セレノウリジン、５－シアノメチルウリジン、５－ヒドロキシシチジン、５－メチルアミノメチル－２－ゲラニルチオウリジン、７－アミノカルボキシプロピル－デメチルワイオシン、７－アミノカルボキシプロピルワイオシン、７－アミノカルボキシプロピルワイオシンメチルエステル、８－メチルアデノシン、Ｎ４，Ｎ４－ジメチルシチジン、Ｎ６－ホルミルアデノシン、Ｎ６－ヒドロキシメチルアデノシン、アグマチジン、環式Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、グルタミル－キューオシン、メチル化中間体ヒドロキシワイブトシン、Ｎ４，Ｎ４，２’－Ｏ－トリメチルシチジン、ゲラニル化５－メチルアミノメチル－２－チオウリジン、ゲラニル化５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、Ｑ塩基、ｐｒｅＱ０塩基、ｐｒｅＱ１塩基、ならびにそれらの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオシドは、シュードウリジン、１－メチル－シュードウリジン、１－エチル－シュードウリジン、５－メチルシトシン、５－メトキシウリジン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリリボヌクレオチドなどのＲＮＡポリリボヌクレオチド）は、前述の修飾核酸塩基の少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれを超える数）の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、前述の修飾核酸塩基の少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれを超える数）の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）における修飾核酸塩基は、１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）、１－エチル－シュードウリジン（ｅ１ψ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、シュードウリジン（ψ）、α－チオ－グアノシン、及びα－チオ－アデノシンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、限定はされないが、化学修飾を含む前述の修飾核酸塩基の少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれを超える数）の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、シュードウリジン（ψ）及び５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、１－エチル－シュードウリジン（ｅ１ψ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）及び５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、１－エチル－シュードウリジン（ｅ１ψ）及び５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、２－チオウリジン及び５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）及び５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、２’－Ｏ－メチルウリジンを含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、２’－Ｏ－メチルウリジン及び５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、Ｎ６－メチル－アデノシン（ｍ６Ａ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、Ｎ６－メチル－アデノシン（ｍ６Ａ）及び５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、特定の修飾を施すために一様に修飾される（例えば、完全な修飾、全配列にわたる修飾が実施される）。例えば、ポリヌクレオチドは、１－メチル－シュードウリジンで一様に修飾することができ、このことは、ｍＲＮＡ配列におけるウリジン残基のすべてが、１－メチル－シュードウリジンと交換されることを意味する。同様に、ポリヌクレオチドは、上記のものなどの修飾残基を用いた交換によって任意の型のヌクレオシド残基が配列に存在するように一様に修飾することができる。
修飾シトシンを有する核酸塩基及びヌクレオシドの例には、Ｎ４－アセチル－シチジン（ａｃ４Ｃ）、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、５－ハロ－シチジン（例えば、５－ヨード－シチジン）、５－ヒドロキシメチル－シチジン（ｈｍ５Ｃ）、１－メチル－シュードイソシチジン、２－チオ－シチジン（ｓ２Ｃ）、及び２－チオ－５－メチル－シチジンが含まれる。
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾ウリジンである。修飾ウリジンを有する核酸塩基及びヌクレオシドの例には、１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）、１－エチル－シュードウリジン（ｅ１ψ）、５－メトキシウリジン、２－チオウリジン、５－シアノウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジン、及び４’－チオウリジンが含まれる。
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾アデニンである。修飾アデニンを有する核酸塩基及びヌクレオシドの例には、７－デアザ－アデニン、１－メチル－アデノシン（ｍ１Ａ）、２－メチル－アデニン（ｍ２Ａ）、及びＮ６－メチル－アデノシン（ｍ６Ａ）が含まれる。
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾グアニンである。修飾グアニンを有する核酸塩基及びヌクレオシドの例には、イノシン（Ｉ）、１－メチル－イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、７－デアザ－グアノシン、７－シアノ－７－デアザ－グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７－アミノメチル－７－デアザ－グアノシン（ｐｒｅＱ１）、７－メチル－グアノシン（ｍ７Ｇ）、１－メチル－グアノシン（ｍ１Ｇ）、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシンが含まれる。
本開示のポリヌクレオチドは、部分的に修飾するか、または分子の全長にわたって完全に修飾してよい。例えば、１つもしくは複数もしくはすべてまたは所与の型のヌクレオチド（例えば、プリンもしくはピリミジン、またはＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つもしくは複数もしくはすべて）を、本発明のポリヌクレオチドまたはその所与の所定配列領域（例えば、ポリＡ尾部を含むｍＲＮＡまたはポリＡ尾部を除外したｍＲＮＡ）において一様に修飾してよい。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（またはその所与の配列領域）におけるヌクレオチドＸはすべて、修飾ヌクレオチドであり、Ｘは、ヌクレオチドＡ、ヌクレオチドＧ、ヌクレオチドＵ、ヌクレオチドＣのいずれか１つ、またはＡ＋Ｇ、Ａ＋Ｕ、Ａ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ、Ｇ＋Ｃ、Ｕ＋Ｃ、Ａ＋Ｇ＋Ｕ、Ａ＋Ｇ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ＋Ｃ、もしくはＡ＋Ｇ＋Ｃという組み合わせのいずれか１つであり得る。
ポリヌクレオチドは、（全ヌクレオチド含量に関するか、または１つもしくは複数の型のヌクレオチド、すなわちＡ、Ｇ、Ｕ、もしくはＣのいずれか１つもしくは複数に関して）修飾ヌクレオチドを、約１％～約１００％または介在する任意の割合（例えば、１％～２０％、１％～２５％、１％～５０％、１％～６０％、１％～７０％、１％～８０％、１％～９０％、１％～９５％、１０％～２０％、１０％～２５％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、１０％～１００％、２０％～２５％、２０％～５０％、２０％～６０％、２０％～７０％、２０％～８０％、２０％～９０％、２０％～９５％、２０％～１００％、５０％～６０％、５０％～７０％、５０％～８０％、５０％～９０％、５０％～９５％、５０％～１００％、７０％～８０％、７０％～９０％、７０％～９５％、７０％～１００％、８０％～９０％、８０％～９５％、８０％～１００％、９０％～９５％、９０％～１００％、及び９５％～１００％）で含み得る。任意の残りの割合は、非修飾のＡ、Ｇ、Ｕ、またはＣの存在に相当することを理解されたい。
ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドを最小１％～最大１００％含むか、または修飾ヌクレオチドを少なくとも５％、修飾ヌクレオチドを少なくとも１０％、修飾ヌクレオチドを少なくとも２５％、修飾ヌクレオチドを少なくとも５０％、修飾ヌクレオチドを少なくとも８０％、もしくは修飾ヌクレオチドを少なくとも９０％含むなど、介在する任意の割合で修飾ヌクレオチドを含み得る。例えば、ポリヌクレオチドは、修飾ウラシルまたは修飾シトシンなどの修飾ピリミジンを含み得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドにおけるウラシルの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％が、修飾ウラシル（例えば、５－置換ウラシル）と交換される。修飾ウラシルは、単一の特有構造を有する化合物によって交換することができるか、または異なる構造（例えば、２つ、３つ、４つ、もしくはそれを超える数の特有構造）を有する複数の化合物によって交換することができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドにおけるシトシンの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％が修飾シトシン（例えば、５－置換シトシン）と交換される。修飾シトシンは、単一の特有構造を有する化合物によって交換することができるか、または異なる構造（例えば、２つ、３つ、４つ、もしくはそれを超える数の特有構造）を有する複数の化合物によって交換することができる。
したがって、いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、５’ＵＴＲ要素、任意選択でコドン最適化オープンリーディングフレーム、及び３’ＵＴＲ要素、ポリ（Ａ）配列及び／またはポリアデニル化シグナルを含み、ＲＮＡは、化学的に修飾されない。
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾ウラシルである。修飾ウラシルを有する核酸塩基及びヌクレオシドの例には、シュードウリジン（ψ）、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザ－ウリジン、６－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ウリジン（ｓ２Ｕ）、４－チオ－ウリジン（ｓ４Ｕ）、４－チオ－シュードウリジン、２－チオ－シュードウリジン、５－ヒドロキシ－ウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５－アミノアリル－ウリジン、５－ハロ－ウリジン（例えば、５－ヨード－ウリジンまたは５－ブロモ－ウリジン）、３－メチル－ウリジン（ｍ３Ｕ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、ウリジン５－オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５－カルボキシメチル－ウリジン（ｃｍ５Ｕ）、１－カルボキシメチル－シュードウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオ－ウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５－アミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－メチルアミノメチル－ウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、５－メチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－メチルアミノメチル－２－セレノ－ウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５－カルバモイルメチル－ウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－シュードウリジン、５－タウリノメチル－ウリジン（τｍ５Ｕ）、１－タウリノメチル－シュードウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１－タウリノメチル－４－チオ－シュードウリジン、５－メチル－ウリジン（ｍ５Ｕ、すなわち、核酸塩基であるデオキシチミンを有する）、１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）、１－エチル－シュードウリジン（ｅ１ψ）、５－メチル－２－チオ－ウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１－メチル－４－チオ－シュードウリジン（ｍ１ｓ４ψ）、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、３－メチル－シュードウリジン（ｍ３ψ）、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロシュードウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、５－メチル－ジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－メトキシ－ウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、Ｎ１－メチル－シュードウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュードウリジン（ａｃｐ３ψ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２－チオ－ウリジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、α－チオ－ウリジン、２’－Ｏ－メチル－ウリジン（Ｕｍ）、５、２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２’－Ｏ－メチル－シュードウリジン（ψｍ）、２－チオ－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３、２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン（ｍ３Ｕｍ）、及び５－（イソペンテニルアミノメチル）－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１－チオ－ウリジン、デオキシチミジン、２’－Ｆ－アラ－ウリジン、２’－Ｆ－ウリジン、２’－ＯＨ－アラ－ウリジン、５－（２－カルボメトキシビニル）ウリジン、ならびに５－［３－（１－Ｅ－プロペニルアミノ）］ウリジンが含まれる。
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾シトシンである。修飾シトシンを有する核酸塩基及びヌクレオシドの例には、５－アザ－シチジン、６－アザ－シチジン、シュードイソシチジン、３－メチル－シチジン（ｍ３Ｃ）、Ｎ４－アセチル－シチジン（ａｃ４Ｃ）、５－ホルミル－シチジン（ｆ５Ｃ）、Ｎ４－メチル－シチジン（ｍ４Ｃ）、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、５－ハロ－シチジン（例えば、５－ヨード－シチジン）、５－ヒドロキシメチル－シチジン（ｈｍ５Ｃ）、１－メチル－シュードイソシチジン、ピロロ－シチジン、ピロロ－シュードイソシチジン、２－チオ－シチジン（ｓ２Ｃ）、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－チオ－シュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル－シュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン、１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－シュードイソシチジン、４－メトキシ－１－メチル－シュードイソシチジン、ライシジン（ｋ２Ｃ）、α－チオ－シチジン、２’－Ｏ－メチル－シチジン（Ｃｍ）、５、２’－Ｏ－ジメチル－シチジン（ｍ５Ｃｍ）、Ｎ４－アセチル－２’－Ｏ－メチル－シチジン（ａｃ４Ｃｍ）、Ｎ４、２’－Ｏ－ジメチル－シチジン（ｍ４Ｃｍ）、５－ホルミル－２’－Ｏ－メチル－シチジン（ｆ５Ｃｍ）、Ｎ４，Ｎ４，２’－Ｏ－トリメチル－シチジン（ｍ４ ２Ｃｍ）、１－チオ－シチジン、２’－Ｆ－アラ－シチジン、２’－Ｆ－シチジン、及び２’－ＯＨ－アラ－シチジンが含まれる。
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾アデニンである。修飾アデニンを有する核酸塩基及びヌクレオシドの例には、２－アミノ－プリン、２，６－ジアミノプリン、２－アミノ－６－ハロ－プリン（例えば、２－アミノ－６－クロロ－プリン）、６－ハロ－プリン（例えば、６－クロロ－プリン）、２－アミノ－６－メチル－プリン、８－アジド－アデノシン、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノ－プリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノ－プリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチル－アデノシン（ｍ１Ａ）、２－メチル－アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６－メチル－アデノシン（ｍ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－メチル－アデノシン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６－イソペンテニル－アデノシン（ｉ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニル－アデノシン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｉｏ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６－グリシニルカルバモイル－アデノシン（ｇ６Ａ）、Ｎ６－スレオニルカルバモイル－アデノシン（ｔ６Ａ）、Ｎ６－メチル－Ｎ６－スレオニルカルバモイル－アデノシン（ｍ６ｔ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイル－アデノシン（ｍｓ２ｇ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６－ジメチル－アデノシン（ｍ６ ２Ａ）、Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイル－アデノシン（ｈｎ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイル－アデノシン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６－アセチル－アデノシン（ａｃ６Ａ）、７－メチル－アデニン、２－メチルチオ－アデニン、２－メトキシ－アデニン、α－チオ－アデノシン、２’－Ｏ－メチル－アデノシン（Ａｍ）、Ｎ６，２’－Ｏ－ジメチル－アデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２’－Ｏ－トリメチル－アデノシン（ｍ６ ２Ａｍ）、１，２’－Ｏ－ジメチル－アデノシン（ｍ１Ａｍ）、２’－Ｏ－リボシルアデノシン（ホスフェート）（Ａｒ（ｐ））、２－アミノ－Ｎ６－メチル－プリン、１－チオ－アデノシン、８－アジド－アデノシン、２’－Ｆ－アラ－アデノシン、２’－Ｆ－アデノシン、２’－ＯＨ－アラ－アデノシン、及びＮ６－（１９－アミノ－ペンタオキサノナデシル）－アデノシンが含まれる。
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾グアニンである。修飾グアニンを有する核酸塩基及びヌクレオシドの例には、イノシン（Ｉ）、１－メチル－イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、４－デメチル－ワイオシン（ｉｍＧ－１４）、イソワイオシン（ｉｍＧ２）、ワイブトシン（ｙＷ）、ペルオキシワイブトシン（ｏ２ｙＷ）、ヒドロキシワイブトシン（ＯｈｙＷ）、中間体ヒドロキシワイブトシン（ＯｈｙＷ＊）、７－デアザ－グアノシン、キューオシン（Ｑ）、エポキシキューオシン（ｏＱ）、ガラクトシル－キューオシン（ｇａｌＱ）、マンノシル－キューオシン（ｍａｎＱ）、７－シアノ－７－デアザ－グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７－アミノメチル－７－デアザ－グアノシン（ｐｒｅＱ１）、アルカエオシン（Ｇ＋）、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－グアノシン（ｍ７Ｇ）、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－メチル－イノシン、６－メトキシ－グアノシン、１－メチル－グアノシン（ｍ１Ｇ）、Ｎ２－メチル－グアノシン（ｍ２Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－グアノシン（ｍ２ ２Ｇ）、Ｎ２，７－ジメチル－グアノシン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７－ジメチル－グアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、１－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシン、α－チオ－グアノシン、２’－Ｏ－メチル－グアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２－メチル－２’－Ｏ－メチル－グアノシン（ｍ２Ｇｍ）、Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－２’－Ｏ－メチル－グアノシン（ｍ２ ２Ｇｍ）、１－メチル－２’－Ｏ－メチル－グアノシン（ｍ１Ｇｍ）、Ｎ２，７－ジメチル－２’－Ｏ－メチル－グアノシン（ｍ２，７Ｇｍ）、２’－Ｏ－メチル－イノシン（Ｉｍ）、１，２’－Ｏ－ジメチル－イノシン（ｍ１Ｉｍ）、２’－Ｏ－リボシルグアノシン（ホスフェート）（Ｇｒ（ｐ））、１－チオ－グアノシン、Ｏ６－メチル－グアノシン、２’－Ｆ－アラ－グアノシン、及び２’－Ｆ－グアノシンが含まれる。
ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）のインビトロでの転写
本開示の癌ワクチンは、ｍＲＮＡ（例えば、修飾ｍＲＮＡ）などのＲＮＡポリヌクレオチドを少なくとも１つ含む。ｍＲＮＡは、例えば、鋳型ＤＮＡからインビトロで転写され、こうした鋳型ＤＮＡは、「インビトロの転写鋳型」と称される。いくつかの実施形態では、インビトロの転写鋳型は、５’非翻訳（ＵＴＲ）領域をコードし、オープンリーディングフレームを含み、３’ＵＴＲ及びポリＡ尾部をコードする。インビトロの転写鋳型の特定の核酸配列組成及び長さは、鋳型によってコードされるｍＲＮＡに依存することになる。
「５’非翻訳領域」（ＵＴＲ）は、ｍＲＮＡにおいて、開始コドン（すなわち、ｍＲＮＡ転写物においてリボソームによって最初に翻訳されるコドン）のすぐ上流（すなわち、５’側）に位置し、ポリペプチドをコードしない領域を指す。
「３’非翻訳領域」（ＵＴＲ）は、ｍＲＮＡにおいて、終止コドン（すなわち、ｍＲＮＡ転写物において翻訳終結の情報を伝えるコドン）のすぐ下流（すなわち、３’側）に位置し、ポリペプチドをコードしない領域を指す。
「オープンリーディングフレーム」は、ＤＮＡにおいて、開始コドン（例えば、メチオニン（ＡＴＧ））から始まり、終止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧ、またはＴＧＡ）で終結する連続ストレッチであり、ポリペプチドをコードするものである。
「ポリＡ尾部」は、ｍＲＮＡにおいて、下流（例えば、３’ＵＴＲのすぐ下流（すなわち、３’側））に位置し、アデノシンモノホスフェートを連続して複数含む領域である。ポリＡ尾部は、１０～３００のアデノシンモノホスフェートを含み得る。例えば、ポリＡ尾部は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、または３００のアデノシンモノホスフェートを含み得る。いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は、５０～２５０のアデノシンモノホスフェートを含む。生物学的に関連する状況（例えば、細胞中、インビボ）では、ポリ（Ａ）尾部は、例えば細胞質において、酵素分解からｍＲＮＡを保護するために機能すると共に、転写の終結、核からのｍＲＮＡの輸送、及び翻訳に役立つ。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、２００～３，０００のヌクレオチドを含む。例えば、ポリヌクレオチドは、２００～５００、２００～１０００、２００～１５００、２００～３０００、５００～１０００、５００～１５００、５００～２０００、５００～３０００、１０００～１５００、１０００～２０００、１０００～３０００、１５００～３０００、または２０００～３０００ヌクレオチドを含み得る。
他の態様では、本発明は、ＩＶＴ法によるｍＲＮＡ癌ワクチンの調製方法に関する。インビトロ転写（ＩＶＴ）法では、ほとんど任意の配列のＲＮＡ分子の鋳型誘導型の合成が可能になる。ＩＶＴ法を使用して合成することができるＲＮＡ分子のサイズ範囲は、短いオリゴヌクレオチドから数千塩基という長い核酸ポリマーにまで及ぶ。ＩＶＴ法では、大量（例えば、マイクログラム量～ミリグラム量）のＲＮＡ転写物の合成が可能になる（Ｂｅｃｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ＲＮＡ ｂｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．７０３：２９－４１（２０１１）、Ｒｉｏ ｅｔ ａｌ．ＲＮＡ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２０１１，２０５－２２０．、Ｃｏｏｐｅｒ，Ｇｅｏｆｆｅｒｙ Ｍ．Ｔｈｅ Ｃｅｌｌ：Ａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｐｐｒｏａｃｈ．４ｔｈ ｅｄ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．：ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，２００７．２６２－２９９）。一般に、ＩＶＴでは、目的とする配列の上流に位置するプロモーター配列を特徴とするＤＮＡ鋳型が利用される。プロモーター配列は、バクテリオファージ起源のもの（例えば、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６のプロモーター配列）が最も一般的であるが、デノボ設計されたものを含む多くの他のプロモーター配列も許容可能である。典型的には、特定のバクテリオファージプロモーター配列に対応するＲＮＡポリメラーゼを使用することによってＤＮＡ鋳型の転写を達成することが最良である。ＲＮＡポリメラーゼの例には、限定はされないが、数ある中でも特に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、またはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼが含まれる。ＩＶＴは、一般に、二本鎖ＤＮＡにおいて開始されるが、一本鎖ででも進行可能である。
例えば、癌抗原をコードするｍＲＮＡなどの、本開示のｍＲＮＡワクチンは、任意の適切な合成方法を使用して調製してよいことを理解されたい。例えば、いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡワクチンは、鋳型としての一本鎖のボトム鎖ＤＮＡ、及びプロモーターとして働く相補的オリゴヌクレオチドからＩＶＴを使用して調製される。一本鎖のボトム鎖ＤＮＡは、ＲＮＡをインビトロで転写するためのＤＮＡ鋳型として働き得るものであり、例えば、プラスミド、ＰＣＲ産物、または化学合成から得てよい。いくつかの実施形態では、一本鎖のボトム鎖ＤＮＡは、環状の鋳型から直鎖化される。一本鎖のボトム鎖ＤＮＡ鋳型は、一般に、ＩＶＴが容易になるように、例えば、バクテリオファージのプロモーター配列などのプロモーター配列を含む。一本鎖のボトム鎖ＤＮＡと、プロモーター相補的オリゴヌクレオチドであるトップ鎖と、を使用するＲＮＡの調製方法は、当該技術分野において知られている。例示の方法では、限定はされないが、鋳型であるＤＮＡボトム鎖と、プロモーター相補的オリゴヌクレオチドであるトップ鎖（例えば、Ｔ７プロモーター相補的オリゴヌクレオチド、Ｔ３プロモーター相補的オリゴヌクレオチド、またはＳＰ６プロモーター相補的オリゴヌクレオチド）と、のアニーリングが実施された後、例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、またはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼなどの、プロモーター配列に対応するＲＮＡポリメラーゼを使用するＩＶＴが実施される。
ＩＶＴ法は、二本鎖のＤＮＡ鋳型を使用しても実施することができる。例えば、いくつかの実施形態では、二本鎖のＤＮＡ鋳型は、当該技術分野において利用可能な鎖伸長技術を使用し、相補的オリゴヌクレオチドを伸長させて相補的ＤＮＡ鎖を生成することによって調製される。いくつかの実施形態では、プロモーター配列、及び目的とするエピトープを１つまたは複数コードする配列を含む一本鎖のボトム鎖ＤＮＡ鋳型が、プロモーター相補的オリゴヌクレオチドであるトップ鎖へとアニーリングされ、ＰＣＲ様プロセスに供されることでトップ鎖が伸長して二本鎖のＤＮＡ鋳型が生成する。あるいは、またはさらに、ボトム鎖プロモーター配列に相補的であり、かつ目的とするエピトープを１つまたは複数コードする配列に相補的な配列を含むトップ鎖ＤＮＡが、ボトム鎖プロモーターオリゴヌクレオチドへとアニーリングされ、ＰＣＲ様プロセスに供されることでボトム鎖が伸長して二本鎖のＤＮＡ鋳型が生成する。いくつかの実施形態では、ＰＣＲ様サイクルの回数範囲は、１～２０サイクルであり、例えば、３～１０サイクルである。いくつかの実施形態では、二本鎖のＤＮＡ鋳型は、完全または部分的に化学合成法によって合成される。二本鎖のＤＮＡ鋳型は、本明細書に記載のインビトロでの転写に供すことができる。
別の態様では、例えば、癌抗原をコードするｍＲＮＡなどの、本開示のｍＲＮＡワクチンは、それらの配列が重なり合う部分全体が相補的な２つのＤＮＡ鎖を使用して調製し、相補部分がアニーリングしたときに一本鎖のオーバーハング（すなわち、粘着末端）を残してよい。こうした一本鎖オーバーハングは、もう一方の鎖を鋳型として使用して伸長し、それによって二本鎖ＤＮＡを生成することによって二本鎖にすることができる。場合によっては、このプライマー伸長法では、例えば、トップ鎖ＤＮＡ合成法によって得られる鋳型ＤＮＡ配列に組み込まれるサイズと比較して、鋳型ＤＮＡ配列に組み込まれることになるＯＲＦを長鎖化することが可能である。プライマー伸長法では、第１の鎖（５’’から３’の方向）の３’末端の一部が、第２の鎖（３’から５’の方向）３’末端の一部に相補的である。そのような実施形態のいくつかでは、一本鎖の第１鎖ＤＮＡは、プロモーター（例えば、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６）の配列、任意選択で５’－ＵＴＲ、及びＯＲＦの一部またはすべて（例えば、ＯＲＦの５’末端の一部）を含み得る。いくつかの実施形態では、一本鎖の第２鎖ＤＮＡは、ＯＲＦの一部またはすべてに相補的な配列（例えば、ＯＲＦの３’末端に相補的な部分）、及び任意選択で３’－ＵＴＲ、終始配列、及び／またはポリ（Ａ）尾部を含み得る。２つの合成ＤＮＡ鎖を使用するＲＮＡの調製方法では、重なり合う相補部分を有する２つの鎖のアニーリングが実施された後、１回または複数回のＰＣＲ様サイクルを使用することで鎖が伸長して二本鎖のＤＮＡ鋳型が生成するプライマー伸長が実施され得る。いくつかの実施形態では、ＰＣＲ様サイクルの回数範囲は、１～２０サイクルであり、例えば、３～１０サイクルである。そのような二本鎖ＤＮＡは、本明細書に記載のインビトロでの転写に供すことができる。
別の態様では、例えば、癌抗原をコードするｍＲＮＡなどの、本開示のｍＲＮＡワクチンは、ｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ）などの合成の二本鎖直鎖ＤＮＡ分子を二本鎖のＤＮＡ鋳型として使用して調製してよい。そのような合成二本鎖直鎖ＤＮＡ分子の利点は、そうしたものによって、ｍＲＮＡがそこから生成するための、より長い鋳型が与えられることである。例えば、ｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）のサイズ範囲は、４５～１０００（例えば、１２５～７５０のヌクレオチド）であり得る。いくつかの実施形態では、合成の二本鎖直鎖ＤＮＡ鋳型は、全長の５’－ＵＴＲ、全長の３’－ＵＴＲ、または両方を含む。全長の５’－ＵＴＲは、最大で１００のヌクレオチド長であり得、例えば、約４０～６０のヌクレオチド長である。全長の３’－ＵＴＲは、最大で３００のヌクレオチド長であり得、例えば、約１００～１５０のヌクレオチド長である。
より長い構築物の生成を容易にするために、３’側の鎖に重複配列を有するように設計された２つ以上の二本鎖直鎖ＤＮＡ分子及び／または遺伝子断片を、当該技術分野において知られる方法を使用して共に会合させてよい。例えば、こうした二本鎖ＤＮＡ断片の５’末端から塩基を切断する中温性エキソヌクレアーゼを使用した後、新たに形成された相補的な一本鎖３’末端をアニーリングさせてから、ポリメラーゼ依存性の伸長によって任意の一本鎖ギャップを埋め、最終的に、ＤＮＡリガーゼによってＤＮＡセグメントを共有結合で連結してＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（商標）法（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を実施してよい。
別の態様では、例えば、癌抗原をコードするｍＲＮＡなどの、本開示のｍＲＮＡワクチンは、ＲＮＡの化学合成を使用して調製してよい。方法は、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む第１のポリヌクレオチド、及び５’－ＵＴＲを含む第２のポリヌクレオチドの、固形担体に複合化した相補的ポリヌクレオチドへのアニーリングを含む。その後、第１のポリヌクレオチドの５’末端に対して、第２のポリヌクレオチドの３’末端が適切な条件下でライゲーションされる。適切な条件には、ＤＮＡリガーゼの使用が含まれる。ライゲーション反応によって第１のライゲーション産物が生成する。その後、第１のライゲーション産物の３’末端に対して、３’－ＵＴＲを含む第３のポリヌクレオチドの５’末端が適切な条件下でライゲーションされる。第２のライゲーション反応に適切な条件には、ＲＮＡリガーゼが含まれる。第２のライゲーション反応では、第２のライゲーション産物が生成する。第２のライゲーション産物を固形担体から遊離させることで、目的とするポリペプチドをコードするｍＲＮＡが生成する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、３０～１０００のヌクレオチドである。
目的とするポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む第１のポリヌクレオチド、及び３’－ＵＴＲを含む第２のポリヌクレオチドを、固形担体に複合化した相補的ポリヌクレオチドに結合することによって調製してもよい。第１のポリヌクレオチドの３’末端に対して、第２のポリヌクレオチドの５’末端が適切な条件下でライゲーションされる。適切な条件には、ＤＮＡリガーゼが含まれる。方法によって、第１のライゲーション産物が生成する。第１のライゲーション産物に対して、５’－ＵＴＲを含む第３のポリヌクレオチドが適切な条件でライゲーションされることで第２のライゲーション産物が生成する。適切な条件には、Ｔ４ＲＮＡなどのＲＮＡリガーゼが含まれる。第２のライゲーション産物を固形担体から遊離させることで、目的とするポリペプチドをコードするｍＲＮＡが生成する。
いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、５’－トリホスフェート及び３’－ＯＨを特徴とする。さらに他の実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、３’－ＯＨを含む。さらに別の実施形態では、第３のポリヌクレオチドは、５’－トリホスフェート及び３’－ＯＨを含む。第２のポリヌクレオチドは、５’－キャップ構造も含み得る。方法は、第３のポリヌクレオチドの３’末端に対する、ポリ－Ａ領域を含む第４のポリヌクレオチドのライゲーション段階もさらに含み得る。第４のポリヌクレオチドは、５’－トリホスフェートを含み得る。
方法は、逆相精製を含んでも含まなくてもよい。方法は、洗浄段階も含み得、固形担体は、未反応のポリヌクレオチドを除去するために洗浄される。固形担体は、例えば、捕捉樹脂であり得る。いくつかの実施形態では、方法は、ｄＴによる精製を含む。
本開示によれば、本開示のｍＲＮＡワクチンをコードする鋳型ＤＮＡは、１つまたは複数の癌エピトープをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。いくつかの実施形態では、鋳型ＤＮＡは、最大で１０００のヌクレオチドのＯＲＦを含み、例えば、約１０～３５０のヌクレオチド、約３０～３００のヌクレオチド、または約５０～２５０のヌクレオチドのＯＲＦを含む。いくつかの実施形態では、鋳型ＤＮＡは、約１５０のヌクレオチドのＯＲＦを含む。いくつかの実施形態では、鋳型ＤＮＡは、約２００のヌクレオチドのＯＲＦを含む。
いくつかの実施形態では、ＩＶＴ転写物は、反応が生じた後のＩＶＴ反応混合物の構成成分から精製される。例えば、未精製のＩＶＴ混合物は、元の鋳型を消化するために、ＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅで処理してよい。ｍＲＮＡは、当該技術分野において知られる方法を使用して精製することができ、こうした方法には、限定はされないが、有機溶媒を使用する沈殿、またはカラムに基づく精製方法が含まれる。ＲＮＡを精製するためには、例えば、ＭＥＧＡＣＬＥＡＲ（商標）キット（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）などの市販のキットが利用可能である。ｍＲＮＡは、当該技術分野において知られる方法を使用して定量化することができ、こうした方法には、限定はされないが、例えば、ＮａｎｏＤｒｏｐなどの市販の機器を用いるものが含まれる。精製されたｍＲＮＡは、例えば、ＲＮＡのサイズが正しいかの確認、及び／またはＲＮＡに分解が生じていないかの確認を行うためにアガロースゲル電気泳動によって分析することができる。
鋳型ＤＮＡは、５’－キャップ構造または３’－ポリ（Ａ）尾部などの他の構造的特徴に加えて、１つまたは複数の安定化要素を含み得、こうした安定化要素には、限定はされないが、その５’末端の非翻訳領域（ＵＴＲ）（５’ＵＴＲ）及び／またはその３’末端の非翻訳領域（ＵＴＲ）（３’ＵＴＲ）が含まれる。いくつかの実施形態では、鋳型ＤＮＡは、約１～３０のヌクレオチドの５’－ＵＴＲを含み、例えば、約５～２５のヌクレオチドまたは約１０～２０のヌクレオチドの５’－ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、鋳型ＤＮＡは、１３のヌクレオチドの５’－ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、鋳型ＤＮＡは、５’－ＵＴＲを含まない。いくつかの実施形態では、鋳型ＤＮＡは、約１～６０のヌクレオチドの３’－ＵＴＲを含み、例えば、１０～５０のヌクレオチドの３’－ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、鋳型ＤＮＡは、４０のヌクレオチドの３’－ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、鋳型ＤＮＡは、３’－ＵＴＲを含まない。いくつかの実施形態では、鋳型ＤＮＡは、１～１５０のヌクレオチドの３’－ポリ（Ａ）尾部を含み、例えば、１０～１００のヌクレオチド（例えば、３０のヌクレオチド）の３’－ポリ（Ａ）尾部を含む。そのような安定化要素は、ＩＶＴ反応における転写を目的とするＤＮＡに含めてもよく、または別に合成し、ＩＶＴ反応から得られる生成ＲＮＡに付加してもよい。
本開示のＲＮＡに３’－ポリ（Ａ）尾部を付加してよい。ポリ（Ａ）尾部の付加方法は、当該技術分野においてよく知られている。そのような方法には、限定はされないが、ポリ（Ａ）ポリメラーゼによる触媒作用または過ヨウ素酸処理が含まれる。あるいは、またはさらに、ポリ（Ａ）尾部は、別に合成した後、クリックケミストリー、オルトクリックケミストリー、ソルリンク（ｓｏｌｕｌｉｎｋ）、または当業者に知られる他の生体複合化ケミストリーなどの、任意の適切な技術を使用してＲＮＡに付加することができる。
本開示のＲＮＡに７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）キャップを付加してよい。ｍ７Ｇキャップの付加方法は、当該技術分野においてよく知られている。例には、限定はされないが、Ｔ７ポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラーゼを使用して抗リバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ）の同時転写組み込みが含まれる。Ｔ７によるＡＲＣＡを含むｍＲＮＡの生成には、ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７ ＡＲＣＡ ｍＲＮＡキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）などの市販のキットが利用可能である。
本開示に従って、例えばトリホスフェートケミストリーを使用し、キメラポリヌクレオチドの２つの領域または部分を連結またはライゲーションしてよい。いくつかの実施形態では、１００以下のヌクレオチドの第１の領域または部分は、化学的に合成され、５’はモノホスフェートとなり、末端の３’－ＯＨは除去または遮断される。領域が８０のヌクレオチドより長いのであれば、後にライゲーションによって化学的に連結されることになる２つ以上の鎖として合成してよい。第１の領域または部分が、ＩＶＴを使用して、非位置的に修飾された領域または部分として合成されるのであれば、その後に、５’－モノホスフェートへと変換し、続けて３’末端のキャッピングを実施してよい。モノホスフェート保護基は、当該技術分野で知られるもののいずれから選択してもよい。キメラポリヌクレオチドの第２の領域または部分は、例えば本明細書に記載の、化学合成法またはＩＶＴ法のいずれを使用して合成してもよい。ＩＶＴ法は、修飾されたキャップを有するプライマーを利用することができるＲＮＡポリメラーゼの使用を含み得る。あるいは、キャップは、化学的に合成し、ＩＶＴの領域または部分にカップリングさせてよい。
ライゲーション方法については、ＤＮＡ Ｔ４リガーゼでのライゲーションの後に、（ＤＮＡ Ｔ４リガーゼの活性に必要になるＤＮＡスプリントを除去するために）ＤＮＡｓｅで処理することで、望ましくない連結産物形成が容易に阻止されるであろうことに留意されたい。
キメラポリヌクレオチド全体がホスフェート－糖骨格で製造される必要はない。領域または部分の１つがポリペプチドをコードするのであれば、そのような領域または部分は、ホスフェート－糖骨格を含むことが好ましい。
ライゲーションは、酵素的ライゲーション、クリックケミストリー、オルトクリックケミストリー、ソルリンク（ｓｏｌｕｌｉｎｋ）、または当業者に知られる他の生体複合化ケミストリーなどの、任意の適切な技術を使用して実施してよい。いくつかの実施形態では、ライゲーションは、相補的オリゴヌクレオチドスプリントによって誘導される。いくつかの実施形態では、ライゲーションは、相補的オリゴヌクレオチドスプリントなしで実施される。
他の態様では、本発明は、ＩＶＴ法によるｍＲＮＡ癌ワクチンの調製を目的とするキットに関する。個別化癌ワクチンでは、患者特異的変異を同定し、１つまたは複数のネオエピトープで患者にワクチン接種を施すことが重要である。そのようなワクチンでは、ｍＲＮＡのＯＲＦによってコードされる抗原（複数可）は、患者特異的ということになる。抗原（複数可）をコードするＲＮＡの５’末端及び３’末端は、多くのＲＮＡに共通する非翻訳領域及び安定化領域を含むため、より広く適用可能であり得る。数ある中でも特に、本開示は、ＲＮＡの１つまたは複数の５’領域及び／３’領域などの、キメラポリヌクレオチドの１つまたは複数の部分を含むキットを提供し、こうした１つまたは複数の部分は、患者特異的エピトープをコードするＯＲＦと組み合わせてよい。例えば、キットは、５’－ＯＲＦ、３’－ＯＲＦ、及びポリ（Ａ）尾部の１つまたは複数を含むポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、それぞれのポリヌクレオチド構成要素は、個々の容器に存在する。他の実施形態では、複数のポリヌクレオチド構成要素が単一の容器に共に存在する。いくつかの実施形態では、キットは、リガーゼ酵素を含む。いくつかの実施形態では、提供されるキットは、使用のための説明を含む。いくつかの実施形態では、説明は、ＯＲＦをコードするエピトープと、例えば、５’－ＯＲＦ、３’－ＯＲＦ、及び／またはポリ（Ａ）尾部などの、キットに含まれる１つまたは複数の他の構成要素と、のライゲーションについての説明を含む。
本発明による個別化癌ワクチンの生成方法は、組織試料に対して本明細書に記載の核酸またはタンパク質のディープシークエンシング法などの技術を使用する変異の同定を含む。いくつかの実施形態では、患者のトランスクリプトームにおける変異の最初の同定が実施される。患者のトランスクリプトームに由来するデータは、患者特異的かつ腫瘍特異的な発現変異を同定するために、患者のエクソームに由来する配列情報と比較される。比較によって推定ネオエピトープのデータセットが得られ、このデータセットは、ミュータノームと称される。ミュータノームは、患者当たり約１００～１０，０００の候補変異を含み得る。ミュータノームは、ネオ抗原ワクチンの生成を目的とする最適変異セットを同定するために、問い合わせまたはアルゴリズムのセットを使用するデータ探索解析に供される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡネオ抗原ワクチンが設計され、製造される。その後、患者はそのワクチンで治療される。
ネオ抗原ワクチンは、複数のネオエピトープ、または１つもしくは複数の単一のＲＮＡワクチン、またはそれらの組み合わせを含むポリシストロニックワクチンであり得る。
いくつかの実施形態では、変異同定プロセスを開始してから、患者の治療を開始するまでの全方法は、２ヶ月未満で達成される。他の実施形態では、全プロセスは、７週間以内、６週間以内、５週間以内、４週間以内、３週間以内、２週間以内、または１週間未満で達成される。いくつかの実施形態では、全方法は、３０日未満で実施される。
変異同定プロセスは、トランスクリプトーム解析とエクソーム解析との両方、またはトランスクリプトーム解析のみ、もしくはエクソーム解析のみを含み得る。いくつかの実施形態では、トランスクリプトーム解析が最初に実施され、エクソーム解析は２番目に実施される。解析は、生体試料または組織試料に対して実施される。いくつかの実施形態では、生体試料または組織試料は、血液試料または血清試料である。他の実施形態では、試料は、組織バンクの試料であるか、またはＥＢＶで形質転換したＢ細胞である。
癌関連変異のある特定の特性を解析することによって、ｍＲＮＡワクチンに含めるために最適なネオエピトープを評価及び／または選択し得るということが認識及び理解されてきた。例えば、所与の時点で、ワクチンに含めるためのネオエピトープのセットを選択されるために、いくつかの特性の１つまたは複数を評価または重み付けしてよい。１つのネオエピトープまたはネオエピトープのセットの特性には、例えば、患者のＲＮＡシークエンシングもしくは他の核酸分析における遺伝子もしくは転写物レベルの発現評価、利用可能なデータベースにおける組織特異的発現、既知の癌遺伝子／腫瘍抑制因子、バリアントコール（ｖａｒｉａｎｔ ｃａｌｌ）信頼スコア、ＲＮＡシークエンシングに基づく対立遺伝子特異的発現、保存的アミノ酸置換と非保存的アミノ酸置換との比較、点変異の位置（ＴＣＲの関与増加についての中心スコア（Ｃｅｎｔｅｒｉｎｇ Ｓｃｏｒｅ））、点変異の位置（ＨＬＡとの結合の差異についての固定スコア（Ａｎｃｈｏｒｉｎｇ Ｓｃｏｒｅ））、独自性（Ｓｅｌｆｎｅｓｓ）：患者のＷＥＳデータとのコアエピトープ相同性（＜１００％）、８マー～１１マーについてはＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂに対するＩＣ５０、１５マー～２０マーについてはＨＬＡ－ＤＲＢ１に対するＩＣ５０、広範結合スコア（ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ Ｓｃｏｒｅ）（すなわち、結合すると予測される患者ＨＬＡの数）、８マー～１１マーについてはＨＬＡ－Ｃに対するＩＣ５０、１５マー～２０マーについてはＨＬＡ－ＤＲＢ３～５に対するＩＣ５０、１５マー～２０マーについてはＨＬＡ－ＤＱＢ１／Ａ１に対するＩＣ５０、１５マー～２０マーについてはＨＬＡ－ＤＰＢ１／Ａ１に対するＩＣ５０、クラスＩとクラスＩＩとの比率比較、患者においてカバーされるＨＬＡ－Ａアロタイプ、ＨＬＡ－Ｂアロタイプ、及びＨＬＡ－ＤＲＢ１アロタイプの多様性、点変異と複合エピトープ（例えば、フレームシフト）との比率比較、及び／または偽エピトープＨＬＡ結合スコアが含まれ得る。
いくつかの実施形態では、最適なオエピトープの同定に使用される癌関連変異癌の特性は、変異の型、患者試料における変異の存在量、免疫原性、自己反応性の欠如、ペプチド組成の性質と関連する特性である。
変異の型が決定され、推定エピトープをワクチンに含めるべきかどうかの決定要素として考慮されるべきである。変異の型は、変わり得るものである。いくつかの実例では、単一のワクチンに異なる型の変異を複数含めることが望ましくあり得る。他の実例では、単一の型の変異がより望ましくあり得る。特定の変異に対する値を重み付け及び計算することができる。いくつかの実施形態では、特定の変異は、一塩基多型（ＳＮＰ）である。いくつかの実施形態では、特定の変異は、複合変異体であり、例えば、イントロンの保持、複合的なスプライシング事象、または配列のリーディングフレームを変化させる挿入／欠失変異から生じるペプチド配列である。
患者試料における変異の存在量もスコア化し、推定エピトープをワクチンに含めるべきかどうかの決定要素としてよい。大量に存在する変異は、より強固な免疫応答を促進し得る。
免疫原性の考慮は、ワクチンに含めるための最適なネオエピトープの選択における重要な要素である。免疫原性は、例えば、ネオエピトープのＭＨＣ結合能力、ＨＬＡ広範結合度、変異位置、Ｔ細胞の予測される反応性、Ｔ細胞の実際の反応性、特定の立体構造及び結果的な溶媒への露出につながる構造、ならびに特定のアミノ酸の表現状態（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を解析することによって評価してよい。ＮｅｔＭＨＣ予測アルゴリズムなどの既知のアルゴリズムを使用することで、一般的なＨＬＡ－Ａ対立遺伝子及びＨＬＡ－Ｂ対立遺伝子にペプチドが結合する能力を予測することができる。インシリコの３次元解析及び／またはタンパク質ドッキングプログラムによってＭＨＣと結合したペプチドの構造評価を実施してもよい。エピトープがＭＨＣ分子に結合したときにエピトープのアミノ酸残基が溶媒に露出する度合いを評価するために、Ｒｏｓｅｔｔａアルゴリズムから得たものなどの、ＭＨＣ分子への結合時の予測エピトープ構造を使用してよい。Ｔ細胞反応性は、エピトープ及びＴ細胞をインビトロで用いて実験的に評価してよい。あるいは、Ｔ細胞反応性は、Ｔ細胞応答／配列データセットを使用して評価してよい。
ワクチンに含まれるネオエピトープに重要な要素は、自己反応性が存在しないことである。推定ネオエピトープは、そのエピトープが、例えば、悪性細胞内で遺伝子変化の結果として生じ、腫瘍組織に限ったものであることを確認するためにスクリーニングしてよい。理想的には、エピトープは、患者の正常組織には存在するべきではなく、したがって、自己に類似したエピトープは、データセットから除外される。自己反応性が存在しないことを決定するために、ネオ抗原候補の比較のための参照として個別化コードゲノムを使用してよい。いくつかの実施形態では、個別化コードゲノムは、個別化されたトランスクリプトーム及び／またはエクソームから生成される。
エピトープの設計においてペプチド組成の性質を考慮してもよい。例えば、エピトープに見られる保存アミノ酸と非保存アミノ酸とを比較した値に対するスコアをそれぞれの推定エピトープに与えることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のツールによって実施される解析は、異なる時間、すなわち、治療行為の前及び後に患者から得られる異なる特性セット、異なる組織試料から得られる異なる特性セット、同様の腫瘍を有する異なる患者から得られる異なる特性セット等の比較を含み得る。いくつかの実施形態では、あるセットの特性に由来するピーク値の平均を別のセットの特性に由来するピーク値の平均と比較してよい。例えば、２つの異なるセットの分布の間でＨＬＡ結合の平均値を比較してよい。２つのセットの分布は、例えば、日数、月数、または年数によって区切られた期間について決定してよい。
さらに、発明者らは、本明細書に記載のアルゴリズムを使用することで、癌変異の特性に対するそのようなデータを収集し、解析し得ることを認識及び理解している。データは、個別化癌ワクチンを開発するためのネオエピトープ及びネオエピトープのセットの同定に有用である。
いくつかの実施形態では、腫瘍変異ペプチドの注解された転写物はすべて、本発明に従ってワクチンに含められる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡシークエンシングにおいて同定されたＲＮＡの翻訳物が、本発明に従ってワクチンに含められる。
例えば、２つ以上のネオ抗原などの、２つ以上のペプチドのコンカテマーによって、ペプチドの境界に、意図されない新たなエピトープ（偽エピトープ）が創出され得ることを理解されたい。そのような偽エピトープを阻止または除外するために、クラスＩ対立遺伝子がヒットするかを、コンカテマーにおけるペプチド境界にわたってスクリーニングしてよい。いくつかの実施形態では、偽エピトープの形成を低減または除外するために、コンカテマー内のペプチドの順序がシャッフルされる。いくつかの実施形態では、偽エピトープの形成を低減または除外するために、ペプチド間にリンカーを使用してよく、こうしたリンカーは、例えば、グリシンなどの単一アミノ酸のリンカーである。いくつかの実施形態では、偽エピトープの形成を低減または除外することになる他のアミノ酸でアンカーアミノ酸を交換することができる。いくつかの実施形態では、偽エピトープの形成を低減または除外するために、コンカテマー内のペプチド境界でペプチドが切り詰められる。
いくつかの実施形態では、複数のペプチドエピトープ抗原は、偽エピトープが最小化するように配置及び順序決定される。他の実施形態では、複数のペプチドエピトープ抗原は、偽エピトープを含まないポリペプチドである。癌抗原エピトープが、コンカテマー構造においてヘッドトゥーテール編成で配置されると、それぞれの癌抗原エピトープの間にジャンクションが形成される。このジャンクションは、ペプチドのＮ末端に存在するエピトープに由来するいくつかのアミノ酸、すなわち１～１０のアミノ酸と、直接連結される隣接エピトープのＣ末端のいくつかのアミノ酸、すなわち１～１０のアミノ酸と、を含む。ジャンクションは、免疫応答を生成し得る免疫原性ペプチドではないことが重要である。いくつかの実施形態では、ジャンクションは、個別化癌ワクチンの設計対象である対象のＨＬＡタンパク質に対して、約５０ｎＭを超えるＩＣ５０で結合するペプチド配列を形成する。他の実施形態では、ジャンクションのペプチド配列は、対象のＨＬＡタンパク質に対して、約１０ｎＭ、約１５０ｎＭ、約２００ｎＭ、約２５０ｎＭ、約３００ｎＭ、約３５０ｎＭ、約４００ｎＭ、約４５０ｎｍ、または約５００ｎＭを超えるＩＣ５０で結合する。
本明細書に記載の技術に従ってネオエピトープを特徴付けるシステムは、任意の適切な形態をとり得るものであり、この点に関して実施形態は限定されない。いくつかの実施形態と関連させて使用してよいコンピューターシステム９００の実施態様の例は、図１５に示される。上記の機能性のいずれを実施するためにも、コンピューターシステム９００などの、１つまたは複数のコンピューターシステムを使用してよい。コンピューターシステム９００は、１つまたは複数のプロセッサ９１０と、例えば、揮発性記憶装置９２０及び１つまたは複数の不揮発性記憶媒体９３０などの１つまたは複数のコンピューター可読記憶媒体（すなわち、有形かつ非一過性のコンピューター可読媒体）と、を含み得、こうした記憶媒体は、任意の適切なデータ記憶媒体から形成し得る。プロセッサ９１０は、任意の適切な様式で揮発性記憶装置９２０及び不揮発性記憶装置機器９３０からのデータ書き込み及びデータ読み込みを制御し得、この点に関して実施形態は限定されない。本明細書に記載の機能性のいずれを実施するためにも、プロセッサ９１０は、１つまたは複数のコンピューター可読記憶媒体（例えば、揮発性記憶装置９２０及び／または不揮発性記憶装置９３０）に記憶される１つまたは複数の命令を実行し得、こうした記憶媒体は、プロセッサ９１０によって実行するための命令を記憶する有形かつ非一過性のコンピューター可読媒体として働き得る。
上記の実施形態は、多くの様式のいずれで実施することもできる。例えば、実施形態は、ハードウェア、ソフトウェア、またはそれらの組み合わせを使用して実施してよい。ソフトウェアにおいて実施されるとき、任意の適切なプロセッサまたはプロセッサの集合体でソフトウェアコードを実行することができ、こうしたプロセッサが、単一のコンピューターにおいて提供されるか、または複数のコンピューター間に分散しているかは問われない。上記の機能を実施する任意の要素または要素の集合体が、一般に、上で議論される機能を制御する１つまたは複数の制御装置であると考え得ることを理解されるべきである。１つまたは複数の制御装置は、専用のハードウェア、または上記の機能を実施するためのマイクロコードもしくはソフトウェアを使用してプログラム化された汎用ハードウェア（例えば、１つもしくは複数のプロセッサ）などを用いてさまざまな様式で実施することができる。
この点に関して、１つの実施態様は、少なくとも１つのコンピューター可読記憶媒体（すなわち、少なくとも１つの有形かつ非一過性のコンピューター可読媒体）を含むと理解されるべきであり、こうしたコンピューター可読記憶媒体は、１つまたは複数のプロセッサで実行されると、上で議論される機能を実施するコンピュータープログラム（すなわち、複数の命令）がコードされるコンピューターメモリー（例えば、ハードドライブ、フラッシュメモリー、プロセッサワーキングメモリー等）、フロッピーディスク、光ディスク、磁気テープ、または他の有形かつ非一過性のコンピューター可読媒体などである。コンピューター可読記憶媒体は持ち運び可能であり、その結果、そこに記憶されるプログラムは、本明細書で議論される技術を実施するために任意のコンピューターリソースに読み込ませることができる。さらに、実行されると上で議論される機能を実施するコンピュータープログラムに対する参照は、ホストコンピューターで動くアプリケーションプログラムに限定されないことを理解されるべきである。むしろ、本明細書では、「コンピュータープログラム」という用語は、上記の技術を実施する１つまたは複数のプロセッサをプログラムするために用いることができる任意の型のコンピューターコード（例えば、ソフトウェアまたはマイクロコード）を参照するために一般的な意味において使用される。
治療方法
ヒト及び他の哺乳類における癌の予防及び／または治療を目的とする組成物（例えば、医薬組成物）、方法、キット、及び試薬が本明細書で提供される。癌ＲＮＡワクチンは、治療剤または予防剤として使用することができる。癌ＲＮＡワクチンは、癌を予防及び／または治療するための医療において使用してよい。例示の態様では、本開示の癌ＲＮＡワクチンは、癌からの予防的保護を与えるために使用される。癌からの予防的保護は、本開示の癌ＲＮＡワクチンの投与後に達成することができる。ワクチンは、１回、２回、３回、４回、またはそれより多い回数投与することができるが、１回のワクチン投与（続いて任意選択でブースターの単回投与）で十分である可能性を有している。治療応答を達成するために、癌を有する個体にワクチンを投与することがより望ましい。投薬は、状況に応じて調節する必要があり得る。
ｍＲＮＡワクチンが合成されると、患者に投与される。いくつかの実施形態では、ワクチンは、最大２ヶ月、最大３ヶ月、最大４ヶ月、最大５ヶ月、最大６ヶ月、最大７ヶ月、最大８ヶ月、最大９ヶ月、最大１０ヶ月、最大１１ヶ月、最大１年、最大１年半、最大２年、最大３年、または最大４年のスケジュールで投与される。スケジュールは、同一であるか、または変更され得る。いくつかの実施形態では、スケジュールは、最初の３ヶ月は１週間に１回であり、その後は１ヶ月に１回となる。
ワクチンは、任意の経路によって投与してよい。いくつかの実施形態では、ワクチンは、筋肉内または静脈内の経路によって投与される。
ワクチンにおける変異が依然として適切であるかどうかを決定するために、治療の任意の時点で患者を調べてよい。その分析に基づいてワクチンを調節または再形成することで、１つもしくは複数の異なる変異を含めるか、または１つもしくは複数の変異を除去してよい。
治療組成物及び予防組成物
例えば、ヒトまたは哺乳類における癌の予防、治療、または診断を目的とする組成物（例えば、医薬組成物）、方法、キット、及び試薬が本明細書で提供される。癌ＲＮＡワクチンは、治療剤または予防剤として使用することができる。癌ＲＮＡワクチンは、癌を予防及び／または治療するための医療において使用してよい。いくつかの実施形態では、本発明の癌ワクチンは、例えば、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をエクスビボで活性化するための、免疫エフェクター細胞のプライミングにおける使用を想定することができ、当該末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、その後、対象へと注入（再注入）される。
例示の実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡポリヌクレオチドを含む癌ワクチンは、対象（例えば、ヒト対象などの哺乳類対象）に投与することができ、ＲＮＡポリヌクレオチドは、インビボで翻訳されることで抗原ポリペプチドを生成する。
癌ＲＮＡワクチンは、細胞、組織、または生物においてポリペプチド（例えば、抗原または免疫原）の翻訳を誘導し得る。例示の実施形態では、そのような翻訳はインビボで生じるが、そのような翻訳がエクスビボ、培養物中、またはインビトロで生じる実施形態を想定することができる。例示の実施形態では、細胞、組織、または生物は、抗原ポリペプチドをコードする少なくとも１つの翻訳可能領域を有するポリヌクレオチドを含む癌ＲＮＡワクチンを含む有効量の組成物と接触する。
「有効量」の癌ＲＮＡワクチンは、ポリヌクレオチドの標的組織、標的細胞型、投与手段、物理的特徴（例えば、ヌクレオシドのサイズ及び修飾度）、ならびに癌ＲＮＡワクチンの他の成分、ならびに他の決定要素に少なくとも部分的に基づいて提供される。一般に、有効量の癌ＲＮＡワクチン組成物は、細胞における抗原産生に応じて免疫応答を誘導または強化し、こうした抗原産生は、好ましくは、同一の抗原またはペプチド抗原をコードする対応する非修飾ポリヌクレオチドを含む組成物と比較してより効率的である。抗原産生の増加は、細胞トランスフェクション（ＲＮＡワクチンが細胞にトランスフェクトされる割合）の増加、ポリヌクレオチドからのタンパク質の翻訳の増加、核酸分解の減少（例えば、修飾ポリヌクレオチドからのタンパク質の翻訳持続期間の増加によって示される）、または宿主細胞の抗原特異的免疫応答の変化によって示され得る
いくつかの実施形態では、本開示によるＲＮＡワクチン（ポリヌクレオチド及びそれがコードするポリペプチドを含む）は、癌の治療に使用してよい。
癌ＲＮＡワクチンは、健康な個体または早期癌もしくは症状発症後の活性期の癌を有する個体に対する活性免疫化スケジュールの一部として予防的または治療的に投与してよい。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡワクチンが細胞、組織、または対象に提供される量は、免疫予防に有効な量であり得る。
癌ＲＮＡワクチンは、他の予防化合物または治療化合物と共に投与してよい。非限定例として、予防化合物または治療化合物は、アジュバントまたはブースターであり得る。ワクチンなどの組成物を指すとき、本明細書で使用される「ブースター」という用語は、予防（ワクチン）組成物の追加投与を指す。ブースター（またはブースターワクチン）は、予防組成物が先に投与された後に与えてよい。予防組成物の初回投与とブースターとの投与時間間隔は、限定はされないが、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１５分、２０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日、３６時間、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、１０日、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１年、１８ヶ月、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、１１年、１２年、１３年、１４年、１５年、１６年、１７年、１８年、１９年、２０年、２５年、３０年、３５年、４０年、４５年、５０年、５５年、６０年、６５年、７０年、７５年、８０年、８５年、９０年、９５年、または９９年超であり得る。例示の実施形態では、予防組成物の初回投与とブースターとの投与時間間隔は、限定はされないが、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、または１年であり得る。
１つの実施形態では、ポリヌクレオチドは、当該技術分野において知られるワクチンの投与と同様に筋肉内または皮内に投与してよい。
ｍＲＮＡ癌ワクチンは、癌の重症度またはアンメットメディカルニーズの程度もしくはレベルに応じてさまざまな状況において利用してよい。非限定例として、ｍＲＮＡ癌ワクチンは、任意のステージの癌の治療に利用してよい。ｍＲＮＡ癌ワクチンは、市販の抗癌ワクチンと比較して、生成抗体価がはるかに高く、Ｔ細胞応答を生成し、応答生成が早いという点において優れた特性を有する。理論に束縛されるものではないが、ｍＲＮＡ癌ワクチンは天然の細胞機構を取り入れているため、ｍＲＮＡであるｍＲＮＡ癌ワクチンは、翻訳時に適切なタンパク質の立体構造を生成するように良好に設計されると発明者らは仮定する。エクスビボで製造され、望ましくない細胞応答を誘発する可能性のある従来型ワクチンとは異なり、ｍＲＮＡ癌ワクチンは、より自然な方法で細胞系に提示される。
ｍＲＮＡ癌ワクチンが治療し得る癌のリストが以下に示されるが、そのリストに限定はされない。ペプチドエピトープまたは抗原は、こうした癌または腫瘍の任意の抗原に由来し得る。そのようなエピトープは、癌抗原または腫瘍抗原と称される。癌細胞は、腫瘍進行の異なるフェーズの間に細胞表面分子を異なって発現し得る。例えば、癌細胞は、良性状態では細胞表面抗原を発現し得るが、転位時にその特定の細胞表面抗原を下方制御し得る。したがって、腫瘍抗原または癌抗原は、癌の進行の任意のステージの間に産生する抗原を包含し得ると想定される。本発明の方法は、こうした変化に適合するように調整してよい。例えば、特定の患者向けに異なるｍＲＮＡワクチンをいくつか生成してよい。例えば、治療の開始時点で最初のワクチンを使用してよい。その後のある時点で、新たなｍＲＮＡワクチンを生成し、患者に投与することで、発現中の異なる抗原を網羅してよい。
いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、下記の抗原のうちの１つである：ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７９、ＣＤ１３７、４－ＩＢＢ、５Ｔ４、ＡＧＳ－５、ＡＧＳ－１６、アンジオポエチン２、Ｂ７．１、Ｂ７．２、Ｂ７ＤＣ、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ２、Ｂ７Ｈ３、ＢＴ－０６２、ＢＴＬＡ、ＣＡＩＸ、癌胎児抗原、ＣＴＬＡ４、クリプト（Ｃｒｉｐｔｏ）、ＥＤ－Ｂ、ＥｒｂＢｌ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥＧＦＬ７、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＢ２、ＦＡＰ、フィブロネクチン、葉酸受容体、ガングリオシドＧＭ３、ＧＤ２、グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）、ｇｐｌＯＯ、ｇｐＡ３３、ＧＰＮＭＢ、ＩＣＯＳ、ＩＧＦ１Ｒ、インテグリンａｖ、インテグリンανβ、ＬＡＧ－３、ルイスＹ、メソテリン、ｃ－ＭＥＴ、ＭＮ炭酸脱水酵素ＩＸ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ネクチン－４、ＮＫＧＤ２、ＮＯＴＣＨ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＰＤ－１、ＰＤＬ１、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＳＬＣ４４Ａ４、シンデカン－１、ＴＡＣＩ、ＴＡＧ－７２、テネイシン、ＴＩＭ３、ＴＲＡＩＬＲｌ、ＴＲＡＩＬＲ２、ＶＥＧＦＲ－１、ＶＥＧＦＲ－２、ＶＥＧＦＲ－３、及びそれらの変異体。
癌または腫瘍には、限定はされないが、新生物、悪性腫瘍、転移癌、または無制御の細胞増殖によって特徴付けられ、結果的に癌性であると想定される任意の疾患もしくは障害が含まれる。癌は、原発性または転移性の癌であり得る。本発明に従って治療することができる特定の癌には、限定はされないが、下記のものが含まれる（そのような障害の概説については、Ｆｉｓｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２ｄ Ｅｄ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａを参照のこと）。癌には、限定はされないが、胆道癌、膀胱癌、神経膠芽腫及び髄芽腫を含む脳癌、乳癌、子宮頸癌、絨毛癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、急性リンパ性白血病及び急性骨髄性白血病を含む血液新生物、多発性骨髄腫、ＡＩＤＳ関連白血病及び成人Ｔ細胞白血病リンパ腫、ボーエン病及びパジェット病を含む上皮内新生物、肝癌、肺癌、ホジキン病及びリンパ球性リンパ腫を含むリンパ腫、神経芽細胞腫、扁平上皮癌を含む口腔癌、上皮細胞、間質細胞、生殖細胞、及び間葉系細胞から生じるものを含む卵巣癌、膵癌、前立腺癌、直腸癌、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、及び骨肉腫を含む肉腫、メラノーマ、カポジ肉腫、基底細胞癌、及び扁平上皮癌を含む皮膚癌、セミノーマ、非セミノーマ、奇形腫、絨毛癌などの胚腫瘍を含む精巣癌、間質性腫瘍及び生殖細胞腫瘍、甲状腺の腺癌及び髄様癌を含む甲状腺癌、ならびに腺癌及びウィルムス腫瘍を含む腎癌が含まれる。一般に経験する癌には、乳癌、前立腺癌、肺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、及び脳癌が含まれる。
癌ＲＮＡワクチン及びＲＮＡワクチン組成物及び／または複合物を、１つもしくは複数の薬学的に許容される賦形剤と任意選択で組み合わせて含む医薬組成物が本明細書で提供される。
癌ＲＮＡワクチンは、単独で製剤化もしくは投与するか、または１つもしくは複数の他の成分と組み合わせて製剤化もしくは投与してよい。例えば、癌ＲＮＡワクチン（ワクチン組成物）は、限定はされないが、アジュバントを含む他の成分を含み得る。いくつかの実施形態では、癌ＲＮＡワクチンは、アジュバントを含まない（アジュバント非含有）。
他の実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡ癌ワクチンは、患者の治療に有用な任意の他の治療と組み合わせてよい。例えば、患者は、ｍＲＮＡ癌ワクチン及び抗癌剤で治療してよい。したがって、１つの実施形態では、本発明の方法は、１つまたは複数の癌治療と組み合わせて使用することができ、例えば、抗癌剤、従来型癌ワクチン、化学療法、放射線療法等と（例えば、同時に、または全治療手順の一部として）組み合わせて使用することができる。変動し得る癌治療のパラメーターには、限定はされないが、用量、投与タイミング、または期間もしくは治療が含まれ、癌治療は、用量、タイミング、または期間で変わり得る。癌の別の治療は手術であり、手術は、単独または前述の治療方法のいずれかと組み合わせて利用することができる。有用であることが知られているか、または癌の予防もしくは治療に使用されたことがあるか、もしくは現在使用されている任意の薬剤または治療（例えば、従来型癌ワクチン、化学療法、放射線療法、手術、ホルモン療法及び／または生物学的治療／免疫療法）を本発明の組成物と共に、本明細書に記載の発明に従って組み合わせて使用することができる。医療分野の当業者であれば、対象に適した治療を決定することができる。
そのような薬剤（すなわち、抗癌剤）の例には、限定はされないが、ＤＮＡ相互作用性の薬剤（限定はされないが、アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、シクロホスファミド、イソファミド（Ｉｓｏｆａｍｉｄｅ）、メクロレタミン、メルファラン、ウラシルマスタード）；チオテパなどのアジリジン；ブスルファンなどのメタンスルホン酸エステル；カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシンなどのニトロソウレア；シスプラチン、カルボプラチンなどの白金錯体；マイトマイシン、及びプロカルバジン、ダカルバジン及びアルトレタミンなどの生体内還元性アルキル化剤）；例えばブレオマイシンなどのＤＮＡ鎖切断剤；例えばアムサクリン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトキサントロンなどのインターカレーターなどの挿入性のトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、ならびにエトポシド及びテニポシドなどの非インターカレーター；例えばエトポシド及びテニポシド（Ｔｅｎｉｐｏｓｄｅ）などの非挿入性のトポイソメラーゼＩＩ阻害剤；ならびに例えばプリカマイジン（Ｐｌｉｃａｍｙｄｉｎ）などのＤＮＡ副溝結合剤を含む）；代謝拮抗剤（限定はされないが、メトトレキサート及びトリメトレキサートなどの葉酸アンタゴニスト；フルオロウラシル、フルオロデオキシウリジン、ＣＢ３７１７、アザシチジン、及びフロクスウリジンなどのピリミジンアンタゴニスト；メルカプトプリン、６－チオグアニン、ペントスタチンなどのプリンアンタゴニスト；シタラビン及びフルダラビンなどの糖修飾類似体；ならびにヒドロキシウレアなどのリボヌクレオチド還元酵素阻害剤を含む）；チューブリン相互作用性の薬剤（限定はされないが、コルビチン（ｃｏｌｃｂｉｃｉｎｅ）、ビンクリスチン及びビンブラスチン、両方のアルカロイド、ならびにパクリタキセル及びシトキサン（ｃｙｔｏｘａｎ）を含む）；ホルモン剤（限定はされないが、エストロゲン、複合化エストロゲン及びエチニルエストラジオール及びジエチルスチルベステロール（Ｄｉｅｔｈｙｌｓｔｉｌｂｅｓｔｅｒｏｌ）、クロロトリアニセン（Ｃｈｌｏｒｔｒｉａｎｉｓｅｎ）及びイデンエストロール（Ｉｄｅｎｅｓｔｒｏｌ）；カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、メドロキシプロゲステロン、及びメゲストロールなどのプロゲスチン；ならびにテストステロン、プロピオン酸テストステロンなどのアンドロゲン；フルオキシメステロン、メチルテストステロン；例えば、プレドニゾン、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、及びプレドニゾロンなどの副腎皮質ステロイド；例えば、酢酸ロイプロリド及び酢酸ゴセレリンなどの黄体化ホルモン放出ホルモン剤または性腺刺激ホルモン放出ホルモンアンタゴニストを含む）；抗ホルモン抗原（ａｎｔｉｈｏｒｍｏｎａｌ ａｎｔｉｇｅｎ）（限定はされないが、タモキシフェンなどの抗エストロゲン剤、フルタミドなどの抗アンドロゲン剤；ならびにミトタン及びアミノグルテチミドなどの抗副腎剤を含む）；サイトカイン（限定はされないが、ＩＬ－１．アルファ．、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１８、ＴＧＦ－β、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、ＬＡＦ、ＴＣＧＦ、ＢＣＧＦ、ＴＲＦ、ＢＡＦ、ＢＤＧ、ＭＰ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＴＭＦ、ＰＤＧＦ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－．γ、及びウテログロビン（米国特許第５，６９６、０９２号）を含む）；抗血管新生剤（限定はされないが、ＶＥＧＦを阻害する薬剤（例えば、他の中和抗体）、可溶性受容体構築物、チロシンキナーゼ阻害剤、アンチセンス戦略、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体に対するＲＮＡアプタマー及びリボザイム、免疫毒素及びコアグリガンド（ｃｏａｇｕｌｉｇａｎｄ）、腫瘍ワクチン、ならびに抗体を含む）が含まれる。
本発明の方法に従って使用することができる抗癌剤の特定の例には、限定はされないが、アシビシン、アクラルビシン、アコダゾール塩酸塩、アクロニン、アドゼレシン、アルデスロイキン、アルトレタミン、アンボマイシン、酢酸アメタントロン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アントラマイシン、アスパラギナーゼ、アスペルリン、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン、バチマスタット、ベンゾデパ、ビカルタミド、ビサントレン塩酸塩、メシル酸ビスナフィド、ビセレシン、ブレオマイシン硫酸塩、ブレキナルナトリウム、ブロピリミン、ブスルファン、カクチノマイシン、カルステロン、カラセミド、カルベチマー、カルボプラチン、カルムスチン、カルビシン塩酸塩、カルゼレシン、セデフィンゴール、クロラムブシル、シロレマイシン、シスプラチン、クラドリビン、メシル酸クリスナトール、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン塩酸塩、デシタビン、デキソルマプラチン、デザグアニン、メシル酸デザグアニン、ジアジコン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドキソルビシン塩酸塩、ドロロキシフェン、ドロロキシフェンクエン酸塩、プロピオン酸ドロモスタノロン、デュアゾマイシン、エダトレキサート、エフロミチン塩酸塩（ｅｆｌｏｍｉｔｈｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、エルサミトルシン、エンロプラチン、エンプロマート、エピプロピジン、エピルビシン塩酸塩、エルブロゾール、エソルビシン塩酸塩、エストラムスチン、エストラムスチンホスフェートナトリウム、エタニダゾール、エトポシド、エトポシドホスフェート、エトプリン、ファドロゾール塩酸塩、ファザラビン、フェンレチニド、フロクスウリジン、フルダラビンホスフェート、フルオロウラシル、フルロシタビン、ホスキドン、ホストリエシンナトリウム、ゲムシタビン、ゲムシタビン塩酸塩、ヒドロキシウレア、イダルビシン塩酸塩、イホスファミド、イルモホシン、インターロイキンＩＩ（組換えインターイエキン（ｉｎｔｅｒｉｅｕｋｉｎ）ＩＩまたはｒＩＬ２を含む）、インターフェロンアルファ－２ａ、インターフェロンアルファ－２ｂ、インターフェロンアルファ－ｎ１、インターフェロンアルファ－ｎ３、インターフェロンベータ－Ｉａ、インターフェロンガンマ－Ｉｂ、イプロプラチン、イリノテカン塩酸塩、酢酸ランレオチド、レトロゾール、酢酸リュープロリド、リアロゾール塩酸塩、ロメトレキソールナトリウム、ロムスチン、ロソキサントロン塩酸塩、マソプロコール、マイタンシン、メクロレタミン塩酸塩、酢酸メゲストロール、酢酸メレンゲストロール、メルファラン、メノガリル、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトトレキサートナトリウム、メトプリン、メツレデパ、ミチンドミド、ミトカルシン、ミトクロミン、ミトギリン、ミトマルシン、マイトマイシン、ミトスペル、ミトタン、ミトキサントロン塩酸塩、ミコフェノール酸、ノコダゾール、ノガラマイシン、オルマプラチン、オキシスラン、パクリタキセル、ペグアスパルガーゼ、ペリオマイシン、ペンタムスチン、硫酸ペプロマイシン、ペルホスファミド、ピポブロマン、ピポスルファン、ピロキサントロン塩酸塩、プリカマイシン、プロメスタン、ポルフィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、プロカルバジン塩酸塩、ピューロマイシン、ピューロマイシン塩酸塩、ピラゾフリン、リボプリン、ログレチミド、サフィンゴール、サフィンゴール塩酸塩、セムスチン、シムトラゼン、スパルフォセートナトリウム、スパルソマイシン、スピロゲルマニウム塩酸塩、スピロムスチン、スピロプラチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌル、タリソマイシン、テコガランナトリウム、テガフール、テロキサントロン塩酸塩、テモポルフィン、テニポシド、テロキシロン、テストラクトン、チアミプリン、チオグアニン、チオテパ、チアゾフリン、チラパザミン、クエン酸トレミフェン、酢酸トレストロン、リン酸トリシリビン、トリメトレキサート、グルクロン酸トリメトレキサート、トリプトレリン、ツブロゾール塩酸塩、ウラシルマスタード、ウレデパ、バプレオチド、ベルテポルフィン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ビンデシン、硫酸ビンデシン、硫酸ビネピジン、硫酸ビングリシナート、硫酸ビンロイロシン、ビノレルビン酒石酸塩、硫酸ビンロシジン、硫酸ビンゾリジン、ボロゾール、ゼニプラチン、ジノスタチン、及びゾルビシン塩酸塩が含まれる。
他の抗癌剤には、限定はされないが、２０－エピ－１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３、５－エチニルウラシル、血管新生阻害剤、抗背側化形態形成タンパク質―１（ａｎｔｉ－ｄｏｒｓａｌｉｚｉｎｇ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ－１）、アラ－ＣＤＰ－ＤＬ－ＰＴＢＡ、ＢＣＲ／ＡＢＬアンタゴニスト、ＣａＲｅｓｔＭ３、ＣＡＲＮ７００、カゼインキナーゼ阻害剤（ＩＣＯＳ）、クロトリマゾール、コリスマイシンＡ、コリスマイシンＢ、コンブレタスタチンＡ４、クランベシジン８１６、クリプトフィシン８、クラシンＡ、デヒドロジデムニンＢ、ジデムニンＢ、ジヒドロ－５－アザシチジン、ジヒドロタキソール，デュオカルマイシンＳＡ、カハラリドＦ、ラメラリン－Ｎトリアセテート、リュープロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン、リッソクリナミド７、モノホスホリルリピドＡ＋マイオバクテリウム（ｍｙｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細胞壁ｓｋ、Ｎ－アセチルジナリン、Ｎ－置換ベンズアミド、Ｏ６－ベンジルグアニン、プラセチンＡ、プラセチンＢ、白金錯体、白金化合物、白金－トリアミン複合体、レニウムＲｅ１８６エチドロネート、ＲＩＩレチンアミド、ルビギノンＢ１、ＳａｒＣＮＵ、サルコフィトールＡ、サルグラモスチム、老化由来阻害剤１（ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ１）、スピカマイシンＤ、タリムスチン、５－フルオロウラシル、トロンボポエチン、チモトリナン、甲状腺刺激ホルモン、バリオリンＢ、サリドマイド、ベラレソール、ベラミン（ｖｅｒａｍｉｎｅ）、ベルジン（ｖｅｒｄｉｎ）、ベルテポルフィン、ビノレルビン、ビンキサルチン（ｖｉｎｘａｌｔｉｎｅ）、ビタキシン（ｖｉｔａｘｉｎ）、ザノテロン、ゼニプラチン、及びジラスコルブが含まれる。
本発明は、癌細胞を破壊するためのＸ線、ガンマ線、及び他の線源の使用を含む放射線療法と組み合わせた、ｍＲＮＡ癌ワクチンを含む組成物の投与も包含する。好ましい実施形態では、放射線治療は、外照射または遠隔療法として実施され、放射線は、遠隔の線源から向けられる。他の好ましい実施形態では、放射線治療は、内療法または密封小線源療法として実施され、放射能源は、癌細胞または腫瘤に近接して体内に設置される。
特定の実施形態では、癌の型に応じて適切な抗原レジメンが選択される。例えば、卵巣癌を有する患者には、卵巣癌治療に有用な１つまたは複数の他の薬剤を予防的または治療的に有効な量で組み合わせて、ｍＲＮＡ癌ワクチンを含む予防的または治療的に有効な量の組成物を投与してよく、卵巣癌治療に有用なこうした他の薬剤には、限定はされないが、Ｐ３２療法などの腹腔内放射線療法、複部及び骨盤全体の放射線療法、シスプラチン、パクリタキセル（タキソール）もしくはドセタキセル（タキソテール）とシスプラチンもしくはカルボプラチンとの組み合わせ、シクロホスファミドとシスプラチンとの組み合わせ、シクロホスファミドとカルボプラチンとの組み合わせ、５－ＦＵとロイコボリンとの組み合わせ、エトポシド、リポソームドキソルビシン、ゲムシタビン、またはトポテカンが含まれる。癌治療及びその用量、投与経路、ならびに推奨用法は、当該技術分野において知られており、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（５６ｔｈ ｅｄ．，２００２）などの文献に記載されている。
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ｍＲＮＡ癌ワクチンは、免疫チェックポイント調節因子などのＴ細胞活性化因子と共に投与される。免疫チェックポイント調節因子には、刺激性チェックポイント分子と阻害性チェックポイント分子（すなわち、抗ＣＴＬＡ４抗体及び抗ＰＤ１抗体）との両方が含まれる。
刺激性チェックポイント阻害剤は、チェックポイントプロセスを促進することによって機能する。いくつかの刺激性チェックポイント分子は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーのメンバー（ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、及びＣＤ１３７）であり、他のものは、Ｂ７－ＣＤ２８スーパーファミリーに属する（ＣＤ２８及びＩＣＯＳ）。ＯＸ４０（ＣＤ１３４）は、エフェクターＴ細胞及びメモリーＴ細胞の増殖に関与する。抗ＯＸ４０モノクローナル抗体は、進行癌の治療に有効であることが示されている。ＭＥＤＩ０５６２は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストである。ＧＩＴＲは、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲファミリー関連遺伝子であり、Ｔ細胞の増殖に関与する。ＧＩＴＲに対するいくつかの抗体は、抗癌応答を促進することが示されている。ＩＣＯＳは、誘導性のＴ細胞共刺激因子であり、Ｔ細胞のエフェクター機能において重要である。ＣＤ２７は、ナイーブＴ細胞の抗原特定的な増殖を支持し、Ｔ細胞及びＢ細胞のメモリー生成に関与する。アゴニストである抗ＣＤ２７抗体がいくつか開発中である。ＣＤ１２２は、インターロイキン－２受容体ベータサブユニットである。ＮＫＴＲ－２１４は、ＣＤ１２２偏向結合性免疫賦活性サイトカインである。
阻害性チェックポイント分子には、限定はされないが、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡ、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、及びＬＡＧ３が含まれる。ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、及びそのリガンドは、Ｔ細胞機能及び他の細胞機能のすべての段階を通して重要な役割を担う共刺激分子のＣＤ２８－Ｂ７ファミリーのメンバーである。ＣＴＬＡ－４は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＤ１５２）であり、Ｔ細胞の増殖制御に関与する。
ＰＤ－１受容体は、活性化したＴ細胞（及びＢ細胞）の表面に発現し、通常の状況下では、樹状細胞またはマクロファージなどの抗原提示細胞の表面に発現するそのリガンド（ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２）に結合する。この相互作用は、Ｔ細胞にシグナルを送り込み、Ｔ細胞を阻害する。癌細胞は、その表面に高レベルのＰＤ－Ｌ１発現を誘導することによって、このシステムを悪用する。これによって、癌細胞によるＰＤ－１経路の支配が可能になり、腫瘍微小環境に侵入し得るＰＤ－１発現Ｔ細胞のスイッチが切れることによって抗癌免疫応答が抑制される。ペンブロリズマブ（以前の名称はＭＫ－３４７５及びランブロリズマブであり、商品名はＫｅｙｔｒｕｄａである）は、癌免疫療法において使用されるヒト抗体である。この抗体は、ＰＤ－１受容体を標的とする。
ＩＤＯ（インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ）は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞を抑制するトリプトファン分解酵素であり、Ｔｒｅｇ及び骨髄系由来サプレッサー細胞を生成及び活性化すると共に、腫瘍の血管新生を促進する。ＴＩＭ－３（Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３）は、そのリガンドであるガレクチン－９と相互作用すると細胞死を引き起こすことによってＴｈ１／Ｔｃ１機能の負の制御因子として働く。ＶＩＳＴＡは、Ｔ細胞活性化のＶ－ドメインＩｇサプレッサーである。
チェックポイント阻害剤は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、融合タンパク質もしくはそれらの組み合わせ、または小分子などの分子である。例えば、チェックポイント阻害剤は、チェックポイントタンパク質を阻害するものであり、こうしたチェックポイントタンパク質は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＣＧＥＮ－１５０４９、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ａ２ａＲ、Ｂ－７ファミリーのリガンド、またはそれらの組み合わせであり得る。チェックポイントタンパク質のリガンドには、限定はされないが、ＣＴＬＡ－４、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＣＧＥＮ－１５０４９、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ａ２ａＲ、及びＢ－７ファミリーのリガンドが含まれる。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ＢＭＳ－９３６５５８（ニボルマブ）である。他の実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、イピリムマブ（商品名はＹｅｒｖｏｙであり、以前はＭＤＸ－０１０及びＭＤＸ－１０１として知られる）である。
いくつかの好ましい実施形態では、チェックポイント調節因子を含む癌治療剤は、例えば、抗ＰＤ１、サイトカイン、ケモカイン、または刺激性受容体／リガンド（例えば、ＯＸ４０）などの癌治療剤をコードするｍＲＮＡの形態で送達される。
いくつかの実施形態では、癌治療剤は、標的治療である。標的治療は、ベムラフェニブ（ＰＬＸ４０３２）またはダブラフェニブなどのＢＲＡＦ阻害剤であり得る。ＢＲＡＦ阻害剤は、ＰＬＸ４０３２、ＰＬＸ４７２０、ＰＬＸ４７３４、ＧＤＣ－０８７９、ＰＬＸ４０３２、ＰＬＸ－４７２０、ＰＬＸ４７３４、及びトシル酸ソラフェニブであり得る。ＢＲＡＦは、Ｂ－Ｒａｆと呼ばれるタンパク質をつくるヒト遺伝子であり、癌原遺伝子Ｂ－Ｒａｆ及びｖ－Ｒａｆマウス肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログＢ１とも称される。Ｂ－Ｒａｆタンパク質は、細胞増殖の誘導に関与する細胞内でのシグナル送達に関与する。ベムラフェニブは、ＢＲＡＦ阻害剤であり、後期のメラノーマの治療を対象としてＦＤＡによって認可された。
他の実施形態では、Ｔ細胞治療剤は、ＯＸ４０Ｌである。ＯＸ４０は、腫瘍壊死因子／神経成長因子受容体（ＴＮＦＲ／ＮＧＦＲ）ファミリーのメンバーである。ＯＸ４０は、Ｔ細胞活性化ならびに正常及び悪性のリンパ球系細胞の分化、増殖、またはアポトーシスの制御において一定の役割を担い得る。
他の実施形態では、癌治療剤は、サイトカインである。さらに他の実施形態では、癌治療剤は、集団ベースの腫瘍特異的抗原を含むワクチンである。
他の実施形態では、癌治療剤は、癌－生殖系列遺伝子が発現する１つまたは複数の従来型抗原（複数の患者に見られる腫瘍に共通する抗原であり、「共通癌抗原」とも称される）を含むワクチンである。いくつかの実施形態では、従来型抗原は、癌もしくは腫瘍に一般に見られることが知られるものであるか、または特定の型の癌もしくは腫瘍において見られることが知られるものである。いくつかの実施形態では、従来型癌抗原は、変異していない腫瘍抗原である。いくつかの実施形態では、従来型癌抗原は、変異した腫瘍抗原である。
Ｐ５３遺伝子（正式記号ＴＰ５３）は、ヒトの癌においてほかのどの遺伝子よりも高い頻度で変異する。Ｐ５３に生じる変異のほとんどで、そのゲノム位置は１人または少数の患者のみに特有であるため、こうした変異は、特定の患者集団向けに設計される治療ワクチンのための反復ネオ抗原として使用できないことが大規模コホート研究によって示された。しかしながら、ｐ５３遺伝子座の小サブセットは実に「ホットスポット」のパターンを示しており、そこでは、遺伝子のいくつかの位置が相対的に高い頻度で変異するのである。際だったことに、反復して変異するこうした領域の大部分が、エクソンとイントロンとの境界付近に存在し、ｍＲＮＡのスプライシング機構によって認識される標準のヌクレオチド配列モチーフを破壊する（図１６）。スプライシングモチーフが変異すると、局所的なアミノ酸配列には変化が生じない（すなわち、同義変異またはイントロン変異）と予測されるとしても、最終的なｍＲＮＡ配列には変化が生じ得る。それ故に、こうした変異によって予測不可能な様式でｍＲＮＡのスプライシングに変化が生じ得、翻訳されるタンパク質が著しい機能的影響を受け得るにもかかわらず、こうした変異は、一般的なアノテーションツールによって「ノンコーディング」として注解されてしまい、さらに解析されることなく無視されることが多い。代替的にスプライシングを受けたアイソフォームにインフレームの配列変化が生じる（すなわち、中途終始コドン（ｐｒｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎ）（ＰＴＣ）が生じない）のであれば、こうしたアイソフォームはナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構（ＮＭＤ）による排除を免れることができ、速やかに発現し、プロセシングを受けてＨＬＡ系によって細胞表面に提示される。さらに、変異に由来する代替的なスプライシングは、通常、「潜在性」であって、すなわち、正常組織では発現しないものであり、それ故に、Ｔ細胞によって非自己のネオ抗原として認識され得る。
いくつかの実例では、癌治療剤は、癌治療剤は、反復多型（「ホットスポット変異」）であるネオ抗原を１つまたは複数含むワクチンである。例えば、数ある中でも特に、本発明は、ｐ５３におけるある特定の反復体細胞癌変異から得られるネオ抗原ペプチド配列を提供する。ネオ抗原ペプチド及びＨＬＡ拘束性エピトープが生じる変異及びｍＲＮＡのスプライシング事象の例には、限定はされないが、図１７に示されるもの、及び下記のものが含まれる：
（１）コドン位置Ｔ１２５に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＡＶＳＰＣＩＳＦＶＷ（配列番号２）（ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５８：０１）、エピトープＨＰＬＡＳＣＱＣＦＦ（配列番号３）（ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１）、エピトープＦＶＷＮＦＧＩＰＬ（配列番号４）（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０６、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１）を含むペプチド配列ＴＡＫＳＶＴＣＴＶＳＣＰＥＧＬＡＳＭＲＬＱＣＬＡＶＳＰＣＩＳＦＶＷＮＦＧＩＰＬＨＰＬＡＳＣＱＣＦＦＩＶＹＰＬＮＶ（配列番号１）を有する保持型イントロンを誘導する変異、
（２）コドン位置３３１に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＬＱＶＬＳＬＧＴＳＹ（配列番号６）（ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１）、エピトープＦＱＳＮＴＱＮＡＶＦ（配列番号７）（ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１）を含むペプチド配列ＥＹＦＴＬＱＶＬＳＬＧＴＳＹＱＶＥＳＦＱＳＮＴＱＮＡＶＦＦＬＴＶＬＰＡＩＧＡＦＡＩＲＧＱ（配列番号５）を有する保持型イントロンを誘導する変異、
（３）コドン位置１２６に隣接する標準３’スプライス部位における変異であって、エピトープＣＴＭＦＣＱＬＡＫ（配列番号９）（ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１）、エピトープＫＳＶＴＣＴＭＦ（配列番号１０）（ＨＬＡ－Ｂ＊５８：０１）を含む新規のスパニングペプチド配列ＡＫＳＶＴＣＴＭＦＣＱＬＡＫ（配列番号８）を生成する潜在性の代替エクソン３’スプライス部位を誘導する変異、及び／または
（４）コドン位置２２４に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＶＰＹＥＰＰＥＶＷ（配列番号１２）（ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１）、エピトープＬＴＶＰＰＳＴＡＷ（配列番号１３）（ＨＬＡ－Ｂ＊５８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１）を含む新規のスパニングペプチド配列ＶＰＹＥＰＰＥＶＷＬＡＬＴＶＰＰＳＴＡＷＡＡ（配列番号１１）を生成する潜在性の代替イントロン５’スプライス部位を誘導する変異。
（転写コドン位置は、Ｅｎｓｅｍｂｌのｖ８３のヒトゲノムアノテーションに由来する標準の全長ｐ５３転写物であるＥＮＳＴ０００００２６９３０５（配列番号１４）を参照したものである）
１つの実施形態では、本発明は、ネオ抗原ペプチド（１）～（４）の１つまたは複数をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードするｍＲＮＡを含む癌治療ワクチンを提供する。１つの実施形態では、本発明は、患者の腫瘍が上記の変異のいずれを含むかということに基づく、ペプチド（１）～（４）の１つまたは複数を含むか、またはコードするワクチンの選択投与を提供する。１つの実施形態では、本発明は、対象の腫瘍が上記の変異のいずれを含むか、及び対象の正常なＨＬＡ型が、得られるネオ抗原に結合すると予測される対応ＨＬＡ対立遺伝子を含むかという二重の判断基準に基づく、ワクチンの選択投与を提供する。
いくつかの実施形態では、癌治療ワクチンは、１つまたは複数の反復多型をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、癌治療ワクチンは、１つまたは複数の患者特異的ネオ抗原をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、癌治療ワクチンは、免疫チェックポイント調節因子をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含む。１つもしくは複数の反復多型、１つもしくは複数の患者特異的ネオ抗原、及び／または１つもしくは複数の免疫チェックポイント調節因子は、任意の様式で組み合わせることができる。例えば、１つまたは複数のコンカテマー構築物が１つもしくは複数の反復多型、１つもしくは複数の患者特異的ネオ抗原、及び／または１つもしくは複数の免疫チェックポイント調節因子をコードすることが望ましくあり得る。他の実例では、１つもしくは複数の反復多型、１つもしくは複数の患者特異的ネオ抗原、及び／または１つもしくは複数の免疫チェックポイント調節因子は、別々のｍＲＮＡ構築物によってコードされることが望ましくあり得る。１つもしくは複数の反復多型、１つもしくは複数の患者特異的ネオ抗原、及び／または１つもしくは複数の免疫チェックポイント調節因子は、同時に投与するか、または連続的に投与することができることを理解されたい。
ｍＲＮＡ癌ワクチン及び抗癌治療剤は、免疫治療応答をさらに増進するために組み合わせることができる。ｍＲＮＡ癌ワクチン及び他の治療剤は、同時または連続的に投与してよい。他の治療剤が同時に投与されるとき、それを同一の製剤または別々の製剤において投与することができるが、投与は同時に実施される。他の治療剤及びｍＲＮＡ癌ワクチンの投与が時間的に別々であるとき、他の治療剤は、互いに連続的に投与され、かつｍＲＮＡ癌ワクチンと連続的に投与される。こうした化合物の投与の時間間隔は、数分程度であり得るか、または例えば、数時間、数日、数週間、数ヶ月などの、より長い時間であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、こうした化合物の投与の時間間隔は、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、８時間、１２時間、２４時間、またはそれより長い時間である。いくつかの実施形態では、こうした化合物の投与の時間間隔は、２日、３日、４日、５日、６日、または７日以上である。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ癌ワクチンは、抗癌治療剤の前に投与される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ癌ワクチンは、抗癌治療剤の後に投与される。
他の治療剤には、限定はされないが、抗癌治療剤、アジュバント、サイトカイン、抗体、抗原等が含まれる。
ＲＮＡワクチンは、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて製剤化または投与してよい。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、例えば、治療的に活性な物質、予防的に活性な物質、または両方の組み合わせなどの追加の活性物質を少なくとも１つ含む。ワクチン組成物は、無菌、発熱物質非含有、または無菌かつ発熱物質非含有であり得る。ワクチン組成物などの医薬剤の製剤化及び／または製造における一般的な考慮事項は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２１ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）において見つけてよい。
いくつかの実施形態では、癌ＲＮＡワクチンは、ヒト、ヒト患者、または対象に投与される。本開示の目的では、「活性成分」という語句は、一般に、例えば、抗原ポリペプチドをコードするＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）などの、そこに含まれるＲＮＡワクチンまたはポリヌクレオチドを指す。
本明細書に記載のワクチン組成物の製剤は、既に知られている任意の方法、または薬理学の分野において今後開発される任意の方法によって調製してよい。一般に、そのような調製方法は、活性成分（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）を賦形剤及び／または１つもしくは複数の他の付属成分と結びつける段階と、必要及び／または望ましいのであれば、その後に実施される、所望の単一用量単位または複数用量単位への製造物の分割段階、成形段階、及び／または充填段階と、を含む。
癌ＲＮＡワクチンは、下記のことを達成するために、１つまたは複数の賦形剤を使用して製剤化することができる：（１）安定性の向上、（２）細胞へのトランスフェクションの増加、（３）（例えば、デポ製剤からの）持続放出もしくは遅延放出の実現（４）生体内分布（例えば、特定の組織もしくは細胞型への標的指向化）の改変、（５）コードタンパク質のインビボでの翻訳の増加、及び／または（６）コードタンパク質（抗原）のインビボでの放出プロファイルの改変。任意及びすべての溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体媒体、分散助剤または懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、保存剤などの従来型賦形剤に加えて、賦形剤には、限定はされないが、リピドイド（ｌｉｐｉｄｏｉｄ）、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コアシェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、癌ＲＮＡワクチンをトランスフェクトした細胞（例えば、対象への移植向け）、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣体、及びそれらの組み合わせが含まれ得る。
安定化要素
天然起源の真核生物ｍＲＮＡ分子は、５’－キャップ構造または３’－ポリ（Ａ）尾部などの他の構造的特徴に加えて、安定化要素を含むことが明らかになっており、こうした安定化要素には、限定はされないが、その５’末端の非翻訳領域（ＵＴＲ）（５’ＵＴＲ）及び／またはその３’末端の非翻訳領域（ＵＴＲ）（３’ＵＴＲ）が含まれる。５’ＵＴＲと３’ＵＴＲとは両方共、典型的には、ゲノムＤＮＡから転写され、未成熟ｍＲＮＡの要素となる。５’－キャップ及び３’－ポリ（Ａ）尾部などの、成熟ｍＲＮＡの特徴的な構造的特徴は、通常、ｍＲＮＡのプロセシングの間に転写（未成熟）ｍＲＮＡに付加される。３’－ポリ（Ａ）尾部は、典型的には、転写ｍＲＮＡの３’末端にアデニンヌクレオチドが付加されたストレッチである。３’－ポリ（Ａ）尾部は、最大で約４００のアデニンヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、３’－ポリ（Ａ）尾部の長さは、個々のｍＲＮＡの安定性に関して必須の要素であり得る。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、１つまたは複数の安定化要素を含み得る。安定化要素には、例えば、ヒストンステムループが含まれ得る。ステムループ結合タンパク質（ＳＬＢＰ）は、３２ｋＤａのタンパク質として同定された。ＳＬＢＰは、核と細胞質との両方においてヒストンメッセージの３’末端のヒストンステムループと会合する。ＳＬＢＰの発現レベルは、細胞周期によって制御されており、ヒストンｍＲＮＡのレベルも上昇する時期であるＳ期の間にピークを迎える。このタンパク質は、Ｕ７ｓｎＲＮＰによるヒストンｍＲＮＡ前駆体の効率的な３’末端プロセシングに必須であることが示されている。ＳＬＢＰは、プロセシング後にステムループと会合し続け、続いて細胞質において成熟ヒストンｍＲＮＡの、ヒストンタンパク質への翻訳を刺激する。ＳＬＢＰのＲＮＡ結合ドメインは、後生動物から原生動物を通して保存されており、ヒストンステムループへのその結合は、ループの構造に依存する。最小結合部位は、ステムループに対して５’側にヌクレオチドを少なくとも３つ、及び３’側にヌクレオチドを少なくとも２つ含む。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、コード領域、少なくとも１つのヒストンステムループ、及び任意選択でポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナルを含む。ポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナルは、一般に、コードタンパク質の発現レベルを増進することになる。いくつかの実施形態では、コードタンパク質は、ヒストンタンパク質、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、β－ガラクトシダーゼ、ＥＧＦＰ）、またはマーカーもしくは選択タンパク質（例えば、アルファ－グロビン、ガラクトキナーゼ、及びキサンチン：グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ））ではない。
いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナルと、少なくとも１つのヒストンステムループと、を組み合わせると、天然では互いが代替機構になるものの、それらが相乗的に働くことで、個々の要素のいずれかで観測されるレベルを超えてタンパク質の発現が増加する。ポリ（Ａ）と少なくとも１つのヒストンステムループとの組み合わせの相乗効果は、要素の順序またはポリ（Ａ）配列の長さに依存しないことが明らかになっている。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、ヒストン下流要素（ＨＤＥ）を含まない。「ヒストン下流要素」（ＨＤＥ）は、天然起源のステムループの３’側に約１５～２０ヌクレオチドを含む高プリン含量のポリヌクレオチドストレッチを含み、このストレッチは、Ｕ７ｓｎＲＮＡに対する結合部位となっており、Ｕ７ｓｎＲＮＡは、ヒストンｍＲＮＡ前駆体を成熟ヒストンｍＲＮＡへと変換するプロセシングに関与する。理想的には、本発明の核酸は、イントロンを含まない。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、エンハンサー配列及び／またはプロモーター配列を含んでも含まなくてもよく、こうした配列は、修飾もしくは非修飾とするか、または活性化もしくは不活性化してよい。いくつかの実施形態では、ヒストンステムループは、一般に、ヒストン遺伝子に由来するものであり、ヒストンステムループでは、スペーサーによって分離され、短い配列からなる部分的または完全に逆相補的な２つの隣接配列が分子内で塩基対を形成しており、これによってループ構造が形成される。対を形成しないループ領域は、典型的には、ステムループ要素のいずれとも塩基対を形成する能力を有さない。ステムループは、多くのＲＮＡ二次構造の重要な構成要素であるため、ＲＮＡに生じることがより多いが、一本鎖ＤＮＡにも存在し得る。ステムループ構造の安定性は、一般に、長さ、不適正塩基対またはバルジの数、及び対形成領域の塩基組成に依存する。いくつかの実施形態では、ゆらぎ塩基対形成（非ワトソン・クリック塩基対形成）が結果的に生じ得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヒストンステムループ配列は、１５～４５のヌクレオチド長を含む。
他の実施形態では、ＲＮＡワクチンは、１つまたは複数の高ＡＵ含量の配列が除去されたものあり得る。こうした配列は、ＡＵＲＥＳと称されることがあり、３’ＵＴＲに見られる不安定化配列である。ＲＮＡワクチンからＡＵＲＥＳを除去してよい。あるいは、ＲＮＡワクチンにＡＵＲＥＳを残してよい。
ナノ粒子製剤
いくつかの実施形態では、癌ＲＮＡワクチンは、ナノ粒子において製剤化される。いくつかの実施形態では、癌ＲＮＡワクチンは、脂質ナノ粒子において製剤化される。いくつかの実施形態では、癌ＲＮＡワクチンは、脂質－ポリカチオン複合体において製剤化され、この複合体は、カチオン性脂質ナノ粒子と称される。脂質ナノ粒子の製剤化は、当該技術分野において知られる方法及び／または米国公開第２０１２０１７８７０２号に記載される方法によって達成してよく、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。非限定例として、ポリカチオンには、限定はされないが、ポリリジン、ポリオルニチン、及び／またはポリアルギニン、ならびに国際公開第ＷＯ２０１２０１３３２６号または米国特許公開第ＵＳ２０１３０１４２８１８号に記載のカチオン性ペプチドなどのカチオン性のペプチドまたはポリペプチドが含まれ得、これらの文献はそれぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、癌ＲＮＡワクチンは、限定はされないが、コレステロールまたはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）などの非カチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子において製剤化される。
脂質ナノ粒子製剤は、限定はされないが、カチオン性脂質成分の選択、カチオン性脂質の飽和度、ＰＥＧ化の性質、すべての構成成分の比率、及びサイズなどの生物物理学的なパラメーターによって影響を受け得る。Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１０ ２８：１７２－１７６（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる））による１つの例では、脂質ナノ粒子製剤は、５７．１％がカチオン性脂質、７．１％がジパルミトイルホスファチジルコリン、３４．３％がコレステロール、及び１．４％がＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡから構成される。別の例として、カチオン性脂質の組成を変更することで、さまざまな抗原提示細胞へのｓｉＲＮＡの送達効率を向上させることができる（Ｂａｓｈａ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１１ １９：２１８６－２２００（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる））。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質を３５～４５％、カチオン性脂質を４０％～５０％、カチオン性脂質を５０％～６０％、及び／またはカチオン性脂質を５５％～６５％含み得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子における脂質とＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）との比率は、５：１～２０：１、１０：１～２５：１、１５：１～３０：１、及び／または少なくとも３０：１であり得る。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤におけるＰＥＧの比率を増加または低減してよく、及び／またはＰＥＧ脂質の炭素鎖長をＣ１４からＣ１８に改変することで脂質ナノ粒子製剤の薬物動態及び／または生体内分布を改変してよい。非限定例として、脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質、ＤＳＰＣ、及びコレステロールと比較して、０．５％～３．０％、１．０％～３．５％、１．５％～４．０％、２．０％～４．５％、２．５％～５．０％、及び／または３．０％～６．０％の脂質モル比率でＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ（Ｒ－３－［（ω－メトキシ－ポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル）］－１，２－ジミリスチルオキシプロピル－３－アミン）（本明細書ではＰＥＧ－ＤＯＭＧとも称される）を含み得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧは、限定はされないが、ＰＥＧ－ＤＳＧ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）、ＰＥＧ－ＤＭＧ（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール）、及び／またはＰＥＧ－ＤＰＧ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）などのＰＥＧ脂質と交換してよい。カチオン性脂質は、限定はされないが、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、Ｃ１２－２００、及びＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡなどの、当該技術分野において知られる任意の脂質から選択してよい。
いくつかの実施形態では、癌ＲＮＡワクチン製剤は、少なくとも１つの脂質を含むナノ粒子である。脂質は、限定はされないが、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ化脂質、及びアミノアルコール脂質から選択してよい。いくつかの実施形態では、脂質は、限定はされないが、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｄ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、及びアミノアルコール脂質などのカチオン性脂質であり得る。アミノアルコールカチオン性脂質は、米国特許公開第ＵＳ２０１３０１５０６２５号に記載の脂質であり得、及び／またはそこに記載の方法によって調製してよく、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。非限定例として、カチオン性脂質は、２－アミノ－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－２－｛［（９Ｚ，２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］メチル｝プロパン－１－オール（ＵＳ２０１３０１５０６２５に記載の化合物１）、２－アミノ－３－［（９Ｚ）－オクタデカ－９－エン－１－イルオキシ］－２－｛［（９Ｚ）－オクタデカ－９－エン－１－イルオキシ］メチル｝プロパン－１－オール（ＵＳ２０１３０１５０６２５に記載の化合物２）、２－アミノ－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－２－［（オクチルオキシ）メチル］プロパン－１－オール（ＵＳ２０１３０１５０６２５に記載の化合物３）、及び２－（ジメチルアミノ）－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－２－｛［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］メチル｝プロパン－１－オール（ＵＳ２０１３０１５０６２５に記載の化合物４）、または薬学的に許容されるその任意の塩もしくは立体異性体であり得る。
脂質ナノ粒子製剤は、典型的には、脂質、特に、イオン化可能なカチオン性脂質を含むと共に、中性脂質、ステロール、及び例えば、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質などの、粒子の凝集を低減する能力を有する分子をさらに含み、こうしたイオン化可能なカチオン性脂質は、例えば、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、またはジ（（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）である。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、（ｉ）２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）からなる群から選択される少なくとも１つの脂質と、（ｉｉ）ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、及びＳＭから選択される中性脂質と、（ｉｉｉ）例えば、コレステロールなどのステロールと、（ｉｖ）例えば、ＰＥＧ－ＤＭＧまたはＰＥＧ－ｃＤＭＡなどのＰＥＧ－脂質と、から本質的になるものであり、これらのモル比率は、カチオン性脂質が２０～６０％、中性脂質が５～２５％、ステロールが２５～５５％、ＰＥＧ－脂質が０．５～１５％である。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質をモルベースで２５％～７５％含み、例えば、モルベースで３５～６５％、４５～６５％、６０％、５７．５％、５０％、または４０％含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、中性脂質をモルベースで０．５％～１５％含み、例えば、モルベースで３～１２％、５～１０％、または１５％、１０％、もしくは７．５％含む。中性脂質の例には、限定はされないが、ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、及びＳＭが含まれる。いくつかの実施形態では、製剤は、ステロールをモルベースで５％～５０％（例えば、モルベースで１５～４５％、２０～４０％、４０％、３８．５％、３５％、または３１％）含む。ステロールの非限定例は、コレステロールである。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質をモルベースで０．５％～２０％（例えば、モルベースで０．５～１０％、０．５～５％、１．５％、０．５％、１．５％、３．５％、または５％）含む．いくつかの実施形態では、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質は、平均分子量が２，０００ＤａのＰＥＧ分子を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質は、平均分子量が２，０００未満（例えば、およそ１，５００Ｄａ、およそ１，０００Ｄａ、またはおよそ５００Ｄａ）のＰＥＧ分子を含む。ＰＥＧ修飾脂質の例には、限定はされないが、ＰＥＧ－ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）（本明細書ではＰＥＧ－Ｃ１４またはＣ１４－ＰＥＧとも称される）、ＰＥＧ－ｃＤＭＡが含まれる（Ｒｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１０７，２７６－２８７（２００５）においてさらに議論されており、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質を２５～７５％、中性脂質を０．５～１５％、ステロールを５～５０％、ならびにＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を０．５～２０％、モルベースで含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質を３５～６５％、中性脂質を３～１２％、ステロールを１５～４５％、ならびにＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を０．５～１０％、モルベースで含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質を４５～６５％、中性脂質を５～１０％、ステロールを２５～４０％、ならびにＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を０．５～１０％、モルベースで含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質を６０％、中性脂質を７．５％、ステロールを３１％、ならびにＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を１．５％、モルベースで含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質を５０％、中性脂質を１０％、ステロールを３８．５％、ならびにＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を１．５％、モルベースで含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質を５０％、中性脂質を１０％、ステロールを３５％、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を４．５％または５％、ならびに標的指向化脂質を０．５％、モルベースで含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質を４０％、中性脂質を１５％、ステロールを４０％、ならびにＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を５％、モルベースで含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質を５７．２％、中性脂質を７．１％、ステロールを３４．３％、ならびにＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を１．４％、モルベースで含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、ＰＥＧ脂質から選択されるカチオン性脂質としてＰＥＧ－ｃＤＭＡ（ＰＥＧ－ｃＤＭＡについては、Ｒｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１０７，２７６－２８７（２００５）においてさらに議論されており、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を５７．５％、中性脂質を７．５％、ステロールを３１．５％、及びＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を３．５％、モルベースで含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質が２０～７０％：中性脂質が５～４５％：コレステロールが２０～５５％：ＰＥＧ修飾脂質が０．５～１５％というモル比率の脂質混合物から本質的になる。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質が２０～６０％：中性脂質が５～２５％：コレステロールが２５～５５％：ＰＥＧ修飾脂質が０．５～１５％というモル比率の脂質混合物から本質的になる。
いくつかの実施形態では、脂質のモル比率は、５０／１０／３８．５／１．５（カチオン性脂質／中性脂質（例えば、ＤＳＰＣ）／コレステロール／ＰＥＧ修飾脂質（例えば、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＳＧ、もしくはＰＥＧ－ＤＰＧ）のモル％）、５７．２／７．１１３４．３／１．４（カチオン性脂質／中性脂質（例えば、ＤＰＰＣ）／コレステロール／ＰＥＧ修飾脂質（例えば、ＰＥＧ－ｃＤＭＡ）のモル％）、４０／１５／４０／５（カチオン性脂質／中性脂質（例えば、ＤＳＰＣ）／コレステロール／ＰＥＧ修飾脂質（例えば、ＰＥＧ－ＤＭＧ）のモル％）、５０／１０／３５／４．５／０．５（カチオン性脂質／中性脂質（例えば、ＤＳＰＣ）／コレステロール／ＰＥＧ修飾脂質（例えば、ＰＥＧ－ＤＳＧ）のモル％）、５０／１０／３５／５（カチオン性脂質／中性脂質（例えば、ＤＳＰＣ）／コレステロール／ＰＥＧ修飾脂質（例えば、ＰＥＧ－ＤＭＧ））、４０／１０／４０／１０（カチオン性脂質／中性脂質（例えば、ＤＳＰＣ）／コレステロール／ＰＥＧ修飾脂質（例えば、ＰＥＧ－ＤＭＧもしくはＰＥＧ－ｃＤＭＡ）のモル％）、３５／１５／４０／１０（カチオン性脂質／中性脂質（例えば、ＤＳＰＣ）／コレステロール／ＰＥＧ修飾脂質（例えば、ＰＥＧ－ＤＭＧもしくはＰＥＧ－ｃＤＭＡ）のモル％）、または５２／１３／３０／５（カチオン性脂質／中性脂質（例えば、ＤＳＰＣ）／コレステロール／ＰＥＧ修飾脂質（例えば、ＰＥＧ－ＤＭＧもしくはＰＥＧ－ｃＤＭＡ）のモル％）である。
脂質ナノ粒子組成物及びその調製方法の例は、限定はされないが、例えば、Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８：１７２－１７６、Ｊａｙａｒａｍａ ｅｔ ａｌ．（２０１２），Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，５１：８５２９－８５３３、及びＭａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２１，１５７０－１５７８（これらの文献のそれぞれの内容は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されている。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質、ＰＥＧ脂質、及び構造脂質を含み得、非カチオン性脂質を任意選択で含み得る。非限定例として、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質を４０～６０％、非カチオン性脂質を５～１５％、ＰＥＧ脂質を１～２％、及び構造脂質を３０～５０％含み得る。別の非限定例として、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質を５０％、非カチオン性脂質を１０％、ＰＥＧ脂質を１．５％、及び構造脂質を３８．５％含み得る。さらに別の非限定例として、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質を５５％、非カチオン性脂質を１０％、ＰＥＧ脂質を２．５％、及び構造脂質を３２．５％含み得る。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、限定はされないが、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、及びＬ３１９などの、本明細書記載のカチオン性脂質のいずれかであり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子製剤は、４つの構成成分を含む脂質ナノ粒子であり得る。脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、ＰＥＧ脂質、及び構造脂質を含み得る。非限定例として、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質を４０～６０％、非カチオン性脂質を５～１５％、ＰＥＧ脂質を１～２％、及び構造脂質を３０～５０％含み得る。別の非限定例として、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質を５０％、非カチオン性脂質を１０％、ＰＥＧ脂質を１．５％、及び構造脂質を３８．５％含み得る。さらに別の非限定例として、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質を５５％、非カチオン性脂質を１０％、ＰＥＧ脂質を２．５％、及び構造脂質を３２．５％含み得る。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、限定はされないが、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、及びＬ３１９などの、本明細書記載のカチオン性脂質のいずれかであり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、ＰＥＧ脂質、及び構造脂質を含み得る。非限定例として、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質としてＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡを５０％、非カチオン性脂質としてＤＳＰＣを１０％、ＰＥＧ脂質としてＰＥＧ－ＤＯＭＧを１．５％、及び構造脂質としてコレステロールを３８．５％含む。非限定例として、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質としてＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡを５０％、非カチオン性脂質としてＤＳＰＣを１０％、ＰＥＧ脂質としてＰＥＧ－ＤＯＭＧを１．５％、及び構造脂質としてコレステロールを３８．５％含む。非限定例として、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質としてＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡを５０％、非カチオン性脂質としてＤＳＰＣを１０％、ＰＥＧ脂質としてＰＥＧ－ＤＭＧを１．５％、及び構造脂質コレステロールを３８．５％含む。さらに別の非限定例として、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質としてＬ３１９を５５％、非カチオン性脂質としてＤＳＰＣを１０％、ＰＥＧ脂質としてＰＥＧ－ＤＭＧを２．５％、及び構造脂質としてコレステロールを３２．５％含む。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、式（Ｉ）の化合物：
Figure 2023024669000001
 またはその塩もしくは異性体を含み、式中：
Ｒ１は、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、Ｑは、炭素環、ヘテロ環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、ｎはそれぞれ、１、２、３、４、及び５から独立して選択され、
Ｒ５はそれぞれ、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ６はそれぞれ、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｍ及びＭ’は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から独立して選択され、
Ｒ７は、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８は、Ｃ３－６炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環、及びヘテロ環からなる群から選択され、
Ｒはそれぞれ、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ’はそれぞれ、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ”はそれぞれ、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
Ｒ＊はそれぞれ、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
Ｙはそれぞれ、独立してＣ３－６炭素環であり、
Ｘはそれぞれ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から独立して選択され、かつ
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、Ｒ４が、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、または－ＣＱ（Ｒ）２であるとき、（ｉ）ｎが、１、２、３、４、もしくは５であるとき、Ｑが、－Ｎ（Ｒ）２ではない化合物、または（ｉｉ）ｎが、１もしくは２であるとき、Ｑが、５員、６員、もしくは７員のヘテロシクロアルキルではない化合物を含む。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、
Ｒ１が、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３が、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２及びＲ３が、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４が、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、Ｑが、Ｃ３－６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有する５～１４員のヘテロアリール、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、ならびにオキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノ、モノ－アルキルアミノまたはジ－アルキルアミノ、及びＣ１－３アルキルから選択される１つまたは複数の置換基で置換されており、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有する５～１４員のヘテロシクロアルキルから選択され、ｎがそれぞれ、１、２、３、４、及び５から独立して選択され、
Ｒ５がそれぞれ、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ６がそれぞれ、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｍ及びＭ’が、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から独立して選択され、
Ｒ７が、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８が、Ｃ３－６炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
Ｒ９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環、及びヘテロ環からなる群から選択され、
Ｒがそれぞれ、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ’がそれぞれ、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ”がそれぞれ、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
Ｒ＊がそれぞれ、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
Ｙがそれぞれ、独立してＣ３－６炭素環であり、
Ｘがそれぞれ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から独立して選択され、かつ
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、
化合物またはその塩もしくは異性体を含む。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、
Ｒ１が、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３が、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２及びＲ３が、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４が、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、Ｑが、Ｃ３－６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有する５～１４員のヘテロ環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２からなる群から選択され、ｎがそれぞれ、１、２、３、４、及び５から独立して選択され、Ｑが、５～１４員のヘテロ環であり、かつ（ｉ）Ｒ４が、－（ＣＨ２）ｎＱ（ｎは、１もしくは２である）であるか、または（ｉｉ）Ｒ４が、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ（ｎは、１である）であるか、または（ｉｉｉ）Ｒ４が、－ＣＨＱＲ、及び－ＣＱ（Ｒ）２であるとき、Ｑが、５～１４員のヘテロアリール、または８～１４員のヘテロシクロアルキルのいずれかであり、
Ｒ５がそれぞれ、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ６がそれぞれ、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｍ及びＭ’が、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から独立して選択され、
Ｒ７が、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８が、Ｃ３－６炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
Ｒ９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環、及びヘテロ環からなる群から選択され、
Ｒがそれぞれ、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ’がそれぞれ、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ”がそれぞれ、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
Ｒ＊がそれぞれ、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
Ｙがそれぞれ、独立してＣ３－６炭素環であり、
Ｘがそれぞれ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から独立して選択され、かつ
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、
化合物またはその塩もしくは異性体を含む。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、
Ｒ１が、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３が、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２及びＲ３が、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４が、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、Ｑが、Ｃ３－６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を有する５～１４員のヘテロアリール、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２から選択され、ｎがそれぞれ、１、２、３、４、及び５から独立して選択され、
Ｒ５がそれぞれ、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ６がそれぞれ、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｍ及びＭ’が、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から独立して選択され、
Ｒ７が、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８が、Ｃ３－６炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
Ｒ９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環、及びヘテロ環からなる群から選択され、
Ｒがそれぞれ、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ’がそれぞれ、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ”がそれぞれ、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
Ｒ＊がそれぞれ、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
Ｙがそれぞれ、独立してＣ３－６炭素環であり、
Ｘがそれぞれ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から独立して選択され、かつ
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、
化合物またはその塩もしくは異性体を含む。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、
Ｒ１が、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３が、Ｈ、Ｃ２－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２及びＲ３が、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４が、－（ＣＨ２）ｎＱまたは－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、Ｑが、－Ｎ（Ｒ）２であり、ｎが、３、４、及び５から選択され、
Ｒ５がそれぞれ、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ６がそれぞれ、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｍ及びＭ’が、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から独立して選択され、
Ｒ７が、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒがそれぞれ、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ’がそれぞれ、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ”がそれぞれ、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
Ｒ＊がそれぞれ、Ｃ１－１２アルキル及びＣ１－１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
Ｙがそれぞれ、独立してＣ３－６炭素環であり、
Ｘがそれぞれ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から独立して選択され、かつ
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、
化合物またはその塩もしくは異性体を含む。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットは、
Ｒ１が、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３が、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２及びＲ３が、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４が、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、及び－ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、Ｑが、－Ｎ（Ｒ）２であり、ｎが、１、２、３、４、及び５から選択され、
Ｒ５がそれぞれ、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ６がそれぞれ、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｍ及びＭ’が、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から独立して選択され、
Ｒ７が、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒがそれぞれ、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ’がそれぞれ、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から独立して選択され、
Ｒ”がそれぞれ、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
Ｒ＊がそれぞれ、Ｃ１－１２アルキル及びＣ１－１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
Ｙがそれぞれ、独立してＣ３－６炭素環であり、
Ｘがそれぞれ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から独立して選択され、かつ
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、
化合物またはその塩もしくは異性体を含む。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＡ）の化合物：
Figure 2023024669000002
 またはその塩もしくは異性体を含み、式中、ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され、Ｍ１は、結合またはＭ’であり、Ｒ４は、非置換Ｃ１－３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリール、もしくはヘテロシクロアルキルであり、Ｍ及びＭ’は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から独立して選択され、かつＲ２及びＲ３は、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から独立して選択される。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＩ）の化合物：
Figure 2023024669000003
 またはその塩もしくは異性体を含み、式中、ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、Ｍ１は、結合またはＭ’であり、Ｒ４は、非置換Ｃ１－３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、ｎは２、３、または４であり、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルであり、Ｍ及びＭ’は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から独立して選択され、かつＲ２及びＲ３は、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から独立して選択される。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＩａ）、式（ＩＩｂ）、式（ＩＩｃ）、もしくは式（ＩＩｅ）の化合物：
Figure 2023024669000004
 またはその塩もしくは異性体を含み、式中、Ｒ４は、本明細書に記載のとおりである。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＩｄ）の化合物：
Figure 2023024669000005
 またはその塩もしくは異性体を含み、式中、ｎは、２、３、または４であり、ｍ、Ｒ’、Ｒ”、及びＲ２～Ｒ６は、本明細書に記載のとおりである。例えば、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ、Ｃ５－１４アルキル及びＣ５－１４アルケニルからなる群から独立して選択され得る。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＩａ）、式（ＩＩｂ）、式（ＩＩｃ）、または式（ＩＩｅ）の化合物：
Figure 2023024669000006
 またはその塩もしくは異性体を含み、式中、Ｒ４は、本明細書に記載のとおりである。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＩｄ）の化合物：
Figure 2023024669000007
 またはその塩もしくは異性体を含み、式中、ｎは、２、３、または４であり、ｍ、Ｒ’、Ｒ”、及びＲ２～Ｒ６は、本明細書に記載のとおりである。例えば、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ、Ｃ５－１４アルキル及びＣ５－１４アルケニルからなる群から独立して選択され得る。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、
Figure 2023024669000008
Figure 2023024669000009
Figure 2023024669000010
Figure 2023024669000011
Figure 2023024669000012
Figure 2023024669000013
Figure 2023024669000014
Figure 2023024669000015
Figure 2023024669000016
 からなる群から選択される。
追加の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、
Figure 2023024669000017
 からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、
Figure 2023024669000018
Figure 2023024669000019
Figure 2023024669000020
Figure 2023024669000021
Figure 2023024669000022
Figure 2023024669000023
Figure 2023024669000024
Figure 2023024669000025
Figure 2023024669000026
Figure 2023024669000027
Figure 2023024669000028
Figure 2023024669000029
Figure 2023024669000030
Figure 2023024669000031
Figure 2023024669000032
Figure 2023024669000033
Figure 2023024669000034
Figure 2023024669000035
Figure 2023024669000036
Figure 2023024669000037
Figure 2023024669000038
Figure 2023024669000039
Figure 2023024669000040
Figure 2023024669000041
Figure 2023024669000042
Figure 2023024669000043
Figure 2023024669000044
 それらの塩及び異性体からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、下記の化合物を含む：
Figure 2023024669000045
 またはその塩及び異性体。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の化合物（例えば、式（Ｉ）、式（ＩＡ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩａ）、式（ＩＩｂ）、式（ＩＩｃ）、式（ＩＩｄ）、または式（ＩＩｅ）による化合物）を含む脂質成分を含むナノ粒子組成物を特徴とする。
本発明の他の態様では、こうした方法の達成を目的とするキットも提供される。キットは、脂質ナノ粒子製剤を収容する容器と、ワクチン製剤を収容する容器と、対象への投与までの２４時間以内に、個別化ｍＲＮＡ癌ワクチンをワクチン製剤に添加して個別化ｍＲＮＡ癌ワクチン製剤を生成し、個別化ｍＲＮＡ癌ワクチン製剤と脂質ナノ粒子製剤とを混合することについての説明と、を含む。いくつかの実施形態では、キットは、２～１００の癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡを含む。
物品は、１つまたは複数の容器に医薬グレードまたは診断グレードの本発明の化合物を含む。物品は、本発明の化合物の使用を促進または記載する説明またはラベルを含み得る。
本明細書に記載の「促進」は、教育、病院的及び他の臨床的説明、医薬販売を含む医薬業界活動、ならびに任意の形態の文書的、口頭的、及び電子的なコミュニケーションを含む任意の宣伝活動または他の販売促進活動を行う方法を含む、癌の治療に関して本発明の組成物と関連してビジネスを実施するすべての方法を含む。
「説明」は、販売促進の構成要素であると定義することができ、典型的には、本発明の組成物の梱包に対する文書的説明またはそれと関連する文書的説明を含む。説明は、任意の様式で提供される任意の口頭的または電子的な説明も含み得る。
したがって、いくつかの実施形態では、治療的、診断的、または研究的な用途におけるその使用を促進するための、医薬的または診断的または研究的なキットを、本明細書に記載の薬剤から構築してよい。キットは、本発明の構成要素及び使用説明を収容する１つまたは複数の容器を含み得る。具体的には、そのようなキットは、意図される治療用途及びこうした薬剤の適切な投与について記載する説明と共に、本明細書に記載の薬剤を１つまたは複数含み得る。ある特定の実施形態では、キットにおける薬剤は、特定の用途及び薬剤の投与方法に適した医薬製剤及び用量であり得る。
キットは、医師による本明細書に記載の方法の使用が容易になるように設計してよく、多くの形態をとることができる。キットの組成物はそれぞれ、適用可能な場合、液体形態（例えば、溶液）または固体形態（例えば、乾燥粉末）で提供してよい。ある特定の場合では、組成物のいくつかは、（例えば、活性形態にするために）例えば、適切な溶媒もしくは他の種類のもの（例えば、水もしくは細胞培養培地）を添加することによって構成可能であるか、または別の形で処理可能であり得、こうした溶媒または他の種類のものは、キットに付属して提供されてもされなくてもよい。本明細書で使用される「説明」は、説明及び／または販売促進の構成要素であると定義することができ、典型的には、本発明の梱包に対する文書的説明またはそれと関連する文書的説明を含む。説明は、任意の様式で提供される任意の口頭的または電子的な説明も含み得、その結果、使用者は、例えば、視聴覚的なもの（例えば、ビデオテープ、ＤＶＤ等）、インターネット、及び／またはウェブに基づくコミュニケーション等を通して、説明がキットと関連することになると明確に認識することになる。文書的説明は、医薬物または生物学的産物の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって規定された形態であり得、当該説明は、ヒトへの投与を目的とする製造、使用、または販売の機関による承認を反映したものでもあり得る。
キットは、本明細書に記載の要素のいずれか１つまたは複数を１つまたは複数の容器に含み得る。例として、１つの実施形態では、キットは、キットの１つまたは複数の構成要素の混合、及び／または試料の単離及び混合、ならびに対象への適用のための説明を含み得る。キットは、本明細書に記載の薬剤を収容する容器を含み得る。薬剤は、無菌的に調製し、シリンジに充填し、冷蔵配送してよい。あるいは、バイアルまたは他の貯蔵用容器に薬剤を収容してもよい。無菌的に調製された他の薬剤を第２の容器に収容してよい。あるいは、シリンジ、バイアル、チューブ、または他の容器において配送される事前混合済の活性剤をキットに含めてもよい。
キットは、ブリスターパウチ、収縮包装パウチ、真空密封可能なパウチ、密封可能な熱形成トレイ、または同様のパウチ形態もしくはトレイ形態などのさまざまな形態を有し得、パウチ、１つまたは複数のチューブ、容器、箱、またはバッグの中に緩く梱包された付属物を共に含む。キットは、付属物を追加した後に無菌化してよく、それによって容器内の個々の付属品を通常なら未包装となる状態にしておくことが可能になる。キットは、放射線滅菌法、加熱滅菌法、または当該技術分野において知られる他の滅菌法などの、任意の適切な滅菌技術を使用して無菌化することができる。キットは、特定の用途に応じて他の構成要素も含み得、こうした構成要素は、例えば、容器、細胞培地、塩、緩衝剤、試薬、シリンジ、針、消毒剤の適用または除去のためのガーゼなどの布、使い捨ての手袋、投与前の薬剤支持体等である。
キットの組成物は、例えば、液体溶液または乾燥粉末などの任意の適切な形態として提供してよい。提供される組成物が乾燥粉末であるとき、粉末は、併せて提供され得る適切な溶媒を添加することによって再構成してよい。液体形態の組成物が使用される実施形態では、液体形態は、濃縮するか、またはすぐ使用可能な状態にしてよい。溶媒は、使用または投与される化合物及び様式に依存することになる。薬物組成物に適した溶媒はよく知られており、文献から情報を入手することが可能である。溶媒は、使用または投与される化合物及び様式に依存することになる。
実施形態の１つのセットでは、キットは、バイアル、チューブ、及び同様のものなどの１つまたは複数の容器手段を密閉受容する区分けされた運搬手段を含み得、容器手段はそれぞれ、方法において使用されることになる別々の要素のうちの１つを含む。例えば、容器の１つは、アッセイに対する正の対照を含み得る。さらに、キットは、例えば、アッセイにおいて有用な緩衝液などの他の構成要素のための容器を含み得る。
本発明は、梱包及びラベル添付が終了した医薬製品も包含する。この製造物品は、ガラスバイアルまたは密閉される他の容器などの適切なベッセルまたは容器に、適切な単位用量形態を含む。非経口投与に適した用量形態の場合、活性成分は無菌であり、微粒子を含有しない溶液としての投与に適している。言い換えれば、本発明は、非経口溶液と凍結乾燥粉末との両方を包含し、これらはそれぞれ無菌であり、後者は注射前の再構成に適するものである。あるいは、単位用量形態は、経口送達、経皮送達、局所送達、または経粘膜送達に適した固体であり得る。
好ましい実施形態では、単位用量形態は、静脈内送達、筋肉内送達、または皮下送達に適する。したがって、本発明は、溶液を包含し、こうした溶液は、好ましくは、無菌でありそれぞれの送達経路に適したものである。
別の好ましい実施形態では、本発明の組成物は、生体適合性界面活性剤または他のタンパク質と共に容器に貯蔵され、こうした界面活性剤には、限定はされないが、レシチン、タウロコール酸、及びコレステロールが含まれ、こうした他のタンパク質には、限定はされないが、ガンマグロブリン及び血清アルブミンが含まれる。より好ましくは、本発明の組成物は、ヒトにおける使用目的ではヒト血清アルブミンと共に貯蔵され、獣医学的な使用目的ではウシ血清アルブミンと共に貯蔵される。
任意の医薬製品と同様に、梱包材料及び容器は、貯蔵及び発送の間に製品の安定性が保護されるように設計される。さらに、本発明の製品は、使用説明、または問題の疾患もしくは障害をどのように適切に予防もしくは治療するかについて医師、専門技師、もしくは患者に通知する他の情報材料を含む。言い換えれば、製造物品は、投薬レジメンを指示または提案する説明手段を含み、こうした投薬レジメンには、限定はされないが、実際用量、監視手順（平均絶対リンパ球数、腫瘍細胞数、及び腫瘍サイズの監視方法など）ならびに他の監視情報が含まれる。
より具体的には、本発明は、箱、ボトル、チューブ、バイアル、容器、噴霧器、吸入器、静注輸液（静注）バッグ、エンベロープ、及び同様のものなどの梱包材料と、当該梱包材料内に含まれる少なくとも１つの単位用量形態の医薬剤と、を含む製造物品を提供する。本発明は、箱、ボトル、チューブ、バイアル、容器、噴霧器、吸入器、静注輸液（静注）バッグ、エンベロープ、及び同様のものなどの梱包材料と、当該梱包材料内に含まれる少なくとも１つの単位用量形態のそれぞれの医薬剤と、を含む製造物品も提供する。本発明は、箱、ボトル、チューブ、バイアル、容器、噴霧器、吸入器、静注輸液（静注）バッグ、エンベロープ、及び同様のものなどの梱包材料と、当該梱包材料内に含まれる少なくとも１つの単位用量形態のそれぞれの医薬剤と、を含む製造物品をさらに提供する。本発明は、製剤の注射を目的とする針もしくはシリンジ（好ましくは、無菌形態で梱包される）、及び／または梱包されたアルコールパッドを含む製造物品をさらに提供する。
ワクチン組成物における活性成分、薬学的に許容される賦形剤、及び／または任意の追加成分の相対量は、治療中の対象の独自性、サイズ、及び／または病状、さらにこれらに加えて、組成物が投与されることになる経路に応じて変わり得るものである。例えば、組成物は、活性成分を０．１％～９９％（ｗ／ｗ）含み得る。例として、組成物は、活性成分を０．１％～１００％（ｗ／ｗ）含み得、例えば、．５～５０％（ｗ／ｗ）、１～３０％（ｗ／ｗ）、５～８０％（ｗ／ｗ）、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）含む。
いくつかの実施形態では、所望の治療効果、診断効果、予防効果、または造影効果を得るために、対象の体重当たりとして１日当たり０．０００１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ～０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ～０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ～０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ～０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～４０ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ～３０ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇ～２５ｍｇ／ｋｇを送達するために十分な用量レベルでＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン組成物を、１日当たり、１週間当たり、１ヶ月当たりなどに１回または複数回投与してよい（例えば、国際公開第ＷＯ２０１３０７８１９９号に記載の単位用量の範囲を参照のこと。当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。所望の用量は、１日に３回、１日に２回、１日に１回、２日ごとに１回、３日ごとに１回、１週間ごとに１回、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、４週間ごとに１回、２ヶ月ごとに１回、３ヶ月ごとに１回、６ヶ月ごとに１回などの頻度で送達してよい。ある特定の実施形態では、所望の用量は、複数回の投与（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、またはそれを超える回数の投与）を使用して送達してよい。複数回投与が用いられるときは、本明細書に記載のものなどの分割投薬レジメンを使用してよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチン組成物は、０．０００５ｍｇ／ｋｇ～０．０１ｍｇ／ｋｇを送達するために十分な用量レベルで投与してよく、例えば、約０．０００５ｍｇ／ｋｇ～約０．００７５ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０００５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ、約０．００２ｍｇ／ｋｇ、約０．００３ｍｇ／ｋｇ、約０．００４ｍｇ／ｋｇ、または約０．００５ｍｇ／ｋｇを送達するために十分な用量レベルで投与してよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチン組成物は、０．０２５ｍｇ／ｋｇ～０．２５０ｍｇ／ｋｇ、０．０２５ｍｇ／ｋｇ～０．５００ｍｇ／ｋｇ、０．０２５ｍｇ／ｋｇ～０．７５０ｍｇ／ｋｇ、または０．０２５ｍｇ／ｋｇ～１．０ｍｇ／ｋｇを送達するために十分な用量レベルで１回または２回（またはそれを超える回数）投与してよい。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチン組成物は、０．０１００ｍｇ、０．０２５ｍｇ、０．０５０ｍｇ、０．０７５ｍｇ、０．１００ｍｇ、０．１２５ｍｇ、０．１５０ｍｇ、０．１７５ｍｇ、０．２００ｍｇ、０．２２５ｍｇ、０．２５０ｍｇ、０．２７５ｍｇ、０．３００ｍｇ、０．３２５ｍｇ、０．３５０ｍｇ、０．３７５ｍｇ、０．４００ｍｇ、０．４２５ｍｇ、０．４５０ｍｇ、０．４７５ｍｇ、０．５００ｍｇ、０．５２５ｍｇ、０．５５０ｍｇ、０．５７５ｍｇ、０．６００ｍｇ、０．６２５ｍｇ、０．６５０ｍｇ、０．６７５ｍｇ、０．７００ｍｇ、０．７２５ｍｇ、０．７５０ｍｇ、０．７７５ｍｇ、０．８００ｍｇ、０．８２５ｍｇ、０．８５０ｍｇ、０．８７５ｍｇ、０．９００ｍｇ、０．９２５ｍｇ、０．９５０ｍｇ、０．９７５ｍｇ、または１．０ｍｇの総用量またはその総用量を送達するために十分な用量レベルで、２回（例えば、０日目と７日目、０日目と１４日目、０日目と２１日目、０日目と２８日目、０日目と６０日目、０日目と９０日目、０日目と１２０日目、０日目と１５０日目、０日目と１８０日目、０日目と３ヶ月後、０日目と６ヶ月後、０日目と９ヶ月後、０日目と１２ヶ月後、０日目と１８ヶ月後、０日目と２年後、０日目と５年後、または０日目と１０年後）投与してよい。本開示は、投与用量を上げたもの及び下げたもの、ならびに投与頻度を上げたもの及び下げたものを包含する。例えば、ＲＮＡワクチン組成物は、３回または４回投与してよい。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチン組成物は、０．０１０ｍｇ、０．０２５ｍｇ、０．１００ｍｇ、または０．４００ｍｇの総用量またはその総用量を送達するために十分な用量レベルで、２回（例えば、０日目と７日目、０日目と１４日目、０日目と２１日目、０日目と２８日目、０日目と６０日目、０日目と９０日目、０日目と１２０日目、０日目と１５０日目、０日目と１８０日目、０日目と３ヶ月後、０日目と６ヶ月後、０日目と９ヶ月後、０日目と１２ヶ月後、０日目と１８ヶ月後、０日目と２年後、０日目と５年後、または０日目と１０年後）投与してよい。
いくつかの実施形態では、対象のワクチン接種方法における使用を目的とするＲＮＡワクチンでは、対象のワクチン接種に有効な量で、１０μｇ／ｋｇ～４００μｇ／ｋｇの単回用量の核酸ワクチンが対象に投与される。いくつかの実施形態では、対象のワクチン接種方法における使用を目的とするＲＮＡワクチンでは、対象のワクチン接種に有効な量で、１０μｇ～４００μｇの単回用量の核酸ワクチンが対象に投与される。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチン組成物は、ＭＣ３、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ２０００－ＤＭＧを含む脂質ナノ粒子において製剤化された本明細書に記載のポリヌクレオチド、クエン酸三ナトリウム緩衝剤、スクロース、ならびに注射用水を含み得る。非限定例として、組成物は、２．０ｍｇ／ｍＬの薬物物質（例えば、癌抗原をコードするポリヌクレオチド）、２１．８ｍｇ／ｍＬのＭＣ３、１０．１ｍｇ／ｍＬのコレステロール、５．４ｍｇ／ｍＬのＤＳＰＣ、２．７ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ２０００－ＤＭＧ、５．１６ｍｇ／ｍＬのクエン酸三ナトリウム、７１ｍｇ／ｍＬのスクロース、及び１．０ｍＬの注射用水を含む。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、１０～５００ｎｍ、２０～４００ｎｍ、３０～３００ｎｍ、４０～２００ｎｍの平均直径を有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、５０～１５０ｎｍ、５０～２００ｎｍ、８０～１００ｎｍ、または８０～２００ｎｍの平均直径を有する。
フラゲリンは、約５００のアミノ酸の単量体タンパク質であり、このタンパク質が重合することで、細菌の動きと関連する鞭毛が形成される。さまざまな鞭毛細菌（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ならびに非鞭毛細菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉなど）がフラゲリンを発現する。自然免疫系の細胞（樹状細胞、マクロファージ等）によるフラゲリンの感知は、Ｔｏｌｌ様受容体５（ＴＬＲ５）ならびにＮｏｄ様受容体（ＮＬＲ）であるＩｐａｆ及びＮａｉｐ５によって媒介される。ＴＬＲ及びＮＬＲは、自然免疫応答及び適応免疫応答の活性化において一定の役割を担うことが同定されている。したがって、フラゲリンは、ワクチンにおいてアジュバント効果を発揮する。
既知のフラゲリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて公的に利用可能である。フラゲリン配列としては、数ある中でも特に、Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｈ．Ｐｙｌｏｒｉ、Ｖ．Ｃｈｏｌｅｒａ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｅｎｓ、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｅｉ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｒ．ｌｕｐｉｎｉ、Ｂ．ｃｌａｒｒｉｄｇｅｉａｅ、Ｐ．Ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｕｓ、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、及びＥ．ｃｏｌｉに由来するものが知られている。
本明細書で使用されるフラゲリンポリペプチドは、全長フラゲリンタンパク質、その免疫原性断片、及びフラゲリンタンパク質またはその免疫原性断片に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するペプチドを指す。フラゲリンタンパク質の例には、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ（ＵｎｉＰｒｏ登録番号：Ｑ５６０８６）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（Ａ０Ａ０Ｃ９ＤＧ０９）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（Ａ０Ａ０Ｃ９ＢＡＢ７）、及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ（Ｑ６Ｖ２Ｘ８）に由来するフラゲリン、ならびに配列番号４２０～４２２（表６６）のいずれか１つによって同定されるアミノ酸配列を有するタンパク質が含まれる。いくつかの実施形態では、フラゲリンポリペプチドは、フラゲリンタンパク質またはその免疫原性断片に対して、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、フラゲリンポリペプチドは、免疫原性断片である。免疫原性断片は、免疫応答を誘発するフラゲリンタンパク質の一部分である。いくつかの実施形態では、免疫応答は、ＴＬＲ５を介する免疫応答である。免疫原性断片の例は、ヒンジ領域のすべてまたは一部が、欠失または他のアミノ酸と交換されたフラゲリンタンパク質である。例えば、抗原ポリペプチドをヒンジ領域に挿入してよい。ヒンジ領域は、フラゲリンの超可変領域である。フラゲリンのヒンジ領域は、「Ｄ３ドメインまたはＤ３領域」、「プロペラドメインまたはプロペラ領域」、「超可変ドメインまたは超可変領域」、及び「可変ドメインまたは可変領域」とも称される。本明細書で使用される「ヒンジ領域の少なくとも一部」は、フラゲリンのヒンジ領域の任意の部分、またはヒンジ領域全体を指す。他の実施形態では、フラゲリンの免疫原性断片は、２０、２５、３０、３５、または４０のアミノ酸のフラゲリンＣ末端断片である。
フラゲリン単量体は、ドメインＤ０～Ｄ３によって形成される。Ｄ０及びＤ１は、ステムを形成するものであり、タンデム型の長いアルファヘリックスから構成され、異なる細菌の間で高度に保存されている。Ｄ１ドメインは、ＴＬＲ５の活性化に有用なアミノ酸ストレッチをいくつか含む。Ｄ１ドメイン全体またはドメイン内の活性領域の１つもしくは複数が、フラゲリンの免疫原性断片である。Ｄ１ドメイン内の免疫原性領域の例には、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのフラゲリンであるＦｌｉＣにおける残基８８～１１４及び残基４１１～４３１が含まれる。８８～１００の領域における１３のアミノ酸の中では、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａのフラゲリン及び他のフラゲリンの間で少なくとも６つの置換が許容され、こうした置換が存在してもＴＬＲ５の活性化は依然として保存される。したがって、フラゲリンの免疫原性断片には、ＴＬＲ５を活性化すると共に、ＦｌｉＣの８８～１００のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ配列（ＬＱＲＶＲＥＬＡＶＱＳＡＮ（配列番号４２８））に対する同一性が５３％以上である１３のアミノ酸のモチーフを含むフラゲリン様配列が含まれる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、フラゲリンと１つまたは複数の抗原ポリペプチドとの融合タンパク質をコードするＲＮＡを含む。本明細書で使用される「融合タンパク質」は、構築物の２つの構成要素が連結されたものを指す。いくつかの実施形態では、抗原ポリペプチドのカルボキシ末端は、フラゲリンポリペプチドのアミノ末端に融合または連結される。他の実施形態では、抗原ポリペプチドのアミノ末端は、フラゲリンポリペプチドのカルボキシ末端に融合または連結される。融合タンパク質には、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれを超える数のフラゲリンポリペプチドと、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれを超える数の抗原ポリペプチドと、が連結されたものが含まれ得る。２つ以上のフラゲリンポリペプチド及び／または２つ以上の抗原ポリペプチドが連結されると、そのような構築物は、「多量体」と称され得る。
融合タンパク質の構成要素はそれぞれ、互いに直接連結するか、またはリンカーを介して連結してよい。例えば、リンカーは、アミノ酸リンカーであり得る。融合タンパク質の構成要素を連結するためにＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンによってコードされるアミノ酸リンカーには、例えば、リジン残基、グルタミン酸残基、セリン残基、及びアルギニン残基からなる群から選択される少なくとも１つのメンバーが含まれ得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、１～３０、１～２５、１～２５、５～１０、５、１５、または５～２０のアミノ酸長である。
他の実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、１つが１つまたは複数の抗原ポリペプチドをコードし、残りがフラゲリンポリペプチドをコードする少なくとも２つの別々のＲＮＡポリヌクレオチドを含む。少なくとも２つのＲＮＡポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子などの担体において共に製剤化してよい。
リポソーム、リポプレックス、及び脂質ナノ粒子
本発明のＲＮＡワクチンは、１つまたは複数のリポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を使用して製剤化することができる。１つの実施形態では、ＲＮＡワクチンの医薬組成物は、リポソームを含む。リポソームは、脂質二重層から主に構成され得る人工的に調製されたベシクルであり、栄養素及び医薬製剤を投与するための送達媒体として使用してよい。リポソームは、サイズが異なり得るものであり、限定はされないが、直径が数百ナノメートルであり得、狭い水性コンパートメントによって分離された一連の同心円状二重層を含み得る多重層ベシクル（ＭＬＶ）、直径が５０ｎｍより小さくあり得る小型単層ベシクル（ＳＵＶ）、及び直径が５０～５００ｎｍであり得る大型単層ベシクル（ＬＵＶ）などである。リポソームの設計には、限定はされないが、不健康組織へのリポソームの付着改善、または限定はされないが、エンドサイトーシスなどの事象の活性化を目的とするオプソニンまたはリガンドの使用が含まれ得る。リポソームは、医薬製剤の送達を改善するために、低ｐＨまたは高ｐＨの部分を含み得る。
リポソームの形成は、物理化学的特徴に依存し得るものであり、こうした特徴は、限定はされないが、封入される医薬製剤及びリポソーム成分、脂質ベシクルが分散する媒体の性質、封入される物質の有効濃度及びその潜在的毒性、ベシクルの適用及び／または送達の間に伴う任意の追加プロセス、意図される用途向けのベシクルの至適化サイズ、多分散、及び有効期間、ならびに安全かつ効率的なリポソーム製品の大規模生産のバッチ間再現性及び可能性などである。
非限定例としては、米国特許公開第ＵＳ２０１３０１７７６３８号、第ＵＳ２０１３０１７７６３７号、第ＵＳ２０１３０１７７６３６号、第ＵＳ２０１３０１７７６３５号、第ＵＳ２０１３０１７７６３４号、第ＵＳ２０１３０１７７６３３号、第ＵＳ２０１３０１８３３７５号、第ＵＳ２０１３０１８３３７３号、及び第ＵＳ２０１３０１８３３７２号に記載の方法、装置、及び機器によって調製され得る合成膜ベシクルなどのリポソームが挙げられ、これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
１つの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、限定はされないが、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）リポソーム、Ｍａｒｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）から供給されるＤｉＬａ２リポソーム、１，２－ジリノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、及びＭＣ３（ＵＳ２０１００３２４１２０（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる））から形成されるものなどのリポソーム、ならびに小分子薬物を送達し得るリポソーム（限定はされないが、Ｊａｎｓｓｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｈｏｒｓｈａｍ，ＰＡ）から供給されるＤＯＸＩＬ（登録商標）など）を含み得る。
１つの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、限定はされないが、インビトロ及びインビボでのオリゴヌクレオチド送達に適することが以前に説明及び示された安定化プラスミド－脂質粒子（ＳＰＬＰ）または安定化核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）の合成から形成されたもの（Ｗｈｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．１９９９ ６：２７１－２８１、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．１９９９ ６：１４３８－１４４７、Ｊｅｆｆｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．２００５ ２２：３６２－３７２、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５ ２：１００２－１００７、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００６ ４４１：１１１－１１４、Ｈｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｏｎｔｒ Ｒｅｌ．２００５ １０７：２７６－２８７、Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１０ ２８：１７２－１７６、Ｊｕｄｇｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００９ １１９：６６１－６７３、ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００８ １９：１２５－１３２、米国特許公開第ＵＳ２０１３０１２２１０４号を参照のこと。これらの文献はすべて、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる）などのリポソームを含み得る。Ｗｈｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．による元々の製造方法は、界面活性剤透析法であり、この方法は、Ｊｅｆｆｓ ｅｔ ａｌ．によって後に改良され、自発的ベシクル形成法と称される。リポソーム製剤は、ポリヌクレオチドに加えて３～４つの脂質成分から構成される。例として、リポソームは、限定はされないが、Ｊｅｆｆｓ ｅｔ ａｌによって記載されるように、コレステロールを５５％、ジステロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）を２０％、ＰＥＧ－Ｓ－ＤＳＧを１０％、及び１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）を１５％含み得る。別の例として、ある特定のリポソーム製剤は、限定はされないが、コレステロールを４８％、ＤＳＰＣを２０％、ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡを２％、及びカチオン性脂質を３０％含み得、この場合、カチオン性脂質は、Ｈｅｙｅｓ ｅｔ ａｌによって記載される１，２－ジステアリルオキシ（ｄｉｓｔｅａｒｌｏｘｙ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、または１，２－ジリノレニルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）であり得る。
いくつかの実施形態では、リポソーム製剤は、コレステロールを約２５．０％～約４０．０％、コレステロールを約３０．０％～約４５．０％、コレステロールを約３５．０％～約５０．０％、及び／またはコレステロールを約４８．５％～約６０％含み得る。好ましい実施形態では、製剤は、２８．５％、３１．５％、３３．５％、３６．５％、３７．０％、３８．５％、３９．０％、及び４３．５％からなる群から選択される割合でコレステロールを含み得る。いくつかの実施形態では、製剤は、ＤＳＰＣを約５．０％～約１０．０％、及び／またはＤＳＰＣを約７．０％～約１５．０％含み得る。
１つの実施形態では、医薬組成物は、免疫原（抗原）または目的とする任意の他のポリペプチドを少なくとも１つコードし得るポリヌクレオチドを送達するために形成され得るリポソームを含み得る。ＲＮＡワクチンは、リポソームによって封入してよく、及び／または水性コアに含めた後にその水性コアをリポソームによって封入してよい（国際公開第ＷＯ２０１２０３１０４６号、第ＷＯ２０１２０３１０４３号、第ＷＯ２０１２０３０９０１号、及び第ＷＯ２０１２００６３７８号、ならびに米国特許公開第ＵＳ２０１３０１８９３５１号、第ＵＳ２０１３０１９５９６９号、及び第ＵＳ２０１３０２０２６８４号を参照のこと。これらの文献のそれぞれの内容は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
別の実施形態では、リポソームは、標的指向型送達を目的として製剤化してよい。非限定例として、リポソームは、肝臓への標的指向型送達を目的として製剤化してよい。標的指向型送達に使用されるリポソームには、限定はされないが、米国特許公開第ＵＳ２０１３０１９５９６７号に記載のリポソーム及びリポソームの調製方法が含まれ得、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
別の実施形態では、免疫原（抗原）をコードし得るポリヌクレオチドは、エマルション粒子が、油のコアと、ポリヌクレオチドと相互作用してその分子をエマルション粒子に固定することができるカチオン性脂質と、を含むカチオン性水中油型エマルションにおいて製剤化してよい（国際公開第ＷＯ２０１２００６３８０号を参照のこと。当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
１つの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、親水相が散在する連続疎水相を含む油中水型エマルションにおいて製剤化してよい。非限定例として、エマルションは、国際公開第ＷＯ２０１０８７７９１号に記載の方法によって製剤化してよく、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
別の実施形態では、脂質製剤は、トランスフェクションを増進し得る脂質であるカチオン性脂質を少なくとも含み得ると共に、脂質部分に連結された親水性の頭部を含む脂質を少なくとも１つ含み得る（国際公開第ＷＯ２０１１０７６８０７号及び米国公開第２０１１０２００５８２号。これらの文献のそれぞれの内容は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。別の実施形態では、免疫原をコードするポリヌクレオチドは、官能基を持たせた脂質二重層の間に架橋を有し得る脂質ベシクルにおいて製剤化してよい（米国公開第２０１２０１７７７２４号を参照のこと。当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
１つの実施形態では、ポリヌクレオチドは、国際特許公開第ＷＯ２０１３０８６５２６号に記載のリポソームにおいて製剤化してよく、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。ＲＮＡワクチンは、国際特許公開第ＷＯ２０１３０８６５２６号に記載の逆ｐＨ勾配及び／または最適化内部緩衝液組成を使用してリポソームに封入してよく、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
１つの実施形態では、ＲＮＡワクチン医薬組成物は、限定はされないが、ＤｉＬａ２リポソーム（Ｍａｒｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）、ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ（登録商標）（Ｍａｒｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）、中性ＤＯＰＣ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）に基づくリポソーム（例えば、卵巣癌へのｓｉＲＮＡの送達であり（Ｌａｎｄｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＆ Ｔｈｅｒａｐｙ ２００６ ５（１２）１７０８－１７１３）、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）、及びヒアルロナン被覆型リポソーム（Ｑｕｉｅｔ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｓｒａｅｌ）などのリポソームにおいて製剤化してよい。
１つの実施形態では、カチオン性脂質は、米国特許出願第２０１３００９０３７２号に記載のものなどの低分子量のカチオン性脂質であり得、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
１つの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、官能基を持たせた脂質二重層の間に架橋を有し得る脂質ベシクルにおいて製剤化してよい。
１つの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、カチオン性脂質を含むリポソームにおいて製剤化してよい。リポソームは、カチオン性脂質における窒素原子とＲＮＡにおけるホスフェートとのモル比率（Ｎ：Ｐ比率）が、１：１～２０：１であり得、このことについては、国際公開第ＷＯ２０１３００６８２５号に記載されており、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。別の実施形態では、リポソームは、２０：１を超えるか、または１：１を下回るＮ：Ｐ比率を有し得る。
１つの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、脂質－ポリカチオン複合体において製剤化してよい。脂質－ポリカチオン複合体の製剤化は、当該技術分野において知られる方法及び／または米国公開第２０１２０１７８７０２号に記載される方法によって達成してよく、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。非限定例として、ポリカチオンには、限定はされないが、ポリリジン、ポリオルニチン、及び／またはポリアルギニン、ならびに国際公開第ＷＯ２０１２０１３３２６号または米国特許公開第ＵＳ２０１３０１４２８１８号に記載のカチオン性ペプチドなどのカチオン性のペプチドまたはポリペプチドが含まれ得、これらの文献はそれぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。別の実施形態では、限定はされないが、コレステロールまたはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）などの非カチオン性脂質をさらに含み得る脂質－ポリカチオン複合体においてＲＮＡワクチンを製剤化してよい。
１つの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、アミノアルコールリピドイドにおいて製剤化してよい。本発明において使用され得るアミノアルコールリピドイドは、米国特許第８，４５０，２９８号に記載の方法によって調製してよく、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
リポソーム製剤は、限定はされないが、カチオン性脂質成分の選択、カチオン性脂質の飽和度、ＰＥＧ化の性質、すべての構成成分の比率、及びサイズなどの生物物理学的なパラメーターによって影響を受け得る。Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．（Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１０ ２８：１７２－１７６（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる））による１つの例では、リポソーム製剤は、５７．１％がカチオン性脂質、７．１％がジパルミトイルホスファチジルコリン、３４．３％がコレステロール、及び１．４％がＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡから構成されるものであった。別の例として、カチオン性脂質の組成を変更すると、さまざまな抗原提示細胞へのｓｉＲＮＡの送達効率が向上する可能性がある（Ｂａｓｈａ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１１ １９：２１８６－２２００（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる））。いくつかの実施形態では、リポソーム製剤は、カチオン性脂質を約３５～約４５％、カチオン性脂質を約４０％～約５０％、カチオン性脂質を約５０％～約６０％、及び／またはカチオン性脂質を約５５％～約６５％含み得る。いくつかの実施形態では、リポソームにおける脂質とｍＲＮＡとの比率は、約５：１～約２０：１、約１０：１～約２５：１、約１５：１～約３０：１、及び／または少なくとも３０：１であり得る。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤におけるＰＥＧの比率を増加または低減してよく、及び／またはＰＥＧ脂質の炭素鎖長をＣ１４からＣ１８に改変することでＬＮＰ製剤の薬物動態及び／または生体内分布を改変してよい。非限定例として、ＬＮＰ製剤は、カチオン性脂質、ＤＳＰＣ、及びコレステロールと比較して、約０．５％～約３．０％、約１．０％～約３．５％、約１．５％～約４．０％、約２．０％～約４．５％、約２．５％～約５．０％、及び／または約３．０％～約６．０％の脂質モル比率でＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ（Ｒ－３－［（ω－メトキシ－ポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル）］－１，２－ジミリスチルオキシプロピル－３－アミン）（本明細書ではＰＥＧ－ＤＯＭＧとも称される）を含み得る。別の実施形態では、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧは、限定はされないが、ＰＥＧ－ＤＳＧ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）、ＰＥＧ－ＤＭＧ（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール）、及び／またはＰＥＧ－ＤＰＧ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）などのＰＥＧ脂質と交換してよい。カチオン性脂質は、限定はされないが、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、Ｃ１２－２００、及びＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡなどの、当該技術分野において知られる任意の脂質から選択してよい。
１つの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、国際公開第ＷＯ２０１２１７０９３０号に記載のものなどの脂質ナノ粒子において製剤化してよく、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
１つの実施形態では、ポリヌクレオチドを含むＲＮＡワクチン製剤は、少なくとも１つの脂質を含み得るナノ粒子である。脂質は、限定はされないが、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ化脂質、及びアミノアルコール脂質から選択してよい。別の態様では、脂質は、限定はされないが、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｄ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、及びアミノアルコール脂質などのカチオン性脂質であり得る。アミノアルコールカチオン性脂質は、米国特許公開第ＵＳ２０１３０１５０６２５号に記載の脂質であり得、及び／またはそこに記載の方法によって調製してよく、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。非限定例として、カチオン性脂質は、２－アミノ－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－２－｛［（９Ｚ，２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］メチル｝プロパン－１－オール（ＵＳ２０１３０１５０６２５に記載の化合物１）、２－アミノ－３－［（９Ｚ）－オクタデカ－９－エン－１－イルオキシ］－２－｛［（９Ｚ）－オクタデカ－９－エン－１－イルオキシ］メチル｝プロパン－１－オール（ＵＳ２０１３０１５０６２５に記載の化合物２）、２－アミノ－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－２－［（オクチルオキシ）メチル］プロパン－１－オール（ＵＳ２０１３０１５０６２５に記載の化合物３）、及び２－（ジメチルアミノ）－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－２－｛［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］メチル｝プロパン－１－オール（ＵＳ２０１３０１５０６２５に記載の化合物４）、または薬学的に許容されるその任意の塩もしくは立体異性体であり得る。
脂質ナノ粒子製剤は、典型的には、脂質、特に、イオン化可能なカチオン性脂質を含むと共に、中性脂質、ステロール、及び例えば、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質などの、粒子の凝集を低減する能力を有する分子をさらに含み、こうしたイオン化可能なカチオン性脂質は、例えば、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、またはジ（（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）である。
１つの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、（ｉ）２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）からなる群から選択される少なくとも１つの脂質と、（ｉｉ）ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、及びＳＭから選択される中性脂質と、（ｉｉｉ）例えば、コレステロールなどのステロールと、（ｉｖ）例えば、ＰＥＧ－ＤＭＧまたはＰＥＧ－ｃＤＭＡなどのＰＥＧ－脂質と、から本質的になるものであり、これらのモル比率は、カチオン性脂質が約２０～６０％、中性脂質が５～２５％、ステロールが２５～５５％、ＰＥＧ－脂質が０．５～１５％である。
１つの実施形態では、製剤は、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質をモルベースで約２５％～約７５％含み、例えば、モルベースで約３５～約６５％、約４５～約６５％、約６０％、約５７．５％、約５０％、または約４０％含む。
１つの実施形態では、製剤は、中性脂質をモルベースで約０．５％～約１５％含み、例えば、モルベースで約３～約１２％、約５～約１０％、または約１５％、約１０％、もしくは約７．５％含む。中性脂質の例には、限定はされないが、ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、及びＳＭが含まれる。１つの実施形態では、製剤は、ステロールをモルベースで約５％～約５０％（例えば、モルベースで約１５～約４５％、約２０～約４０％、約４０％、約３８．５％、約３５％、または約３１％）含む。ステロールの例は、コレステロールである。１つの実施形態では、製剤は、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質をモルベースで約０．５％～約２０％（例えば、モルベースで約０．５～約１０％、約０．５～約５％、約１．５％、約０．５％、約１．５％、約３．５％、または約５％）を含む。１つの実施形態では、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質は、平均分子量が２，０００ＤａのＰＥＧ分子を含む。他の実施形態では、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質は、平均分子量が２，０００未満（例えば、およそ１，５００Ｄａ、およそ１，０００Ｄａ、またはおよそ５００Ｄａ）のＰＥＧ分子を含む。ＰＥＧ修飾脂質の例には、限定はされないが、ＰＥＧ－ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）（本明細書ではＰＥＧ－Ｃ１４またはＣ１４－ＰＥＧとも称される）、ＰＥＧ－ｃＤＭＡが含まれる（Ｒｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１０７，２７６－２８７（２００５）においてさらに議論されており、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
１つの実施形態では、本発明の製剤は、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質を２５～７５％、中性脂質を０．５～１５％、ステロールを５～５０％、ならびにＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を０．５～２０％、モルベースで含む。
１つの実施形態では、本発明の製剤は、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質を３５～６５％、中性脂質を３～１２％、ステロールを１５～４５％、ならびにＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を０．５～１０％、モルベースで含む。
１つの実施形態では、本発明の製剤は、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質を４５～６５％、中性脂質を５～１０％、ステロールを２５～４０％、ならびにＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を０．５～１０％、モルベースで含む。
１つの実施形態では、本発明の製剤は、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質を約６０％、中性脂質を約７．５％、ステロールを約３１％、ならびにＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を約１．５％、モルベースで含む。
１つの実施形態では、本発明の製剤は、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質を約５０％、中性脂質を約１０％、ステロールを約３８．５％、ならびにＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を約１．５％、モルベースで含む。
１つの実施形態では、本発明の製剤は、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質を約５０％、中性脂質を約１０％、ステロールを約３５％、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を約４．５％または約５％、ならびに標的指向化脂質を約０．５％、モルベースで含む。
１つの実施形態では、本発明の製剤は、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質を約４０％、中性脂質を約１５％、ステロールを約４０％、ならびにＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を約５％、モルベースで含む。
１つの実施形態では、本発明の製剤は、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質を約５７．２％、中性脂質を約７．１％、ステロールを約３４．３％、ならびにＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を約１．４％、モルベースで含む。
１つの実施形態では、本発明の製剤は、ＰＥＧ脂質から選択されるカチオン性脂質としてＰＥＧ－ｃＤＭＡ（ＰＥＧ－ｃＤＭＡについては、Ｒｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１０７，２７６－２８７（２００５）においてさらに議論されており、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を約５７．５％、中性脂質を約７．５％、ステロールを約３１．５％、及びＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を約３．５％、モルベースで含む。
好ましい実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質が約２０～７０％：中性脂質が５～４５％：コレステロールが２０～５５％：ＰＥＧ修飾脂質が０．５～１５％というモル比率の脂質混合物から本質的になり、より好ましくは、カチオン性脂質が約２０～６０％：中性脂質が５～２５％：コレステロールが２５～５５％：ＰＥＧ修飾脂質が０．５～１５％というモル比率の脂質混合物から本質的になる。
特定の実施形態では、脂質のモル比率は、約５０／１０／３８．５／１．５（カチオン性脂質／中性脂質（例えば、ＤＳＰＣ）／コレステロール／ＰＥＧ修飾脂質（例えば、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＳＧ、もしくはＰＥＧ－ＤＰＧ）のモル％）、５７．２／７．１１３４．３／１．４（カチオン性脂質／中性脂質（例えば、ＤＰＰＣ）／コレステロール／ＰＥＧ修飾脂質（例えば、ＰＥＧ－ｃＤＭＡ）のモル％）、４０／１５／４０／５（カチオン性脂質／中性脂質（例えば、ＤＳＰＣ）／コレステロール／ＰＥＧ修飾脂質（例えば、ＰＥＧ－ＤＭＧ）のモル％）、５０／１０／３５／４．５／０．５（カチオン性脂質／中性脂質（例えば、ＤＳＰＣ）／コレステロール／ＰＥＧ修飾脂質（例えば、ＰＥＧ－ＤＳＧ）のモル％）、５０／１０／３５／５（カチオン性脂質／中性脂質（例えば、ＤＳＰＣ）／コレステロール／ＰＥＧ修飾脂質（例えば、ＰＥＧ－ＤＭＧ））、４０／１０／４０／１０（カチオン性脂質／中性脂質（例えば、ＤＳＰＣ）／コレステロール／ＰＥＧ修飾脂質（例えば、ＰＥＧ－ＤＭＧもしくはＰＥＧ－ｃＤＭＡ）のモル％）、３５／１５／４０／１０（カチオン性脂質／中性脂質（例えば、ＤＳＰＣ）／コレステロール／ＰＥＧ修飾脂質（例えば、ＰＥＧ－ＤＭＧもしくはＰＥＧ－ｃＤＭＡ）のモル％）、または５２／１３／３０／５（カチオン性脂質／中性脂質（例えば、ＤＳＰＣ）／コレステロール／ＰＥＧ修飾脂質（例えば、ＰＥＧ－ＤＭＧもしくはＰＥＧ－ｃＤＭＡ）のモル％）である。
脂質ナノ粒子組成物及びその調製方法の例は、例えば、Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８：１７２－１７６、Ｊａｙａｒａｍａ ｅｔ ａｌ．（２０１２），Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，５１：８５２９－８５３３、及びＭａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２１，１５７０－１５７８（これらの文献のそれぞれの内容は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されている。
１つの実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質、ＰＥＧ脂質、及び構造脂質を含み得、非カチオン性脂質を任意選択で含み得る。非限定例として、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質を約４０～６０％、非カチオン性脂質を約５～１５％、ＰＥＧ脂質を約１～２％、及び構造脂質を約３０～５０％含み得る。別の非限定例として、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質を約５０％、非カチオン性脂質を約１０％、ＰＥＧ脂質を約１．５％、及び構造脂質を約３８．５％含み得る。さらに別の非限定例として、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質を約５５％、非カチオン性脂質を約１０％、ＰＥＧ脂質を約２．５％、及び構造脂質を約３２．５％含み得る。１つの実施形態では、カチオン性脂質は、限定はされないが、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、及びＬ３１９などの、本明細書記載のカチオン性脂質のいずれかであり得る。
１つの実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子製剤は、４つの構成成分を含む脂質ナノ粒子であり得る。脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、ＰＥＧ脂質、及び構造脂質を含み得る。非限定例として、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質を約４０～６０％、非カチオン性脂質を約５～１５％、ＰＥＧ脂質を約１～２％、及び構造脂質を約３０～５０％含み得る。別の非限定例として、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質を約５０％、非カチオン性脂質を約１０％、ＰＥＧ脂質を約１．５％、及び構造脂質を約３８．５％含み得る。さらに別の非限定例として、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質を約５５％、非カチオン性脂質を約１０％、ＰＥＧ脂質を約２．５％、及び構造脂質を約３２．５％含み得る。１つの実施形態では、カチオン性脂質は、限定はされないが、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、及びＬ３１９などの、本明細書記載のカチオン性脂質のいずれかであり得る。
１つの実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、ＰＥＧ脂質、及び構造脂質を含み得る。非限定例として、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質としてＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡを約５０％、非カチオン性脂質としてＤＳＰＣを約１０％、ＰＥＧ脂質としてＰＥＧ－ＤＯＭＧを約１．５％、及び構造脂質コレステロールを約３８．５％含む。非限定例として、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質としてＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡを約５０％、非カチオン性脂質としてＤＳＰＣを約１０％、ＰＥＧ脂質としてＰＥＧ－ＤＯＭＧを約１．５％、及び構造脂質としてコレステロールを約３８．５％含む。非限定例として、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質としてＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡを約５０％、非カチオン性脂質としてＤＳＰＣを約１０％、ＰＥＧ脂質としてＰＥＧ－ＤＭＧを約１．５％、及び構造脂質としてコレステロールを約３８．５％含む。さらに別の非限定例として、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質としてＬ３１９を約５５％、非カチオン性脂質としてＤＳＰＣを約１０％、ＰＥＧ脂質としてＰＥＧ－ＤＭＧを約２．５％、及び構造脂質としてコレステロールを約３２．５％含む。
１つの実施形態では、カチオン性脂質は、限定はされないが、国際公開第ＷＯ２０１２０４０１８４号、第ＷＯ２０１１１５３１２０号、第ＷＯ２０１１１４９７３３号、第ＷＯ２０１１０９０９６５号、第ＷＯ２０１１０４３９１３号、第ＷＯ２０１１０２２４６０号、第ＷＯ２０１２０６１２５９号、第ＷＯ２０１２０５４３６５号、第ＷＯ２０１２０４４６３８号、第ＷＯ２０１００８０７２４号、第ＷＯ２０１０２１８６５号、第ＷＯ２００８１０３２７６号、第ＷＯ２０１３０８６３７３号、及び第ＷＯ２０１３０８６３５４号、米国特許第７，８９３，３０２号、第７，４０４，９６９号、第８，２８３，３３３号、及び第８，４６６，１２２号、ならびに米国特許公開第ＵＳ２０１０００３６１１５号、第ＵＳ２０１２０２０２８７１号、第ＵＳ２０１３００６４８９４号、第ＵＳ２０１３０１２９７８５号、第ＵＳ２０１３０１５０６２５号、第ＵＳ２０１３０１７８５４１号、及び第ＵＳ２０１３０２２５８３６号に記載のカチオン性脂質から選択してよく、これらの文献のそれぞれの内容は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。別の実施形態では、カチオン性脂質は、限定はされないが、限定はされないが、国際公開第第ＷＯ２０１２０４０１８４号、第ＷＯ２０１１１５３１２０号、第ＷＯ２０１１１４９７３３号、第ＷＯ２０１１０９０９６５号、第ＷＯ２０１１０４３９１３号、第ＷＯ２０１１０２２４６０号、第ＷＯ２０１２０６１２５９号、第ＷＯ２０１２０５４３６５号、第ＷＯ２０１２０４４６３８号、及び第ＷＯ２０１３１１６１２６号、または米国特許公開第ＵＳ２０１３０１７８５４１号及び第ＵＳ２０１３０２２５８３６号に記載の式Ａから選択してよく、これらの文献のそれぞれの内容は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。さらに別の実施形態では、カチオン性脂質は、限定はされないが、国際公開第ＷＯ２００８１０３２７６号に記載の式ＣＬＩ－ＣＬＸＸＩＸ、米国特許第７，８９３，３０２号に記載の式ＣＬＩ－ＣＬＸＸＩＸ、米国特許第７，４０４，９６９号に記載の式ＣＬＩ－ＣＬＸＸＸＸＩＩ、及び米国特許公開第ＵＳ２０１０００３６１１５号に記載の式Ｉ－ＶＩ、米国特許公開第ＵＳ２０１３０１２３３３８号に記載の式Ｉから選択してよく、これらの文献はそれぞれ、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。非限定例として、カチオン性脂質は、（２０Ｚ，２３Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－２０，２３－ジエン－１０－アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメミルヘキサコサ（ｄｉｍｅｍｙｌｈｅｘａｃｏｓａ）－１７，２０－ジエン－９－アミン、（１Ｚ，１９Ｚ）－Ｎ５Ｎ－ジメチルペンタコサ－ｌ６，１９－ジエン－８－アミン、（１３Ｚ，１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルドコサ－１３，１６－ジエン－５－アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘンイコサ－１２，１５－ジエン－４－アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリコサ－１４，１７－ジエン－６－アミン、（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルテトラコサ－１５，１８－ジエン－７－アミン、（１８Ｚ，２１Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサ－１８，２１－ジエン－１０－アミン、（１５Ζ，１８Ζ）－Ν，Ν－ジメチルテトラコサ－１５，１８－ジエン－５－アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリコサ－１４，１７－ジエン－４－アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメイヒルオクタコサ（ｄｉｍｅｉｈｙｌｏｃｔａｃｏｓａ）－１９，２２－ジエン－９－アミン、（１８Ｚ，２１Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサ－１８，２１－ジエン－８－アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘキサコサ－１７，２０－ジエン－７－アミン、（１６Ｚ，１９Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルペンタコサ－１６，１９－ジエン－６－アミン、（２２Ｚ，２５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘントリアコンタ－２２，２５－ジエン－１０－アミン、（２１Ｚ，２４Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリアコンタ－２１，２４－ジエン－９－アミン、（１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサ（ｄｉｍｅｔｙｌｈｅｐｔａｃｏｓ）－１８－エン－１０－アミン、（１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘキサコサ－１７－エン－９－アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルオクタコサ－１９，２２－ジエン－７－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサン－１０－アミン、（２０Ｚ，２３Ｚ）－Ｎ－エチル－Ｎ－メチルノナコサ－２０，２３－ジエン－ｌ０－アミン、１－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－１－ノニルイコサ－１１，１４－ジエン－１－イル］ピロリジン、（２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサ－２０－エン－ｌ０－アミン、（１５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエプタコサ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｅｐｔａｃｏｓ）－１５－エン－ｌ０－アミン、（１４Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－１４－エン－ｌ０－アミン、（１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－１７－エン－ｌ０－アミン、（２４Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリトリアコンタ－２４－エン－ｌ０－アミン、（２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－２０－エン－ｌ０－アミン、（２２Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘントリアコンタ－２２－エン－ｌ０－アミン、（１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルペンタコサ－１６－エン－８－アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２－ノニルヘンイコサ－１２，１５－ジエン－１－アミン、（１３Ｚ，１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－ノニルドコサ－ｌ３，１６－ジエン－１－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（ｌＳ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］エプタデカン（ｅｐｔａｄｅｃａｎ）－８－アミン、１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－ヘキシルシクロプロピル］－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナデカン－１０－アミン、Ν，Ν－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ノナデカン－１０－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２１－［（ｌＳ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘンイコサン－ｌ０－アミン、Ν，Ν－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｓ）－２－｛［（ｌＲ，２Ｒ）－２－ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］ノナデカン－１０－アミン、Ν，Ν－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘキサデカン－８－アミン、Ν，Ν－ジメチル－［（ｌＲ，２Ｓ）－２－ウンデシルシクロプロピル］テトラデカン－５－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－｛７－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘプチル｝ドデカン－１－アミン、１－［（１Ｒ，２Ｓ）－２－ヘプチルシクロプロピル］－Ν，Ν－ジメチルオクタデカン－９－アミン、１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－デシルシクロプロピル］－Ｎ，Ｎ－ジメチルペンタデカン－６－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（ｌＳ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ペンタデカン－８－アミン、Ｒ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、Ｓ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、１－｛２－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－１－［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝ピロリジン、（２Ｓ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－３－［（５Ｚ）－オクタ－５－エン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、１－｛２－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－１－［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝アゼチジン、（２Ｓ）－１－（ヘキシルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－（ヘプチルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、Ν，Ν－ジメチル－１－（ノニルオキシ）－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、Ν，Ν－ジメチル－１－［（９Ｚ）－オクタデカ－９－エン－１－イルオキシ］－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－６，９，１２－トリエン－１－イルオキシ］－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－イコサ－１１，１４－ジエン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（ペンチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－（ヘキシルオキシ）－３－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－イコサ－１１，１４－ジエン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－２－アミン、１－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－イコサ－１１，１４－ジエン－１－イルオキシ］－Ν，Ν－ジメチル－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、１－［（１３Ｚ，１６Ｚ）－ドコサ－ｌ３，１６－ジエン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－［（１３Ｚ，１６Ｚ）－ドコサ－１３，１６－ジエン－１－イルオキシ］－３－（ヘキシルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－２－アミン、（２Ｓ）－１－［（１３Ｚ）－ドコサ－１３－エン－１－イルオキシ］－３－（ヘキシルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－２－アミン、１－［（１３Ｚ）－ドコサ－１３－エン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、１－［（９Ｚ）－ヘキサデカ－９－エン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、（２Ｒ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｈ（１－メトイルオクチル（ｍｅｔｏｙｌｏｃｔｙｌ））オキシ］－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、（２Ｒ）－１－［（３，７－ジメチルオクチル）オキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－（オクチルオキシ）－３－（｛８－［（１Ｓ，２Ｓ）－２－｛［（１Ｒ，２Ｒ）－２－ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］オクチル｝オキシ）プロパン－２－アミン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－｛［８－（２－オクチルシクロプロピル）オクチル］オキシ｝－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン、及び（１１Ｅ，２０Ｚ，２３Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－１１，２０，２－トリエン－１０－アミン、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体から選択してよい。
１つの実施形態では、脂質は、国際公開第ＷＯ２０１２１７０８８９号に記載のものなどの切断可能な脂質であり得、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
別の実施形態では、脂質は、限定はされないが、米国特許出願第ＵＳ２０１３００６４８９４号に記載の式（Ｉ）などのカチオン性脂質であり得、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
１つの実施形態では、カチオン性脂質は、当該技術分野において知られる方法及び／または国際公開第ＷＯ２０１２０４０１８４号、第ＷＯ２０１１１５３１２０号、第ＷＯ２０１１１４９７３３号、第ＷＯ２０１１０９０９６５号、第ＷＯ２０１１０４３９１３号、第ＷＯ２０１１０２２４６０号、第ＷＯ２０１２０６１２５９号、第ＷＯ２０１２０５４３６５号、第ＷＯ２０１２０４４６３８号、第ＷＯ２０１００８０７２４号、第ＷＯ２０１０２１８６５号、第ＷＯ２０１３０８６３７３号、及び第ＷＯ２０１３０８６３５４号に記載の方法によって合成してよく、これらの文献のそれぞれの内容は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
別の実施形態では、カチオン性脂質は、トリアルキルカチオン性脂質であり得る。トリアルキルカチオン性脂質、ならびにトリアルキルカチオン性脂質の調製方法及び使用方法の例は、限定はされないが、国際特許公開第ＷＯ２０１３１２６８０３号に記載されており、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
１つの実施形態では、ＲＮＡワクチンのＬＮＰ製剤は、３％の脂質モル比率でＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧを含み得る。別の実施形態では、ＲＮＡワクチンのＬＮＰ製剤は、１．５％の脂質モル比率でＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧを含み得る。
１つの実施形態では、ＲＮＡワクチンの医薬組成物は、国際公開第ＷＯ２０１２０９９７５５号に記載のＰＥＧ化脂質を少なくとも１つ含み得、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
１つの実施形態では、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ－ＤＭＧ２０００（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００）を含み得る。１つの実施形態では、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ－ＤＭＧ２０００、当該技術分野において知られるカチオン性脂質、及び少なくとも１つの他の構成成分を含み得る。別の実施形態では、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ－ＤＭＧ２０００、当該技術分野において知られるカチオン性脂質、ＤＳＰＣ、及びコレステロールを含み得る。非限定例として、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ－ＤＭＧ２０００、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、及びコレステロールを含み得る。別の非限定例として、ＬＮＰ製剤は、ＰＥＧ－ＤＭＧ２０００、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、及びコレステロールを２：４０：１０：４８のモル比率で含み得る（例えば、Ｇｅａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｏｎｖｉｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｅｌｆ－ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ＲＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ，ＰＮＡＳ ２０１２、ＰＭＩＤ：２２９０８２９４を参照のこと。当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
１つの実施形態では、ＬＮＰ製剤は、国際公開第ＷＯ２０１１１２７２５５号または第ＷＯ２００８１０３２７６号に記載の方法によって製剤化してよく、これらの文献のそれぞれの内容は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。非限定例として、本明細書に記載のＲＮＡワクチンは、ＷＯ２０１１１２７２５５及び／またはＷＯ２００８１０３２７６に記載のＬＮＰ製剤に封入してよく、これらの文献はそれぞれ、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
１つの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡワクチンは、米国公開第ＵＳ２０１２０２０７８４５号に記載の非経口経路によって送達されることになるナノ粒子において製剤化してよく、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
１つの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、米国特許公開第ＵＳ２０１３０１５６８４５号、または国際公開第ＷＯ２０１３０９３６４８号もしくは第ＷＯ２０１２０２４５２６号に記載の方法によって調製される脂質ナノ粒子において製剤化してよく、これらの文献はそれぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、米国特許公開第ＵＳ２０１３０１６４４００号に記載のシステム及び／または方法による無菌環境において調製してよく、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
１つの実施形態では、ＬＮＰ製剤は、米国特許第８，４９２，３５９号に記載の核酸－脂質粒子などのナノ粒子において製剤化してよく、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。非限定例として、脂質粒子は、１つまたは複数の活性剤または治療剤と、粒子に存在する総脂質の約５０モル％～約８５モル％を構成する１つまたは複数のカチオン性脂質と、粒子に存在する総脂質の約１３モル％～約４９．５モル％を構成する１つまたは複数の非カチオン性脂質と、粒子に存在する総脂質の約０．５モル％～約２モル％を構成し、粒子の凝集を抑制する１つまたは複数の複合化脂質と、を含み得る。ナノ粒子における核酸は、本明細書に記載のポリヌクレオチド及び／または当該技術分野において知られるポリヌクレオチドであり得る。
１つの実施形態では、ＬＮＰ製剤は、国際公開第ＷＯ２０１１１２７２５５号または第ＷＯ２００８１０３２７６号に記載の方法によって製剤化してよく、これらの文献のそれぞれの内容は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。非限定例として、本明細書に記載の修飾ＲＮＡは、ＷＯ２０１１１２７２５５及び／またはＷＯ２００８１０３２７６に記載のＬＮＰ製剤に封入してよく、これらの文献のそれぞれの内容は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
１つの実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰ製剤は、ポリカチオン性組成物を含み得る。非限定例として、ポリカチオン性組成物は、米国特許公開第ＵＳ２００５０２２２０６４号に記載の式１～６０から選択してよく、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。別の実施形態では、ポリカチオン性組成物を含むＬＮＰ製剤は、本明細書に記載の修飾ＲＮＡのインビボ及び／またはインビトロでの送達に使用してよい。
１つの実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰ製剤は、透過性エンハンサー分子をさらに含み得る。透過性エンハンサー分子の例は、限定はされないが、米国特許公開第ＵＳ２００５０２２２０６４号に記載されており、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
１つの実施形態では、ＲＮＡワクチン医薬組成物は、限定はされないが、ＤｉＬａ２リポソーム（Ｍａｒｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）、ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ（登録商標）（Ｍａｒｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）、中性ＤＯＰＣ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）に基づくリポソーム（例えば、卵巣癌へのｓｉＲＮＡの送達であり（Ｌａｎｄｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＆ Ｔｈｅｒａｐｙ ２００６ ５（１２）１７０８－１７１３）、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）、及びヒアルロナン被覆型リポソーム（Ｑｕｉｅｔ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｓｒａｅｌ）などのリポソームにおいて製剤化してよい。
１つの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、米国公開第ＵＳ２０１２０６０２９３号に記載の凍結乾燥されたゲル相リポソーム組成物において製剤化してよく、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
ナノ粒子製剤は、ホスフェート複合体を含み得る。ホスフェート複合体は、インビボの循環時間を増進、及び／またはナノ粒子の標的指向型送達を増進し得る。本発明で使用するためのホスフェート複合体は、国際出願第ＷＯ２０１３０３３４３８号または米国特許公開第ＵＳ２０１３０１９６９４８号に記載の方法によって調製してよく、これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。非限定例として、ホスフェート複合体は、国際出願第ＷＯ２０１３０３３４３８号に記載の式のいずれか１つの化合物を含み得、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
ナノ粒子製剤は、ポリマー複合体を含み得る。ポリマー複合体は、水溶性複合体であり得る。ポリマー複合体は、米国特許出願第２０１３００５９３６０号に記載の構造を有し得、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。１つの態様では、本発明のポリヌクレオチドとのポリマー複合体は、米国特許出願第２０１３００７２７０９号に記載の方法及び／またはセグメント化ポリマー試薬を使用して調製してよく、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。別の態様では、ポリマー複合体は、限定はされないが、米国特許公開第ＵＳ２０１３０１９６９４８号に記載のポリマー複合体などの、環部分を含むペンダント側鎖を有するものであり得、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
ナノ粒子製剤は、対象における本発明のナノ粒子の送達を増進する複合体を含み得る。さらに、複合体は、対象におけるナノ粒子の食作用性のクリアランスを抑制し得る。１つの態様では、複合体は、ヒトの膜タンパク質であるＣＤ４７から設計された「自己」ペプチドであり得る（例えば、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３ ３３９，９７１－９７５）によって記載される「自己」粒子であり、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。マクロファージ媒介性のナノ粒子のクリアランスが自己ペプチドによって遅延し、これによってナノ粒子の送達が増進することがＲｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．によって示された。別の態様では、複合体は、膜タンパク質であるＣＤ４７であり得る（例えば、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３ ３３９，９７１－９７５を参照のこと。当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。スクランブル型ペプチド及びＰＥＧ被覆型ナノ粒子と比較して、ＣＤ４７が、「自己」ペプチドと同様に、対象における粒子の循環比率を増加させることができることがＲｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．によって示された。
１つの実施形態では、本発明のＲＮＡワクチンは、対象における本発明のナノ粒子の送達を増進する複合体を含むナノ粒子において製剤化される。複合体は、ＣＤ４７膜であり得るか、または複合体は、前述の「自己」ペプチドなどの、ＣＤ４７膜タンパク質に由来し得るものである。別の態様では、ナノ粒子は、ＰＥＧ、及びＣＤ４７の複合体またはその誘導体を含み得る。さらに別の態様では、ナノ粒子は、上記の「自己」ペプチドと膜タンパク質であるＣＤ４７との両方を含み得る。
別の態様では、「自己」ペプチド及び／またはＣＤ４７タンパク質は、本発明のＲＮＡワクチンの送達を対象として本明細書に記載されるように、ウイルス様粒子または偽ウイルス粒子に複合化してよい。
別の実施形態では、ＲＮＡワクチン医薬組成物は、本発明のポリヌクレオチドと、分解可能な結合を有し得る複合体と、を含む。複合体の例は、限定はされないが、イオン化可能な水素原子を含む芳香族部分、スペーサー部分、及び水溶性ポリマーを含む。非限定例として、分解可能な結合を有する複合体を含む医薬組成物、及びそのような医薬組成物の送達方法は、米国特許公開第ＵＳ２０１３０１８４４４３号に記載されており、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
ナノ粒子製剤は、糖質担体及びＲＮＡワクチンを含む糖質ナノ粒子であり得る。非限定例として、糖質担体には、限定はされないが、無水物修飾型フィトグリコーゲンまたはグリコーゲン型材料、フォトグリコーゲン（ｐｈｔｏｇｌｙｃｏｇｅｎ）オクテニルスクシネート、フィトグリコーゲンベータ－デキストリン、無水物修飾型フィトグリコーゲンベータ－デキストリンが含まれ得る（例えば、国際公開第ＷＯ２０１２１０９１２１を参照のこと。当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
本発明のナノ粒子製剤は、粒子の送達を改善するために界面活性剤またはポリマーで被覆してよい。１つの実施形態では、ナノ粒子は、限定はされないが、ＰＥＧコーティング、及び／または中性表面電荷を有するコーティングなどの親水性コーティングで被覆してよい。親水性コーティングは、限定はされないが、中枢神経系内での、ＲＮＡワクチンの送達などの、より大きなペイロードを有するナノ粒子の送達に役立ち得る。非限定例として、親水性コーティングを含むナノ粒子、及びそのようなナノ粒子の調製方法は、米国特許公開第ＵＳ２０１３０１８３２４４号に記載されており、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
１つの実施形態では、本発明の脂質ナノ粒子は、親水性ポリマー粒子であり得る。親水性ポリマー粒子、及び親水性ポリマー粒子の調製方法の例は、限定はされないが、米国特許公開第ＵＳ２０１３０２１０９９１号に記載されており、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
別の実施形態では、本発明の脂質ナノ粒子は、疎水性ポリマー粒子であり得る。
脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質を、迅速排出型脂質ナノ粒子（ｒｅＬＮＰ）として知られる生分解性のカチオン性脂質と交換することによって改良してよい。限定はされないが、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、及びＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡなどのイオン化可能なカチオン性脂質は、時間と共に血漿及び組織に蓄積することが示されており、潜在的な毒性源となり得る。迅速排出型脂質は迅速に代謝されるため、ラットにおいて脂質ナノ粒子の忍容性及び治療指数を１ｍｇ／ｋｇ用量から１０ｍｇ／ｋｇ用量へと１桁改善することができる。酵素的に分解したエステル結合を含めることで、ｒｅＬＮＰ製剤の活性を依然として維持しつつ、カチオン性成分の分解及び代謝のプロファイルを改善することができる。エステル結合は、脂質鎖中に内部的に位置し得るか、または脂質鎖の終端に末端的に位置し得る。内部エステル結合によって、脂質鎖における任意の炭素を置換してよい。
１つの実施形態では、内部エステル結合は、飽和炭素のどちら側に位置してもよい。
１つの実施形態では、免疫応答は、ナノ種、ポリマー、及び免疫原を含み得る脂質ナノ粒子を送達することによって誘発してよい（米国公開第２０１２０１８９７００号及び国際公開第ＷＯ２０１２０９９８０５号（これらの文献はそれぞれ、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる））。ポリマーは、ナノ種を封入し得るか、またはナノ種を部分的に封入し得る。免疫原は、本明細書に記載の組換えタンパク質、修飾ＲＮＡ、及び／またはポリヌクレオチドであり得る。１つの実施形態では、脂質ナノ粒子は、限定はされないが、病原体などに対するワクチンにおける使用を目的として製剤化してよい。
脂質ナノ粒子は、脂質ナノ粒子が粘膜バリアを透過し得るように粒子の表面特性を操作改変してよい。粘液は、限定はされないが、口腔（例えば、頬側及び食道の膜ならびに扁桃組織）、眼、胃腸（例えば、胃、小腸、大腸、結腸、直腸）、鼻、呼吸器（例えば、鼻、咽頭、気管、及び気管支の膜）、性器（例えば、腟、子宮頸部、及び尿道の膜）などの粘膜組織に位置する。薬物封入効率を高め、多様な薬物を持続的に送達する能力を付与するには１０～２００ｎｍより大きなナノ粒子が好ましいが、こうしたナノ粒子は、粘膜バリアを介して迅速に拡散するには大きすぎると考えられてきた。粘液は、連続的に分泌、排出、廃棄、または分解及び再利用されるため、捕捉される粒子の大部分は、数秒以内または数時間以内に粘膜組織から排除され得る。低分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で密に被覆された大型ポリマーナノ粒子（直径２００ｎｍ～５００ｎｍ）が粘液を介して拡散する効率は、同一粒子が水中を拡散する効率と比較して４～６倍低いものにすぎなかった（Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ２００７ １０４（５）：１４８２－４８７、Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２００９ ６１（２）：１５８－１７１（これらの文献はそれぞれ、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる））。透過速度及び／または蛍光顕微鏡技術を使用してナノ粒子の輸送を決定してよく、こうした技術には、限定はされないが、蛍光退色後回復測定（ＦＲＡＰ）及び高解像度多粒子追跡（ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｔｒａｃｋｉｎｇ）（ＭＰＴ）が含まれる。非限定例として、粘膜バリアを透過することができる組成物は、米国特許第８，２４１，６７０号または国際特許公開第ＷＯ２０１３１１００２８号に記載されるように調製してよく、これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
粘液を透過するように操作された脂質ナノ粒子は、ポリマー材料（すなわち、ポリマーコア）及び／またはポリマー－ビタミン複合体及び／またはトリブロックコポリマーを含み得る。ポリマー材料には、限定はされないが、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリウレア、ポリカーボネート、ポリ（スチレン）、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチエンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｅｎｅｉｍｉｎｅ）、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリル、及びポリアリレートが含まれ得る。ポリマー材料は、生分解性及び／または生体適合性であり得る。生体適合性ポリマーの例は、限定はされないが、国際特許公開第ＷＯ２０１３１１６８０４号に記載されており、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。ポリマー材料に対して、照射処理を追加で実施してよい。非限定例として、ポリマー材料に対して、ガンマ線照射処理を実施してよい（例えば、国際出願第ＷＯ２０１２８２１６５号を参照のこと。当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。特定のポリマーの例には、限定はされないが、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、エチレン酢酸ビニルポリマー（ＥＶＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（Ｌ－乳酸）（ＰＬＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ－乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＬＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド）（ＰＤＬＡ）、ポリ（Ｌ－ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－カプロラクトン）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－カプロラクトン－コ－グリコリド）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－ＰＥＯ－コ－Ｄ，Ｌ－ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－ＰＰＯ－コ－Ｄ，Ｌ－ラクチド）、ポリアルキルシアノアクラレート（ｐｏｌｙａｌｋｙｌ ｃｙａｎｏａｃｒａｌａｔｅ）、ポリウレタン、ポリ－Ｌ－リジン（ＰＬＬ）、ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ）、ポリエチレングリコール、ポリ－Ｌ－グルタミン酸、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、ポリ（エステルアミド）、ポリアミド、ポリ（エステルエーテル）、ポリカーボネート、ポリアルキレン（ポリエチレン及びポリプロピレンなど）、ポリアルキレングリコール（ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）など）、ポリアルキレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリアルキレンテレフタレート（ポリ（エチレンテレフタレート）など）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル（ポリ（酢酸ビニル）など）、ポリビニルハロゲン化物（ポリ（塩化ビニル）（ＰＶＣ）など）、ポリビニルピロリドン、ポリシロキサン、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリウレタン、誘導体化セルロース（アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースなど）、アクリル酸のポリマー（ポリ（メチル（メタ）アクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリ（エチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ヘキシル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソデシル（メタ）アクリレート）、ポリ（ラウリル（メタ）アクリレート）、ポリ（フェニル（メタ）アクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）など）ならびにそのコポリマー及びその混合物、ポリジオキサノン及びそのコポリマー、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリプロピレンフマレート、ポリオキシメチレン、ポロクサマー、ポリ（オルト）エステル、ポリ（ブタン酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド－コ－カプロラクトン）、ＰＥＧ－ＰＬＧＡ－ＰＥＧ及びトリメチレンカーボネート、ポリビニルピロリドンが含まれる。脂質ナノ粒子は、限定はされないが、ブロックコポリマー（国際公開第ＷＯ２０１３０１２４７６号に記載の分岐型ポリエーテル－ポリアミドブロックコポリマーなど。当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）、ならびに（ポリ（エチレングリコール））－（ポリ（プロピレンオキシド））－（ポリ（エチレングリコール））トリブロックコポリマー（例えば、米国公開第２０１２０１２１７１８号及び米国公開第２０１００００３３３７号ならびに米国特許第８，２６３，６６５号を参照のこと。これらの文献はそれぞれ、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる）などのコポリマーで被覆またはそれと会合させてよい。コポリマーは、一般に安全と見なされる（ＧＲＡＳ）ポリマーであり得、脂質ナノ粒子の形成は、新たな化学物質が創出されない様式によるものであり得る。例えば、脂質ナノ粒子は、新たな化学物質の形成を伴わず、依然としてヒトの粘液を迅速に透過することができるポロクサマーコーティングＰＬＧＡナノ粒子（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１１ ５０：２５９７－２６００（当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる））を含み得る。ヒトの粘液を透過することができるナノ粒子を得るための拡張可能な方法は、限定はされないが、Ｘｕ ｅｔ ａｌによって記載されている（例えば、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ２０１３，１７０（２）：２７９－８６を参照のこと。当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
ポリマー－ビタミン複合体のビタミンは、ビタミンＥであり得る。複合体のビタミン部分は、他の適した成分で置換してよく、こうした他の適した成分は、限定はされないが、ビタミンＡ、ビタミンＥ、他のビタミン、コレステロール、疎水性部分、または他の界面活性剤の疎水性成分（例えば、ステロール鎖、脂肪酸、炭化水素鎖、及びアルキレンオキシド鎖）などである。
粘液を透過するように操作された脂質ナノ粒子は、表面改変剤を含み得、こうした表面改変剤は、限定はされないが、ポリヌクレオチド、アニオン性タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）、界面活性剤（例えば、カチオン性界面活性剤（例えば、ジメチルジオクタデシル－アンモニウムブロミドなど））、糖または糖誘導体（例えば、シクロデキストリン）、核酸、ポリマー（例えば、ヘパリン、ポリエチレングリコール、及びポロクサマー）、粘液溶解剤（例えば、Ｎ－アセチルシステイン、ヨモギ、ブロメライン、パパイン、クサギ属、アセチルシステイン、ブロムヘキシン、カルボシステイン、エプラジノン、メスナ、アンブロキソール、ソブレロール、ドミオドール、レトステイン、ステプロニン、チオプロニン、ゲルゾリン、サイモシンβ４ドルナーゼアルファ、ネルテネキシン、エルドステイン）、ならびにさまざまなＤＮａｓｅｓ（ｒｈＤＮａｓｅを含む）などである。表面改変剤は、粒子表面に包埋もしくは絡み合わせるか、または（例えば、コーティング、吸着、共有結合、もしくは他のプロセスによって）脂質ナノ粒子の表面に配置してよい（例えば、米国公開第２０１００２１５５８０号及び米国公開第２００８０１６６４１４号ならびにＵＳ２０１３０１６４３４３を参照のこと。これらの文献のそれぞれの内容は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
１つの実施形態では、粘液透過脂質ナノ粒子は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを少なくとも１つ含み得る。ポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子に封入し、及び／または粒子表面に配置してよい。ポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子に共有結合でカップリングさせてよい。粘液透過脂質ナノ粒子の製剤は、複数のナノ粒子を含み得る。さらに、粘液と相互作用し、周囲の粘液の構造特性及び／または接着特性を改変することで粘膜付着を低減し得、これによって粘膜組織への粘液透過脂質ナノ粒子の送達を増加させ得る粒子を製剤に含めてよい。
別の実施形態では、粘液透過脂質ナノ粒子は、粘膜透過増進コーティングを含む低浸透圧性製剤であり得る。製剤は、それが送達される上皮に対して低浸透圧性であり得る。低浸透圧性製剤の例は、限定はされないが、国際特許公開第ＷＯ２０１３１１００２８号において見つけることができ、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
１つの実施形態では、粘膜バリアを介する送達を増進するために、ＲＮＡワクチン製剤は、低浸透圧性溶液を含み得るか、または低浸透圧性溶液であり得る。低浸透圧性溶液は、限定はされないが、粘液透過粒子などの粘液不活性（ｍｕｃｏｉｎｅｒｔ）粒子が膣上皮表面に到達することができる速度を増加させることが見出された（例えば、Ｅｎｓｉｇｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２０１３ ３４（２８）：６９２２－９を参照のこと。当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
１つの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、リポプレックスとして製剤化され、こうしたリポプレックスは、限定はされないが、Ｓｉｌｅｎｃｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｌｏｎｄｏｎ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）から供給されるＡＴＵＰＬＥＸ（商標）システム、ＤＡＣＣシステム、ＤＢＴＣシステム、及び他のｓｉＲＮＡ－リポプレックス技術、ＳＴＥＭＧＥＮＴ（登録商標）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から供給されるＳＴＥＭＦＥＣＴ（商標）、ならびにポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはプロタミンに基づく標的指向型の核酸送達及び非標的指向型の核酸送達などである（Ａｌｅｋｕ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００８ ６８：９７８８－９７９８、Ｓｔｒｕｍｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１２ ５０：７６－７８、Ｓａｎｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００６ １３：１２２２－１２３４、Ｓａｎｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００６ １３：１３６０－１３７０、Ｇｕｔｂｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｕｌｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１０ ２３：３３４－３４４、Ｋａｕｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ Ｒｅｓ ２０１０ ８０：２８６－２９３ Ｗｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００９ ３２：４９８－５０７、Ｗｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００８ ３１：１８０－１８８、Ｐａｓｃｏｌｏ Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：１２８５－１２９４、Ｆｏｔｉｎ－Ｍｌｅｃｚｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３４：１－１５、Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５，２３：７０９－７１７、Ｐｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００７ ６；１０４：４０９５－４１００、ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００８ １９：１２５－１３２（これらの文献はすべて、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
１つの実施形態では、そのような製剤は、異なる細胞型に対してそれが受動的または能動的にインビボで指向化されるように構築するか、またはそのように改変された組成物としてもよく、こうした細胞型には、限定はされないが、肝細胞、免疫細胞、腫瘍細胞、内皮細胞、抗原提示細胞、及び白血球が含まれる（Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０ １８：１３５７－１３６４、Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５ ２３：７０９－７１７、Ｊｕｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００９ １１９：６６１－６７３、Ｋａｕｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ Ｒｅｓ ２０１０ ８０：２８６－２９３、Ｓａｎｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００６ １３：１２２２－１２３４、Ｓａｎｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００６ １３：１３６０－１３７０、Ｇｕｔｂｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｕｌｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１０ ２３：３３４－３４４、Ｂａｓｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１１ １９：２１８６－２２００、Ｆｅｎｓｋｅ ａｎｄ Ｃｕｌｌｉｓ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．２００８ ５：２５－４４、Ｐｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００８ ３１９：６２７－６３０、Ｐｅｅｒ ａｎｄ Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１１ １８：１１２７－１１３３（これらの文献はすべて、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる））。肝細胞へと受容的に標的指向化される製剤の例の１つには、ＤＬｉｎ－ＤＭＡに基づく脂質ナノ粒子製剤、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡに基づく脂質ナノ粒子製剤、及びＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡに基づく脂質ナノ粒子製剤が含まれ、こうした脂質ナノ粒子製剤は、アポリポタンパク質Ｅに結合し、肝細胞へのこうした製剤の結合及び取り込みをインビボで促進することが示されている（Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０ １８：１３５７－１３６４（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる））。製剤は、限定はされないが、葉酸、トランスフェリン、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）によって例示される異なるリガンドのその表面での発現、及び抗体による標的指向化手法を介して選択的に標的指向化することもできる（Ｋｏｌｈａｔｋａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１ ８：１９７－２０６、Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ ａｎｄ Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．２０１１ １６：１３８８－１４１２、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｍｅｍｂｒ Ｂｉｏｌ．２０１０ ２７：２８６－２９８、Ｐａｔｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．２００８ ２５：１－６１、Ｂｅｎｏｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１１ １２：２７０８－２７１４、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．２００８ ５：３０９－３１９、Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０ １８：１３５７－１３６４、Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１２ ８２０：１０５－１１６、Ｂｅｎ－Ａｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１２ ７５７：４９７－５０７、Ｐｅｅｒ ２０１０ Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２０：６３－６８、Ｐｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００７ １０４：４０９５－４１００、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１１ ７２１：３３９－３５３、Ｓｕｂｒａｍａｎｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０ １８：２０２８－２０３７、Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５ ２３：７０９－７１７、Ｐｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００８ ３１９：６２７－６３０、Ｐｅｅｒ ａｎｄ Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１１ １８：１１２７－１１３３（これらの文献はすべて、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる））。
１つの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、固形脂質ナノ粒子として製剤化される。固形脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）は、１０～１０００ｎｍの平均直径を有する球状であり得る。ＳＬＮは、親油性分子を可溶化することができる固形の脂質コアマトリックスを有し、界面活性剤及び／または乳化剤で安定化してよい。追加の実施形態では、脂質ナノ粒子は、自己会合性の脂質－ポリマーナノ粒子であり得る（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ，２００８，２（８），ｐｐ１６９６－１７０２を参照のこと。当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。非限定例として、ＳＬＮは、国際特許公開第ＷＯ２０１３１０５１０１号に記載のＳＬＮであり得、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。別の非限定例として、ＳＬＮは、国際特許公開第ＷＯ２０１３１０５１０１号に記載の方法またはプロセスによって調製してよく、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
ポリヌクレオチドが誘導するタンパク質産生の効果を改善するために、リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を使用してよく、この理由は、こうした製剤によって、ＲＮＡワクチンによる細胞トランスフェクションの増加及び／またはコードタンパク質の翻訳の増加が可能になり得るためである。そのような例の１つでは、ポリプレックスプラスミドＤＮＡの効率的な全身性送達を可能にするために脂質封入が使用される（Ｈｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００７ １５：７１３－７２０（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる））。ポリヌクレオチドの安定性を向上させるためにも、リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を使用してよい。
１つの実施形態では、本発明のＲＮＡワクチンは、制御放出及び／または標的指向型送達を目的として製剤化することができる。本明細書で使用される「制御放出」は、治療結果に影響を与える特定の放出パターンに従う、医薬組成物または化合物の放出プロファイルを指す。１つの実施形態では、ＲＲＮＡワクチンは、本明細書に記載の送達剤、及び／または制御放出及び／または標的指向型送達向けとして当該技術分野において知られる送達剤に封入してよい。本明細書で使用される「封入」という用語は、密閉、包囲、または収容を意味する。この用語が本発明の化合物の製剤と関係するとき、封入は、実質的、完全、または部分的であり得る。「実質的に封入される」という用語は、本発明の医薬組成物または化合物が送達剤の中に密閉、包囲、または収容され得る割合が少なくとも５０％超、少なくとも６０％超、少なくとも７０％超、少なくとも８０％超、少なくとも８５％超、少なくとも９０％超、少なくとも９５％超、少なくとも９６％超、少なくとも９７％超、少なくとも９８％超、少なくとも９９％超、少なくとも９９．９％超、少なくとも９９．９％超、または少なくとも９９．９９９％超であることを意味する。「部分的封入」は、本発明の医薬組成物または化合物が送達剤の中に密閉、包囲、または収容され得る割合が１０未満、１０未満、２０未満、３０未満、４０未満、５０未満、またはそれ未満であることを意味する。有利には、蛍光及び／または電子顕微鏡写真を使用して本発明の医薬組成物または化合物の漏出または活性を測定することによって封入を決定しよい。例えば、本発明の医薬組成物または化合物が送達剤に封入される割合は、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．９％、少なくとも９９．９９％、または少なくとも９９．９９％超である。
１つの実施形態では、制御放出製剤は、限定はされないが、トリブロックコポリマーを含み得る。非限定例として、製剤は、２つの異なる型のトリブロックコポリマーを含み得る（国際公開第ＷＯ２０１２１３１１０４号及び第ＷＯ２０１２１３１１０６号（これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる））。
別の実施形態では、ＲＮＡワクチンは、脂質ナノ粒子または迅速排出型脂質ナノ粒子に封入してよく、その後、脂質ナノ粒子または迅速排出型脂質ナノ粒子は、本明細書に記載及び／または当該技術分野において知られるポリマー、ヒドロゲル、及び／または外科用シーラントに封入してよい。非限定例として、ポリマー、ヒドロゲル、または外科用シーラントは、ＰＬＧＡ、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡｃ）、ポロクサマー、ＧＥＬＳＩＴＥ（登録商標）（Ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．Ａｌａｃｈｕａ，ＦＬ）、ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）（Ｈａｌｏｚｙｍｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）、外科用シーラント（フィブリノーゲンポリマー（Ｅｔｈｉｃｏｎ Ｉｎｃ．Ｃｏｒｎｅｌｉａ，ＧＡ）、ＴＩＳＳＥＬＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）、ＰＥＧに基づくシーラント、及びＣＯＳＥＡＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）など）であり得る。
別の実施形態では、脂質ナノ粒子は、当該技術分野において知られ、対象に注射されるとゲルを形成し得る任意のポリマーに封入してよい。別の非限定例として、脂質ナノ粒子は、生分解性であり得るポリマーマトリックスに封入してよい。
１つの実施形態では、制御放出及び／または標的指向型送達を目的とするＲＮＡワクチン製剤は、少なくとも１つの制御放出コーティングも含み得る。制御放出コーティングには、限定はされないが、ＯＰＡＤＲＹ（登録商標）、ポリビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ＥＵＤＲＡＧＩＴ ＲＬ（登録商標）、ＥＵＤＲＡＧＩＴ ＲＳ（登録商標）、ならびにセルロース誘導体（エチルセルロースなど）の水性分散液（ＡＱＵＡＣＯＡＴ（登録商標）及びＳＵＲＥＬＥＡＳＥ（登録商標））が含まれる。
１つの実施形態では、ＲＮＡワクチン制御放出及び／または標的指向型送達製剤は、ポリカチオン性側鎖を含み得る分解性ポリエステルを少なくとも１つ含み得る。分解性ポリエステルには、限定はされないが、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－Ｌ－リジン）、ポリ（４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンエステル）、及びそれらの組み合わせが含まれる。別の実施形態では、分解性ポリエステルは、ＰＥＧ化ポリマーを形成するためのＰＥＧ複合化部を含み得る。
１つの実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むＲＮＡワクチン制御放出及び／または標的指向型送達製剤は、米国特許第８，４０４，２２２号に記載のＰＥＧ及び／またはＰＥＧ関連ポリマー誘導体を少なくとも１つ含み得、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
別の実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むＲＮＡワクチン制御放出送達製剤は、ＵＳ２０１３０１３０３４８に記載の制御放出ポリマーシステムであり得、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
１つの実施形態では、本発明のＲＮＡワクチンは、治療ナノ粒子に封入してよく、これは、「治療ナノ粒子ＲＲＮＡワクチン」と本明細書で称される。治療ナノ粒子は、本明細書に記載の方法及び当該技術分野において知られる方法によって製剤化してよく、こうした方法には、限定はされないが、国際公開第ＷＯ２０１０００５７４０号、第ＷＯ２０１００３０７６３号、第ＷＯ２０１０００５７２１号、第ＷＯ２０１０００５７２３号、第ＷＯ２０１２０５４９２３号、米国公開第ＵＳ２０１１０２６２４９１号、第ＵＳ２０１００１０４６４５号、第ＵＳ２０１０００８７３３７号、第ＵＳ２０１０００６８２８５号、第ＵＳ２０１１０２７４７５９号、第ＵＳ２０１０００６８２８６号、第ＵＳ２０１２０２８８５４１号、第ＵＳ２０１３０１２３３５１号、及び第ＵＳ２０１３０２３０５６７号、ならびに米国特許第８，２０６，７４７号、第８，２９３，２７６号、第８，３１８，２０８号、及び第８，３１８，２１１号などに記載の方法であり、これらの文献のそれぞれの内容は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。別の実施形態では、治療ポリマーナノ粒子は、米国公開第ＵＳ２０１２０１４０７９０号に記載の方法によって同定してよく、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
１つの実施形態では、治療ナノ粒子ＲＮＡワクチンは、持続放出を目的として製剤化してよい。本明細書で使用される「持続放出」は、特定期間にわたって一定放出速度に従う医薬組成物または化合物を指す。期間には、限定はされないが、数時間、数日、数週間、数ヶ月、及び数年が含まれ得る。非限定例として、持続放出ナノ粒子は、ポリマー及び治療剤を含み得、こうしたポリマー及び治療剤は、限定はされないが、本発明のポリヌクレオチドなどである（国際公開第２０１００７５０７２号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１００２１６８０４号、第ＵＳ２０１１０２１７３７７号、及び第ＵＳ２０１２０２０１８５９号を参照のこと。これらの文献はそれぞれ、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。別の非限定例では、持続放出製剤は、持続的な生物学的利用能を実現する薬剤を含み得、こうした薬剤は、限定はされないが、結晶、巨大分子ゲル、及び／または微粒子懸濁液などである（米国特許公開第ＵＳ２０１３０１５０２９５号を参照のこと。当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
１つの実施形態では、治療ナノ粒子ＲＮＡワクチンは、標的特異的になるように製剤化してよい。非限定例として、治療ナノ粒子は、副腎皮質ステロイドを含み得る（国際公開第ＷＯ２０１１０８４５１８号を参照のこと。当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。非限定例として、治療ナノ粒子は、国際公開第ＷＯ２００８１２１９４９号、第ＷＯ２０１０００５７２６号、第ＷＯ２０１０００５７２５号、第ＷＯ２０１１０８４５２１号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１０００６９４２６号、第ＵＳ２０１２０００４２９３号、及び第ＵＳ２０１００１０４６５５号に記載のナノ粒子において製剤化してよく、これらの文献はそれぞれ、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
１つの実施形態では、本発明のナノ粒子は、ポリマーマトリックスを含み得る。非限定例として、ナノ粒子は、２つ以上のポリマーを含み得、こうしたポリマーは、限定はされないが、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ酸無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメレート（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｆｕｍｅｒａｔｅ）、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリウレア、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－Ｌ－リジン）、ポリ（４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンエステル）、またはそれらの組み合わせなどである。
１つの実施形態では、治療ナノ粒子は、ジブロックコポリマーを含む。１つの実施形態では、ジブロックコポリマーは、ポリマーと組み合わせてＰＥＧを含み得、こうしたポリマーは、限定はされないが、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ酸無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメレート（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｆｕｍｅｒａｔｅ）、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリウレア、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－Ｌ－リジン）、ポリ（４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンエステル）、またはそれらの組み合わせなどである。別の実施形態では、ジブロックコポリマーは、欧州特許第号に記載のジブロックコポリマーを含み得、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。さらに別の実施形態では、ジブロックコポリマーは、国際特許公開第ＷＯ２０１３１２００５２号に記載のものなどの高Ｘ（ｈｉｇｈ－Ｘ）ジブロックコポリマーであり得、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
非限定例として、治療ナノ粒子は、ＰＬＧＡ－ＰＥＧブロックコポリマー（米国公開第ＵＳ２０１２０００４２９３号及び米国特許第８，２３６，３３０号を参照のこと。これらの文献はそれぞれ、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を含む。別の非限定例では、治療ナノ粒子は、ＰＥＧとＰＬＡとのジブロックコポリマーまたはＰＥＧとＰＬＧＡとのジブロックコポリマーを含むステルスナノ粒子である（米国特許第８，２４６，９６８号及び国際公開第ＷＯ２０１２１６６９２３号を参照のこと。これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。さらに別の非限定例では、治療ナノ粒子は、米国特許公開第ＵＳ２０１３０１７２４０６号に記載のステルスナノ粒子または標的特異的ステルスナノ粒子であり、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
１つの実施形態では、治療ナノ粒子は、マルチブロックコポリマー（例えば、米国特許第８，２６３，６６５号及び第８，２８７，９１０号、ならびに米国特許公開第ＵＳ２０１３０１９５９８７号を参照のこと。これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を含み得る。
さらに別の非限定例では、脂質ナノ粒子は、ブロックコポリマーであるＰＥＧ－ＰＬＧＡ－ＰＥＧ（例えば、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｈｙｄｒｏｇｅｌ ａｓ ａ Ｔｇｆ－β１ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｖｅｈｉｃｌｅ Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｗｏｕｎｄ Ｈｅａｌｉｎｇ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３ ２０（１２）：１９９５－２０００（ＴＧＦ－ベータ１遺伝子の送達媒体として温度感受性ヒドロゲル（ＰＥＧ－ＰＬＧＡ－ＰＥＧ）が使用された）、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｈｙｄｒｏｇｅｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００３ ２０（６）：８８４－８８８（制御された遺伝子送達システムとして温度感受性ヒドロゲル（ＰＥＧ－ＰＬＧＡ－ＰＥＧ）が使用された）、及びＣｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｏｎ－ｉｏｎｉｃ ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ＰＥＧ－ＰＬＧＡ－ＰＥＧ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ｒａｔ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ．Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ．２００７ １１８：２４５－２５３を参照のこと。これらの文献はそれぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を含む。本発明のＲＮＡワクチンは、ＰＥＧ－ＰＬＧＡ－ＰＥＧブロックコポリマーを含む脂質ナノ粒子において製剤化してよい。
１つの実施形態では、治療ナノ粒子は、マルチブロックコポリマー（例えば、米国特許第８，２６３，６６５号及び第８，２８７，９１０号、ならびに米国特許公開第ＵＳ２０１３０１９５９８７号を参照のこと。これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を含み得る。
１つの実施形態では、本明細書に記載のブロックコポリマーは、非ポリマーミセルとブロックコポリマーとを含むポリイオン複合体（例えば、米国公開第２０１２００７６８３６号を参照のこと。当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に含めてよい。
１つの実施形態では、治療ナノ粒子は、少なくとも１つのアクリルポリマーを含み得る。アクリルポリマーには、限定はされないが、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸とメタクリル酸とのコポリマー、メチルメタクリレートコポリマー、エトキシエチルメタクリレート、シアノエチルメタクリレート、アミノアルキルメタクリレートコポリマー、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリシアノアクリレート、及びそれらの組み合わせが含まれる。
１つの実施形態では、治療ナノ粒子は、少なくとも１つのポリ（ビニルエステル）ポリマーを含み得る。ポリ（ビニルエステル）ポリマーは、ランダムコポリマーなどのコポリマーであり得る。非限定例として、ランダムコポリマーは、国際出願第ＷＯ２０１３０３２８２９号または米国特許公開第ＵＳ２０１３０１２１９５４号に記載のものなどの構造を有し得、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。１つの態様では、ポリ（ビニルエステル）ポリマーは、本明細書に記載のポリヌクレオチドに複合化してよい。別の態様では、本発明において使用してよいポリ（ビニルエステル）ポリマーは、に記載のものであり得、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
１つの実施形態では、治療ナノ粒子は、少なくとも１つのジブロックコポリマーを含み得る。ジブロックコポリマーは、限定はされないが、ポリ（乳）酸－ポリ（エチレン）グリコールコポリマーであり得る（例えば、国際特許公開第ＷＯ２０１３０４４２１９号を参照のこと。当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。非限定例として、治療ナノ粒子は、癌の治療に使用してよい（国際公開第ＷＯ２０１３０４４２１９号を参照のこと。当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
１つの実施形態では、治療ナノ粒子は、本明細書に記載のカチオン性ポリマー及び／または当該技術分野において知られるカチオン性ポリマーを少なくとも１つ含み得る。
１つの実施形態では、治療ナノ粒子は、少なくとも１つのアミン含有ポリマーを含み得、こうしたアミン含有ポリマーは、限定はされないが、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（アミドアミン）デンドリマー、ポリ（ベータ－アミノエステル）（例えば、米国特許第８，２８７，８４９号を参照のこと。当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）、及びそれらの組み合わせなどである。
別の実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子は、国際特許出願第ＷＯ２０１３０５９４９６号に記載のものなどのアミンカチオン性脂質を含み得、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。１つの態様では、カチオン性脂質は、アミノ－アミン部分またはアミノ－アミド部分を有し得る。
１つの実施形態では、治療ナノ粒子は、ポリカチオン性側鎖を含み得る分解性ポリエステルを少なくとも１つ含み得る。分解性ポリエステルには、限定はされないが、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－Ｌ－リジン）、ポリ（４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンエステル）、及びそれらの組み合わせが含まれる。別の実施形態では、分解性ポリエステルは、ＰＥＧ化ポリマーを形成するためのＰＥＧ複合化部を含み得る。
別の実施形態では、治療ナノ粒子は、少なくとも１つの標的指向化リガンドの複合化部を含み得る。標的指向化リガンドは、限定はされないが、モノクローナル抗体（Ｋｉｒｐｏｔｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００６ ６６：６７３２－６７４０（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる））などの当該技術分野において知られる任意のリガンドであり得る。
１つの実施形態では、治療ナノ粒子は、癌の治療に使用してよい水溶液において製剤化してよい（国際公開第ＷＯ２０１１０８４５１３号及び米国公開第ＵＳ２０１１０２９４７１７号を参照のこと。これらの文献はそれぞれ、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
１つの実施形態では、例えば、少なくとも１つのＲＮＡワクチンを含む治療ナノ粒子などの治療ナノ粒子ＲＮＡワクチンは、米国特許第８，４０４，７９９号においてＰｏｄｏｂｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌによって記載される方法を使用して製剤化してよく、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
１つの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、合成ナノ担体に封入、連結、及び／またはそれと会合させてよい。合成ナノ担体には、限定はされないが、国際公開第ＷＯ２０１０００５７４０号、第ＷＯ２０１００３０７６３号、第ＷＯ２０１２１３５０１号、第ＷＯ２０１２１４９２５２号、第ＷＯ２０１２１４９２５５号、第ＷＯ２０１２１４９２５９号、第ＷＯ２０１２１４９２６５号、第ＷＯ２０１２１４９２６８号、第ＷＯ２０１２１４９２８２号、第ＷＯ２０１２１４９３０１号、第ＷＯ２０１２１４９３９３号、第ＷＯ２０１２１４９４０５号、第ＷＯ２０１２１４９４１１号、第ＷＯ２０１２１４９４５４号、及び第ＷＯ２０１３０１９６６９号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１１０２６２４９１号、第ＵＳ２０１００１０４６４５号、第ＵＳ２０１０００８７３３７号、及び第ＵＳ２０１２０２４４２２２号に記載のものが含まれ、これらの文献はそれぞれ、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。合成ナノ担体は、当該技術分野において知られる方法及び／または本明細書に記載の方法を使用して製剤化してよい。非限定例として、合成ナノ担体は、国際公開第ＷＯ２０１０００５７４０号、第ＷＯ２０１００３０７６３号、及び第ＷＯ２０１２１３５０１号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１１０２６２４９１号、第ＵＳ２０１００１０４６４５号、第ＵＳ２０１０００８７３３７号、及び第ＵＳ２０１２０２４４２２号に記載の方法によって製剤化してよく、これらの文献はそれぞれ、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。別の実施形態では、合成ナノ担体製剤は、国際公開第ＷＯ２０１１０７２２１８号及び米国特許第８，２１１，４７３号に記載の方法によって凍結乾燥してよく、これらの文献のそれぞれの内容は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。さらに別の実施形態では、限定はされないが、合成ナノ担体を含む本発明の製剤は、米国特許公開第ＵＳ２０１３０２３０５６８号に記載の方法によって凍結乾燥または再構成してよく、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
１つの実施形態では、合成ナノ担体は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを遊離させるための反応基を含み得る（国際公開第ＷＯ２０１２０９５２５５２号及び米国公開第ＵＳ２０１２０１７１２２９号を参照のこと。これらの文献はそれぞれ、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
１つの実施形態では、合成ナノ担体は、合成ナノ担体の送達に由来する免疫応答を増進するために免疫賦活剤を含み得る。非限定例として、合成ナノ担体は、Ｔｈ１に基づく免疫系応答を増進し得るＴｈ１免疫賦活剤を含み得る（国際公開第ＷＯ２０１０１２３５６９号及び米国公開第ＵＳ２０１１０２２３２０１号を参照のこと。これらの文献はそれぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
１つの実施形態では、合成ナノ担体は、標的指向型放出を目的に製剤化してよい。１つの実施形態では、合成ナノ担体は、特定のｐＨで、及び／または所望の時間間隔の後に、ポリヌクレオチドを遊離させるために製剤化される。非限定例として、合成ナノ粒子は、２４時間後及び／またはｐＨ４．５でＲＮＡワクチンを遊離させるために製剤化してよい（国際公開第ＷＯ２０１０１３８１９３号及び第ＷＯ２０１０１３８１９４号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１１００２０３８８号及び第ＵＳ２０１１００２７２１７号を参照のこと。これらの文献はそれぞれ、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
１つの実施形態では、合成ナノ担体は、本明細書に記載のポリヌクレオチドの制御放出及び／または持続放出を目的として製剤化してよい。非限定例として、持続放出を目的とする合成ナノ担体は、当該技術分野において知られる方法、本明細書に記載の方法、及び／または国際公開第ＷＯ２０１０１３８１９２号及び米国公開第２０１００３０３８５０号に記載の方法によって製剤化してよく、これらの文献はそれぞれ、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
１つの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、制御放出及び／または持続放出を目的として製剤化してよく、製剤は、結晶性側鎖（ＣＹＳＣ）ポリマーであるポリマーを少なくとも１つ含む。ＣＹＳＣポリマーは、米国特許第８，３９９，００７号に記載されており、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
１つの実施形態では、合成ナノ担体は、ワクチンとしての使用を目的として製剤化してよい。１つの実施形態では、少なくとも１つの抗原をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを合成ナノ担体に封入してよい。非限定例として、合成ナノ担体は、少なくとも１つの抗原と、ワクチン剤形のための賦形剤とを含み得る（国際公開第ＷＯ２０１１１５０２６４号及び米国公開第ＵＳ２０１１０２９３７２３号を参照のこと。これらの文献はそれぞれ、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。別の非限定例として、ワクチン剤形は、同一または異なる抗原を有する少なくとも２つの合成ナノ担体と、賦形剤とを含み得る（国際公開第ＷＯ２０１１１５０２４９号及び米国公開第ＵＳ２０１１０２９３７０１号を参照のこと。これらの文献はそれぞれ、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。ワクチン剤形は、本明細書に記載の方法、当該技術分野において知られる方法、及び／または国際公開第ＷＯ２０１１１５０２５８号及び米国公開第ＵＳ２０１２００２７８０６号に記載の方法によって選択してよく、これらの文献はそれぞれ、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
１つの実施形態では、合成ナノ担体は、少なくとも１つのアジュバントをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み得る。非限定例として、アジュバントは、ジメチルジオクタデシルアンモニウム－ブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウム－クロリド、ジメチルジオクタデシルアンモニウム－ホスフェート、またはジメチルジオクタデシルアンモニウム－アセテート（ＤＤＡ）と、マイコバクテリアの総脂質抽出物の無極性画分または当該無極性画分の一部と、を含み得る（例えば、米国特許第８，２４１，６１０号を参照のこと。当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。別の実施形態では、合成ナノ担体は、少なくとも１つのポリヌクレオチド、及びアジュバントを含み得る。非限定例として、アジュバントを含む合成ナノ担体は、国際公開第ＷＯ２０１１１５０２４０号及び米国公開第ＵＳ２０１１０２９３７００号に記載の方法によって製剤化してよく、これらの文献はそれぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
１つの実施形態では、ウイルスに由来するペプチド、断片、または領域をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを合成ナノ担体に封入してよい。非限定例として、合成ナノ担体には、限定はされないが、国際公開第ＷＯ２０１２０２４６２１号、第ＷＯ２０１２０２６２９号、第ＷＯ２０１２０２４６３２号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１２００６４１１０号、第ＵＳ２０１２００５８１５３号、及び第ＵＳ２０１２００５８１５４号に記載のナノ担体が含まれ得、これらの文献はそれぞれ、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
１つの実施形態では、合成ナノ担体は、体液性及び／または細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を引き起こすことができる可能性を有するポリヌクレオチドにカップリングさせてよい（例えば、国際公開第ＷＯ２０１３０１９６６９号を参照のこと。当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
１つの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、双性イオン性脂質に封入、連結、及び／またはそれと会合させてよい。双性イオン性脂質、及び双性イオン性脂質の使用方法の例は、限定はされないが、米国特許公開第ＵＳ２０１３０２１６６０７号に記載されており、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。１つの態様では、双性イオン性脂質は、本明細書に記載のリポソーム及び脂質ナノ粒子において使用してよい。
１つの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、米国特許公開第ＵＳ２０１３０１９７１００号に記載のコロイドナノ担体において製剤化してよく、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
１つの実施形態では、ナノ粒子は、経口投与を目的として最適化してよい。ナノ粒子は、限定はされないが、キトサンまたはその誘導体などのカチオン性バイオポリマーを少なくとも１つ含み得る。非限定例として、ナノ粒子は、米国公開第２０１２０２８２３４３号に記載の方法によって製剤化してよく、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、脂質ＫＬ５２（米国出願公開第２０１２／０２９５８３２号に開示のアミノ－脂質であり、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に明確に組み込まれる）を含む。そのような脂質を組み込むことによってＬＮＰ投与の活性及び／または安全性（ＡＬＴ／ＡＳＴ、白血球数、及びサイトカイン誘導の１つまたは複数を調べることによって測定される）を改善してよい。ＫＬ５２を含むＬＮＰは、静脈内に投与及び／または単回もしくは複数回の用量において投与してよい。いくつかの実施形態では、ＫＬ５２を含むＬＮＰの投与では、ＭＣ３を含むＬＮＰと比較して、ｍＲＮＡ及び／またはタンパク質の発現が同等であるか、または改善される。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、より小さなＬＮＰを使用して送達してよい。そのような粒子が有し得る直径は、０．１ｕｍ未満～最大１００ｎｍであり、限定はされないが、０．１ｕｍ未満、１．０ｕｍ未満、５ｕｍ未満、１０ｕｍ未満、１５ｕｍ未満、２０ｕｍ未満、２５ｕｍ未満、３０ｕｍ未満、３５ｕｍ未満、４０ｕｍ未満、５０ｕｍ未満、５５ｕｍ未満、６０ｕｍ未満、６５ｕｍ未満、７０ｕｍ未満、７５ｕｍ未満、８０ｕｍ未満、８５ｕｍ未満、９０ｕｍ未満、９５ｕｍ未満、１００ｕｍ未満、１２５ｕｍ未満、１５０ｕｍ未満、１７５ｕｍ未満、２００ｕｍ未満、２２５ｕｍ未満、２５０ｕｍ未満、２７５ｕｍ未満、３００ｕｍ未満、３２５ｕｍ未満、３５０ｕｍ未満、３７５ｕｍ未満、４００ｕｍ未満、４２５ｕｍ未満、４５０ｕｍ未満、４７５ｕｍ未満、５００ｕｍ未満、５２５ｕｍ未満、５５０ｕｍ未満、５７５ｕｍ未満、６００ｕｍ未満、６２５ｕｍ未満、６５０ｕｍ未満、６７５ｕｍ未満、７００ｕｍ未満、７２５ｕｍ未満、７５０ｕｍ未満、７７５ｕｍ未満、８００ｕｍ未満、８２５ｕｍ未満、８５０ｕｍ未満、８７５ｕｍ未満、９００ｕｍ未満、９２５ｕｍ未満、９５０ｕｍ未満、９７５ｕｍ未満などである。別の実施形態では、ＲＮＡワクチンは、より小さなＬＮＰを使用して送達してよく、こうしたＬＮＰが有し得る直径は、約１ｎｍ～約１００ｎｍ、約１ｎｍ～約１０ｎｍ、約１ｎｍ～約２０ｎｍ、約１ｎｍ～約３０ｎｍ、約１ｎｍ～約４０ｎｍ、約１ｎｍ～約５０ｎｍ、約１ｎｍ～約６０ｎｍ、約１ｎｍ～約７０ｎｍ、約１ｎｍ～約８０ｎｍ、約１ｎｍ～約９０ｎｍ、約５ｎｍ～約１００ｎｍ、約５ｎｍ～約１０ｎｍ、約５ｎｍ～約２０ｎｍ、約５ｎｍ～約３０ｎｍ、約５ｎｍ～約４０ｎｍ、約５ｎｍ～約５０ｎｍ、約５ｎｍ～約６０ｎｍ、約５ｎｍ～約７０ｎｍ、約５ｎｍ～約８０ｎｍ、約５ｎｍ～約９０ｎｍ、約１０～約５０ｎＭ、約２０～約５０ｎｍ、約３０～約５０ｎｍ、約４０～約５０ｎｍ、約２０～約６０ｎｍ、約３０～約６０ｎｍ、約４０～約６０ｎｍ、約２０～約７０ｎｍ、約３０～約７０ｎｍ、約４０～約７０ｎｍ、約５０～約７０ｎｍ、約６０～約７０ｎｍ、約２０～約８０ｎｍ、約３０～約８０ｎｍ、約４０～約８０ｎｍ、約５０～約８０ｎｍ、約６０～約８０ｎｍ、約２０～約９０ｎｍ、約３０～約９０ｎｍ、約４０～約９０ｎｍ、約５０～約９０ｎｍ、約６０～約９０ｎｍ、及び／または約７０～約９０ｎｍである。
いくつかの実施形態では、そのようなＬＮＰは、マイクロ流体ミキサーを用いる方法を使用して合成される。マイクロ流体ミキサーの例には、限定はされないが、スリット式インターデジタルマイクロミキサー（限定はされないが、Ｍｉｃｒｏｉｎｎｏｖａ（Ａｌｌｅｒｈｅｉｌｉｇｅｎ ｂｅｉ Ｗｉｌｄｏｎ，Ａｕｓｔｒｉａ）によって製造されるものを含む）、及び／またはスタガードヘリンボーンマイクロミキサー（ＳＨＭ）が含まれ得る（Ｚｈｉｇａｌｔｓｅｖ，Ｉ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｏｔｔｏｍ－ｕｐ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｌｉｍｉｔ ｓｉｚｅ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｙｓｔｅｍｓ ｗｉｔｈ ａｑｕｅｏｕｓ ａｎｄ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｃｏｒｅｓ ｕｓｉｎｇ ｍｉｌｌｉｓｅｃｏｎｄ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｍｉｘｉｎｇ（Ｌａｎｇｍｕｉｒ．２０１２．２８：３６３３－４０として刊行）、Ｂｅｌｌｉｖｅａｕ，Ｎ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｐｏｔｅｎｔ ｌｉｍｉｔ－ｓｉｚｅ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．２０１２．１：ｅ３７、Ｃｈｅｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｒａｐｉｄ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔ ｓｉＲＮＡ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｅｎａｂｌｅｄ ｂｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２０１２．１３４（１６）：６９４８－５１（これらの文献はそれぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる））。いくつかの実施形態では、ＳＨＭを用いるＬＮＰの生成方法は、流入する少なくとも２つの流れの混合をさらに含み、この場合、マイクロ構造誘導型のカオス的移流（ＭＩＣＡ）によって混合が生じる。この方法によれば、液流は、ヘリンボーンパターンで存在するチャネルを通過し、回転流を生み出して流体を互いの周りに巻き合わせる。この方法では、流体を混合するための表面を用いてもよく、この場合、表面によって流体循環の間に流向が変化する。ＳＨＭを使用するＬＮＰの生成方法には、米国出願公開第２００４／０２６２２２３号及び第２０１２／０２７６２０９号に開示のものが含まれ、これらの文献はそれぞれ、それらの全体が参照によって本明細書に明確に組み込まれる。
１つの実施形態では、本発明のＲＮＡワクチンは、限定はされないが、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｆｕｒ Ｍｉｋｒｏｔｅｃｈｎｉｋ Ｍａｉｎｚ ＧｍｂＨ，Ｍａｉｎｚ Ｇｅｒｍａｎｙから供給されるスリット式インターデジタルマイクロ構造ミキサー（ＳＩＭＭ－Ｖ２）または標準スリット式インターデジタルマイクロミキサー（ＳＳＩＭＭ）またはキャタピラー型（ＣＰＭＭ）または衝突型（ＩＪＭＭ）などのマイクロミキサーを使用して創出される脂質ナノ粒子において製剤化してよい。
１つの実施形態では、本発明のＲＮＡワクチンは、マイクロ流体技術（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇｅｏｒｇｅ Ｍ．Ｔｈｅ Ｏｒｉｇｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ．Ｎａｔｕｒｅ，２００６ ４４２：３６８－３７３、及びＡｂｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｏｔｉｃ Ｍｉｘｅｒ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２ ２９５：６４７－６５１を参照のこと。これらの文献はそれぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を使用して創出される脂質ナノ粒子において製剤化してよい。非限定例として、マイクロ流体の製剤化制御には、マイクロチャネルにおいて定常圧力によって推進される低レイノルズ数の液流を受動的に混合する方法が含まれる（例えば、Ａｂｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｏｔｉｃ Ｍｉｘｅｒ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２ ２９５：６４７－６５１を参照のこと。当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
１つの実施形態では、本発明のＲＮＡワクチンは、限定はされないが、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）またはＤｏｌｏｍｉｔｅ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（Ｒｏｙｓｔｏｎ，ＵＫ）から供給されるものなどのマイクロミキサーチップを使用して創出される脂質ナノ粒子において製剤化してよい。マイクロミキサーチップは、分離して再統合する機構で２つ以上の液流を迅速に混合するために使用することができる。
１つの実施形態では、本発明のＲＮＡワクチンは、国際特許公開第ＷＯ２０１３０６３４６８号または米国特許第８，４４０，６１４号に記載の薬物封入マイクロスフェアを使用する送達を目的として製剤化してよく、これらの文献はそれぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。マイクロスフェアは、国際特許公開第ＷＯ２０１３０６３４６８号に記載の式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＶ）、式（Ｖ）、または式（ＶＩ）の化合物を含み得、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。別の態様では、本発明のＲＮＡワクチンの細胞への送達において、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、脂質（ＡＰＰＬ）が有用である（国際特許公開第ＷＯ２０１３０６３４６８号を参照のこと。当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
１つの実施形態では、本発明のＲＮＡワクチンは、脂質ナノ粒子において製剤化してよく、こうした脂質ナノ粒子が有する直径は、約１０～約１００ｎｍであり、限定はされないが、約１０～約２０ｎｍ、約１０～約３０ｎｍ、約１０～約４０ｎｍ、約１０～約５０ｎｍ、約１０～約６０ｎｍ、約１０～約７０ｎｍ、約１０～約８０ｎｍ、約１０～約９０ｎｍ、約２０～約３０ｎｍ、約２０～約４０ｎｍ、約２０～約５０ｎｍ、約２０～約６０ｎｍ、約２０～約７０ｎｍ、約２０～約８０ｎｍ、約２０～約９０ｎｍ、約２０～約１００ｎｍ、約３０～約４０ｎｍ、約３０～約５０ｎｍ、約３０～約６０ｎｍ、約３０～約７０ｎｍ、約３０～約８０ｎｍ、約３０～約９０ｎｍ、約３０～約１００ｎｍ、約４０～約５０ｎｍ、約４０～約６０ｎｍ、約４０～約７０ｎｍ、約４０～約８０ｎｍ、約４０～約９０ｎｍ、約４０～約１００ｎｍ、約５０～約６０ｎｍ、約５０～約７０ｎｍ、約５０～約８０ｎｍ、約５０～約９０ｎｍ、約５０～約１００ｎｍ、約６０～約７０ｎｍ、約６０～約８０ｎｍ、約６０～約９０ｎｍ、約６０～約１００ｎｍ、約７０～約８０ｎｍ、約７０～約９０ｎｍ、約７０～約１００ｎｍ、約８０～約９０ｎｍ、約８０～約１００ｎｍ、及び／または約９０～約１００ｎｍなどである。
１つの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約１０～５００ｎｍの直径を有し得る。
１つの実施形態では、脂質ナノ粒子が有し得る直径は、１００ｎｍ超、１５０ｎｍ超、２００ｎｍ超、２５０ｎｍ超、３００ｎｍ超、３５０ｎｍ超、４００ｎｍ超、４５０ｎｍ超、５００ｎｍ超、５５０ｎｍ超、６００ｎｍ超、６５０ｎｍ超、７００ｎｍ超、７５０ｎｍ超、８００ｎｍ超、８５０ｎｍ超、９００ｎｍ超、９５０ｎｍ超、または１０００ｎｍ超である。
１つの態様では、脂質ナノ粒子は、国際特許公開第ＷＯ２０１３０５９９２２号に記載の限界サイズ脂質ナノ粒子であり得、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。限界サイズ脂質ナノ粒子は、水性コアまたは疎水性コアを囲む脂質二重層を含み得、脂質二重層は、限定はされないが、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン、セレブロシド、Ｃ８－Ｃ２０脂肪酸ジアシルホスファチジルコリン、及び１－パルミトイル－２－オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）などのリン脂質を含み得る。別の態様では、限界サイズ脂質ナノ粒子は、限定はされないが、ＤＬＰＥ－ＰＥＧ、ＤＭＰＥ－ＰＥＧ、ＤＰＰＣ－ＰＥＧ、及びＤＳＰＥ－ＰＥＧなどのポリエチレングリコール－脂質を含み得る。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、イオン化可能なカチオン性脂質であり、非カチオン性脂質は、中性脂質であり、ステロールは、コレステロールである。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、ジ（（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）、（１２Ｚ，１５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２－ノニルヘンイコサ－１２，１５－ジエン－１－アミン（Ｌ６０８）、及びＮ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘプタデカン－８－アミン（Ｌ５３０）からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、脂質は、
Figure 2023024669000046
 である。
いくつかの実施形態では、脂質は、
Figure 2023024669000047
 である。
１つの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、国際特許公開第ＷＯ２０１３０６３５３０号に記載の送達方法を使用して特定の位置に送達、局在化、及び／または濃縮してよく、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。非限定例として、対象にＲＮＡワクチンを送達する前、同時、または後に、中空ポリマー粒子を対象に投与してよい。中空ポリマー粒子は、対象と接触すると体積変化を起こし、対象における特定の位置に埋没、包埋、固定化、または捕捉された状態になる。
１つの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、活性物質遊離システム（例えば、米国特許公開第ＵＳ２０１３０１０２５４５号を参照のこと。当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）において製剤化してよい。活性物質遊離システムは、１）触媒的に活性な核酸とハイブリッド形成したオリゴヌクレオチド阻害剤鎖に結合した少なくとも１つのナノ粒子と、２）治療的に活性な物質（例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチド）に結合した少なくとも１つの基質分子に結合した化合物と、を含み得、治療的に活性な物質は、触媒的に活性な核酸による基質分子の切断によって遊離する。
１つの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、非細胞材料を含む内部コアと、細胞膜を含む外部表面と、を含むナノ粒子において製剤化してよい。細胞膜は、細胞に由来し得るか、またはウイルスに由来する膜であり得る。非限定例として、ナノ粒子は、国際特許公開第ＷＯ２０１３０５２１６７号に記載の方法によって調製してよく、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。別の非限定例として、本明細書に記載のＲＮＡワクチンを送達するために国際特許公開第ＷＯ２０１３０５２１６７号に記載のナノ粒子を使用してよく、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
１つの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、多孔性ナノ粒子支持型脂質二重層（原始細胞）において製剤化してよい。原始細胞は、国際特許公開第ＷＯ２０１３０５６１３２号に記載されており、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
１つの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡワクチンは、米国特許第８，４２０，１２３号及び第８，５１８，９６３号ならびに欧州特許第ＥＰ２０７３８４８Ｂ１号に記載のポリマーナノ粒子において製剤化するか、またはこれらの文献に記載の方法によって調製されるポリマーナノ粒子において製剤化してよく、これらの文献のそれぞれの内容は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。非限定例として、ポリマーナノ粒子は、米国特許第８，５１８，９６３号に記載のナノ粒子または当該文献に記載の方法によって調製されるナノ粒子などの高ガラス転移点を有するものであり得、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。別の非限定例として、経口製剤及び非経口製剤向けのポリマーナノ粒子は、欧州特許第ＥＰ２０７３８４８Ｂ１号に記載の方法によって調製してよく、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
別の実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡワクチンは、造影において使用されるナノ粒子において製剤化してよい。ナノ粒子は、米国特許公開第ＵＳ２０１３０１２９６３６号に記載のものなどのリポソームナノ粒子であり得、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。非限定例として、リポソームは、ガドリニウム（ＩＩＩ）２－｛４，７－ビス－カルボキシメチル－１０－［（Ｎ，Ｎ－ジステアリルアミドメチル－Ｎ’－アミド－メチル］－１，４，７，１０－テトラ－アザシクロドデカ－１－イル｝－酢酸及び中性完全飽和リン脂質成分（例えば、米国特許公開第ＵＳ２０１３０１２９６３６号を参照のこと。当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を含み得る。
１つの実施形態では、本発明において使用してよいナノ粒子は、米国特許出願第ＵＳ２０１３０１３０３４８号に記載の方法によって形成され、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本発明のナノ粒子は、限定はされないが、それが欠乏すると貧血から神経管欠損に至るまでの健康障害につながり得るものなどの栄養素をさらに含み得る（例えば、国際特許公開第ＷＯ２０１３０７２９２９号に記載のナノ粒子を参照のこと。当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。非限定例として、栄養素は、二価鉄、第二鉄塩、もしくは元素鉄の形態の鉄、ヨウ素、葉酸、ビタミン、または微量栄養素であり得る。
１つの実施形態では、本発明のＲＮＡワクチンは、膨潤性ナノ粒子において製剤化してよい。膨潤性ナノ粒子は、限定はされないが、米国特許第８，４４０，２３１号に記載のものであり得、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。非限定実施形態として、本発明のＲＮＡワクチンの肺系統への送達に膨潤性ナノ粒子を使用してよい（例えば、米国特許第８，４４０，２３１号を参照のこと。当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
本発明のＲＮＡワクチンは、限定はされないが、米国特許第８，４４９，９１６号に記載のものなどのポリ酸無水物ナノ粒子において製剤化してよく、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本発明のナノ粒子及びマイクロ粒子は、マクロファージ及び／または免疫応答を調節するように幾何学的に操作してよい。１つの態様では、幾何学的に操作された粒子は、限定はされないが、肺送達などの標的指向型送達を目的として本発明のポリヌクレオチドに組み込むために形状、サイズ、及び／または表面電荷を変えたものであり得る（例えば、国際公開第ＷＯ２０１３０８２１１１号を参照のこと。当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。幾何学的に操作された粒子の他の物理的特徴には、限定はされないが、細胞及び組織との相互作用を改変することができる穿孔、角度を有するアーム、非対称性及び表面の粗雑さ、電荷が含まれ得る。非限定例として、本発明のナノ粒子は、国際公開第ＷＯ２０１３０８２１１１号に記載の方法によって調製してよく、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
１つの実施形態では、本発明のナノ粒子は、限定はされないが、国際公開第ＷＯ２０１３０９０６０１号に記載のものなどの水溶性ナノ粒子であり得、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。ナノ粒子は、良好な水溶性を持たせるために小型かつ双性イオン性のリガンドを有する無機ナノ粒子であり得る。ナノ粒子は、小さな流体力学的直径（ＨＤ）、時間、ｐＨ、及び塩分に関する安定性、ならびに低レベルの非特異的タンパク質結合性も有し得る。
１つの実施形態では、本発明のナノ粒子は、米国特許公開第ＵＳ２０１３０１７２４０６号に記載の方法によって開発してよく、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
１つの実施形態では、本発明のナノ粒子は、限定はされないが、米国特許公開第ＵＳ２０１３０１７２４０６号に記載のものなどのステルスナノ粒子または標的特異的ステルスナノ粒子であり、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。本発明のナノ粒子は、米国特許公開第ＵＳ２０１３０１７２４０６号に記載の方法によって調製してよく、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
別の実施形態では、ステルスナノ粒子または標的特異的ステルスナノ粒子は、ポリマーマトリックスを含み得る。ポリマーマトリックスは、２つ以上のポリマーを含み得、こうしたポリマーは、限定はされないが、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ酸無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメレート（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｆｕｍｅｒａｔｅ）、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリウレア、ポリスチレン、ポリアミン、ポリエステル、ポリ酸無水物、ポリエーテル、ポリウレタン、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリシアノアクリレート、またはそれらの組み合わせなどである。
１つの実施形態では、ナノ粒子は、高密度の核酸層を有するナノ粒子－核酸ハイブリッド構造であり得る。非限定例として、ナノ粒子－核酸ハイブリッド構造は、米国特許公開第ＵＳ２０１３０１７１６４６号に記載の方法によって調製してよく、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。ナノ粒子は、限定はされないが、本明細書に記載のポリヌクレオチド及び／または当該技術分野において知られるポリヌクレオチドなどの核酸を含み得る。
本発明のナノ粒子の少なくとも１つは、コアナノ構造に包埋するか、またはナノ構造の内部または表面で少なくとも１つのペイロードを保有もしくはそれと会合する能力を有する低密度多孔性三次元構造もしくはコーティングで被覆してよい。少なくとも１つのナノ粒子を含むナノ構造の例は、限定はされないが、国際特許公開第ＷＯ２０１３１２３５２３号に記載されており、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡワクチンは、カチオン性化合物またはポリカチオン性化合物（プロタミン、ヌクレオリン、スペルミンもしくはスペルミジン、または他のカチオン性ペプチドもしくはタンパク質（ポリ－Ｌ－リジン（ＰＬＬ）、ポリアルギニン、塩基性ポリペプチドなど）を含む）、細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）（ＨＩＶ結合ペプチド、ＨＩＶ－１Ｔａｔ（ＨＩＶ）、Ｔａｔ由来のペプチド、ペネトラチン、ＶＰ２２由来のペプチドもしくはＶＰ２２の類似体ペプチド、ペスチウイルスのＥｒｎｓ、ＨＳＶ、ＶＰ２２（単純ヘルペス）、ＭＡＰ、ＫＡＬＡ、またはタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）を含む）、ＰｐＴ６２０、高プロリン含量のペプチド、高アルギニン含量のペプチド、高リジン含量のペプチド、ＭＰＧ－ペプチド（複数可）、Ｐｅｐ－１、Ｌ－オリゴマー、カルシトニンペプチド（複数可）、アンテナペディア由来のペプチド（具体的には、ショウジョウバエのアンテナペディアに由来するもの）、ｐＡｎｔｐ、ｐＩｓｌ、ＦＧＦ、ラクトフェリン、トランスポータン、ブフォリン－２、Ｂａｃ７１５－２４、ＳｙｎＢ、ＳｙｎＢ（１）、ｐＶＥＣ、ｈＣＴ由来のペプチド、ＳＡＰ、ヒストン、カチオン性多糖、例えば、キトサン、ポリブレン、カチオン性ポリマー、例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、カチオン性脂質、例えば、ＤＯＴＭＡ：［１－（２，３－シオレイルオキシ）プロピル）］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド、ＤＭＲＩＥ、ジ－Ｃ１４－アミジン、ＤＯＴＩＭ、ＳＡＩＮＴ、ＤＣ－コレステロール、ＢＧＴＣ、ＣＴＡＰ、ＤＯＰＣ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＰＥ：ジオレイルホスファチジルエタノール－アミン、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＤＡＢ、ＤＯＩＣ、ＤＭＥＰＣ、ＤＯＧＳ：ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン、ＤＩＭＲＩ：ジミリストオキシプロピルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、ＤＯＴＡＰ：ジオレオイルオキシ－３－（トリメチルアンモニオ）プロパン、ＤＣ－６－１４：Ｏ，Ｏ－ジテトラデカノイル－Ｎ－．アルファ．－トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロリド、ＣＬＩＰ１：ｒａｃ－［（２，３－ジオクタデシルオキシプロピル）（２－ヒドロキシエチル）］－ジメチルアンモニウムクロリド、ＣＬＩＰ６：ｒａｃ－［２（２，３－ジヘキサデシルオキシプロピルオキシメチルオキシ）エチル］－トリメチルアンモニウム、ＣＬＩＰ９：ｒａｃ－［２（２，３－ジヘキサデシルオキシプロピルオキシスクシニルオキシ）エチル］－トリメチルアンモニウム、オリゴフェクタミン（ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）、またはカチオン性ポリマーもしくはポリカチオン性ポリマー、例えば、修飾ポリアミノ酸（ベータ－アミノ酸－ポリマーまたは逆ポリアミドなど）、修飾ポリエチレン（ＰＶＰ（ポリ（Ｎ－エチル－４－ビニルピリジニウムブロミド））など）、修飾アクリレート（ｐＤＭＡＥＭＡ（ポリ（ジメチルアミノエチルメチルアクリレート））など）、修飾アミドアミン（ｐＡＭＡＭ（ポリ（アミドアミン））など）、修飾ポリベータアミノエステル（ｐｏｌｙｂｅｔａｍｉｎｏｅｓｔｅｒ）（ＰＢＡＥ）（ジアミン及び修飾１，４ブタンジオールジアクリレート－コ－５－アミノ－１－ペンタノールポリマーなど）、デンドリマー（ポリプロピルアミンデンドリマーまたはｐＡＭＡＭに基づくデンドリマーなど）、ポリイミン（複数可）（ＰＥＩ：ポリ（エチレンイミン）、ポリ（プロピレンイミン）など）、ポリアリルアミン、糖骨格に基づくポリマー（シクロデキストリンに基づくポリマー、デキストランに基づくポリマー、キトサンなど）、シラン骨格に基づくポリマー（ＰＭＯＸＡ－ＰＤＭＳコポリマーなど）、１つまたは複数のカチオン性ブロックの組み合わせからなるブロックポリマー（例えば、上述のカチオン性ポリマーから選択される）、ならびに１つまたは複数の親水性ブロックまたは疎水性ブロックの組み合わせからなるブロックポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）等と会合させてよい。
他の実施形態では、ＲＮＡワクチンは、カチオン性化合物またはポリカチオン性化合物と会合していない。
ワクチンの投与様式
癌ＲＮＡワクチンは、治療的に有効な結果をもたらす任意の経路によって投与してよい。こうしたものには、限定はされないが、皮内投与、筋肉内投与、及び／または皮下投与が含まれる。本開示は、ＲＮＡワクチンを必要とする対象へのその投与を含む方法を提供する。正確な必要量は、対象の種、年齢、及び全身状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与様式、その活性様式、ならびに同様のものに応じて対象ごとに変わることになる。癌ＲＮＡワクチン組成物は、典型的には、投与を容易化し、用量を均一にするための単位剤形において製剤化される。しかしながら、癌ＲＮＡワクチン組成物の全体的な日々の用法は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定され得ることを理解されたい。任意の特定の患者を対象とする治療的に有効、予防的に有効、または適切な造影の特定用量レベルは、さまざまな因子に依存することになり、こうした因子には、治療中の障害及び障害の重症度、用いられる特定の化合物の活性、用いられる特定の組成物、年齢、体重、総体的な健康、患者の性別及び食事、投与時間、投与経路、及び用いられる特定の化合物の排出速度、治療の期間、用いられる特定の化合物と組み合わせられるか、または同時発生的に使用される薬物、ならびに医学分野においてよく知られる同様の因子が含まれる。
いくつかの実施形態では、所望の治療効果、診断効果、予防効果、または造影効果を得るために、対象の体重当たりとして１日当たり０．０００１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ～０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ～０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ～０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ～０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～４０ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ～３０ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇ～２５ｍｇ／ｋｇを送達するために十分な用量レベルで癌ＲＮＡワクチン組成物を、１日当たり、１週間当たり、１ヶ月当たりなどに１回または複数回投与してよい（例えば、国際公開第ＷＯ２０１３０７８１９９号に記載の単位用量の範囲を参照のこと。当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。所望の用量は、１日に３回、１日に２回、１日に１回、２日ごとに１回、３日ごとに１回、１週間ごとに１回、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、４週間ごとに１回、２ヶ月ごとに１回、３ヶ月ごとに１回、６ヶ月ごとに１回などの頻度で送達してよい。ある特定の実施形態では、所望の用量は、複数回の投与（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、またはそれを超える回数の投与）を使用して送達してよい。複数回投与が用いられるときは、本明細書に記載のものなどの分割投薬レジメンを使用してよい。例示の実施形態では、癌ＲＮＡワクチン組成物は、０．０００５ｍｇ／ｋｇ～０．０１ｍｇ／ｋｇを送達するために十分な用量レベルで投与してよく、例えば、約０．０００５ｍｇ／ｋｇ～約０．００７５ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０００５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ、約０．００２ｍｇ／ｋｇ、約０．００３ｍｇ／ｋｇ、約０．００４ｍｇ／ｋｇ、または約０．００５ｍｇ／ｋｇを送達するために十分な用量レベルで投与してよい。
本明細書に記載のＲＮＡワクチン医薬組成物は、鼻腔内へのもの、気管内へのもの、または注射用のもの（例えば、静脈内、眼内、硝子体内、筋肉内、皮内、心臓内、腹腔内、及び皮下へのもの）などの、本明細書に記載の剤形へと製剤化することができる。
本発明は、下記の説明に示されるか、または図面に例示される構成の詳細及び構成要素の配置にその用途が限定されることはない。本発明は、他の実施形態が可能であり、さまざまな様式において実施または実行することが可能である。また、本明細書で使用される用語表現及び専門用語は、説明を目的とするものであり、限定であると見なされるべきではない。「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」、または「ｈａｖｉｎｇ（有する）」、「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（含む）」、「ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ（含む）」、及びその変形形態の本明細書での使用は、その後に列挙される項目及びその同等形態ならびに追加の項目を包含することが意図される。
実施例１．ポリヌクレオチドの製造
本開示によれば、ポリヌクレオチド及びまたはその一部もしくは領域の製造は、「ＲＮＡ転写物の生成を目的とする製造方法」と題する国際出願ＷＯ２０１４／１５２０２７に教示される方法を利用して達成してよく、当該文献の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
精製方法には、国際出願ＷＯ２０１４／１５２０３０及びＷＯ２０１４／１５２０３１に教示されるものが含まれ得、これらの文献はそれぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
ポリヌクレオチドの検出方法及び特徴付け方法は、ＷＯ２０１４／１４４０３９に教示されるように実施してよく、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本開示のポリヌクレオチドの特徴付けは、ポリヌクレオチドマッピング、逆転写酵素によるシークエンシング、電荷分布解析、及びＲＮＡ不純物の検出からなる群から選択される手順を使用して達成してよく、特徴付けは、ＲＮＡ転写物の配列決定、ＲＮＡ転写物の純度決定、またはＲＮＡ転写物の電荷不均一性の決定を含む。そのような方法は、例えば、ＷＯ２０１４／１４４７１１及びＷＯ２０１４／１４４７６７に教示されており、これらの文献のそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
実施例２ キメラポリヌクレオチドの合成
序論
本開示によれば、トリホスフェートケミストリーを使用し、キメラポリヌクレオチドの２つの領域または部分を連結またはライゲーションしてよい。
この方法によれば、１００以下のヌクレオチドの第１の領域または部分は、化学的に合成され、５’はモノホスフェートとなり、末端の３’ＯＨは除去または遮断される。領域が８０のヌクレオチドより長いのであれば、ライゲーションするための２つの鎖として合成してよい。
第１の領域または部分が、インビトロ転写（ＩＶＴ）を使用して、非位置的に修飾された領域または部分として合成されるのであれば、その後に、５’モノホスフェートへの変換、続いて３’末端のキャッピングを実施してよい。
モノホスフェート保護基は、当該技術分野で知られるもののいずれから選択してもよい。
キメラポリヌクレオチドの第２の領域または部分は、化学合成法またはＩＶＴ法のいずれを使用して合成してもよい。ＩＶＴ法は、修飾されたキャップを有するプライマーを利用することができるＲＮＡポリメラーゼの使用を含み得る。あるいは、１３０までのヌクレオチドのキャップは、化学的に合成し、ＩＶＴの領域または部分にカップリングさせてよい。
キメラポリヌクレオチド全体がホスフェート－糖骨格で製造される必要はない。領域または部分の１つがポリペプチドをコードするのであれば、そのような領域または部分は、ホスフェート－糖骨格を含むことが好ましい。
その後、ライゲーションは、任意の既知のクリックケミストリー、オルトクリックケミストリー、ソルリンク（ｓｏｌｕｌｉｎｋ）、または当業者に知られる他の生体複合化ケミストリーを使用して実施される。
合成経路
キメラポリヌクレオチドは、一連の出発セグメントを使用して調製される。そのようなセグメントは、
（ａ）通常の３’ＯＨを含み、５’がキャップされて保護されたセグメント（セグメント１）
（ｂ）ポリペプチドのコード領域を含み得、通常の３’ＯＨを含み、５’にトリホスフェートを有するセグメント（セグメント２）
（ｃ）キメラポリヌクレオチドの３’末端（例えば、尾部）向けに５’にモノホスフェートを有し、コーディセピンを含むか、または３’ＯＨを含まないセグメント（セグメント３）
を含む。
合成（化学的またはＩＶＴ）の後、セグメント３（セグメント３）は、コーディセピンで処理され、その後、ピロホスファターゼで処理されることで５’モノホスフェートが創出される。
その後、セグメント２（セグメント２）は、ＲＮＡリガーゼを使用してセグメント３にライゲーションされる。その後、ライゲーションされたポリヌクレオチドは、精製され、ピロホスファターゼで処理されることでジホスフェートが切断される。その後、処理されたセグメント２－セグメント３構築物は精製され、その５’末端にセグメント１がライゲーションされる。キメラポリヌクレオチドの精製段階をさらに実施してよい。
キメラポリヌクレオチドがポリペプチドをコードする場合、ライゲーションまたは連結されたセグメントは、５’ＵＴＲ（セグメント１）、オープンリーディングフレームまたはＯＲＦ（セグメント２）、及び３’ＵＴＲ＋ポリＡ（セグメント３）として示され得る。
それぞれの段階の収率は、９０～９５％にもなり得る。
実施例３：ｃＤＮＡの生成を目的とするＰＣＲ
ｃＤＮＡを調製するためのＰＣＲ手順は、Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）による２ｘのＫＡＰＡ ＨＩＦＩ（商標）ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲｅａｄｙＭｉｘを使用して実施される。このシステムは、２ｘのＫＡＰＡ ＲｅａｄｙＭｉｘを１２．５μｌ、フォワードプライマー（１０μＭ）を０．７５μｌ、リバースプライマー（１０μＭ）を０．７５μｌ、鋳型ｃＤＮＡを～１００ｎｇ、及び２５．０μｌに希釈したｄＨ２０を含む。反応条件は、９５℃で５分間保持した後、９８℃２０秒、続いて５８℃１５秒、続いて７２℃４５秒というサイクルを２５回実施した後、７２℃で５分間保持し、その後終了まで４℃で保持するというものである。
ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＰＵＲＥＬＩＮＫ（商標）ＰＣＲマイクロキット（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を製造者の説明に記載の量（最大５μｇ）ごとに使用して、反応に対する浄化処理が実施される。反応のスケールが大きくなればなるほど、より大きな能力を有する製品を使用して浄化処理を実施する必要が生じることになる。浄化処理の後、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）を使用してｃＤＮＡが定量化され、ｃＤＮＡが予想サイズであることがアガロースゲル電気泳動による分析によって確認される。その後、ｃＤＮＡは、インビトロでの転写反応を行う前にシークエンシング解析に供される。
実施例４．インビトロ転写（ＩＶＴ）
インビトロでの転写反応では、一様に修飾されたポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが生成する。そのような一様に修飾されたポリヌクレオチドは、本開示のポリヌクレオチドの領域または一部を含み得る。投入用のヌクレオチドトリホスフェート（ＮＴＰ）混合物は、天然のＮＴＰ及び非天然のＮＴＰを使用して社内で調製される。
インビトロでの典型的な転写反応は、下記のものを含む：
１ 鋳型ｃＤＮＡ １．０μｇ
２ １０ｘ転写緩衝液（４００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１９０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭのスペルミジン） ２．０μｌ
３ カスタムＮＴＰ（それぞれ２５ｍＭ） ７．２μｌ
４ ＲＮａｓｅ阻害剤 ２０Ｕ
５ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ ３０００Ｕ
６ ｄＨ２０ 最大２０．０μｌ、及び
７ ３時間～５時間の３７℃でのインキュベート。
未精製のＩＶＴ混合物は、翌日の浄化処理に向けて４℃で一晩貯蔵してよい。その後、ＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅを１Ｕ使用することで元の鋳型が消化される。ｍＲＮＡは、３７℃で１５分間インキュベートした後、ＡｍｂｉｏｎのＭＥＧＡＣＬＥＡＲ（商標）キット（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を製造者の説明に従って使用して精製される。このキットによって最大５００μｇのＲＮＡを精製することができる。浄化処理の後、ＮａｎｏＤｒｏｐを使用してＲＮＡが定量化され、ＲＮＡのサイズが適切であり、ＲＮＡに分解が生じていないことがアガロースゲル電気泳動による分析によって確認される。
実施例５．ｍＲＮＡ癌ワクチンを用いたインビボでの免疫原性アッセイ
ｍＲＮＡワクチンを使用し、ＭＣ３８の免疫原性試験をマウスにおいて実施した。ｍＲＮＡ抗原（２５マーの形式、ＴＭＧの形式、分泌型ＣＤ４０Ｌ－ＴＭＧ融合タンパク質の形式を有するＡｄｐｇｋ、Ｄｐａｇｔ１、Ｒｅｐｓ１という３つのＭＣ３８ネオエピトープ）を生成した。２５マーのペプチドによる免疫化＋抗ＣＤ４０＋ポリ（Ｉ：Ｃ）とのベンチマーク比較を正の対照とした（Ｙａｄａｖ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ２０１５）。０日目、７日目、及び１４日目にマウスを免疫化した。読み取り測定は、３日目、１０日目、及び１７日目に実施し、その後、２１日目にＭＣ３８を負荷し、３５日目に屠殺を実施した。
エピトープ特異的なＴ細胞集団の特徴付けは、デキストラマー（ｄｅｘｔｒａｍｅｒ）染色によって抗原特異的なＴ細胞集団の頻度をみることによって実施した。サイトカインプロファイルは、細胞内サイトカイン染色（ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ－２）及びＥＬＩＳＰＯＴ（ＭＣ３８の変異ペプチドによる刺激時）によって生成した。下記のマーカーを使用した。メモリー及びＴ細胞分化のマーカー：ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、ＩＬ７Ｒ、ＫＬＲＧ１、ＣＤ１２２、ならびに疲弊マーカー：ＰＤ１、Ｌａｇ３、Ｔｉｍ３、２Ｂ４。
図１には、ｍＲＮＡワクチンが抗原特異的なＣＤ８応答を誘導したことを示す結果が示される。図２には、ｍＲＮＡワクチンが抗原特異的なエフェクター／メモリーＣＤ８Ｔ細胞を誘導したことを示す結果が示される。
抗原設計のための考慮事項のいくつかには、ＭＨＣクラス、発現の局在化、ポリペプチドの形式及び配置、ならびに効力増進モチーフが含まれる。図３（模式図）及び図４（表）には、ｍＲＮＡに基づくネオエピトープの抗原設計の多元的考察が示される。
実施例６．ＦＡＣＳに基づくＭＨＣ提示の方法開発
目的：ＭＣＦ７（ＨＬＡ＊２０１）における、ｍＲＮＡがコードするエピトープのＦＡＣＳに基づくアッセイの検証。使用したｍＲＮＡは、変異ｇｐ１００（Ｔ２０９Ｍ）＋変異チロシナーゼ（Ｎ２７１Ｄ）＋変異ＣＤＫ４（Ｒ２４Ｃ）＋変異ＭＡＲＴ１（Ａ２７Ｌ）という４つの異なるエピトープを組み合わせたコンカテマーである。ＴＭＧ．Ｇ２５（１／２）＾３．ｎＰＥＳＴ配列は、変異ｇｐ１００（Ｔ２０９Ｍ）が３回繰り返すタンデム型ミニ遺伝子の対照ｍＲＮＡである。タンパク質の産生は、抗変異ＭＡＲＴ１（Ａ２７Ｌ）ＴＣＲマー－ＰＥ及び抗ＨＬＡ抗体を使用して検出した。
方法では、ＬＦ２０００を使用した２５０ｎｇのｍＲＮＡのＭＣＦ７へのトランスフェクトと、ペプチドをパルスした対照による提示：血清非含有ＲＰＭＩにおける合成ペプチドのパルスなしまたはパルスありでのＭＣＦ７の３７℃での３時間の保持と、抗ＨＬＡ及びＴＣＲマー（変異ＭＡＲＴ１－ＨＬＡ＊２０１複合体に特異的）を用いた約２０時間時点でのＦＡＣＳ分析と、を実施した。
データは、図５に示される。ＭＣＦ７細胞でのＭＨＣ１／変異ＭＡＲＴ１ペプチドの特異的な提示が抗変異ＭＡＲＴ１ＴＣＲマーによって検出された。
実施例７．２０のエピトープのコンカテマーをコードするｍＲＮＡで誘発されたＴ細胞応答
ｍＲＮＡコンカテマーは、クラスＩとクラスＩＩとの両方のＴ細胞応答を誘導した。ＣＡ６０は、患者のミュータノームに由来する２０のエピトープをコードし、マウスのクラスＩＩエピトープを５つ、マウスのクラスＩエピトープを１０、マウスの正の対照（ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２２）（卵白アルブミン由来））を１つ、及びヒトの（ＨＬＡ－Ａ２）エピトープを４つ含む（未掲載）。１０μｇのｍＲＮＡでマウスを２回免疫化（初回免疫＋１４日目の追加免疫）し、２１日目にフローサイトメトリーによって脾臓細胞を分析した。
データは、図７示される。１０のクラスＩエピトープのうちの４つ、及び５つのクラスＩＩエピトープのうちの５つが免疫原性であった。これらのエピトープは、非刺激対照の２倍超の応答を示した。クラスＩであると予測されたエピトープのいくつかは、何らかのレベルの交差提示を示した。
実施例８．エピトープは、ｍＲＮＡコンカテマー内の位置とは無関係に免疫原性である
エピトープは、ｍＲＮＡ内でのその位置とは無関係に免疫原性であった。ＣＡ８０及びＣＡ８１は、Ｔ細胞応答を誘発することが知られる２０の同一エピトープをコードしており、クラスＩＩエピトープを５つ、マウスのクラスＩエピトープを１０、マウスの正の対照（ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２２）（卵白アルブミン由来））を１つ、及びヒトの（ＨＬＡ－Ａ２）エピトープを４つ含む（未掲載）。ＣＡ８０とＣＡ８１とでは、これらの異なるエピトープの相対位置のみが異なる。１０μｇのｍＲＮＡでマウスを２回免疫化（初回免疫＋１４日目の追加免疫）し、２１日目にフローサイトメトリーによって脾臓細胞を分析した。
データは、図８Ａに示される。１０のクラスＩエピトープのうちの８つ、及び５つのクラスＩＩエピトープのうちの３つが免疫原性であった。これらのエピトープは、非刺激対照の８倍超の応答を示した。ｍＲＮＡ内の位置とは無関係に同様のレベルの免疫原性が観測された。図８Ｂは、ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋細胞の頻度パーセントと、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおけるインターフェロン－ガンマスポット形成単位（ＳＦＵ）と、の間に強い相関（Ｒの二乗＝０．７８）が存在することを示す。
ＣＡ－８０でのワクチン接種では、用量応答が観測された。図９Ａ及び図９Ｂに示されるように、ワクチンの投与量が減少するにつれて「ヒット」の減少が観測された。
１つの２０マーと複数の５マーとを使用して免疫化したときの、既知のエピトープに対するＴ細胞応答を比較した。図１０に示されるように、１つの２０マーまたは３つの３マーとしてワクチン接種すると、既知のエピトープに対するＴ細胞応答は同等であった。複数の５マーで免疫化すると、Ｔ細胞応答が僅かに高くなる傾向が観測された。
クラスＩエピトープを単独またはクラスＩＩによる支援の存在下で用いて免疫化したときのＴ細胞応答を比較した。図１１に示されるように、５つの既知のクラスＩエピトープを５マーとして単独投与（クラスＩＩによる支援なし）または５つの既知のクラスＩＩエピトープと共に投与（クラスＩＩによる支援あり）し、５つの既知のクラスＩエピトープに対するＴ細胞応答を比較した。後者の群には、既知のクラスＩエピトープの５マーも追加で含めた。既知のクラスＩエピトープに対するＴ細胞応答は、既知のクラスＩＩエピトープを含む５マーが存在すると強くなった。したがって、クラスＩＩ／Ｔｈエピトープは、クラスＩ／Ｔｃ応答を増進する。
ＭＣ３または化合物２５と共に製剤化したコンカテマーワクチンでのワクチン接種でＴ細胞応答を観測した。ＭＣ３及び化合物２５においてＣＡ－８１（１５の既知のマウスエピトープを含む）を製剤化した。図１２に示されるように、ワクチンにおけるそれぞれのエピトープに対するＴ細胞応答を測定し、２つの製剤間で応答を比較した。化合物２５で製剤化された材料は、ＭＣ３で製剤化された材料と同様のＴ細胞応答を生成した。
実施例９．固形腫瘍を有する患者におけるｍＲＮＡワクチンの安全性、忍容性、及び免疫原性を評価するための第Ｉ相非盲検試験
固形腫瘍を切除した患者におけるｍＲＮＡ１単独の安全性、忍容性、及び免疫原性、ならびに切除不能の固形腫瘍を有する患者におけるｍＲＮＡ１とペンブロリズマブ（ヒト化抗ＰＤ－１抗体）との組み合わせの安全性、忍容性、及び免疫原性を評価するための第Ｉ相非盲検試験が実施される。
目的：主目的：固形腫瘍を切除した患者におけるｍＲＮＡ－１の安全性及び忍容性（パートＡ）、ならびに切除不能の固形腫瘍を有する患者におけるｍＲＮＡ－１＋ペンブロリズマブの安全性及び忍容性（パートＢ）
副次目的：パートＡ：固形腫瘍を切除し、治療された患者のＲＦＳ。パートＢ：切除不能の固形腫瘍を有する患者（ペンブロリズマブの非盲検）のＯＲＲ、ＤＯＲ、ＰＦＳ、及びＯＳ
探索試験目的：免疫原性
方法論：２パート、非盲検、３＋３用量漸増：最大で４サイクルにわたる４回用量の投与に向けて、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、または０．４ｍｇのいずれかの固定用量のｍＲＮＡ－１の投与を、筋肉内（ＩＭ）注射を介して２１日サイクルの間に１回実施。
図１３には、ｍＲＮＡ－１のｍＲＮＡ構成要素の模式図が示される。ｍＲＮＡ－１は、ジヌクレオチド哺乳類キャップ１標準構造を５’末端に含み、このキャップ構造は、リボース糖の２’位がメチル化された最後から２番目のヌクレオチドに対して、５’－５’トリホスフェート配置で７－メチルグアノシンが連結されたものから構成される（Ｋｏｚａｋ，１９９１；Ｆｅｃｈｔｅｒ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎｌｅｅ，２００５）。このキャップ構造は、翻訳の開始に必要になる。このキャップ構造の次には、翻訳の開始が促進されるように最適化された４８ヌクレオチドの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）が続く。それぞれの患者向けに独特に定義されることになるｍＲＮＡ－１のタンパク質コード領域またはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の最初のアミノ酸をコードするＡＵＧメチオニン開始コドンの位置で５’ＵＴＲは終了する。ｍＲＮＡ－１のＯＲＦは、３つ連続して連結された哺乳類終止コドン（５’－ＵＧＡ－ＵＡＡ－ＵＡＧ－３’）で終了し、この終始コドンから、ｍＲＮＡの安定化が促進されるように最適化された一般的な所定の３’ＵＴＲヌクレオチド配列が開始する。ｍＲＮＡ－１は、約１００ヌクレオチドのアデノシンホモポリマーであるポリＡ尾部で終了し、ポリＡ尾部は、ｍＲＮＡの安定化及びタンパク質の翻訳に必要なものである。５’末端のキャップ構造と３’末端のポリＡ尾部とは両方共、ｍＲＮＡ－１が細胞の翻訳機構によって翻訳されるために必要なものである。５’キャップまたは３’ポリＡ尾部のいずれかを欠いたＲＮＡは、翻訳を受けることができず、それ故にタンパク質を生成しないことになる。５’末端に存在するキャップ１構造、または３’末端に存在するポリＡ尾部のいずれかを欠いたｍＲＮＡ－１の分解物はいずれも、どのようなタンパク質も生成しないと想定される。
図１４には、ｍＲＮＡ－１の一般的な分子配列の例が示され、この図では、患者特異的なコード領域は（Ｎ）として参照することよって示される。ｍＲＮＡ－１におけるヌクレオシドは、天然起源の哺乳類ｍＲＮＡヌクレオシドと化学的に同一であるが、例外として、哺乳類のｍＲＮＡに通常存在するウリジンヌクレオシドが、哺乳類のｔＲＮＡに存在する天然起源のピリミジン塩基であるＮ１－メチル－シュードウリジンで完全に交換されていることが異なる（Ｒｏｚｅｎｓｋｉ，Ｃｒａｉｎ ｅｔ ａｌ．１９９９、Ｋａｒｉｋｏ，Ｂｕｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．２００５）。このヌクレオシドは、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）受容体（例えば、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、Ｄｅｓｍｅｔ ａｎｄ Ｉｓｈｉｉ，２０１２）によるｍＲＮＡ－１の無差別認識を最小化するために通常のウリジン塩基の代わりにｍＲＮＡ－１に含められている。
実施例１０．固形腫瘍を有する患者におけるｍＲＮＡワクチンの安全性、忍容性、及び免疫原性を評価するための第Ｉ相非盲検試験
固形腫瘍を切除した患者におけるｍＲＮＡ２単独の安全性、忍容性、及び免疫原性、ならびに切除不能の固形腫瘍を有する患者におけるｍＲＮＡ２とペンブロリズマブ（ヒト化抗ＰＤ－１抗体）との組み合わせの安全性、忍容性、及び免疫原性を評価するための第Ｉ相非盲検試験が実施される。
目的：主目的：固形腫瘍を切除した患者におけるｍＲＮＡ－４１５７での単剤治療の安全性、忍容性、及び第２相の推奨用量（パートＡ）、ならびに切除不能の固形腫瘍を有する患者におけるｍＲＮＡ－４１５７＋ペンブロリズマブの安全性、忍容性、及び第２相の推奨用量（パートＢ）
方法論：２パート、非盲検、３＋３用量漸増：最大で９サイクルにわたる９回用量の投与（すなわち、６ヶ月間の投薬）に向けて、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、または０．４ｍｇのいずれかの固定用量のｍＲＮＡ－４１５７の投与を、筋肉内（ＩＭ）注射を介して２１日サイクルの間に１回実施。
実施例１１．ｐ５３においてスプライス部位の変異及びサイレント変異が反復して生じる「ホットスポット」
Ｐ５３遺伝子（正式記号ＴＰ５３）は、ヒトの癌においてほかのどの遺伝子よりも高い頻度で変異する。Ｐ５３に生じる変異のほとんどで、そのゲノム位置は１人または少数の患者のみに特有であるため、こうした変異は、特定の患者集団向けに設計される治療ワクチンのための反復ネオ抗原として使用できないことが大規模コホート研究によって示された。しかしながら、ｐ５３遺伝子座の小サブセットは実に「ホットスポット」のパターンを示しており、そこでは、遺伝子のいくつかの位置が相対的に高い頻度で変異するのである。際だったことに、反復して変異するこうした領域の大部分が、エクソンとイントロンとの境界付近に存在し、ｍＲＮＡのスプライシング機構によって認識される標準のヌクレオチド配列モチーフを破壊する。図１６に示されるように、スプライシングモチーフが変異すると、局所的なアミノ酸配列には変化が生じない（すなわち、同義変異またはイントロン変異）と予測されるとしても、最終的なｍＲＮＡ配列には変化が生じ得る。それ故に、こうした変異によって予測不可能な様式でｍＲＮＡのスプライシングに変化が生じ得、翻訳されるタンパク質が著しい機能的影響を受け得るにもかかわらず、こうした変異は、一般的なアノテーションツールによって「ノンコーディング」として注解されてしまい、さらに解析されることなく無視されることが多い。代替的にスプライシングを受けたアイソフォームにインフレームの配列変化が生じる（すなわち、ＰＴＣが生じない）のであれば、こうしたアイソフォームはＮＭＤによる排除を免れることができ、速やかに発現し、プロセシングを受けてＨＬＡ系によって細胞表面に提示される。さらに、変異に由来する代替的なスプライシングは、通常、「潜在性」であって、すなわち、正常組織では発現しないものであり、それ故に、Ｔ細胞によって非自己のネオ抗原として認識され得る。図１７には、保持型イントロン及び潜在性スプライシングの生成につながるホットスポットスプライス部位及びサイレント変異が示され、いくつかの変異部位が保持型イントロンまたは潜在性スプライシングを生成することがＲＮＡシークエンシングによって確認された。変異によって得られた２つの代表的なペプチドは、コードゲノムの他の箇所とは一致しないＨＬＡ－Ａ２結合エピトープを複数有していた。
ｐ５３において同定した反復変異は、
（１）コドン位置Ｔ１２５に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＡＶＳＰＣＩＳＦＶＷ（配列番号２）（ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５８：０１）、エピトープＨＰＬＡＳＣＱＣＦＦ（配列番号３）（ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１）、エピトープＦＶＷＮＦＧＩＰＬ（配列番号４）（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０６、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１）を含むペプチド配列ＴＡＫＳＶＴＣＴＶＳＣＰＥＧＬＡＳＭＲＬＱＣＬＡＶＳＰＣＩＳＦＶＷＮＦＧＩＰＬＨＰＬＡＳＣＱＣＦＦＩＶＹＰＬＮＶ（配列番号１）を有する保持型イントロンを誘導する変異、
（２）コドン位置３３１に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＬＱＶＬＳＬＧＴＳＹ（配列番号６）（ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１）、エピトープＦＱＳＮＴＱＮＡＶＦ（配列番号７）（ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１）を含むペプチド配列ＥＹＦＴＬＱＶＬＳＬＧＴＳＹＱＶＥＳＦＱＳＮＴＱＮＡＶＦＦＬＴＶＬＰＡＩＧＡＦＡＩＲＧＱ（配列番号５）を有する保持型イントロンを誘導する変異、
（３）コドン位置１２６に隣接する標準３’スプライス部位における変異であって、エピトープＣＴＭＦＣＱＬＡＫ（配列番号９）（ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１）、エピトープＫＳＶＴＣＴＭＦ（配列番号１０）（ＨＬＡ－Ｂ＊５８：０１）を含む新規のスパニングペプチド配列ＡＫＳＶＴＣＴＭＦＣＱＬＡＫ（配列番号８）を生成する潜在性の代替エクソン３’スプライス部位を誘導する変異、及び
（４）コドン位置２２４に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＶＰＹＥＰＰＥＶＷ（配列番号１２）（ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１）、エピトープＬＴＶＰＰＳＴＡＷ（配列番号１３）（ＨＬＡ－Ｂ＊５８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１）を含む新規のスパニングペプチド配列ＶＰＹＥＰＰＥＶＷＬＡＬＴＶＰＰＳＴＡＷＡＡ（配列番号１１）を生成する潜在性の代替イントロン５’スプライス部位を誘導する変異
を含み、
転写コドン位置は、Ｅｎｓｅｍｂｌのｖ８３のヒトゲノムアノテーションに由来する標準の全長ｐ５３転写物であるＥＮＳＴ０００００２６９３０５（配列番号１４）を参照したものである。
同等形態
当業者であれば、日常的な実験法を使用するだけで、本明細書に記載の開示の特定の実施形態に対する多くの同等形態を認識するか、または確認することができるであろう。そのような同等形態は、下記の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
本明細書に開示される、特許文書を含む参考文献はすべて、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

Claims (267)

  1. 癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有し、脂質ナノ粒子において製剤化されたｍＲＮＡと、免疫チェックポイント調節因子をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡと、を含む、ワクチン。
  2. 前記免疫チェックポイント調節因子が、阻害性チェックポイントポリペプチドである、請求項１に記載のワクチン。
  3. 前記阻害性チェックポイントポリペプチドが、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡ、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、及びＬＡＧ３からなる群から選択される分子に特異的に結合する抗体またはその断片である、請求項２に記載のワクチン。
  4. 前記阻害性チェックポイントポリペプチドが、抗ＣＴＬＡ４抗体または抗ＰＤ１抗体である、請求項２に記載のワクチン。
  5. 前記ｍＲＮＡが、２～１００の癌抗原をコードする、請求項１に記載のワクチン。
  6. 前記ｍＲＮＡが、１０～１００の癌抗原をコードする、請求項１に記載のワクチン。
  7. 前記ｍＲＮＡが、１０～１，０００の癌抗原をコードする、請求項１に記載のワクチン。
  8. 前記ワクチンが、個別化癌ワクチンであり、前記癌抗原が、対象特異的癌抗原である、請求項１～７のいずれか１項に記載のワクチン。
  9. 前記対象特異的癌抗原が、前記対象の腫瘍試料のエクソームの代表物である、請求項１に記載のワクチン。
  10. 前記対象特異的癌抗原が、前記対象の腫瘍試料のトランスクリプトームの代表物である、請求項１に記載のワクチン。
  11. 単一のｍＲＮＡが、前記癌抗原をコードする、請求項６または請求項７に記載のワクチン。
  12. 複数のｍＲＮＡが、前記癌抗原をコードする、請求項６または請求項７に記載のワクチン。
  13. それぞれのｍＲＮＡが、５～１０の癌抗原をコードする、請求項１２に記載のワクチン。
  14. それぞれのｍＲＮＡが、単一の癌抗原をコードする、請求項１２に記載のワクチン。
  15. それぞれのｍＲＮＡが、５０～２００の癌抗原をコードする、請求項１２に記載のワクチン。
  16. それぞれの癌抗原が、１０～５０のアミノ酸長である、請求項１４または請求項１５に記載のワクチン。
  17. それぞれの癌抗原が、２０～１００のアミノ酸長である、請求項１４または請求項１５に記載のワクチン。
  18. 前記ｍＲＮＡが、少なくとも１つの化学修飾を含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載のワクチン。
  19. 前記化学修飾が、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、Ｎ１－エチルシュードウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－シュードウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン、及び２’－Ｏ－メチルウリジンから選択される、請求項１８に記載のワクチン。
  20. 前記ワクチンが、脂質ナノ粒子において製剤化される、請求項１～１９のいずれか１項に記載のワクチン。
  21. 前記脂質ナノ粒子が、カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、ステロール、及び非カチオン性脂質を含む、請求項２０に記載のワクチン。
  22. 前記カチオン性脂質が、イオン化可能なカチオン性脂質であり、前記非カチオン性脂質が、中性脂質であり、前記ステロールが、コレステロールである、請求項２１に記載のワクチン。
  23. 前記カチオン性脂質が、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択される、請求項２２に記載のワクチン。
  24. 前記脂質ナノ粒子が、式（Ｉ）の化合物を含む、請求項２０に記載のワクチン。
  25. 前記式（Ｉ）の化合物が、化合物２５である、請求項２４に記載のワクチン。
  26. 前記脂質ナノ粒子が、０．４未満の多分散値を有する、請求項２０に記載のワクチン。
  27. 前記脂質ナノ粒子が、中性ｐＨ値で正味の中性電荷を有する、請求項２０に記載のワクチン。
  28. 前記ｍＲＮＡが、１つまたは複数の反復多型をコードする、請求項１～２５のいずれか１項に記載のワクチン。
  29. 前記１つまたは複数の反復多型が、ｐ５３における反復体細胞癌変異を含む、請求項２８に記載のワクチン。
  30. ｐ５３における前記１つまたは複数の反復体細胞癌変異が、
    （１）コドン位置Ｔ１２５に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＡＶＳＰＣＩＳＦＶＷ（配列番号２）（ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５８：０１）、エピトープＨＰＬＡＳＣＱＣＦＦ（配列番号３）（ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１）、エピトープＦＶＷＮＦＧＩＰＬ（配列番号４）（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０６、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１）を含むペプチド配列ＴＡＫＳＶＴＣＴＶＳＣＰＥＧＬＡＳＭＲＬＱＣＬＡＶＳＰＣＩＳＦＶＷＮＦＧＩＰＬＨＰＬＡＳＣＱＣＦＦＩＶＹＰＬＮＶ（配列番号１）を有する保持型イントロンを誘導する前記変異、
    （２）コドン位置３３１に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＬＱＶＬＳＬＧＴＳＹ（配列番号６）（ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１）、エピトープＦＱＳＮＴＱＮＡＶＦ（配列番号７）（ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１）を含むペプチド配列ＥＹＦＴＬＱＶＬＳＬＧＴＳＹＱＶＥＳＦＱＳＮＴＱＮＡＶＦＦＬＴＶＬＰＡＩＧＡＦＡＩＲＧＱ（配列番号５）を有する保持型イントロンを誘導する前記変異、
    （３）コドン位置１２６に隣接する標準３’スプライス部位における変異であって、エピトープＣＴＭＦＣＱＬＡＫ（配列番号９）（ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１）、エピトープＫＳＶＴＣＴＭＦ（配列番号１０）（ＨＬＡ－Ｂ＊５８：０１）を含む新規のスパニングペプチド配列ＡＫＳＶＴＣＴＭＦＣＱＬＡＫ（配列番号８）を生成する潜在性の代替エクソン３’スプライス部位を誘導する前記変異、及び／または
    （４）コドン位置２２４に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＶＰＹＥＰＰＥＶＷ（配列番号１２）（ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１）、エピトープＬＴＶＰＰＳＴＡＷ（配列番号１３）（ＨＬＡ－Ｂ＊５８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１）を含む新規のスパニングペプチド配列ＶＰＹＥＰＰＥＶＷＬＡＬＴＶＰＰＳＴＡＷＡＡ（配列番号１１）を生成する潜在性の代替イントロン５’スプライス部位を誘導する前記変異、
    からなる群から選択され、
    前記転写コドン位置が、Ｅｎｓｅｍｂｌのｖ８３のヒトゲノムアノテーションに由来する標準の全長ｐ５３転写物であるＥＮＳＴ０００００２６９３０５（配列番号１４）を参照したものである、請求項２９に記載のワクチン。
  31. 前記オープンリーディングフレームが、フラゲリンタンパク質またはフラゲリンペプチドをさらにコードする、請求項１～３０のいずれか１項に記載のワクチン。
  32. 前記フラゲリンタンパク質またはフラゲリンペプチドが、配列番号３０１～３０３のいずれか１つによって同定されるアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載のワクチン。
  33. 少なくとも２つの癌抗原エピトープをコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡと、脂質ナノ粒子と、を含む、個別化癌ワクチン。
  34. 前記ｍＲＮＡが、２～１００の癌抗原をコードする、請求項３３に記載の個別化癌ワクチン。
  35. 前記ｍＲＮＡが、１０～１，０００の癌抗原をコードする、請求項３３に記載の個別化癌ワクチン。
  36. 単一のｍＲＮＡが、前記癌抗原エピトープをコードする、請求項３４または請求項３５に記載の個別化癌ワクチン。
  37. 複数のｍＲＮＡが、前記癌抗原エピトープをコードする、請求項３４または請求項３５に記載の個別化癌ワクチン。
  38. それぞれのｍＲＮＡが、５～１０または２０～１００の癌抗原をコードする、請求項３７に記載の個別化癌ワクチン。
  39. それぞれのｍＲＮＡが、単一の癌抗原をコードする、請求項３７に記載の個別化癌ワクチン。
  40. それぞれの癌抗原エピトープが、１０～５０のアミノ酸長である、請求項３８または請求項３９に記載の個別化癌ワクチン。
  41. それぞれの癌抗原エピトープが、１５～２０のアミノ酸長である、請求項３８または請求項３９に記載の個別化癌ワクチン。
  42. それぞれの癌抗原エピトープが、２０～２００のアミノ酸長である、請求項３８または請求項３９に記載の個別化癌ワクチン。
  43. 前記ｍＲＮＡが、少なくとも１つの化学修飾を含む、請求項４０～４２のいずれか１項に記載の個別化癌ワクチン。
  44. 前記化学修飾が、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、Ｎ１－エチルシュードウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－シュードウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン、及び２’－Ｏ－メチルウリジンから選択される、請求項４３に記載の個別化癌ワクチン。
  45. 前記ナノ粒子が、５０～２００ｎｍの平均直径を有する、請求項４０～４３に記載の個別化癌ワクチン。
  46. 前記脂質ナノ粒子が、カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、ステロール、及び非カチオン性脂質を含む、請求項４５に記載の個別化癌ワクチン。
  47. 前記カチオン性脂質が、イオン化可能なカチオン性脂質であり、前記非カチオン性脂質が、中性脂質であり、前記ステロールが、コレステロールである、請求項４６に記載の個別化癌ワクチン。
  48. 前記カチオン性脂質が、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択される、請求項４６に記載の個別化癌ワクチン。
  49. 前記脂質ナノ粒子が、式（Ｉ）の化合物を含む、請求項４０～４３に記載の個別化癌ワクチン。
  50. 前記式（Ｉ）の化合物が、化合物２５である、請求項４９に記載の個別化癌ワクチン。
  51. 前記ナノ粒子が、０．４未満の多分散値を有する、請求項４５～５０に記載の個別化癌ワクチン。
  52. 前記ナノ粒子が、中性ｐＨ値で正味の中性電荷を有する、請求項４５に記載の個別化癌ワクチン。
  53. 前記ｍＲＮＡが、１つまたは複数の反復多型をコードする、請求項４０～５２のいずれか１項に記載の個別化癌ワクチン。
  54. 前記１つまたは複数の反復多型が、ｐ５３における反復体細胞癌変異を含む、請求項５３に記載の個別化癌ワクチン。
  55. ｐ５３における前記１つまたは複数の反復体細胞癌変異が、
    （１）コドン位置Ｔ１２５に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＡＶＳＰＣＩＳＦＶＷ（配列番号２）（ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５８：０１）、エピトープＨＰＬＡＳＣＱＣＦＦ（配列番号３）（ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１）、エピトープＦＶＷＮＦＧＩＰＬ（配列番号４）（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０６、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１）を含むペプチド配列ＴＡＫＳＶＴＣＴＶＳＣＰＥＧＬＡＳＭＲＬＱＣＬＡＶＳＰＣＩＳＦＶＷＮＦＧＩＰＬＨＰＬＡＳＣＱＣＦＦＩＶＹＰＬＮＶ（配列番号１）を有する保持型イントロンを誘導する前記変異、
    （２）コドン位置３３１に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＬＱＶＬＳＬＧＴＳＹ（配列番号６）（ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１）、エピトープＦＱＳＮＴＱＮＡＶＦ（配列番号７）（ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１）を含むペプチド配列ＥＹＦＴＬＱＶＬＳＬＧＴＳＹＱＶＥＳＦＱＳＮＴＱＮＡＶＦＦＬＴＶＬＰＡＩＧＡＦＡＩＲＧＱ（配列番号５）を有する保持型イントロンを誘導する前記変異、
    （３）コドン位置１２６に隣接する標準３’スプライス部位における変異であって、エピトープＣＴＭＦＣＱＬＡＫ（配列番号９）（ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１）、エピトープＫＳＶＴＣＴＭＦ（配列番号１０）（ＨＬＡ－Ｂ＊５８：０１）を含む新規のスパニングペプチド配列ＡＫＳＶＴＣＴＭＦＣＱＬＡＫ（配列番号８）を生成する潜在性の代替エクソン３’スプライス部位を誘導する前記変異、及び／または
    （４）コドン位置２２４に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＶＰＹＥＰＰＥＶＷ（配列番号１２）（ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１）、エピトープＬＴＶＰＰＳＴＡＷ（配列番号１３）（ＨＬＡ－Ｂ＊５８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１）を含む新規のスパニングペプチド配列ＶＰＹＥＰＰＥＶＷＬＡＬＴＶＰＰＳＴＡＷＡＡ（配列番号１１）を生成する潜在性の代替イントロン５’スプライス部位を誘導する前記変異、
    からなる群から選択され、
    前記転写コドン位置が、Ｅｎｓｅｍｂｌのｖ８３のヒトゲノムアノテーションに由来する標準の全長ｐ５３転写物であるＥＮＳＴ０００００２６９３０５（配列番号１４）を参照したものである、請求項５４に記載の個別化癌ワクチン。
  56. 前記オープンリーディングフレームが、前記エピトープの間に単一のヌクレオチドスペーサーを挟んで配置された複数のペプチドエピトープ抗原をコードし、前記複数のエピトープ抗原が、少なくとも２つのＭＨＣクラスＩエピトープ、及び少なくとも２つのＭＨＣクラスＩＩエピトープを含む、請求項４０～５５のいずれか１項に記載の個別化癌ワクチン。
  57. 前記オープンリーディングフレームが、前記エピトープの間にスペーサーを挟まずに互いに直接連結された複数のペプチドエピトープ抗原をコードし、前記複数のエピトープ抗原が、少なくとも２つのＭＨＣクラスＩエピトープ、及び少なくとも２つのＭＨＣクラスＩＩエピトープを含む、請求項３３～５５のいずれか１項に記載の個別化癌ワクチン。
  58. 前記複数のペプチドエピトープ抗原が、偽エピトープが最小化するように配置及び順序決定される、請求項５６または請求項５７に記載の個別化癌ワクチン。
  59. 前記複数のペプチドエピトープ抗原が、偽エピトープを含まないポリペプチドである、請求項５６または請求項５７に記載の個別化癌ワクチン。
  60. 前記複数のペプチドエピトープ抗原が、
    （Ｘ－Ｇ－Ｘ）１－１０（Ｇ－Ｙ－Ｇ－Ｙ）１－１０（Ｇ－Ｘ－Ｇ－Ｘ）０－１０（Ｇ－Ｙ－Ｇ－Ｙ）０－１０、
    （Ｘ－Ｇ）１－１０（Ｇ－Ｙ）１－１０（Ｇ－Ｘ）０－１０（Ｇ－Ｙ）０－１０、
    （Ｘ－Ｇ－Ｘ－Ｇ－Ｘ）１－１０（Ｇ－Ｙ－Ｇ－Ｙ）１－１０（Ｘ－Ｇ－Ｘ）０－１０（Ｇ－Ｙ－Ｇ－Ｙ）０－１０、
    （Ｘ－Ｇ－Ｘ）１－１０（Ｇ－Ｙ－Ｇ－Ｙ－Ｇ－Ｙ）１－１０（Ｘ－Ｇ－Ｘ）０－１０（Ｇ－Ｙ－Ｇ－Ｙ）０－１０、
    （Ｘ－Ｇ－Ｘ－Ｇ－Ｘ－Ｇ－Ｘ）１－１０（Ｇ－Ｙ－Ｇ－Ｙ）１－１０（Ｘ－Ｇ－Ｘ）０－１０（Ｇ－Ｙ－Ｇ－Ｙ）０－１０、
    （Ｘ－Ｇ－Ｘ）１－１０（Ｇ－Ｙ－Ｇ－Ｙ－Ｇ－Ｙ－Ｇ－Ｙ）１－１０（Ｘ－Ｇ－Ｘ）０－１０（Ｇ－Ｙ－Ｇ－Ｙ）０－１０、
    という構造を有するポリペプチドであり、
    Ｘが、１０～４０のアミノ酸長のＭＨＣクラスＩエピトープであり、Ｙが、１０～４０のアミノ酸長のＭＨＣクラスＩＩエピトープであり、Ｇが、グリシンである、請求項５６に記載の個別化癌ワクチン。
  61. 前記複数のペプチドエピトープ抗原が、
    （Ｘ）１－１０（Ｙ）１－１０（Ｘ）０－１０（Ｙ）０－１０、
    （Ｙ）１－１０（Ｘ）１－１０（Ｙ）０－１０（Ｘ）０－１０、
    （ＸＸ）１－１０（Ｙ）１－１０（Ｘ）０－１０（Ｙ）０－１０、
    （ＹＹ）１－１０（ＸＸ）１－１０（Ｙ）０－１０（Ｘ）０－１０、
    （Ｘ）１－１０（ＹＹ）１－１０（Ｘ）０－１０（Ｙ）０－１０、
    （ＸＸＸ）１－１０（ＹＹＹ）１－１０（ＸＸ）０－１０（ＹＹ）０－１０、
    （ＹＹＹ）１－１０（ＸＸＸ）１－１０（ＹＹ）０－１０（ＸＸ）０－１０、
    （ＸＹ）１－１０（Ｙ）１－１０（Ｘ）１－１０（Ｙ）１－１０、
    （ＹＸ）１－１０（Ｙ）１－１０（Ｘ）１－１０（Ｙ）１－１０、
    （ＹＸ）１－１０（Ｘ）１－１０（Ｙ）１－１０（Ｙ）１－１０、
    という構造を有するポリペプチドであり、
    Ｘが、１０～４０のアミノ酸長のＭＨＣクラスＩエピトープであり、Ｙが、１０～４０のアミノ酸長のＭＨＣクラスＩＩエピトープである、請求項５７に記載の個別化癌ワクチン。
  62. 前記オープンリーディングフレームが、フラゲリンタンパク質またはフラゲリンペプチドをさらにコードする、請求項４０～６１のいずれか１項に記載の個別化癌ワクチン。
  63. 前記フラゲリンタンパク質またはフラゲリンペプチドが、配列番号３０１～３０３のいずれか１つによって同定されるアミノ酸配列を含む、請求項６２に記載の個別化癌ワクチン。
  64. 対象における免疫応答の誘発方法であって、対象からの生体試料の単離と、前記生体試料に由来する少なくとも２の抗原の同定と、脂質ナノ粒子において製剤化された、前記少なくとも２つの抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンの前記対象への投与と、を含む、前記方法。
  65. 前記生体試料から２～１００の抗原が同定される、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記ｍＲＮＡワクチンが、前記２～１００の抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する、請求項６５に記載の方法。
  67. 単一のｍＲＮＡが、前記抗原をコードする、請求項６６に記載の方法。
  68. 複数のｍＲＮＡが、前記抗原をコードする、請求項６６に記載の方法。
  69. 抗原が、癌抗原である、請求項６４～６８のいずれか１項に記載の方法。
  70. 前記癌抗原が、点変異、フレームシフト変異、及び組換えから選択される変異を有する、請求項６９に記載の方法。
  71. 前記癌抗原が対象特異的であるということの、エクソーム解析による確認をさらに含む、請求項７０に記載の方法。
  72. 前記癌抗原が対象特異的であるということの、トランスクリプトーム解析による確認をさらに含む、請求項７０に記載の方法。
  73. 前記ｍＲＮＡワクチンの前記投与の少なくとも１ヶ月後に実施される、第２のセットの癌抗原を得るための、前記対象の試料に由来する少なくとも２つの癌抗原の同定と、前記対象に対する前記第２のセットの癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンの前記対象への投与と、をさらに含む、請求項７０に記載の方法。
  74. 前記対象の前記試料が、エクソームである、請求項７３に記載の方法。
  75. 前記対象の前記試料が、腫瘍試料である、請求項７３に記載の方法。
  76. 前記オープンリーディングフレームが、１つまたは複数の従来型癌抗原をさらにコードする、請求項６９～７５のいずれか１項に記載の方法。
  77. 前記従来型癌抗原が、変異していない抗原である、請求項７６に記載の方法。
  78. 前記従来型癌抗原が、変異した抗原である、請求項７６に記載の方法。
  79. 前記ｍＲＮＡワクチンが、１つまたは複数の従来型癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡをさらに含む、請求項６９～７５のいずれか１項に記載の方法。
  80. 前記ｍＲＮＡワクチンが、少なくとも１つの化学修飾を含む、請求項６４～７９のいずれか１項に記載の方法。
  81. 前記化学修飾が、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、Ｎ１－エチルシュードウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－シュードウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン、及び２’－Ｏ－メチルウリジンから選択される、請求項８０に記載の方法。
  82. ナノ粒子において製剤化される、請求項６４～８１のいずれか１項に記載の方法。
  83. 前記ナノ粒子が、５０～２００ｎｍの平均直径を有する、請求項８２に記載の方法。
  84. 前記ナノ粒子が、脂質ナノ粒子である、請求項８２に記載の方法。
  85. 前記脂質ナノ粒子が、カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、ステロール、及び非カチオン性脂質を含む、請求項８４に記載の方法。
  86. 前記カチオン性脂質が、イオン化可能なカチオン性脂質であり、前記非カチオン性脂質が、中性脂質であり、前記ステロールが、コレステロールである、請求項８４に記載の方法。
  87. 前記カチオン性脂質が、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択される、請求項８４に記載の方法。
  88. 前記脂質ナノ粒子が、式（Ｉ）の化合物を含む、請求項８２～８４のいずれか１項に記載の方法。
  89. 前記式（Ｉ）の化合物が、化合物２５である、請求項８８に記載の方法。
  90. 前記ナノ粒子が、０．４未満の多分散値を有する、請求項８２に記載の方法。
  91. 前記ナノ粒子が、中性ｐＨ値で正味の中性電荷を有する、請求項８２に記載の方法。
  92. 前記ｍＲＮＡが、１つまたは複数の反復多型をコードする、請求項６４～９１のいずれか１項に記載の方法。
  93. 前記１つまたは複数の反復多型が、ｐ５３における反復体細胞癌変異を含む、請求項９２に記載の方法。
  94. ｐ５３における前記１つまたは複数の反復体細胞癌変異が、
    （１）コドン位置Ｔ１２５に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＡＶＳＰＣＩＳＦＶＷ（配列番号２）（ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５８：０１）、エピトープＨＰＬＡＳＣＱＣＦＦ（配列番号３）（ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１）、エピトープＦＶＷＮＦＧＩＰＬ（配列番号４）（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０６、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１）を含むペプチド配列ＴＡＫＳＶＴＣＴＶＳＣＰＥＧＬＡＳＭＲＬＱＣＬＡＶＳＰＣＩＳＦＶＷＮＦＧＩＰＬＨＰＬＡＳＣＱＣＦＦＩＶＹＰＬＮＶ（配列番号１）を有する保持型イントロンを誘導する前記変異、
    （２）コドン位置３３１に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＬＱＶＬＳＬＧＴＳＹ（配列番号６）（ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１）、エピトープＦＱＳＮＴＱＮＡＶＦ（配列番号７）（ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１）を含むペプチド配列ＥＹＦＴＬＱＶＬＳＬＧＴＳＹＱＶＥＳＦＱＳＮＴＱＮＡＶＦＦＬＴＶＬＰＡＩＧＡＦＡＩＲＧＱ（配列番号５）を有する保持型イントロンを誘導する前記変異、
    （３）コドン位置１２６に隣接する標準３’スプライス部位における変異であって、エピトープＣＴＭＦＣＱＬＡＫ（配列番号９）（ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１）、エピトープＫＳＶＴＣＴＭＦ（配列番号１０）（ＨＬＡ－Ｂ＊５８：０１）を含む新規のスパニングペプチド配列ＡＫＳＶＴＣＴＭＦＣＱＬＡＫ（配列番号８）を生成する潜在性の代替エクソン３’スプライス部位を誘導する前記変異、及び／または
    （４）コドン位置２２４に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＶＰＹＥＰＰＥＶＷ（配列番号１２）（ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１）、エピトープＬＴＶＰＰＳＴＡＷ（配列番号１３）（ＨＬＡ－Ｂ＊５８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１）を含む新規のスパニングペプチド配列ＶＰＹＥＰＰＥＶＷＬＡＬＴＶＰＰＳＴＡＷＡＡ（配列番号１１）を生成する潜在性の代替イントロン５’スプライス部位を誘導する前記変異、
    からなる群から選択され、
    前記転写コドン位置が、Ｅｎｓｅｍｂｌのｖ８３のヒトゲノムアノテーションに由来する標準の全長ｐ５３転写物であるＥＮＳＴ０００００２６９３０５（配列番号１４）を参照したものである、請求項９３に記載の方法。
  95. 対象における免疫応答の誘発方法であって、第１のセットの癌抗原を得るための、対象の試料に由来する少なくとも２つの癌抗原の同定と、前記対象に対する前記第１のセットの癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンの前記対象への投与と、前記ｍＲＮＡワクチンの前記投与の少なくとも１ヶ月後に実施される、第２のセットの癌抗原を得るための、対象の試料に由来する少なくとも２つの癌抗原の同定と、前記対象に対する前記第２のセットの癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンの前記対象への投与と、を含む、前記方法。
  96. 癌抗原の前記第１のセットが、２～１００の抗原を含む、請求項９５に記載の方法。
  97. 第２のセットの抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する前記ｍＲＮＡワクチンが、第１のセットの癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する前記ｍＲＮＡワクチンの６ヶ月～１年後に前記対象に投与される、請求項９６に記載の方法。
  98. 第２のセットの抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する前記ｍＲＮＡワクチンが、第１のセットの癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する前記ｍＲＮＡワクチンの１～２年後に前記対象に投与される、請求項９６に記載の方法。
  99. 単一のｍＲＮＡが、前記癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する、請求項９６に記載の方法。
  100. 複数のｍＲＮＡが、前記抗原をコードする、請求項９６に記載の方法。
  101. 前記第２のセットの癌抗原が、２～１００の抗原を含む、請求項９５～１００のいずれか１項に記載の方法。
  102. 前記癌抗原が、点変異、フレームシフト変異、及び組換えから選択される変異を有する、請求項９６に記載の方法。
  103. 前記対象の前記試料が、エクソームである、請求項９５に記載の方法。
  104. 前記対象の前記試料が、腫瘍試料である、請求項９５に記載の方法。
  105. 前記オープンリーディングフレームが、１つまたは複数の従来型癌抗原をさらにコードする、請求項９５～１００のいずれか１項に記載の方法。
  106. 前記従来型癌抗原が、変異していない抗原である、請求項１０５に記載の方法。
  107. 前記従来型癌抗原が、変異した抗原である、請求項１０５に記載の方法。
  108. 前記ｍＲＮＡワクチンが、１つまたは複数の従来型癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡをさらに含む、請求項９５～１００のいずれか１項に記載の方法。
  109. 前記ｍＲＮＡワクチンが、少なくとも１つの化学修飾を含む、請求項９５～１０８のいずれか１項に記載の方法。
  110. 前記化学修飾が、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、Ｎ１－エチルシュードウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－シュードウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン、及び２’－Ｏ－メチルウリジンから選択される、請求項１０９に記載の方法。
  111. ナノ粒子において製剤化される、請求項９５～１１０のいずれか１項に記載の方法。
  112. 前記ナノ粒子が、５０～２００ｎｍの平均直径を有する、請求項１１１に記載の方法。
  113. 前記ナノ粒子が、脂質ナノ粒子である、請求項１１１に記載の方法。
  114. 前記脂質ナノ粒子が、カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、ステロール、及び非カチオン性脂質を含む、請求項１１３に記載の方法。
  115. 前記カチオン性脂質が、イオン化可能なカチオン性脂質であり、前記非カチオン性脂質が、中性脂質であり、前記ステロールが、コレステロールである、請求項１１４に記載の方法。
  116. 前記カチオン性脂質が、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択される、請求項１１４に記載の方法。
  117. 前記ナノ粒子が、式（Ｉ）の化合物を含む、請求項８７～８９のいずれか１項に記載の方法。
  118. 前記式（Ｉ）の化合物が、化合物２５である、請求項１１７に記載の方法。
  119. 前記ナノ粒子が、０．４未満の多分散値を有する、請求項１１１に記載の方法。
  120. 前記ナノ粒子が、中性ｐＨ値で正味の中性電荷を有する、請求項１１１の方法。
  121. ｍＲＮＡ癌ワクチンを生成するための、癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡと脂質ナノ粒子製剤との混合と、混合の２４時間以内に実施される前記ｍＲＮＡ癌ワクチンの対象への投与と、を含む方法。
  122. 前記ｍＲＮＡ癌ワクチンが、混合の１２時間以内に前記対象に投与される、請求項１２１に記載の方法。
  123. 前記ｍＲＮＡ癌ワクチンが、混合の１時間以内に前記対象に投与される、請求項１２１に記載の方法。
  124. 前記ｍＲＮＡ癌ワクチンが、２～１００の癌抗原をコードする、請求項１２１に記載の方法。
  125. 前記ｍＲＮＡ癌ワクチンが、１０～１００の癌抗原をコードする、請求項１２１に記載の方法。
  126. 前記ワクチンが、個別化癌ワクチンであり、前記癌抗原が、対象特異的癌抗原である、請求項１２１～１２５のいずれか１項に記載の方法。
  127. 前記対象特異的癌抗原が、前記対象の腫瘍試料のエクソームの代表物である、請求項１２６に記載の方法。
  128. 前記対象特異的癌抗原が、前記対象の腫瘍試料のトランスクリプトームの代表物である、請求項１２６に記載の方法。
  129. 前記対象特異的癌抗原が、前記対象のエクソームの代表物である、請求項１２６に記載の方法。
  130. 単一のｍＲＮＡが、前記癌抗原をコードする、請求項１２４または請求項１２５に記載の方法。
  131. 複数のｍＲＮＡが、前記癌抗原をコードする、請求項１２７または請求項１２５に記載の方法。
  132. それぞれのｍＲＮＡが、５～１０の癌抗原をコードする、請求項１３１に記載の方法。
  133. それぞれのｍＲＮＡが、単一の癌抗原をコードする、請求項１３１に記載の方法。
  134. それぞれの癌抗原が、１０～５０のアミノ酸長である、請求項１３２または請求項１３３に記載の方法。
  135. それぞれの癌抗原が、１５～２０のアミノ酸長である、請求項１３２または請求項１３３に記載の方法。
  136. 前記ｍＲＮＡが、１つまたは複数の反復多型をコードする、請求項９５～１３５のいずれか１項に記載の方法。
  137. 前記１つまたは複数の反復多型が、ｐ５３における反復体細胞癌変異を含む、請求項１３６に記載の方法。
  138. ｐ５３における前記１つまたは複数の反復体細胞癌変異が、
    （１）コドン位置Ｔ１２５に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＡＶＳＰＣＩＳＦＶＷ（配列番号２）（ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５８：０１）、エピトープＨＰＬＡＳＣＱＣＦＦ（配列番号３）（ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１）、エピトープＦＶＷＮＦＧＩＰＬ（配列番号４）（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０６、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１）を含むペプチド配列ＴＡＫＳＶＴＣＴＶＳＣＰＥＧＬＡＳＭＲＬＱＣＬＡＶＳＰＣＩＳＦＶＷＮＦＧＩＰＬＨＰＬＡＳＣＱＣＦＦＩＶＹＰＬＮＶ（配列番号１）を有する保持型イントロンを誘導する前記変異、
    （２）コドン位置３３１に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＬＱＶＬＳＬＧＴＳＹ（配列番号６）（ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１）、エピトープＦＱＳＮＴＱＮＡＶＦ（配列番号７）（ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１）を含むペプチド配列ＥＹＦＴＬＱＶＬＳＬＧＴＳＹＱＶＥＳＦＱＳＮＴＱＮＡＶＦＦＬＴＶＬＰＡＩＧＡＦＡＩＲＧＱ（配列番号５）を有する保持型イントロンを誘導する前記変異、
    （３）コドン位置１２６に隣接する標準３’スプライス部位における変異であって、エピトープＣＴＭＦＣＱＬＡＫ（配列番号９）（ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１）、エピトープＫＳＶＴＣＴＭＦ（配列番号１０）（ＨＬＡ－Ｂ＊５８：０１）を含む新規のスパニングペプチド配列ＡＫＳＶＴＣＴＭＦＣＱＬＡＫ（配列番号８）を生成する潜在性の代替エクソン３’スプライス部位を誘導する前記変異、及び／または
    （４）コドン位置２２４に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＶＰＹＥＰＰＥＶＷ（配列番号１２）（ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１）、エピトープＬＴＶＰＰＳＴＡＷ（配列番号１３）（ＨＬＡ－Ｂ＊５８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１）を含む新規のスパニングペプチド配列ＶＰＹＥＰＰＥＶＷＬＡＬＴＶＰＰＳＴＡＷＡＡ（配列番号１１）を生成する潜在性の代替イントロン５’スプライス部位を誘導する前記変異、
    からなる群から選択され、
    前記転写コドン位置が、Ｅｎｓｅｍｂｌのｖ８３のヒトゲノムアノテーションに由来する標準の全長ｐ５３転写物であるＥＮＳＴ０００００２６９３０５（配列番号１４）を参照したものである、請求項１３７に記載の方法。
  139. 脂質ナノ粒子製剤を収容する容器と、
    ワクチン製剤を収容する容器と、
    対象への投与までの２４時間以内に、個別化ｍＲＮＡ癌ワクチンを前記ワクチン製剤に添加して個別化ｍＲＮＡ癌ワクチン製剤を生成し、前記個別化ｍＲＮＡ癌ワクチン製剤と前記脂質ナノ粒子製剤とを混合することについての説明と、
    を含む、キット。
  140. ２～１００の癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡをさらに含む、請求項１３９に記載のキット。
  141. 対象における免疫応答の誘発方法であって、対象の試料に由来する少なくとも２つの癌抗原の同定と、前記少なくとも２つの癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡの前記対象への投与と、癌治療剤の前記対象への投与と、を含む、前記方法。
  142. 前記癌治療剤が、標的治療である、請求項１４１に記載の方法。
  143. 前記標的治療が、ＢＲＡＦ阻害剤である、請求項１４２に記載の方法。
  144. 前記ＢＲＡＦ阻害剤が、ベムラフェニブ（ＰＬＸ４０３２）である、請求項１４２に記載の方法。
  145. 前記ＢＲＡＦ阻害剤が、ダブラフェニブである、請求項１４３に記載の方法。
  146. 前記癌治療剤が、Ｔ細胞治療剤である、請求項１４１に記載の方法。
  147. 前記Ｔ細胞治療剤が、チェックポイント阻害剤である、請求項１４６に記載の方法。
  148. 前記チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－１抗体である、請求項１４７に記載の方法。
  149. 抗ＰＤ－１抗体が、ＢＭＳ－９３６５５８（ニボルマブ）である、請求項１４８に記載の方法。
  150. 前記チェックポイント阻害剤が、抗ＣＴＬＡ－４抗体である、請求項１４３に記載の方法。
  151. 前記抗ＣＴＬＡ－４抗体が、イピリムマブである、請求項１５０に記載の方法。
  152. 前記Ｔ細胞治療剤が、ＯＸ４０Ｌである、請求項１４６に記載の方法。
  153. 前記癌治療剤が、集団ベースの腫瘍特異的抗原を含むワクチンである、請求項１４１に記載の方法。
  154. 前記癌治療剤が、１つまたは複数の従来型癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡを含むワクチンである、請求項１４１に記載の方法。
  155. 前記少なくとも２つの癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する前記ｍＲＮＡが、前記癌治療剤と同時に前記対象に投与される、請求項１４１～１５４のいずれか１項に記載の方法。
  156. 前記少なくとも２つの癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する前記ｍＲＮＡが、前記癌治療剤の投与の前に前記対象に投与される、請求項１４１～１５４のいずれか１項に記載の方法。
  157. 前記少なくとも２つの癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する前記ｍＲＮＡが、前記癌治療剤の投与の後に前記対象に投与される、請求項１４１～１５４のいずれか１項に記載の方法。
  158. 対象における免疫応答の誘発方法であって、対象の試料に由来する少なくとも２つの癌抗原の同定と、前記少なくとも２つの癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンの前記対象への投与と、を含み、前記少なくとも２つの癌抗原が、フレームシフト変異及び組換えからなる群から選択される変異を含む、前記方法。
  159. 前記ｍＲＮＡワクチンが、２～１００の癌抗原をコードする、請求項１５８に記載の方法。
  160. 単一のｍＲＮＡが、前記抗原をコードする、請求項１５９に記載の方法。
  161. 複数のｍＲＮＡが、前記抗原をコードする、請求項１５９に記載の方法。
  162. 前記ｍＲＮＡワクチンが、少なくとも１つの化学修飾を含む、請求項１５８～１６１のいずれか１項に記載の方法。
  163. 前記化学修飾が、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、Ｎ１－エチルシュードウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－シュードウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン、及び２’－Ｏ－メチルウリジンから選択される、請求項１６２に記載の方法。
  164. ナノ粒子において製剤化される、請求項１５８～１６３のいずれか１項に記載の方法。
  165. 前記ナノ粒子が、５０～２００ｎｍの平均直径を有する、請求項１６４に記載の方法。
  166. 前記ナノ粒子が、脂質ナノ粒子である、請求項１６４に記載の方法。
  167. 前記脂質ナノ粒子が、カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、ステロール、及び非カチオン性脂質を含む、請求項１６５に記載の方法。
  168. 前記カチオン性脂質が、イオン化可能なカチオン性脂質であり、前記非カチオン性脂質が、中性脂質であり、前記ステロールが、コレステロールである、請求項１６７に記載の方法。
  169. 前記カチオン性脂質が、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択される、請求項１６７に記載の方法。
  170. 前記ナノ粒子が、式（Ｉ）の化合物を含む、請求項１６４～１６６のいずれか１項に記載の方法。
  171. 前記式（Ｉ）の化合物が、化合物２５である、請求項１７０に記載の方法。
  172. 前記ナノ粒子が、０．４未満の多分散値を有する、請求項１６４に記載の方法。
  173. 前記ナノ粒子が、中性ｐＨ値で正味の中性電荷を有する、請求項１６４に記載の方法。
  174. 前記ｍＲＮＡが、１つまたは複数の反復多型をコードする、請求項１４１～１７３のいずれか１項に記載の方法。
  175. 前記１つまたは複数の反復多型が、ｐ５３における反復体細胞癌変異を含む、請求項１７４に記載の方法。
  176. ｐ５３における前記１つまたは複数の反復体細胞癌変異が、
    （１）コドン位置Ｔ１２５に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＡＶＳＰＣＩＳＦＶＷ（配列番号２）（ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５８：０１）、エピトープＨＰＬＡＳＣＱＣＦＦ（配列番号３）（ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１）、エピトープＦＶＷＮＦＧＩＰＬ（配列番号４）（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０６、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１）を含むペプチド配列ＴＡＫＳＶＴＣＴＶＳＣＰＥＧＬＡＳＭＲＬＱＣＬＡＶＳＰＣＩＳＦＶＷＮＦＧＩＰＬＨＰＬＡＳＣＱＣＦＦＩＶＹＰＬＮＶ（配列番号１）を有する保持型イントロンを誘導する前記変異、
    （２）コドン位置３３１に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＬＱＶＬＳＬＧＴＳＹ（配列番号６）（ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１）、エピトープＦＱＳＮＴＱＮＡＶＦ（配列番号７）（ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１）を含むペプチド配列ＥＹＦＴＬＱＶＬＳＬＧＴＳＹＱＶＥＳＦＱＳＮＴＱＮＡＶＦＦＬＴＶＬＰＡＩＧＡＦＡＩＲＧＱ（配列番号５）を有する保持型イントロンを誘導する前記変異、
    （３）コドン位置１２６に隣接する標準３’スプライス部位における変異であって、エピトープＣＴＭＦＣＱＬＡＫ（配列番号９）（ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１）、エピトープＫＳＶＴＣＴＭＦ（配列番号１０）（ＨＬＡ－Ｂ＊５８：０１）を含む新規のスパニングペプチド配列ＡＫＳＶＴＣＴＭＦＣＱＬＡＫ（配列番号８）を生成する潜在性の代替エクソン３’スプライス部位を誘導する前記変異、及び／または
    （４）コドン位置２２４に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＶＰＹＥＰＰＥＶＷ（配列番号１２）（ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１）、エピトープＬＴＶＰＰＳＴＡＷ（配列番号１３）（ＨＬＡ－Ｂ＊５８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１）を含む新規のスパニングペプチド配列ＶＰＹＥＰＰＥＶＷＬＡＬＴＶＰＰＳＴＡＷＡＡ（配列番号１１）を生成する潜在性の代替イントロン５’スプライス部位を誘導する前記変異、
    からなる群から選択され、
    前記転写コドン位置が、Ｅｎｓｅｍｂｌのｖ８３のヒトゲノムアノテーションに由来する標準の全長ｐ５３転写物であるＥＮＳＴ０００００２６９３０５（配列番号１４）を参照したものである、請求項１７５に記載の方法。
  177. 前記少なくとも２つの癌抗原が、対象特異的癌抗原である、請求項３３に記載の個別化癌ワクチン。
  178. 前記ペプチドエピトープが、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、及び少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープを含む、請求項１に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
  179. 前記エピトープの少なくとも３０％がＭＨＣクラスＩエピトープである、請求項１に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
  180. 前記エピトープの少なくとも３０％がＭＨＣクラスＩＩエピトープである、請求項１に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
  181. 前記阻害性チェックポイントポリペプチドが、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡ、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、及びＬＡＧ３からなる群から選択される分子に特異的に結合する抗体またはその断片である、請求項１に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
  182. サイトカインをコードするｍＲＮＡをさらに含む、請求項１に記載のｍＲＮＡ癌ワクチン。
  183. 少なくとも２つの癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡを含む個別化癌ワクチンであって、前記少なくとも２つの癌抗原が、対象のエキソソーム抗原の代表物である、前記個別化癌ワクチン。
  184. 前記ｍＲＮＡが、２～１００の癌抗原をコードする、請求項１８３に記載の個別化癌ワクチン。
  185. 前記ｍＲＮＡが、１０～１００の癌抗原をコードする、請求項１８３に記載の個別化癌ワクチン。
  186. 単一のｍＲＮＡが、前記癌抗原をコードする、請求項１８４または請求項１８５に記載の個別化癌ワクチン。
  187. 複数のｍＲＮＡが、前記癌抗原をコードする、請求項１８４または請求項１８５に記載の個別化癌ワクチン。
  188. それぞれのｍＲＮＡが、５～１０の癌抗原をコードする、請求項１８７に記載の個別化癌ワクチン。
  189. それぞれのｍＲＮＡが、単一の癌抗原をコードする、請求項１８７に記載の個別化癌ワクチン。
  190. それぞれの癌抗原が、１０～５０のアミノ酸長である、請求項１８８または請求項１８９に記載の個別化癌ワクチン。
  191. それぞれの癌抗原が、１５～２０のアミノ酸長である、請求項１８８または請求項１８９に記載の個別化癌ワクチン。
  192. 前記ｍＲＮＡが、少なくとも１つの化学修飾を含む、請求項１８３～１８５のいずれか１項に記載の個別化癌ワクチン。
  193. 前記化学修飾が、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、Ｎ１－エチルシュードウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－シュードウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン、及び２’－Ｏ－メチルウリジンから選択される、請求項１９２に記載の個別化癌ワクチン。
  194. ナノ粒子において製剤化される、請求項１８３～１９３のいずれか１項に記載の個別化癌ワクチン。
  195. 前記ナノ粒子が、５０～２００ｎｍの平均直径を有する、請求項１９４に記載の個別化癌ワクチン。
  196. 前記ナノ粒子が、脂質ナノ粒子である、請求項１９４に記載の個別化癌ワクチン。
  197. 前記脂質ナノ粒子が、カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、ステロール、及び非カチオン性脂質を含む、請求項１９６に記載の個別化癌ワクチン。
  198. 前記カチオン性脂質が、イオン化可能なカチオン性脂質であり、前記非カチオン性脂質が、中性脂質であり、前記ステロールが、コレステロールである、請求項１９７に記載の個別化癌ワクチン。
  199. 前記カチオン性脂質が、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択される、請求項１９７に記載の個別化癌ワクチン。
  200. 前記ナノ粒子が、式（Ｉ）の化合物を含む、請求項１９４～１９６のいずれか１項に記載の個別化癌ワクチン。
  201. 前記式（Ｉ）の化合物が、化合物２５である、請求項２００に記載の個別化癌ワクチン。
  202. 前記ナノ粒子が、０．４未満の多分散値を有する、請求項１９４に記載の個別化癌ワクチン。
  203. 前記ナノ粒子が、中性ｐＨ値で正味の中性電荷を有する、請求項１９４に記載の個別化癌ワクチン。
  204. 前記少なくとも２つの抗原が、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ、及び少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープを含むペプチドエピトープである、請求項１８３に記載の個別化癌ワクチン。
  205. 前記エピトープの少なくとも３０％がＭＨＣクラスＩエピトープである、請求項２０４に記載の個別化癌ワクチン。
  206. 前記エピトープの少なくとも３０％がＭＨＣクラスＩＩエピトープである、請求項２０４に記載の個別化癌ワクチン。
  207. ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡ、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、及びＬＡＧ３からなる群から選択される分子に特異的に結合する抗体またはその断片などの阻害性チェックポイントポリペプチドをコードするｍＲＮＡをさらに含む、請求項２０４に記載の個別化癌ワクチン。
  208. 前記ｍＲＮＡが、１つまたは複数の反復多型をコードする、請求項１８３～２０７のいずれか１項に記載の個別化癌ワクチン。
  209. 前記１つまたは複数の反復多型が、ｐ５３における反復体細胞癌変異を含む、請求項２０８に記載の個別化癌ワクチン。
  210. ｐ５３における前記１つまたは複数の反復体細胞癌変異が、
    （１）コドン位置Ｔ１２５に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＡＶＳＰＣＩＳＦＶＷ（配列番号２）（ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５８：０１）、エピトープＨＰＬＡＳＣＱＣＦＦ（配列番号３）（ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１）、エピトープＦＶＷＮＦＧＩＰＬ（配列番号４）（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０６、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１）を含むペプチド配列ＴＡＫＳＶＴＣＴＶＳＣＰＥＧＬＡＳＭＲＬＱＣＬＡＶＳＰＣＩＳＦＶＷＮＦＧＩＰＬＨＰＬＡＳＣＱＣＦＦＩＶＹＰＬＮＶ（配列番号１）を有する保持型イントロンを誘導する前記変異、
    （２）コドン位置３３１に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＬＱＶＬＳＬＧＴＳＹ（配列番号６）（ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１）、エピトープＦＱＳＮＴＱＮＡＶＦ（配列番号７）（ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１）を含むペプチド配列ＥＹＦＴＬＱＶＬＳＬＧＴＳＹＱＶＥＳＦＱＳＮＴＱＮＡＶＦＦＬＴＶＬＰＡＩＧＡＦＡＩＲＧＱ（配列番号５）を有する保持型イントロンを誘導する前記変異、
    （３）コドン位置１２６に隣接する標準３’スプライス部位における変異であって、エピトープＣＴＭＦＣＱＬＡＫ（配列番号９）（ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１）、エピトープＫＳＶＴＣＴＭＦ（配列番号１０）（ＨＬＡ－Ｂ＊５８：０１）を含む新規のスパニングペプチド配列ＡＫＳＶＴＣＴＭＦＣＱＬＡＫ（配列番号８）を生成する潜在性の代替エクソン３’スプライス部位を誘導する前記変異、及び／または
    （４）コドン位置２２４に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＶＰＹＥＰＰＥＶＷ（配列番号１２）（ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１）、エピトープＬＴＶＰＰＳＴＡＷ（配列番号１３）（ＨＬＡ－Ｂ＊５８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１）を含む新規のスパニングペプチド配列ＶＰＹＥＰＰＥＶＷＬＡＬＴＶＰＰＳＴＡＷＡＡ（配列番号１１）を生成する潜在性の代替イントロン５’スプライス部位を誘導する前記変異、
    からなる群から選択され、
    前記転写コドン位置が、Ｅｎｓｅｍｂｌのｖ８３のヒトゲノムアノテーションに由来する標準の全長ｐ５３転写物であるＥＮＳＴ０００００２６９３０５（配列番号１４）を参照したものである、請求項２０９に記載の個別化癌ワクチン。
  211. 対象のワクチン接種方法であって、対象からのエキソソームの単離と、前記エキソソームからの少なくとも２つの抗原の同定と、前記少なくとも２つの抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンの前記対象への投与と、を含む、前記方法。
  212. ２～１００の抗原が前記エキソソームから同定される、請求項２１１に記載の方法。
  213. 前記ｍＲＮＡワクチンが、前記２～１００の抗原をコードするオープンリーディングフレームを有する、請求項２１２に記載の方法。
  214. 単一のｍＲＮＡが、前記抗原をコードする、請求項２１３に記載の方法。
  215. 複数のｍＲＮＡが、前記抗原をコードする、請求項２１３に記載の方法。
  216. 抗原が、癌抗原である、請求項２１１～２１５のいずれか１項に記載の方法。
  217. 前記癌抗原が、点変異、フレームシフト変異、及び組換えから選択される変異を有する、請求項２１６に記載の方法。
  218. 前記癌抗原が対象特異的であるということの、エクソーム解析による確認をさらに含む、請求項２１７に記載の方法。
  219. 前記癌抗原が対象特異的であるということの、トランスクリプトーム解析による確認をさらに含む、請求項２１７に記載の方法。
  220. 前記ｍＲＮＡワクチンの前記投与の少なくとも１ヶ月後に実施される、第２のセットの癌抗原を得るための、前記対象の試料に由来する少なくとも２つの癌抗原の同定と、前記対象に対する前記第２のセットの癌抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡワクチンの前記対象への投与と、をさらに含む、請求項２１７に記載の方法。
  221. 前記対象の前記試料が、エキソソームである、請求項２２０に記載の方法。
  222. 前記対象の前記試料が、腫瘍試料である、請求項２２０に記載の方法。
  223. 前記ｍＲＮＡワクチンが、少なくとも１つの化学修飾を含む、請求項２１１～２２２のいずれか１項に記載の方法。
  224. 前記化学修飾が、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、Ｎ１－エチルシュードウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－シュードウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン、及び２’－Ｏ－メチルウリジンから選択される、請求項２２３に記載の方法。
  225. ナノ粒子において製剤化される、請求項２１１～２２４のいずれか１項に記載の方法。
  226. 前記ナノ粒子が、５０～２００ｎｍの平均直径を有する、請求項２２５に記載の方法。
  227. 前記ナノ粒子が、脂質ナノ粒子である、請求項２２５に記載の方法。
  228. 前記脂質ナノ粒子が、カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、ステロール、及び非カチオン性脂質を含む、請求項２２７に記載の方法。
  229. 前記カチオン性脂質が、イオン化可能なカチオン性脂質であり、前記非カチオン性脂質が、中性脂質であり、前記ステロールが、コレステロールである、請求項２２７に記載の方法。
  230. 前記カチオン性脂質が、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ジリノレイル－メチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－イル）９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択される、請求項２２７に記載の方法。
  231. 前記ナノ粒子が、式（Ｉ）の化合物を含む、請求項２２５～２２７のいずれか１項に記載の方法。
  232. 前記式（Ｉ）の化合物が、化合物２５である、請求項２３１に記載の方法。
  233. 前記ナノ粒子が、０．４未満の多分散値を有する、請求項２２５に記載の方法。
  234. 前記ナノ粒子が、中性ｐＨ値で正味の中性電荷を有する、請求項２２５に記載の方法。
  235. 前記対象への癌治療剤の投与をさらに含む、請求項２１１に記載の方法。
  236. 前記癌治療剤が、標的治療である、請求項２３５に記載の方法。
  237. 前記標的治療が、ＢＲＡＦ阻害剤である、請求項２３６に記載の方法。
  238. 前記ＢＲＡＦ阻害剤が、ベムラフェニブ（ＰＬＸ４０３２）である、請求項２３６に記載の方法。
  239. 前記ＢＲＡＦ阻害剤が、ダブラフェニブである、請求項２３７に記載の方法。
  240. 前記癌治療剤が、Ｔ細胞治療剤である、請求項２３５に記載の方法。
  241. 前記Ｔ細胞治療剤が、チェックポイント阻害剤をコードするｍＲＮＡである、請求項２４０に記載の方法。
  242. 前記ｍＲＮＡが、抗ＰＤ－１抗体をコードする、請求項２４１に記載の方法。
  243. 抗ＰＤ－１抗体が、ＢＭＳ－９３６５５８（ニボルマブ）である、請求項２４２に記載の方法。
  244. 前記ｍＲＮＡが、抗ＣＴＬＡ－４抗体をコードする、請求項２４１に記載の方法。
  245. 前記抗ＣＴＬＡ－４抗体が、イピリムマブである、請求項２４４に記載の方法。
  246. 前記Ｔ細胞治療剤が、ＯＸ４０Ｌである、請求項２３６に記載の方法。
  247. ＡＰＣ再プログラム化分子をコードするｍＲＮＡをさらに含む、請求項２１１に記載の方法。
  248. 前記ＡＰＣ再プログラム化分子が、ＣＩＩＴＡである、請求項２４７に記載の方法。
  249. 前記少なくとも２つの癌抗原が、フレームシフト変異及び組換えからなる群から選択される変異を含む、請求項２１１に記載の方法。
  250. 前記ｍＲＮＡが、１つまたは複数の反復多型をコードする、請求項２１１～２４９のいずれか１項に記載の方法。
  251. 前記１つまたは複数の反復多型が、ｐ５３における反復体細胞癌変異を含む、請求項２５０に記載の方法。
  252. ｐ５３における前記１つまたは複数の反復体細胞癌変異が、
    （１）コドン位置Ｔ１２５に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＡＶＳＰＣＩＳＦＶＷ（配列番号２）（ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５８：０１）、エピトープＨＰＬＡＳＣＱＣＦＦ（配列番号３）（ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１）、エピトープＦＶＷＮＦＧＩＰＬ（配列番号４）（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０６、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１）を含むペプチド配列ＴＡＫＳＶＴＣＴＶＳＣＰＥＧＬＡＳＭＲＬＱＣＬＡＶＳＰＣＩＳＦＶＷＮＦＧＩＰＬＨＰＬＡＳＣＱＣＦＦＩＶＹＰＬＮＶ（配列番号１）を有する保持型イントロンを誘導する前記変異、
    （２）コドン位置３３１に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＬＱＶＬＳＬＧＴＳＹ（配列番号６）（ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１）、エピトープＦＱＳＮＴＱＮＡＶＦ（配列番号７）（ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１）を含むペプチド配列ＥＹＦＴＬＱＶＬＳＬＧＴＳＹＱＶＥＳＦＱＳＮＴＱＮＡＶＦＦＬＴＶＬＰＡＩＧＡＦＡＩＲＧＱ（配列番号５）を有する保持型イントロンを誘導する前記変異、
    （３）コドン位置１２６に隣接する標準３’スプライス部位における変異であって、エピトープＣＴＭＦＣＱＬＡＫ（配列番号９）（ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１）、エピトープＫＳＶＴＣＴＭＦ（配列番号１０）（ＨＬＡ－Ｂ＊５８：０１）を含む新規のスパニングペプチド配列ＡＫＳＶＴＣＴＭＦＣＱＬＡＫ（配列番号８）を生成する潜在性の代替エクソン３’スプライス部位を誘導する前記変異、及び／または
    （４）コドン位置２２４に隣接する標準５’スプライス部位における変異であって、エピトープＶＰＹＥＰＰＥＶＷ（配列番号１２）（ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１）、エピトープＬＴＶＰＰＳＴＡＷ（配列番号１３）（ＨＬＡ－Ｂ＊５８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１）を含む新規のスパニングペプチド配列ＶＰＹＥＰＰＥＶＷＬＡＬＴＶＰＰＳＴＡＷＡＡ（配列番号１１）を生成する潜在性の代替イントロン５’スプライス部位を誘導する前記変異、
    からなる群から選択され、
    前記転写コドン位置が、Ｅｎｓｅｍｂｌのｖ８３のヒトゲノムアノテーションに由来する標準の全長ｐ５３転写物であるＥＮＳＴ０００００２６９３０５（配列番号１４）を参照したものである、請求項２５１に記載の方法。
  253. 癌抗原をコードするｍＲＮＡを有効用量で含む、対象のワクチン接種における使用を目的とする医薬組成物であって、前記有効用量が、投与の１～７２時間後に前記対象の血清において測定されるときに検出可能なレベルで抗原を生成するために十分なものである、前記医薬組成物。
  254. 前記抗原のカットオフインデックスが１～２である、請求項２５３に記載の組成物。
  255. 癌抗原をコードするｍＲＮＡを有効用量で含む、対象のワクチン接種における使用を目的とする医薬組成物であって、前記有効用量が、投与の１～７２時間後に前記対象の血清において測定されると、前記抗原に対する中和抗体によって得られる中和価が１，０００～１０，０００となるために十分なものである、前記医薬組成物。
  256. 式（Ｉ）の化合物：
    Figure 2023024669000048
     またはその塩もしくは異性体を含む脂質ナノ粒子において製剤化される、癌抗原をコードするｍＲＮＡを含むワクチンであって、式中、
    Ｒ１が、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
    Ｒ２及びＲ３が、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から独立して選択されるか、またはＲ２及びＲ３が、それらが結合している原子と一緒になってヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
    Ｒ４が、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、Ｑが、炭素環、ヘテロ環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、かつｎがそれぞれ、１、２、３、４、及び５から独立して選択され、
    Ｒ５がそれぞれ、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
    Ｒ６がそれぞれ、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
    Ｍ及びＭ’が、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から独立して選択され、
    Ｒ７が、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
    Ｒ８が、Ｃ３－６炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
    Ｒ９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環、及びヘテロ環からなる群から選択され、
    Ｒがそれぞれ、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から独立して選択され、
    Ｒ’がそれぞれ、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から独立して選択され、
    Ｒ”がそれぞれ、Ｃ３－１４アルキル及びＣ３－１４アルケニルからなる群から独立して選択され、
    Ｒ＊がそれぞれ、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から独立して選択され、
    Ｙがそれぞれ、独立してＣ３－６炭素環であり、
    Ｘがそれぞれ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から独立して選択され、かつ
    ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、前記ワクチン。
  257. 少なくとも５～１００の癌抗原エピトープをコードするオープンリーディングフレームを有するｍＲＮＡを含む個別化癌ワクチンであって、前記癌抗原エピトープの少なくとも５０％が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－ＤＲの１つまたは複数に特異的に結合する、前記個別化癌ワクチン。
  258. 前記癌抗原エピトープの少なくとも９０％が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－ＤＲの１つまたは複数に特異的に結合する、請求項２５７に記載の個別化癌ワクチン。
  259. 前記癌抗原エピトープの１００％が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－ＤＲの１つまたは複数に特異的に結合する、請求項２５７に記載の個別化癌ワクチン。
  260. 前記癌抗原エピトープの１００％が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－Ｃ．ＨＬＡ－Ａ／Ａ’、ＨＬＡ－Ｂ／Ｂ’、ＨＬＡ－Ｃ／Ｃ’、ＨＬＡ－ＤＲＢ１／Ｂ１’、ＨＬＡ－ＤＲＢ３４５／ＤＲＢ３’４’５’、ＨＬＡ－ＤＰＡ／Ｂ、ＨＬＡ－ＤＰＡ’／Ｂ’、ＨＬＡ－ＤＰＡ’／Ｂ、ＨＬＡ－ＤＰＡ／Ｂ’、ＨＬＡ－ＤＱＡ／Ｂ、ＨＬＡ－ＤＱＡ’／Ｂ’、ＨＬＡ－ＤＱＡ’／Ｂ、及びＨＬＡ－ＤＱＡ／Ｂ’の１つまたは複数に特異的に結合する、請求項２５７に記載の個別化癌ワクチン。
  261. 前記癌抗原エピトープの５０％が、ＨＬＡ－Ａ／Ａ’、ＨＬＡ－Ｂ／Ｂ’、ＨＬＡ－Ｃ／Ｃ’の１つまたは複数に特異的に結合し、前記癌抗原エピトープの５０％が、ＨＬＡ－ＤＲＢ１／Ｂ１’、ＨＬＡ－ＤＲＢ３４５／ＤＲＢ３’４’５’、ＨＬＡ－ＤＰＡ／Ｂ、ＨＬＡ－ＤＰＡ’／Ｂ’、ＨＬＡ－ＤＰＡ’／Ｂ、ＨＬＡ－ＤＰＡ／Ｂ’、ＨＬＡ－ＤＱＡ／Ｂ、ＨＬＡ－ＤＱＡ’／Ｂ’、ＨＬＡ－ＤＱＡ’／Ｂ、及びＨＬＡ－ＤＱＡ／Ｂ’の１つまたは複数に特異的に結合する、請求項２５７に記載の個別化癌ワクチン。
  262. 前記癌抗原エピトープが、前記エピトープの間にスペーサーを挟まずに互いに直接連結される、請求項２５７～２６１のいずれか１項に記載の個別化癌ワクチン。
  263. 前記癌抗原エピトープが、１０～２０のＭＨＣクラスＩエピトープ、及び５～１０のＭＨＣクラスＩＩエピトープを含む、請求項３３～５５または請求項２６２のいずれか１項に記載の個別化癌ワクチン。
  264. 前記癌抗原エピトープが、１５のＭＨＣクラスＩエピトープ、及び５つのＭＨＣクラスＩＩエピトープを含む、請求項３３～５５または請求項２６２のいずれか１項に記載の個別化癌ワクチン。
  265. 前記癌抗原エピトープが、コンカテマー構造においてヘッドトゥーテール編成で配置される、請求項３３～５５または請求項２６２～２６４のいずれか１項に記載の個別化癌ワクチン。
  266. それぞれの前記癌抗原エピトープの間にジャンクションが形成され、前記ジャンクションが、前記ペプチドのＮ末端に存在するエピトープに由来する２～１０のアミノ酸と、直接連結される隣接エピトープのＣ末端に存在する２～１０のアミノ酸と、を含み、前記ジャンクションが、前記個別化癌ワクチンの設計対象である対象のＨＬＡタンパク質に対して約５０ｎＭを超えるＩＣ５０で結合するペプチド配列を形成する、請求項２６５に記載の個別化癌ワクチン。
  267. 前記ジャンクションが、約５００ｎＭを超えるＩＣ５０で前記対象の前記ＨＬＡタンパク質に結合するペプチド配列を形成する、請求項２６６に記載の個別化癌ワクチン。
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