CN111773381A

CN111773381A - 一种靶向tem-1基因疫苗及其构建与应用

Info

Publication number: CN111773381A
Application number: CN202010641587.XA
Authority: CN
Inventors: 袁军; 李伟; 张景; 李荣辉; 罗力; 卓召振
Original assignee: Second People's Hospital Of Guiyang
Current assignee: Second People's Hospital Of Guiyang
Priority date: 2020-07-06
Filing date: 2020-07-06
Publication date: 2020-10-16

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种靶向TEM‑1基因疫苗及其构建与应用，该基因疫苗以鞭毛素(SF)为佐剂，以rTEM‑1为抗原，获得rTEM‑1‑SF融合基因，并构建于真核表达质粒pcDNA3.1中；本发明的rTEM‑1/鞭毛素融合基因疫苗能够抑制乳腺癌荷瘤小鼠肿瘤血管的形成、肿瘤大小和肿瘤的转移，并且抑制乳腺癌细胞向肺组织和肝脏组织转移，对于乳腺癌有预防和治疗作用。

Description

一种靶向TEM-1基因疫苗及其构建与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种靶向TEM-1基因疫苗及其构建与应用。

背景技术

肿瘤内部新生血管的形成与实体瘤的发生、发展、局部侵犯及转移密切相关。肿瘤相关血管抗原在多种癌症中高表达，但是在正常组织中表达较少，以肿瘤的血管内皮细胞为靶标具有以下优点：首先，血液中的药物与其作用靶点直接接触，避免了跨越内皮细胞才能抵达靶点的局限，药物通过偶联细胞毒性物质、促凋亡物质、促凝血物质等容易在效应部位达到药效浓度；其次，内皮细胞具有高度遗传稳定性，表型突变导致耐药产生的可能性大大减少；最后，每条毛细血管能够为大量的肿瘤细胞提供营养，激活获得性或抗体介导的免疫应答能特异性的作用于肿瘤血管，这种摧毁肿瘤血管的直接效应和损伤内皮细胞诱导血栓形成的间接效应，可有效阻断血供，抑制肿瘤的发生发展。随着抗肿瘤血管生成相关研究的不断深入，激活细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)为主的主动免疫治疗策略治疗恶性肿瘤成功的引起研究人员的广泛关注。主动免疫治疗通过诱导自身的肿瘤特异性免疫应答，不仅能识别和清除肿瘤细胞，诱发免疫记忆，阻止肿瘤的复发，还能避免患者持续用药的麻烦，同时减轻患者的经济负担。

克服肿瘤微环境免疫负调控状态的方法主要有以下几种：增强 DC细胞摄取和加工递呈肿瘤抗原的能力；沉默免疫负调控基因，机体自身不对肿瘤形成免疫耐受；利用免疫增强剂增强免疫细胞的功能。鞭毛素蛋白作为Toll样受体5(Toll like receptor 5，TLR5)的配体，能够有效地刺激先天免疫系统，表现出较好的佐剂效果，诱导机体产生特异性针对肿瘤抗原的抗体应答和T细胞应答，鞭毛素蛋白既能通过激活先天免疫系统来增强体液免疫应答和促进效应T细胞的增殖与活化，也能促进黏膜部位产生较强的抗原特异性的IgA应答、系统的 IgG应答和针对外来抗原的细胞毒性T细胞；在流感病毒疫苗，铜绿假单胞菌疫苗甚至肿瘤疫苗的研究中都引入鞭毛素蛋白，其佐剂作用能显著提高疫苗的保护效果。此外，Maaser C等人研究发现鞭毛素蛋白激活机体的TLR5通路能够诱发抗肿瘤活性，抑制结肠肿瘤的生长，而且Shi M等人研究发现血管内皮组成性的表达TLR5，鞭毛素蛋白可能会直接与血管内皮细胞相互作用，诱导细胞因子的分泌，介导免疫细胞的趋化。瘤治疗性疫苗在国内外受到越来越多的关注，虽然大量的佐剂已经在肿瘤疫苗中得到了应用，但是以鞭毛素蛋白为佐剂的肿瘤疫苗研究尚少，如专利号CN201680075024.0癌症疫苗，其包含在脂质纳米粒子中配制的具有编码癌抗原的开放阅读框的mRNA和具有编码免疫检查点调节剂的开放阅读框的mRNA，该文献公开了开放阅读框进一步编码鞭毛素蛋白或肽，以及所述抑制性检查点多肽是特异性结合至选自由PD-1、TIM-3、VISTA、A2AR、B7-H3、B7-H4、 BTLA、CTLA-4、IDO、KIR和LAG3组成的组的分子的抗体或其片段，虽然该文献公开了鞭毛素蛋白在肿瘤药物中的应用，但未具体到乳腺癌。

目前，在抗肿瘤血管生成的研究中，靶抗原主要是血管内皮细胞生长因子受体2(Vascular endothelial growth factor receptor 2， VEGFR-2)、血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor， VEGF)、成纤维细胞生长因子受体(Fibroblastgrowth factor receptor， FGFR)、基质金属蛋白酶2(Matrix metalloproteinase-2，MMP-2)等分子，但是这些分子不仅在肿瘤组织中表达丰富，而且在正常组织中也有较高的表达，因此基于这些靶点设计的疫苗对自身有一定的潜在危害性。有研究报道称以VEGF为靶点的抗血管生成药物在临床上取得了一定进展，但其安全性受到质疑，具有剂量依赖的毒副作用。肿瘤相关内皮标志物1(TEM-1)又名内皮唾液酸蛋白或CD248，其基因编码I型跨膜糖蛋白，该蛋白由757个氨基酸组成，即685个氨基酸组成的膜外部分(含3个EGF样结构域)和72个氨基酸组成的膜内部分(1 个C-typelectin样结构域)。TEM-1基因定位于人染色体11ql3，在不同类型的肿瘤中表达情况有差别，它可在小鼠和人的内皮细胞、周细胞、成纤维细胞和肿瘤细胞中表达，但在肿瘤内皮细胞和肿瘤细胞的基质中表达最丰富，肿瘤组织表达量是正常组织表达量的28倍，正常的成年组织中仅心脏有微量的表达，肝、肾、脑等组织均无表达，因此，可以作为有效的免疫治疗靶点。但TEM-1属于自身抗原，机体因其较弱的免疫原性形成免疫耐受。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提一种靶向 TEM-1基因疫苗及其构建与应用，具体如下：

一种靶向TEM-1基因疫苗，该基因疫苗以鞭毛素(SF)为佐剂，以rTEM-1基因为抗原，获得TEM-1-SF融合基因。

所述rTEM-1-SF融合基因的全长为3033bp。

所述rTEM-1是从以TEM-1基因中筛选T淋巴细胞和B细胞优势表位基因序列rTEM-1后再通过PCR合成人工rTEM-1基因片段。

所述基因疫苗采用的载体为含有Amp抗生素(50-100微克/ml)的 pcDNA3.1，它对抗原rTEM-1基因和鞭毛素可共表达。

所述载体的全长为5428bp。

本发明提供了一种靶向TEM-1基因疫苗的构建方法，首先将rTEM-1-SF融合基因序列克隆到载体，然后用重组表达载体转化大肠杆菌菌株，筛选获得所述的基因疫苗。

进一步的，所述一种靶向TEM-1基因疫苗的构建方法，包括如下步骤：

(1)获取rTEM-1-SF融合基因

根据GenBank中登录的TEM-1的全长DNA序列，应用DNA Star生物信息学软件分析T淋巴细胞与B细胞表位，截取胞外表达序列并筛选T淋巴细胞和B细胞优势表位基因序列rTEM-1，通过PCR合成人工 rTEM-1基因片段，以鞭毛素蛋白为佐剂，获得rTEM-1-SF融合基因；

(2)载体与rTEM-1-SF融合基因的酶切连接

用NheI和XhoI双酶切rTEM-1-SF融合基因和载体，再用T4DNA 连接酶连接回收后的rTEM-1-SF融合基因片段和载体消化片段，获得连接产物；

(3)连接产物的转化

取连接产物与大肠杆菌感受态细胞加入至EP管中，混匀，冰浴后，将EP管放入40-45℃的水浴箱进行热激，再将EP管转移至冰盒中使细胞冷却1-2min；然后向EP管中加入2×YT液体培养基，于35-39℃、 180-200rpm条件下恒温摇床培养，将已转化的DH5α感受态细胞转移到含有Amp抗生素的LB固体培养基平板上，其中Amp浓度50-100微克 /mL；最后，倒置平板，于37℃培养12-16h，出现菌斑；

(4)提取：挑取单克隆菌至1升LB培养基中，置于恒温摇床37℃ 220转/分增菌过夜，5000rpm×10min离心菌液后，沉淀菌体用纯化试剂盒Vigorous N001抽提质粒DNA，即得。

所述酶切条件为：rTEM-1-SF融合基因或载体1-2μg,10×cutsmart buffer 5μL,NheI 1μL、XhoI 1μL，去离子水补充至总体积50μL，温度为37℃，时间1-2h。

所述连接条件为：载体消化片段50ng，rTEM-1-SF融合基因片段150ng，T4 DNA连接酶1μL，去离子水补充至总体积20μL，温度为16℃，时间为0.5-1h。

所述2×YT液体培养基和LB固体培养基平板按照本领域常规的操作或者按照实施例方法配制而成。

所述靶向TEM-1基因疫苗在抑制肿瘤血管形成中的应用。

所述靶向TEM-1基因疫苗在治疗乳腺癌中的应用。

所述靶向TEM-1基因疫苗在预防乳腺癌中的应用。

所述靶向TEM-1基因疫苗在制备乳腺癌肺转移抑制剂中的应用。

所述靶向TEM-1基因疫苗在制备乳腺癌肝转移抑制剂中的应用。

所述靶向TEM-1基因疫苗的鉴定采用质粒转染和Western blot技术检测质粒在HEK293T细胞中的表达。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

鞭毛素作为佐剂的优点是能够与抗原进行融合，从而达到更好的佐剂效果，促进抗原特异性的免疫应答。本发明的rTEM-1/鞭毛素融合基因疫苗能够诱导TEM-1特异性的免疫应答，进而能够抑制肿瘤血管的形成、肿瘤大小和肿瘤的转移，并且抑制乳腺癌细胞向肺组织和肝脏组织转移，对于乳腺癌有预防和治疗作用。

本发明方法步骤简单，操作条件不苛刻，通过利用鞭毛素蛋白作为佐剂，与TEM-1抗原中能富集T、B淋巴细胞的基因序列进行融合，打破了机体对TEM-1的免疫耐受，通过诱导特异性靶向肿瘤脉管系统的免疫应答抑制肿瘤的发生发展。与传统的手术治疗、放疗相比，作用范围更广泛，不良反应更小。

附图说明

图1：四种基因疫苗酶切电泳结果图(n＝3)，其中M表示Marker， 1表示酶切后的pcDNA3.1(+)，2表示酶切后的pcDNA3.1(+) /rTEM-1，3表示酶切后的pcDNA3.1(+)/SF，4表示酶切后的 pcDNA3.1(+)/rTEM-1-SF；

图2：pcDNA3.1-TEM-1-EGFP在HEK293T细胞中表达(n＝3)；

图3：Western blot检测HEK293T细胞中蛋白的表达(n＝3)；其中，从左到右依次分别为TEM-1蛋白、SF蛋白和rTEM-1-SF蛋白，分子量大小预测为55kDa；

图4：预防性给药条件下各组小鼠体重变化趋势(n＝5)；其中，第3d、10d、17d分别预防性给药，第24d注射乳腺癌细胞；

图5：治疗性给药条件下各组小鼠体重变化趋势(n＝5)；其中，第1d注射乳腺癌细胞，第7d、14d、21d分别治疗性给药；

图6：肿瘤体积变化趋势图；

图7：小鼠处死后所取肿瘤重量统计图；

图8：各组小鼠生存情况及生存率(n＝5)；

图9：各组小鼠脾脏重量对比图(n＝5)；

图10：基因疫苗预防乳腺癌中各组肿瘤组织HE染色；其中， A-D分别为空载组、rTEM-1组、SF组和rTEM-1-SF组，每张图片的放大倍数均为200倍，其中B图中箭头所示为乳腺腺泡，D图中箭头所示为乳腺中的脂肪组织；

图11：基因疫苗治疗乳腺癌中各组肿瘤组织HE染色；其中， A-D分别为空载组、rTEM-1组、SF组和rTEM-1-SF组，每张图片的放大倍数均为200倍，其中B图中箭头所示为乳腺腺泡，D图中箭头所示为乳腺中的脂肪组织；

图12：基因疫苗预防乳腺癌中各组肿瘤组织中CD31分子表达情况；其中，A-E分别为阳性对照(小鼠皮肤)、空载组、rTEM-1 组、SF组和rTEM-1-SF组，每张图片的放大倍数均为400倍，图中箭头所示棕褐区域即为阳性，F图为各组肿瘤微血管密度统计图， **表示P<0.01；

图13：基因疫苗治疗乳腺癌中各组肿瘤组织CD31分子表达情况；其中，A-D分别为空载组、rTEM-1组、SF组和rTEM-1-SF组，每张图片的放大倍数均为400倍，图中箭头所示棕褐区域即为阳性， E图为各组肿瘤微血管密度统计图，**表示P<0.01；

图14：基因疫苗预防乳腺癌中各组肝组织HE染色；其中，A-E 分别代表：空载组、rTEM-1组、SF组、rTEM-1-SF组和Control组肝脏组织HE染色，每张图片放大倍数为200倍，图A、B、C中箭头所示即肿瘤转移灶；

图15：基因疫苗预防乳腺癌中各组肺组织HE染色；其中，A-E 分别代表：空载组、rTEM-1组、SF组、rTEM-1-SF组和Control组肺组织HE染色，每张图片放大倍数为200倍，图A、B、C中箭头所示即肿瘤转移灶；

图16：基因疫苗治疗乳腺癌中各组肝组织HE染色；其中，A-D 分别代表：空载组、rTEM-1组、SF组和rTEM-1-SF组肝脏组织 HE染色，每张图片放大倍数为200倍，图A、B、C中箭头所示即肿瘤转移灶；

图17：基因疫苗治疗乳腺癌中各组肺组织HE染色；其中，A-D 分别代表：空载组、rTEM-1组、SF组和rTEM-1-SF组肺组织HE 染色，每张图片放大倍数为200倍，图A中箭头所示即肿瘤转移灶；

图18：基因疫苗预防乳腺癌中肿瘤大小和肿瘤微血管密度相关性分析；其中，A-D分别为空载组、rTEM-1组、SF组和rTEM-1-SF 组；

图19：基因疫苗治疗乳腺癌中肿瘤大小和肿瘤微血管密度相关性分析；其中，A-D分别为空载组、rTEM-1组、SF组和rTEM-1-SF组。

具体实施方式

下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。

以下实施例中所需材料的准备，具体如下：

材料准备

1.实验动物

45只雌性BALB/c SPF级小鼠，6-8周龄，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，小鼠实验遵照美国国立卫生研究院实验动物管理条例和使用指南，中国动物福利立法，经伦理委员会的批准，小鼠饲养于温度21℃±2℃、湿度55％±2％和12h的光暗周期环境中，所有小鼠具有标准的啮齿动物自由饮食和饮水的权利；

2实验细胞系

HEK293T细胞株，为人胚肾T细胞，前期保存；

4T1细胞株，为鼠源性乳腺癌细胞，购自北京北纳创联生物技术研究院；

3主要试剂配方

3.1 PBS(pH7.4)：磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.27g，氯化钾(KCl) 0.2g，磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)1.42g，氯化钠(NaCl)8g，加入去离子水900mL充分溶解，调pH至7.4，定容至1L；

3.2 LB液体培养基：称取酵母浸出物5g，胰蛋白胨10g，氯化钠 10g，加入900mL去离子水，调PH至7.4，定容至1000mL，高压灭菌冷却保存备用；

3.3 LB固体培养基：取配好的LB液体培养基加入1.5％(W/V)琼脂粉，121℃高压灭菌后冷却至60℃左右，倾倒于无菌玻璃平皿，冷却备用；

3.4 2×YT液体培养基:称取氯化钠0.5g，酵母浸出物1g，胰蛋白胨1.6g溶于90mL去离子水，调PH至7.4，定容至100mL，高压灭菌冷却保存备用；

3.6细胞培养试剂：HEK293T细胞完全培养基为 DMEM+10％FBS+1％pen/strep；4T1细胞完全培养基为 RPMI1640+10％FBS+1％pen/strep；

3.7苦味酸标记液配方：称取苦味酸5g加入5mL无水乙醇中，反复摇晃至充分溶解；

3.8 Tris-EDTA缓冲液：称取12.11g Tris，溶于99mL去离子水，浓盐酸调PH至9.0；称取EDTA 2Na18.61g溶于90mL去离子水，NaOH调 PH至9.0；取20mL配置好的EDTA 2Na溶液加入Tris溶液中，去离子水补充体积至500mL即得到20×Tris-EDTA，4℃储存备用，实验时现配现用，取储存液用去离子水稀释成1×Tris-EDTA即可；

3.9 4％盐酸：取40mL浓盐酸加入900mL去离子水中，充分混匀后用去离子水定容至1L；

3.10 50×TAE：称取EDTA 29.2g，Tris 242g，冰醋酸57.1mL，加入900mL去离子水，调PH至8.0，定容至1000mL；

3.11 1％琼脂糖凝胶：0.25g琼脂糖溶于25mL 1×TAE中，加热使琼脂糖完全溶解，冷却至60℃左右，加入1.5μL核酸染料GoldView，混匀后室温放置直至凝固；

3.12免疫组化抗体：CD31抗体1：50稀释，在涡旋振荡器上混匀后于4℃避光储存备用；

3.13封片液：将中性树胶与二甲苯3:1混合，现配现用；

3.14 Western blot主要试剂配方：30％丙烯酰胺：称取N,N-甲叉双丙烯胺1g和丙烯酰胺29g溶于90mL水中，搅拌溶解，定容至100mL， 0.22μm滤膜过滤除菌，4℃避光保存；10％分离胶：30％丙烯酰胺 2.5mL，1.5M/L Tris-HCL 1.9mL，10％SDS 75μL，10％过硫酸铵75 μL，蒸馏水2.95mL，TEMED 3μL；5％积层胶：30％丙烯酰胺0.66mL， 1.0M/L Tris-HCL0.5mL，10％SDS 40μL，10％过硫酸铵40μL，蒸馏水2.73mL，TEMED 4μL；10％过硫酸氨：称取过硫酸氨1g，加入10mL 水中完全溶解，1mL/管分装后于-20℃保存；5×甘氨酸电泳缓冲液：称取Tris碱15g，甘氨酸94g，50mL 10％SDS，加900mL去离子水完全溶解，定容至1L；Westernbolt抗体:将抗His-tag抗体20μL加入10mL 一抗稀释液中(1:500)在涡旋振荡器上混匀后4℃避光储存备用。

实施例1

本实施例提供了靶向TEM-1基因疫苗，该基因疫苗以鞭毛素(SF) 为佐剂，以rTEM-1基因为抗原，获得rTEM-1-SF融合基因；

所述rTEM-1是从以TEM-1基因中筛选T淋巴细胞和B细胞优势表位基因序列rTEM-1后再通过PCR合成人工rTEM-1基因片段；

所述rTEM-1基因，其氨基酸序列如下：

DLSCEDPCAQAPCEQQCEPGGPQGYSCHCRLGFRPAEDDPH RCVDTDECQIAGVCQQMCVNYVGGFECYCSEGHELEADGISCSP AGAMGAQASQDLRDELLDDGEEGEDEEEPWEDFDGTWTEEQGI LWLAPTHPPDFGLPYRPNFPQDGEPQRLHLEPTWPPPLSAPRGPY HSSVVSATRPMVISATRPTLPSAHKTSVISATRPPLSPVHPPAMAPA TPPAVFSEHQIPKIKANYPDLPFGHKPGITSATHPARSPPYQPPIIST NYPQVFPPHQAPMSPDTHTITYLPPVPPHLDPGDTTSKAHQHPLL PDAPGIRTQAPQLSVSALQPPLPTNSRSSVHETPVPAANQPPAFPS SPLPPQRPTNQTSSISPTHSYSRAPLVPREGVPSPKSVPQLPSVPST AAPTALAESGLAGQSQRDDRWLLVALLVPTCVFLVVLLALGIVY CTRCGSHAPNKRITDCYRWVTHAGNKSSTEPMPPRGSLTGVQTC RTSV

所述rTEM-1基因，其核苷酸序列如下：

gaattcagttgtgaagacccctgtgcccaggccccctgtgagcagcagtgtgaacctggagggc cacaaggctatagctgccactgtcgccttggcttccggccagctgaggatgatccacaccgctgcgtgg acacggatgagtgccagattgctggtgtgtgccagcagatgtgtgtcaactatgttggtggctttgagtgtt actgcagcgagggtcacgagcttgaggcagatggtatcagctgtagccctgcaggagccatgggtgcc caggcttcccaggatctcagagatgagttgctggatgatggagaagaaggggaggatgaagaggagc cctgggaggactttgatggcacctggacagaggaacaggggatcctatggctggcacctacacatcca cctgactttggcctgccctataggcccaacttcccacaggatggagagcctcagagattgcacctggag cctacctggccacccccacttagtgcccccaggggcccctaccactcctcagtggtgtctgccacacgg cccatggtgatctctgccactcgacccacactaccttctgcccacaagacctctgttatttcagctacacgc ccacccctgagccctgtccacccacctgccatggcccctgccacacctccagctgtgttctctgagcacc agatccccaaaatcaaggccaattatccagacctgccttttggccacaagcctgggataacctcggccac tcacccagcacggtctcctccgtaccagccccccattatctcaaccaactatccccaagtcttccctcccc accaggcccctatgtctccagatacccacactatcacttatttgcctccagtcccccctcaccttgatcctg gggataccacttctaaagcccatcaacaccctttgctcccagatgctccaggtatcagaacccaggcccc ccagctttctgtctcagctctccagccccctcttcctaccaactccaggtcttctgtccatgaaactcctgtg cctgctgccaaccagcccccagccttcccttcttctcccctcccccctcagaggcccactaaccagacct catctatcagccctacacattcctattccagagcccctctagtcccaagggaaggagttcccagtcccaaa tcagtgccacagctgccctcggtgccctccacagcagctccaacagccctggcagagtcaggtcttgca ggccaaagccaaagggatgaccgctggctgctggtggcactcctggtgccaacatgtgtcttcttggtg gtgctgcttgccctgggcattgtgtactgcactcgctgtggctcccacgcacccaacaagcggatcacg gactgctatcgctgggtcacacatgctgggaacaagagctcaacagaacccatgccccccagaggca gccttacaggggtacagacctgtagaaccagtgtgtga

所述rTEM-1-SF融合基因的全长为3033bp，其全长序列为 atgcatcatcaccatcaccatgcacaagtcattaatacaaacagcctgtcgctgttgacccagaataacct gaacaaatcccagtccgcactgggcactgctatcgagcgtttgtcttccggtctgcgtatcaacagcgcg aaagacgatgcggcaggacaggcgattgctaaccgttttaccgcgaacatcaaaggtctgactcaggct tcccgtaacgctaacgacggtatctccattgcgcagaccactgaaggcgcgctgaacgaaatcaacaac aacctgcagcgtgtgcgtgaactggcggttcagtctgcgaatggtactaactcccagtctgacctcgact ccatccaggctgaaatcacccagcgcctgaacgaaatcgaccgtgtatccggccagactcagttcaacg gcgtgaaagtcctggcgcaggacaacaccctgaccatccaggttggtgccaacgacggtgaaactatc gatattgatttaaaagaaatcagctctaaaacactgggacttgataagcttaatgtccaagatgcctacacc ccgaaagaaactgctgtaaccgttgataaaactacctataaaaatggtacagatcctattacagcccaga gcaatactgatatccaaactgcaattggcggtggtgcaacgggggttactggggctgatatcaaatttaaa gatggtcaatactatttagatgttaaaggcggtgcttctgctggtgtttataaagccacttatgatgaaactac aaagaaagttaatattgatacgactgataaaactccgttggcaactgcggaagctacagctattcggggaacggccactataacccacaaccaaattgctgaagtaacaaaagagggtgttgatacgaccacagttgcg gctcaacttgctgcagcaggggttactggcgccgataaggacaatactagccttgtaaaactatcgtttga ggataaaaacggtaaggttattgatggtggctatgcagtgaaaatgggcgacgatttctatgccgctacat atgatgagaaaacaggtgcaattactgctaaaaccactacttatacagatggtactggcgttgctcaaact ggagctgtgaaatttggtggcgcaaatggtaaatctgaagttgttactgctaccgatggtaagacttactta gcaagcgaccttgacaaacataacttcagaacaggcggtgagcttaaagaggttaatacagataagact gaaaacccactgcagaaaattgatgctgccttggcacaggttgatacacttcgttctgacctgggtgcggt tcagaaccgtttcaactccgctatcaccaacctgggcaataccgtaaataacctgtcttctgcccgtagcc gtatcgaagattccgactacgcaaccgaagtctccaacatgtctcgcgcgcagattctgcagcaggccg gtacctccgttctggcgcaggcgaaccaggttccgcaaaacgtcctctctttactgcgtgaattcagttgtg aagacccctgtgcccaggccccctgtgagcagcagtgtgaacctggagggccacaaggctatagctg ccactgtcgccttggcttccggccagctgaggatgatccacaccgctgcgtggacacggatgagtgcca gattgctggtgtgtgccagcagatgtgtgtcaactatgttggtggctttgagtgttactgcagcgagggtca cgagcttgaggcagatggtatcagctgtagccctgcaggagccatgggtgcccaggcttcccaggatct cagagatgagttgctggatgatggagaagaaggggaggatgaagaggagccctgggaggactttgatggcacctggacagaggaacaggggatcctatggctggcacctacacatccacctgactttggcctgcc ctataggcccaacttcccacaggatggagagcctcagagattgcacctggagcctacctggccacccc cacttagtgcccccaggggcccctaccactcctcagtggtgtctgccacacggcccatggtgatctctgc cactcgacccacactaccttctgcccacaagacctctgttatttcagctacacgcccacccctgagccctg tccacccacctgccatggcccctgccacacctccagctgtgttctctgagcaccagatccccaaaatcaa ggccaattatccagacctgccttttggccacaagcctgggataacctcggccactcacccagcacggtct cctccgtaccagccccccattatctcaaccaactatccccaagtcttccctccccaccaggcccctatgtct ccagatacccacactatcacttatttgcctccagtcccccctcaccttgatcctggggataccacttctaaa gcccatcaacaccctttgctcccagatgctccaggtatcagaacccaggccccccagctttctgtctcag ctctccagccccctcttcctaccaactccaggtcttctgtccatgaaactcctgtgcctgctgccaaccagc ccccagccttcccttcttctcccctcccccctcagaggcccactaaccagacctcatctatcagccctaca cattcctattccagagcccctctagtcccaagggaaggagttcccagtcccaaatcagtgccacagctgc cctcggtgccctccacagcagctccaacagccctggcagagtcaggtcttgcaggccaaagccaaag ggatgaccgctggctgctggtggcactcctggtgccaacatgtgtcttcttggtggtgctgcttgccctgg gcattgtgtactgcactcgctgtggctcccacgcacccaacaagcggatcacggactgctatcgctgggt cacacatgctgggaacaagagctcaacagaacccatgccccccagaggcagccttacaggggtacagacctgtagaaccagtgtgtga

所述基因疫苗采用的载体为含有Amp抗生素的pcDNA3.1，它对抗原rTEM-1基因和鞭毛素可共表达；

所述载体的全长为5428bp。

实施例2

所述靶向TEM-1基因疫苗的构建方法，包括如下步骤：

(1)获取rTEM-1-SF融合基因

(2)载体与rTEM-1-SF融合基因的酶切连接

(3)连接产物的转化

取连接产物与大肠杆菌感受态细胞加入至EP管中，混匀，冰浴后，将EP管放入40-45℃的水浴箱进行热激，再将EP管转移至冰盒中使细胞冷却1-2min；然后向EP管中加入2×YT液体培养基，于35-39℃、 180-200rpm条件下恒温摇床培养，将已转化的DH5α感受态细胞转移到含有Amp抗生素的LB固体培养基平板上，其中Amp浓度50-100微克 /mL；最后，倒置平板，于37℃培养12-16h，出现菌斑，即得；

所述酶切条件为：rTEM-1-SF融合基因或载体1-2μg,10×cutsmart buffer 5μL,NheI 1μL、XhoI 1μL，去离子水补充至总体积50μL，温度为37℃，时间1-2h；

所述连接条件为：载体消化片段50ng，rTEM-1-SF融合基因片段150ng，T4 DNA连接酶1μL，去离子水补充至总体积20μL，温度为16℃，时间为0.5-1h；

同时按上述方法分别将TEM-1、SF通过5’Nhe I和3’Xho I克隆至pcDNA3.1(Amp)载体上，分别建立SF、TEM-1对照组；

对以上疫苗进行鉴定

1酶切验证

1.1提取基因疫苗DNA，37℃下通过Nhe I和Xho I双酶切6h，以酶切产物40μL为溶剂，6×上样Buffer 8μL为溶质，混匀，4℃备用，得样品；

1.2开启微波炉，加热1％琼脂糖凝胶30s，取出摇匀后继续加热，每10s摇一次，重复加热4-5次直至完全溶解透明；待冷却至60℃左右加入1μL GoldView，摇匀后倒入插好制胶梳的制胶槽，室温放置 30min直至凝固；向电泳槽中加入1×TAE，轻轻将凝胶放入其中，注意加样孔位于电泳槽负极端，加样：分子量为5000bp的DNA marker 5 μL，样品3-5μL，在小电泳槽电压为90V或大电泳操120V任一条件下电泳30min，轻轻取出凝胶，放入凝胶成像仪中曝光并拍照保存；

1.3结果分析：特异性引物和rTEM-1基因扩增纯化后的产物与 pcDNA3.1(+)连接后转化DH5α菌，筛选阳性克隆菌，用试剂盒提纯的基因疫苗经Nhe I/Xho I双酶切后进行1％琼脂糖凝胶电泳，在约 1500bp处可见目的条带，与rTEM-1基因大小1518bp相符，同样的方法构建pcDNA3.1(+)基因大小5428bp，SF基因大小1539bp， rTEM-1-SF基因大小3033bp，酶切后电泳结果与实验预期相符；详见图1；

2 Western blot验证

2.1高糖DMEM(含10％FBS，1％双抗)，37℃，5％CO₂培养箱培养，每2天换液，2-3d传代1次；3次的对数生长期细胞，PBS轻轻冲洗2次，0.25％胰酶0.5mL消化1min，加入5mLHEK293T细胞完全培养基终止消化，收集细胞悬液后1000rpm离心5min，弃上清液，以5×10⁴个/孔接种至24孔板，每孔设3个复孔，加入2mL不含抗生素的 HEK293T细胞完全培养基，24h后即可进行转染；

2.2脂质体转染：将基因疫苗用脂质体LipofectamineTM 3000转染细胞，LipofectamineTM 3000:基因疫苗＝1:1μL/μg；

2.3将TEM-1基因通过5’Nhe I和3’Kpn I克隆至pcDNA3.1-EGFP (Amp)载体上，建立pcDNA3.1(+)/TEM-1-EGFP组；pcDNA3.1 (+)/TEM-1-EGFP转染HEK293T细胞后培养48h，倒置荧光显微镜下观察，每孔共计5个高倍镜视野观察，观察绿色荧光细胞；

2.4 Westernblot：基因疫苗转染HEK293T细胞48h后弃上清，每孔加预冷PBS 1mL轻轻洗细胞两次，弃上清后加入RIPA裂解液(含1％ PMSF)150μL，冰上裂解10min后吸入1.5mL EP管，加入6×蛋白上样缓冲液37.5μL，金属浴100℃煮10min。蛋白SDS-PAGE电泳分离后 200mA恒流70min湿转至PVDF膜，含5％脱脂奶粉的1×TBST室温封闭1h，1×TBST洗涤三次，用辣根过氧化物酶标记的His抗体(稀释倍数1:500)4℃孵育过夜，回收抗体，1×TBST洗涤3次，EcL试剂显色；

2.5结果分析：

2.5.1 pcDNA3.1-TEM-1-EGFP在HEK293T细胞的表达鉴定， pcDNA3.1(+)/TEM-1-EGFP用脂质体LipofectamineTM 3000转染HEK293T细胞，图2-A为pcDNA3.1(+)/TEM-1-EGFP经脂质体转染 HEK293T细胞24h后白光照射下拍摄的结果图，图2-B为同一视野紫外光照射下拍摄的结果图，绿色荧光蛋白提示载体转染成功；

2.5.2 pcDNA3.1(+)/rTEM-1、pcDNA3.1(+)/SF和pcDNA3.1(+) /rTEM-1-SF用LipofectamineTM 3000转染HEK293T细胞，48h后， Western blot鉴定相应蛋白在真核细胞中的表达，蛋白分子量大小与预期相符，见图3；

3质粒测序验证

在基因N段加入His Tag标签，将质粒pcDNA3.1(+)/rTEM-1、 pcDNA3.1(+)/SF、pcDNA3.1(+)/rTEM-1-SF与 pcDNA3.1(+)/TEM-1-EGFP送武汉金开瑞生物工程有限公司测序验证，结果显示：插入基因序列正确，无突变，阅读框架未发生改变。

实施例3

本实施例探索靶向TEM-1基因疫苗在预防和治疗乳腺癌中的应用；具体操作如下：

一、制备靶向TEM-1基因疫苗

1.1获取rTEM-1-SF融合基因

1.2载体与rTEM-1-SF融合基因的酶切连接

用NheI和XhoI双酶切rTEM-1-SF融合基因和pcDNA3.1(Amp)载体，再用T4DNA连接酶连接回收后的rTEM-1-SF融合基因片段和载体消化片段，获得连接产物；

所述酶切条件为：rTEM-1-SF融合基因或载体1.5μg,10×cutsmart buffer 5μL,5’NheI 1μL、3’XhoI 1μL，去离子水补充至总体积50 μL，温度为37℃，时间1.5h；

所述连接条件为：载体消化片段50ng，rTEM-1-SF融合基因片段150ng，T4 DNA连接酶1μL，去离子水补充至总体积20μL，温度为16℃，时间为0.7h；

1.3连接产物的转化

取连接产物10μL与大肠杆菌感受态细胞80μL加入至1.5mL的 EP管中，混匀，冰浴30min后，将EP管放入42℃的水浴箱进行热激90s，再将EP管转移至冰盒中使细胞冷却1-2min；然后向EP管中加入1mL 2 ×YT液体培养基，于37℃、200rpm条件下恒温摇床培养1h，将已转化的DH5α感受态细胞转移到含有Amp抗生素的LB固体培养基平板上，其中Amp浓度75微克/mL；最后，倒置平板，于37℃培养14h，出现菌斑，即得；

同时按上述方法分别将rTEM-1、SF通过5’Nhe I和3’Xho I克隆至pcDNA3.1(Amp)载体上，分别建立SF、rTEM-1的对照组；

二、动物实验

2.1荷瘤小鼠模型建立

2.1.1复苏细胞：从液氮罐中取出冻存的4T1小鼠乳腺癌细胞，立即放入37℃水浴锅中复温；待完全融化后800rpm离心3min，去上清，加入RPMI 1640完全培养基1mL重悬细胞，将细胞转移至细胞培养瓶中，加入5mL的4T1细胞完全培养基，摇匀，将培养瓶静置5min，将分布均匀的细胞放入37℃，5％CO₂培养箱培养；

2.1.2细胞传代：细胞长至80％即可传代，先从培养箱中取出 25CM2培养瓶，放入紫外照射30min后的超净工作台中，轻摇后吸出培养基，加入无菌PBS 3mL洗两遍，加入0.5mL胰酶放入培养箱消化 3min，待细胞消化完毕后加入2mL培养基终止消化；滴加细胞悬液至新培养瓶，加入5mL4T1细胞完全培养基，摇匀，将培养瓶静置5min，分布均匀的细胞放入37℃，5％CO₂培养箱培养；

2.1.3消化细胞：待培养的细胞数量达到实验预期所需数量时可将细胞全部消化，将消化好的细胞收集在50mL离心管中，1200rpm离心4min，弃掉上清，加入4mL无菌PBS重悬细胞，取1μL细胞悬液和 99μL台盼蓝溶液加入EP管中，用枪头吹打混匀，取10μL加入到细胞计数板中分别计数4个中方格内的细胞数，并根据公式计算出4mL 细胞悬液中的总细胞量，将细胞浓度调至3.5×10⁶个细胞/100μL；

2.1.4预防性给药并建立乳腺癌模型：雌性Balb/c 6-8w龄SPF级小鼠购买后先在隔离间饲养5-7天，每天观察并记录小鼠状态，无异常后移至饲养间开始实验，将小鼠分组，先预防性给药，然后各组小鼠注射乳腺癌细胞，3-5天后肿瘤长至绿豆大小，可触及，观察并记录数据；

2.1.5建立乳腺癌模型后给药：雌性Balb/c 6-8w龄SPF级小鼠购买后先在隔离间饲养5-7天，每天观察并记录小鼠状态，没有异常后移至饲养间开始实验，将小鼠分组，先各组小鼠注射乳腺癌细胞，3-5 天后肿瘤长至绿豆大小，可触及，再给药，观察并记录数据；

2.2分组实验与数据处理

2.2.1基因疫苗预防乳腺癌实验：25只小鼠随机均分为5组，分别为：rTEM-1组、SF组、rTEM-1-SF组、空载组和空白组，空白组小鼠不做任何处理；用苦味酸在小鼠背部做好标记(左耳、左腰、左腿、右耳、右腰、右腿依次为1-6号)；小鼠饲养于SPF级动物实验室，定期添加饲料和水，且饲料和水均经过高压灭菌处理，每周更换两次灭菌后的垫料和鼠笼，每月更换一次灭菌的鼠笼盖，以防实验动物受其他因素影响。药物注射、造模和记录数据：从进入SPF级饲养间开始，第1d、7d、14d分别肌肉注射基因疫苗(100μg/只)，第15d开始于小鼠右腿腋下乳腺部位皮下注射4T1乳腺癌细胞100μL(即3.5×10⁶个细胞 /只)，待肿瘤长至第5日时开始测量肿瘤大小，隔一天测量一次小鼠体重及肿瘤大小，绘制体重变化曲线，并观察小鼠有无饮食活动减少，精神状态改变等，发现异常及时记录；

2.2.2基因疫苗治疗乳腺癌实验：20只小鼠随机均分为4组，分别为：rTEM-1组、SF组、rTEM-1-SF组和空载组；药物注射、造模和记录数据：从进入SPF级饲养间开始，第1d于小鼠右腿腋下乳腺部位皮下注射4T1乳腺癌细胞100μL(即3.5×10⁶个细胞/只)，待肿瘤长至第5 日时开始测量肿瘤大小，第7d、14d、21d分别肌肉注射基因疫苗(100 μg/只)，具体操作同预防实验；

2.2.3肿瘤大小测量：先于肿瘤处涂少许酒精，充分暴露肿瘤形态，再用游标卡尺分别测量其长径(L)和短径(D)，并用公式V＝L ×D2/2计算肿瘤体积大小，绘制肿瘤生长曲线，观察肿瘤变化；待造模28d后，统一处死所有小鼠，取出肿瘤，测量肿瘤重量，并进行比较；

2.2.4组织固定、脱水、包埋和石蜡切片

2.2.4.1固定：小鼠处死后取适量组织放入4％多聚甲醛中，室温固定24h；

2.2.4.2脱水、透明、浸蜡：脱水前五个小时将组织脱水机开机预热使石蜡融化，取出固定好的组织修块后放入包埋盒中，做好标记，将包埋盒放入去除石蜡的铁篮子中，挂好篮子并放入有梯度酒精和 VanClear环保透明剂(即为二甲苯替代剂)的玻璃缸中自动脱水，设定脱水程序(共12h，脱水过夜)：75％乙醇1h；80％乙醇1h；90％乙醇1h；95％乙醇1h；100％乙醇Ⅰ1h；100％乙醇Ⅱ1h；100％乙醇Ⅲ1h；环保透明剂Ⅰ1h；环保透明剂Ⅱ1h；环保透明剂Ⅲ1h；石蜡Ⅰ1h；石蜡Ⅱ1h；

2.2.4.3包埋：脱水结束前2h开启石蜡包埋机使石蜡融化，开启冷台预冷，脱水结束后将包埋模具置于操作台上，滴入少量石蜡，将组织放入模具正中央，镊子轻轻压住组织使最大面位于模具底部，在冷台处放置5s使石蜡凝固，移开镊子，盖上包埋盒后再滴入少量石蜡，放置于冷台15min，石蜡凝固完全后蜡块可轻易取下，注意不能强行分离，否则会导致石蜡和组织分离或石蜡块中出现裂痕等影响切片，包埋好的蜡块室温保存；

2.2.4.4切片：预热摊片机和水台，石蜡块放于-20℃冰箱冷却30min 左右开始连续切片，厚度为3-5μm，放于45℃水中，在水的张力作用下组织充分展开，捞片使组织位于粘附载玻片三分之一处，用力甩掉组织表面的水分，将玻片放在摊片机上放置10min，再次甩掉组织与玻片之间的水分，然后65℃温箱中烤30min～60min；

2.2.4.5将切片置于16℃冷库间储存备用，可放置几个月，最佳为 4℃保存；

2.3 HE染色

2.3.1实验组中全部小鼠的肿瘤组织切片同时染色，每个肿瘤组织切片取3张进行染色，即每组共取15张组织切片，将储存的切片取出后放入65℃烤箱烘烤60min；

2.3.2按顺序依次环保透明剂中脱蜡和在梯度酒精中脱水，环保透明剂Ⅰ15min；环保透明剂Ⅱ15min；环保透明剂Ⅲ15min；100％乙醇8min；95％乙醇Ⅰ8min；95％乙醇Ⅱ8min；80％乙醇8min；70％乙醇8min；蒸馏水洗5min×3次，注意观察有无脱片现象；

2.3.3对组织进行染色，苏木素染液染6min，洗去染液后再用蒸馏水返蓝5min，可观察到组织由红色变为蓝色，1％盐酸酒精分化1～3s (放入即取出)，用蒸馏水浸泡3～5min(提前准备好)，伊红染液染 1～3min，蒸馏水洗5min×3次，显微镜下观察染色效果，细胞核呈蓝色，细胞质呈红色，染色效果不佳可重染；

2.3.4组织切片脱水透明：95％乙醇Ⅰ10s；95％乙醇Ⅱ10s；100％乙醇Ⅰ10s；环保透明剂Ⅰ5min；环保透明剂Ⅱ5min；环保透明剂Ⅲ 5min；通风橱中放置15min左右使水分挥发；

2.3.5封片：滴加含透明剂的中性树胶一滴于组织上，再用盖玻片45°角盖上玻片，通风橱中放置1h左右使水分挥发，然后将标本封固，室温保存；

2.3.6图像采集：将染色完成后的切片置于显微镜下观察，在100 倍、200倍显微镜下随机观察每张切片5个以上不同视野，并进行拍照；

2.4免疫组织化学染色检测肿瘤血管CD31分子的表达情况

2.4.1将储存的切片取出后放入65℃烤箱烘烤60min；

2.4.2按顺序依次环保透明剂中脱蜡和在梯度酒精中脱水，环保透明剂Ⅰ15min；环保透明剂Ⅱ15min；环保透明剂Ⅲ15min；100％酒精8min；95％酒精Ⅰ8min；95％酒精Ⅱ8min；80％酒精8min；70％酒精8min；蒸馏水洗5min×3次，注意观察有无掉片；

2.4.3抗原修复液1×Tris-EDTA缓冲液用微波炉高火3min煮沸取出，立即放入玻片，低火20min后取出室温冷却1h左右，用力甩干玻片上的水分，然后用吸水纸擦干组织周围的水分，注意不要碰到组织，滴加内源性过氧化物酶阻断剂一滴覆盖组织，室温孵育15分钟后放入 PBS中洗3min×3次；

2.4.4滴加山羊血清工作液一滴盖满组织，室温封闭15min；

2.4.5倾去山羊血清，勿洗，直接滴加一抗工作液(一抗稀释液按照1:50进行稀释所得)50μL覆盖组织，玻片放入湿盒中，湿盒放于37℃水浴箱45min～60min后再放入4℃冰箱中孵育过夜；

2.4.6孵育完成后取出，将玻片放入PBS中洗3min×3次，滴加生物素标记山羊抗兔IgG聚合物一滴覆盖组织，室温孵育15min后倾去试剂，将玻片放入PBS中洗3min×3次；

2.4.7滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液一滴覆盖组织，室温孵育15min后倾去试剂，放入PBS中洗3min×3次；

2.4.8加入新鲜配制的DAB显色液一滴覆盖组织(Ⅰ:Ⅱ＝1:20)，室温孵育3～10min，出现肉眼可见棕黄色即洗去显色液，PBS中洗 3min×3次；

2.4.9苏木素染液染2min，洗去染液后再用蒸馏水返蓝5min，可观察到组织由红色变为蓝色，1％盐酸酒精分化1～3s(放入即取出)，用蒸馏水浸泡3～5min(提前准备好水)，显微镜下观察染色效果，细胞核呈蓝色，阳性区域呈棕黄色，细胞核染色效果不佳可重染；

2.4.10组织切片脱水透明：95％乙醇Ⅰ10s；95％乙醇Ⅱ10s；100％乙醇Ⅰ10s；环保透明剂Ⅰ5min；环保透明剂Ⅱ5min；环保透明剂Ⅲ 5min；通风橱中放置15min左右使水分挥发；

2.4.11封片：滴加含透明剂的中性树胶一滴于组织上，再用盖玻片45°角盖上玻片，通风橱中放置1h左右将标本封固，室温保存；

2.4.12图像采集：将染色完成后的切片置于显微镜下查看，在 100、200与400倍显微镜下随机观察每张切片5个以上不同视野，并进行拍照，取400倍镜下视野数免疫组化结果呈阳性的微血管数目，统计并分析微血管密度。

2.5实验数据统计学分析

所有实验均重复至少三次所有实验数据均以平均值±标准差x± s)的形式表示。用GraphPad Prism 6.0对各组数据进行分析后，两组间的比较用t检验，多组间的比较用方差分析，分析结果P<0.05表示为 *；P<0.01表示为**；P<0.001表示为***，P＜0.05说明差异具有统计学意义；

三、结果分析

3.1小鼠体重变化和身体情况

如图4所示，用天平测量小鼠体重，并监测体重变化，在基因疫苗预防小鼠乳腺癌实验中，各组小鼠在第1-3d未做任何处理，体重均呈稳定上升趋势，第3-23d预防性给药期间体重均缓慢增长，而第24d 注射乳腺癌细胞后，各组体重均有波动，其中，TEM-1组波动幅度最大，Control组波动最小，而SF-TEM-1组的体重大部分时期均位于较高水平，最终，仅SF组平均体重最低，约为19.66g，PcDNA3.1组平均体重为19.93g，rTEM-1组和Control组均为20.1g，而rTEM-1-SF 组平均体重最重为20.52g。从总体身体情况看，除rTEM-1组两只小鼠活动性较差，毛发较为稀疏，无光泽且易打结外，其余小鼠均正常。

如图5所示，在基因疫苗治疗小鼠乳腺癌实验中，各组小鼠在造模前三天未做处理，体重均呈稳定上升趋势，第1d注射乳腺癌细胞和第7d开始给药后体重均有不同程度波动，最终，rTEM-1-SF组平均体重最低，约为18.48g，SF组平均体重为19.32g，PcDNA3.1组均为 19.98g，而rTEM-1组平均体重最重为20.22g。从总体身体情况看，各组小鼠活动性尚可，毛发正常，精神及饮食等情况正常。

3.2各组小鼠肿瘤大小情况

如图6-A、7-A所示，在基因疫苗预防小鼠乳腺癌实验中，在注射乳腺癌细胞1-19d期间rTEM-1-SF组药物对肿瘤的抑制效果最好，第 19-28d则rTEM-1组药物对肿瘤的抑制效果最好，最终PcDNA3.1组平均肿瘤体积最大为1236.11mm³，SF组平均肿瘤体积为786.01mm³，rTEM-1组和rTEM-1-SF组平均肿瘤体积为693.18mm³。用GrapPad软件进行组间配对t检验分析，与PcDNA3.1组相比，rTEM-1组、SF组和 rTEM-1-SF组对肿瘤生长均有显著抑制作用(P＜0.05)，同时结果显示，rTEM-1-SF组和SF组相比差异具有统计学意义(P<0.05)，但rTEM-1-SF组和rTEM-1组相比差异没有统计学意义(P＞0.05)。

如图6-B、7-B所示，在基因疫苗治疗小鼠乳腺癌实验中，在注射乳腺癌细胞后观察期间rTEM-1-SF组药物对肿瘤的抑制效果最好，最终PcDNA3.1组平均肿瘤体积最大为857.624mm³，rTEM-1组平均肿瘤体积为542.82mm³，SF组平均肿瘤体积为501.10mm³，rTEM-1-SF组最小平均肿瘤体积为485.08mm³；用GraphPad软件进行组间配对t检验分析，与PcDNA3.1组相比，rTEM-1组、SF组和rTEM-1-SF组对肿瘤生长均有显著抑制作用(P＜0.05)，同时结果显示，rTEM-1-SF组分别和SF组、rTEM-1组相比差异均具有统计学意义(P<0.05)；

3.3各组小鼠生存情况

如图8-A所示，在基因疫苗预防小鼠乳腺癌实验中，根据各组小鼠在整个实验过程中的生存情况绘制生存曲线图，图中每一个直角转折处即为有小鼠死亡。其中小鼠死亡发生在第19d、47d的TEM-1组中，在后续实验过程中，其余组均无小鼠死亡，直至实验第51d，为小鼠处死时间，统一处死小鼠后得到各组最终生存率；Control组为未接种肿瘤的空白对照组，其最终生存率为100％，给药组中，PcDNA3.1 组、SF组和rTEM-1-SF组最终生存率均为100％，rTEM-1组最终生存率为60％；

如图8-B所示，在基因疫苗治疗小鼠乳腺癌实验中，根据各组小鼠在整个实验过程中的生存情况绘制生存曲线图，图中每一个直角转折处即为有小鼠死亡；在实验过程中，各个组均无小鼠死亡，直至实验28d，为小鼠处死时间，统一处死小鼠后得到各组最终生存率，小鼠最终生存率均为100％；

3.4各组小鼠脾脏大小情况

如图9-A所示，在基因疫苗预防小鼠乳腺癌实验中，各组小鼠处死后将脾脏取出称重，Control组作为未接种肿瘤的空白对照组，脾脏平均重量最轻为0.092g，给药组中，PcDNA3.1组脾脏平均重量为 0.778g，SF组脾脏平均重量为0.796g，rTEM-1-SF组脾脏平均重量为 0.824g，rTEM-1组脾脏平均重量最重为0.86g；用GraphPad软件进行组间配对t检验分析，与Control组相比，PcDNA3.1组、rTEM-1组、SF 组和rTEM-1-SF组对脾脏增大均有显著促进作用(P＜0.05)，同时结果显示，PcDNA3.1组、rTEM-1组、SF组和rTEM-1-SF组四组间差异没有统计学意义(P＞0.05)；

如图9-B所示，在基因疫苗治疗小鼠乳腺癌实验中，各组小鼠处死后将脾脏取出称重，给药组中，PcDNA3.1组脾脏平均重量最重为 0.64g，SF组脾脏平均重量为0.63g，rTEM-1组脾脏平均重量为0.62g， rTEM-1-SF组脾脏平均重量为0.61g，用GraphPad软件进行组间配对t 检验分析，结果显示，PcDNA3.1组、rTEM-1组、SF组和rTEM-1-SF 组四组间差异没有统计学意义(P＞0.05)；

3.5检测各组小鼠肿瘤生长情况

3.5.1基因疫苗预防乳腺癌实验中，如图10所示，其中B图中箭头所示即为乳腺腺泡，而D图中箭头所示即为乳腺中的脂肪组织。但与正常乳腺组织相比，所取组织中乳腺腺泡结构显著减少，脂肪组织也相对较少，而结缔组织明显增多，显示乳腺癌组织镜下特征，因此，所取组织经HE染色后，确定为乳腺癌组织，证实建模成功；

3.5.2基因疫苗治疗乳腺癌实验中，如图11所示，其中B图中箭头所示即为乳腺腺泡，而D图中箭头所示即为乳腺中的脂肪组织；但与正常乳腺组织相比，所取组织中乳腺腺泡结构显著减少，脂肪组织也相对较少，而结缔组织明显增多，显示乳腺癌组织镜下特征，因此，所取组织经HE染色后，确定为乳腺癌组织，证实建模成功；

3.6各组肿瘤组织中肿瘤血管CD31分子表达情况

3.6.1通过免疫组化法对肿瘤组织石蜡切片染色，分析肿瘤血管CD31分子表达情况。在基因疫苗预防乳腺癌实验中，图12-A以小鼠尾部皮肤作为阳性对照，如图12-B至E所示，计数以被CD31抗体染成棕褐色单个内皮细胞或内皮细胞簇作为一个微血管计算，先用低倍镜扫视整个切片，寻找确定微血管密度最高的区域，然后在400倍的视野下随机计数5个视野微血管数，共计数5个视野，取平均值统计；镜下观察发现，位于肿瘤不同部位的CD31阳性的血管数量有较大差别，为进一步比较CD31分子在各组血管中表达的情况，如图12-F所示，空载组平均微血管密度为29.00±1.155、rTEM-1组平均微血管密度为 15.00±1.000、SF组平均微血管密度为12.00±1.528、rTEM-1-SF组平均微血管密度为3.33±0.333，经GraphPad软件统计学分析，组间比较采用t检验的方法，与空载组相比，rTEM-1-SF组、rTEM-1组和SF组的微血管密度显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，rTEM-1-SF 组与rTEM-1组相比微血管密度显著降低，差异具有统计学意义 (P<0.05)，rTEM-1-SF 1组与SF组相比微血管密度显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；

3.6.2基因疫苗治疗乳腺癌实验中，如图13A至D所示，计数以被 CD31染成棕褐色单个内皮细胞或内皮细胞簇作为一个微血管计算，先用低倍镜扫视整个切片，寻找确定微血管密度最高的区域，然后在 400倍的视野下随机计数5个视野微血管数，共计数5个视野，取平均值进行统计。镜下观察发现，位于肿瘤不同部位的CD31阳性的血管数量有较大差别，为进一步比较CD31分子在各组血管中表达的情况，如图13-E所示，空载组平均微血管密度为27.33±2.848、rTEM-1组平均微血管密度为10.33±1.202、SF组平均微血管密度为13.00± 1.155、rTEM-1-SF组平均微血管密度为6.00±1.528，经GraphPad软件统计学分析，组间比较采用t检验的方法，与空载组相比，rTEM-1-SF 组、rTEM-1组和SF组的微血管密度显著降低，差异具有统计学意义 (P<0.05)，rTEM-1-SF组与rTEM-1组相比微血管密度降低，差异没有统计学意义(P＞0.05)，rTEM-1-SF组与SF组相比微血管密度显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；

3.7检测各组小鼠肝、肺组织肿瘤转移情况

3.7.1在基因疫苗预防乳腺癌实验中肝组织转移情况：HE染色后镜下观察可知肿瘤转移情况；如图14所示，以Control组小鼠正常肝脏组织为阴性对照，空载组、rTEM-1组和SF组三组均存在肿瘤转移灶 (图中箭头所示)，肝组织总体较疏松，部分肝组织坏死，T、B淋巴细胞浸润十分明显，肿瘤异型性显著，核分裂像明显增多；相比之下， rTEM-1-SF组的肿瘤转移情况和淋巴细胞浸润情况均有较为明显的改善，肝组织情况基本正常，有少量淋巴细胞浸润，无癌巢及瘤巨细胞，细胞核分裂相不明显，肿瘤异型性不明显；

3.7.2在基因疫苗预防乳腺癌实验中肺组织转移情况：HE染色后镜下观察可知肿瘤转移情况；如图15所示，以Control组小鼠正常肺组织为阴性对照，空载组、rTEM-1组和SF组三组均存在肿瘤转移灶(图中箭头所示)，且转移灶较为集中，面积较大，肺间隔明显增厚，并且可见大量的炎性细胞浸润，肺泡间隔内毛细血管扩张充血；相比之下，rTEM-1-SF组的肿瘤转移情况和炎性细胞浸润情况均有较为明显的改善；

3.7.3在基因疫苗治疗乳腺癌实验中肝组织转移情况：HE染色后镜下观察可知肿瘤转移情况；如图16所示，空载组、rTEM-1组和SF 组三组均存在肿瘤转移灶(图中箭头所示)，肝组织总体较疏松，部分肝组织坏死，T、B淋巴细胞浸润十分明显，肿瘤异型性显著，核分裂像明显增多；相比之下，rTEM-1-SF组的肿瘤转移情况和淋巴细胞浸润情况均有较为明显的改善，肝组织情况基本正常，有少量淋巴细胞浸润，无癌巢及瘤巨细胞，细胞核分裂相不明显，肿瘤异型性不明显；

3.7.4在基因疫苗治疗乳腺癌实验中肺组织转移情况：HE染色后镜下观察可知肿瘤转移情况；如图17所示，空载组存在肿瘤转移灶(图中箭头所示)，且转移灶较为集中，面积较大，肺间隔明显增厚，并且可见大量的炎性细胞浸润，肺泡间隔内毛细血管扩张充血；相比之下，rTEM-1组、SF组和rTEM-1-SF组的肿瘤转移情况和炎性细胞浸润情况均有较为明显的改善；

3.8各组小鼠肿瘤大小与肿瘤微血管密度相关性分析

3.8.1在基因疫苗预防乳腺癌实验中，运用GraphPad软件对肿瘤大小和肿瘤微血管密度进行相关性分析；如图18-A、C所示，空载组和SF组中肿瘤大小与肿瘤微血管密度有显著的正相关性P＜0.05，如图18-B、D所示，rTEM-1组和rTEM-1-SF组的肿瘤大小与肿瘤微血管密度没有显著的正相关性P＞0.05；

3.8.2在基因疫苗治疗乳腺癌实验中肺组织转移情况：运用 GraphPad软件对肿瘤大小和肿瘤微血管密度进行相关性分析；如图 19-A至C所示，在空载组、SF组和rTEM-1组中肿瘤大小与肿瘤微血管密度有显著的正相关性P＜0.05，如图19-D所示，rTEM-1-SF组的肿瘤大小与肿瘤微血管密度没有显著的正相关性P＞0.05。

因此，所述靶向TEM-1基因疫苗能够用于抑制肿瘤血管以及乳腺癌。

最后，应当指出，以上实施例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 贵阳市第二人民医院

<120> 一种靶向TEM-1基因及其构建与应用

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TEM-1 上游引物序列

<400> 1

AAAGCCAAAGGGATGACC

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TEM-1 下游引物序列

<400> 2

GCGATAGCAGTCCGTGAT

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SF-TEM-1 上游引物序列

<400> 3

CCCTGGGAGGACTTTGAT

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SF-TEM-1 下游引物序列

<400> 4

CATCCTGTGGGAAGTTGG

Claims

1.一种靶向TEM-1基因疫苗，其特征在于，所述靶向TEM-1基因疫苗为rTEM-1-SF融合基因，其全长为3033bp，其全长序列为atgcatcatcaccatcaccatgcacaagtcattaatacaaacagcctgtcgctgttgacccagaataacctgaacaaatcccagtccgcactgggcactgctatcgagcgtttgtcttccggtctgcgtatcaacagcgcgaaagacgatgcggcaggacaggcgattgctaaccgttttaccgcgaacatcaaaggtctgactcaggcttcccgtaacgctaacgacggtatctccattgcgcagaccactgaaggcgcgctgaacgaaatcaacaacaacctgcagcgtgtgcgtgaactggcggttcagtctgcgaatggtactaactcccagtctgacctcgactccatccaggctgaaatcacccagcgcctgaacgaaatcgaccgtgtatccggccagactcagttcaacggcgtgaaagtcctggcgcaggacaacaccctgaccatccaggttggtgccaacgacggtgaaactatcgatattgatttaaaagaaatcagctctaaaacactgggacttgataagcttaatgtccaagatgcctacaccccgaaagaaactgctgtaaccgttgataaaactacctataaaaatggtacagatcctattacagcccagagcaatactgatatccaaactgcaattggcggtggtgcaacgggggttactggggctgatatcaaatttaaagatggtcaatactatttagatgttaaaggcggtgcttctgctggtgtttataaagccacttatgatgaaactacaaagaaagttaatattgatacgactgataaaactccgttggcaactgcggaagctacagctattcggggaacggccactataacccacaaccaaattgctgaagtaacaaaagagggtgttgatacgaccacagttgcggctcaacttgctgcagcaggggttactggcgccgataaggacaatactagccttgtaaaactatcgtttgaggataaaaacggtaaggttattgatggtggctatgcagtgaaaatgggcgacgatttctatgccgctacatatgatgagaaaacaggtgcaattactgctaaaaccactacttatacagatggtactggcgttgctcaaactggagctgtgaaatttggtggcgcaaatggtaaatctgaagttgttactgctaccgatggtaagacttacttagcaagcgaccttgacaaacataacttcagaacaggcggtgagcttaaagaggttaatacagataagactgaaaacccactgcagaaaattgatgctgccttggcacaggttgatacacttcgttctgacctgggtgcggttcagaaccgtttcaactccgctatcaccaacctgggcaataccgtaaataacctgtcttctgcccgtagccgtatcgaagattccgactacgcaaccgaagtctccaacatgtctcgcgcgcagattctgcagcaggccggtacctccgttctggcgcaggcgaaccaggttccgcaaaacgtcctctctttactgcgtgaattcagttgtgaagacccctgtgcccaggccccctgtgagcagcagtgtgaacctggagggccacaaggctatagctgccactgtcgccttggcttccggccagctgaggatgatccacaccgctgcgtggacacggatgagtgcca gattgctggtgtgtgccagcagatgtgtgtcaactatgttggtggctttgagtgttactgcagcgagggtcacgagcttgaggcagatggtatcagctgtagccctgcaggagccatgggtgcccaggcttcccaggatctcagagatgagttgctggatgatggagaagaaggggaggatgaagaggagccctgggaggactttgatggcacctggacagaggaacaggggatcctatggctggcacctacacatccacctgactttggcctgccctataggcccaacttcccacaggatggagagcctcagagattgcacctggagcctacctggccacccccacttagtgcccccaggggcccctaccactcctcagtggtgtctgccacacggcccatggtgatctctgccactcgacccacactaccttctgcccacaagacctctgttatttcagctacacgcccacccctgagccctgtccacccacctgccatggcccctgccacacctccagctgtgttctctgagcaccagatccccaaaatcaaggccaattatccagacctgccttttggccacaagcctgggataacctcggccactcacccagcacggtctcctccgtaccagccccccattatctcaaccaactatccccaagtcttccctccccaccaggcccctatgtctccagatacccacactatcacttatttgcctccagtcccccctcaccttgatcctggggataccacttctaaagcccatcaacaccctttgctcccagatgctccaggtatcagaacccaggccccccagctttctgtctcagctctccagccccctcttcctaccaactccaggtcttctgtccatgaaactcctgtgcctgctgccaaccagcccccagccttcccttcttctcccctcccccctcagaggcccactaaccagacctcatctatcagccctacacattcctattccagagcccctctagtcccaagggaaggagttcccagtcccaaatcagtgccacagctgccctcggtgccctccacagcagctccaacagccctggcagagtcaggtcttgcaggccaaagccaaagggatgaccgctggctgctggtggcactcctggtgccaacatgtgtcttcttggtggtgctgcttgccctgggcattgtgtactgcactcgctgtggctcccacgcacccaacaagcggatcacggactgctatcgctgggtcacacatgctgggaacaagagctcaacagaacccatgccccccagaggcagccttacaggggtacagacctgtagaaccagtgtgtga。

2.如权利要求1所述靶向TEM-1基因疫苗，其特征在于，该基因疫苗以鞭毛素(SF)为佐剂，以rTEM-1基因为抗原，获得rTEM-1-SF融合基因。

3.如权利要求1所述靶向TEM-1基因疫苗，其特征在于，该所述佐剂为鞭毛素基因，以人肠道沙门氏菌J341基因组为模板进行基因克隆。

4.如权利要求1所述靶向TEM-1基因疫苗，其特征在于，所述rTEM-1基因，其重组核苷酸序列如下：

gaattcagttgtgaagacccctgtgcccaggccccctgtgagcagcagtgtgaacctggagggccacaaggctatagctgccactgtcgccttggcttccggccagctgaggatgatccacaccgctgcgtggacacggatgagtgccagattgctggtgtgtgccagcagatgtgtgtcaactatgttggtggctttgagtgttactgcagcgagggtcacgagcttgaggcagatggtatcagctgtagccctgcaggagccatgggtgcccaggcttcccaggatctcagagatgagttgctggatgatggagaagaaggggaggatgaagaggagccctgggaggactttgatggcacctggacagaggaacaggggatcctatggctggcacctacacatccacctgactttggcctgccctataggcccaacttcccacaggatggagagcctcagagattgcacctggagcctacctggccacccccacttagtgcccccaggggcccctaccactcctcagtggtgtctgccacacggcccatggtgatctctgccactcgacccacactaccttctgcccacaagacctctgttatttcagctacacgcccacccctgagccctgtccacccacctgccatggcccctgccacacctccagctgtgttctctgagcaccagatccccaaaatcaaggccaattatccagacctgccttttggccacaagcctgggataacctcggccactcacccagcacggtctcctccgtaccagccccccattatctcaaccaactatccccaagtcttccctccccaccaggcccctatgtctccagatacccacactatcacttatttgcctccagtcccccctcaccttgatcctggggataccacttctaaagcccatcaacaccctttgctcccagatgctccaggtatcagaacccaggccccccagctttctgtctcagctctccagccccctcttcctaccaactccaggtcttctgtccatgaaactcctgtgcctgctgccaaccagcccccagccttcccttcttctcccctcccccctcagaggcccactaaccagacctcatctatcagccctacacattcctattccagagcccctctagtcccaagggaaggagttcccagtcccaaatcagtgccacagctgccctcggtgccctccacagcagctccaacagccctggcagagtcaggtcttgcaggccaaagccaaagggatgaccgctggctgctggtggcactcctggtgccaacatgtgtcttcttggtggtgctgcttgccctgggcattgtgtactgcactcgctgtggctcccacgcacccaacaagcggatcacggactgctatcgctgggtcacacatgctgggaacaagagctcaacagaacccatgccccccagaggcagccttacaggggtacagacctgtagaaccagtgtgtga。

5.如权利要求1所述靶向TEM-1基因疫苗，其特征在于，所述rTEM-1基因，其氨基酸序列如下：

DLSCEDPCAQAPCEQQCEPGGPQGYSCHCRLGFRPAEDDPHRCVDTDECQIAGVCQQMCVNYVGGFECYCSEGHELEADGISCSPAGAMGAQASQDLRDELLDDGEEGEDEEEPWEDFDGTWTEEQGILWLAPTHPPDFGLPYRPNFPQDGEPQRLHLEPTWPPPLSAPRGPYHSSVVSATRPMVISATRPTLPSAHKTSVISATRPPLSPVHPPAMAPATPPAVFSEHQIPKIKANYPDLPFGHKPGITSATHPARSPPYQPPIISTNYPQVFPPHQAPMSPDTHTITYLPPVPPHLDPGDTTSKAHQHPLLPDAPGIRTQAPQLSVSALQPPLPTNSRSSVHETPVPAANQPPAFPSSPLPPQRPTNQTSSISPTHSYSRAPLVPREGVPSPKSVPQLPSVPSTAAPTALAESGLAGQSQRDDRWLLVALLVPTCVFLVVLLALGIVYCTRCGSHAPNKRITDCYRWVTHAGNKSSTEPMPPRGSLTGVQTCRTSV。

6.如权利要求1所述靶向TEM-1基因疫苗，其特征在于，所述基因疫苗采用的载体为含有Amp抗生素的pcDNA3.1，它对抗原rTEM-1基因和鞭毛素可共表达。

7.如权利要求1或6所述靶向TEM-1基因疫苗的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)获取rTEM-1-SF融合基因

根据GenBank中登录的TEM-1的全长DNA序列，应用DNA Star生物信息学软件分析T淋巴细胞与B细胞表位，截取胞外表达序列并筛选T淋巴细胞和B细胞优势表位基因序列rTEM-1，通过PCR合成人工rTEM-1基因片段，以鞭毛素蛋白为佐剂，获得rTEM-1-SF融合基因；

(2)载体与rTEM-1-SF融合基因的酶切连接

用NheI和XhoI双酶切rTEM-1-SF融合基因和载体，再用T4DNA连接酶连接回收后的rTEM-1-SF融合基因片段和载体消化片段，获得连接产物；

(3)连接产物的转化

取连接产物与大肠杆菌感受态细胞加入至EP管中，混匀，冰浴后，将EP管放入40-45℃的水浴箱进行热激，再将EP管转移至冰盒中使细胞冷却1-2min；然后向EP管中加入2×YT液体培养基，于35-39℃、180-200rpm条件下恒温摇床培养，将已转化的DH5α感受态细胞转移到含有Amp抗生素的LB固体培养基平板上；最后，倒置平板，于37℃培养12-16h，出现菌斑；挑取单菌落于5ml液体LB培养基，220rpm,37℃培养过夜，20％甘油保存菌株。

(4)提取：挑取单克隆菌至1升LB培养基中，置于恒温摇床37℃220转/分增菌过夜，5000rpm×10min离心菌液后，沉淀菌体用纯化试剂盒Vigorous N001抽提质粒DNA，即得。

8.如权利要求1所述靶向TEM-1基因疫苗在抑制肿瘤血管形成中的应用。

9.如权利要求1所述靶向TEM-1基因疫苗在预防或治疗乳腺癌中的应用。

10.如权利要求1所述靶向TEM-1基因疫苗在制备乳腺癌肺转移抑制剂中的应用。

11.如权利要求1所述靶向TEM-1基因疫苗在制备乳腺癌肝转移抑制剂中的应用。