CN115869417B - 一种抗肿瘤融合外泌体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于肿瘤免疫治疗技术领域，具体公开了一种抗肿瘤融合外泌体及其制备方法和应用。本发明将肿瘤细胞来源的外泌体与脂质体融合作为载体，将表达XCL1和FLT3L的质粒包封进载体中，得到能够增加肿瘤内cDC1数量的融合外泌体。通过在融合外泌体表面负载AS16肽，阻断VEGF对cDC1的抑制。同时在融合外泌体膜磷脂双分子层的疏水腔中负载TLR4通路的激动剂MPLA，激活cDC1和CD8⁺T细胞，促进CD8⁺T细胞向肿瘤的浸润和IFN‑γ的分泌。本发明采用依次递进的方式，先增加cDC1在肿瘤中的数量，之后解除cDC1的抑制，重新激活cDC1，整体上恢复和增强cDC1的功能，从而抑制肿瘤生长。

Description

一种抗肿瘤融合外泌体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于肿瘤免疫治疗技术领域，具体涉及一种抗肿瘤融合外泌体及其制备方法和应用。

背景技术

肿瘤免疫治疗是通过增强机体自身的免疫反应来识别和杀伤肿瘤的一种治疗方法。抗肿瘤免疫反应涉及多种免疫细胞和细胞因子之间的作用，其中树突状细胞(DC)处于启动、调控维持抗肿瘤免疫应答的中心环节，其亚型经典I型树突状细胞(cDC1)在肿瘤免疫反应中的作用尤为关键。cDC1擅长在肿瘤部位摄取抗原，并在迁移到肿瘤引流淋巴结后将摄取的抗原提呈给CD8⁺T细胞，进而引起强大的抗肿瘤免疫反应。因此，肿瘤部位cDC1的数量常与多种癌症患者的预后呈正相关。

近期有研究表明，cDC1在肿瘤发生的初期就被排斥在边缘地区，导致肿瘤微环境内部cDC1的数量稀少。同时在肿瘤免疫抑制微环境中，血管内皮生长因子(VEGF)通过与cDC1上的NRP-1结合，抑制cDC1的TLR4信号通路激活，使cDC1处于功能受损的状态。因此，如何提高肿瘤组织中cDC1的丰度，增强cDC1的功能是目前临床研究亟待解决的问题。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种抗肿瘤融合外泌体，通过依次递进的方式，先增加cDC1在肿瘤中的数量，其次解除cDC1受到的抑制，最后重新激活cDC1，整体恢复和增强cDC1的功能，抑制肿瘤生长。

同时，本发明还提供一种抗肿瘤融合外泌体的制备方法及其应用。

为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

一种抗肿瘤融合外泌体，所述融合外泌体以肿瘤细胞来源的外泌体与脂质体融合形成的杂合纳米颗粒作为载体，所述融合外泌体中携带表达趋化因子XCL1和生长因子FLT3L的质粒。

作为本发明一种优选的实施方案，所述融合外泌体的表面负载脂肪酸链修饰的MMP-2酶响应多肽(即RRKKPLGLAG-AS16肽，AS16肽是将两条具有抗血管生成的A7R肽与NS7肽通过柔性连接子AlaAla连接所形成，氨基酸序列为：ATWLPPRAANLLMAAS)。所述脂肪酸链修饰的MMP-2酶响应多肽为C₁₆-RRKKPLGLAG-ATWLPPRAANLLMAAS，分子量为2998.65Da，用于解除VEGF对cDC1的抑制。其中，C₁₆会插入到融合外泌体膜磷脂双分子层的疏水腔中，将AS16肽锚定到融合外泌体上；RRKK序列为正电氨基酸，与带负电的融合外泌体膜正负电荷吸引后也有利于AS16肽在融合外泌体上的固定。

作为本发明一种优选的实施方案，所述融合外泌体膜磷脂双分子层的疏水腔中负载激动剂MPLA，用于激活cDC1的TLR4通路。

作为本发明一种优选的实施方案，所述肿瘤细胞包括结直肠癌细胞(MC38)、肝癌细胞、肺癌细胞、卵巢癌细胞等，优选为结直肠癌细胞。肿瘤细胞来源的外泌体具有与亲本相似的蛋白和脂质成分，从而具有天然的靶向亲本细胞和穿透生物屏障的能力。

作为本发明一种优选的实施方案，所述脂质体采用Lipo2000(商购)，或者采用mRNA疫苗的脂质递送系统LNP。LNP常用材料包括阳离子脂质、磷脂、胆固醇和聚乙二醇脂质。其中，阳离子脂质选自DLin-MC3-DMA、DOTAP(Cl)、DC-Chol等；聚乙二醇脂质选自DMG-PEG2000、DSPE-MPEG2000等。其他还包括ALC-0159、cholesterol、ALC-0315、DSPS、SM-102等中的一种或多种。

作为本发明一种优选的实施方案，所述趋化因子XCL1的核苷酸序列参见NCBIGenBank数据库中登录号NM_008510.2的序列。生长因子FLT3L的核苷酸序列参见NCBIGenBank数据库中登录号NM_013520.3的序列。

一种抗肿瘤融合外泌体的制备方法，包括以下步骤：

(1)将表达趋化因子XCL1和生长因子FLT3L的质粒与脂质体混合，得到复合物；

(2)将肿瘤细胞来源的外泌体与所述复合物混合，得到融合外泌体。

作为本发明一种优选的实施方案，步骤(1)中，所述表达趋化因子XCL1和生长因子FLT3L的质粒的制备方法为：将趋化因子XCL1和生长因子FLT3L基因CDS区克隆到plvx-puro载体的EcoRI和BamHI两个酶切位点中，得到重组质粒；将重组质粒转入DH5α穿刺菌中进行扩增，扩增后提取质粒，即得。

作为本发明一种优选的实施方案，步骤(1)中，所述混合后孵育15-30min，得到稳定的复合物。

作为本发明一种优选的实施方案，步骤(2)中，所述肿瘤细胞来源的外泌体通过外泌体提取试剂盒(商购)提取得到。

作为本发明一种优选的实施方案，步骤(2)中，将肿瘤细胞来源的外泌体与所述复合物、脂肪酸链修饰的MMP-2酶响应多肽、MPLA混合，于35-40℃孵育10-16h。

作为本发明一种优选的实施方案，步骤(2)中，所述孵育后，利用外泌体提取试剂盒纯化融合外泌体，去除游离的核酸、脂肪酸链修饰的MMP-2酶响应多肽、MPLA；之后利用纳米挤出器反复挤压5-15次，滤膜过滤后即得。

作为本发明一种优选的实施方案，所述脂质体与表达趋化因子XCL1和生长因子FLT3L的质粒、肿瘤细胞来源的外泌体、MPLA、脂肪酸链修饰的MMP-2酶响应多肽的用量比为15-25μL：8-12μg：35-45μg：35-45ng：2-5μg，优选为20μL：10μg：40μg：40ng：4μg。

一种抗肿瘤融合外泌体在抑制肿瘤生长中的应用。

作为本发明一种优选的实施方案，所述抗肿瘤融合外泌体在肿瘤组织中招募cDC1、促进cDC1成熟、和/或激活CD8⁺T细胞中的应用。所述激活CD8⁺T细胞为促进CD8⁺T细胞向肿瘤的浸润和IFN-γ的分泌。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种抗肿瘤融合外泌体，通过将能够同源靶向肿瘤的肿瘤细胞来源的外泌体与脂质体融合，以融合后形成的杂合纳米颗粒作为载体，将表达XCL1和FLT3L的质粒包封进载体中，得到了能够增加肿瘤内cDC1数量的融合外泌体。其中，XCL1作为趋化因子能够招募cDC1到达肿瘤部位，FLT3L作为生长因子能够促进cDC1的前体细胞向cDC1分化。进一步地，在融合外泌体表面负载脂肪酸链修饰的MMP-2酶响应多肽，修饰AS16肽能够被肿瘤中丰富的MMP-2酶切，导致cDC1上的NRP-1被AS16肽竞争性结合，从而阻断VEGF对cDC1的抑制。同时，在融合外泌体膜磷脂双分子层的疏水腔中负载TLR4通路的激动剂MPLA，能够激活cDC1和CD8⁺T细胞，促进CD8⁺T细胞向肿瘤的浸润和IFN-γ的分泌。

本发明的融合外泌体的设计思路为：先增加cDC1在肿瘤中的数量，其次解除cDC1受到的抑制，最后重新激活cDC1，通过依次递进的方式整体恢复和增强cDC1的功能，从而抑制肿瘤的生长。体外吞噬实验结果表明，融合外泌体能够被同源细胞吞噬；体内靶向实验结果表明，融合外泌体具有良好的肿瘤靶向性。体内抗肿瘤实验结果表明，融合外泌体能够招募cDC1，提高肿瘤组织中cDC1的比例，促进cDC1的成熟并激活CD8⁺T细胞，增强CD8⁺T细胞向肿瘤的浸润和IFN-γ的分泌。

附图说明

图1为实验例1中AS16肽合成及酶切结果。

A：AS16分子量质谱图；B：酶切后AS16肽分子量质谱图。

图2为实验例1中融合外泌体的表征。

A：外泌体及融合外泌体透射电镜图，比例尺500nm；B、C：制备过程中纳米载体的粒径和电位变化情况，数据用mean±SD表示，n＝3；D：WB表征融合外泌体膜蛋白完整性；E：共聚焦显微镜下融合外泌体的融合情况，细胞核：Hoechest 33258标记，Exo：DID标记，Lipo：DIO标记，比例尺5μm；F：MTT检测融合外泌体对MC38肿瘤细胞增殖的影响，n＝4，数据用mean±SD表示，Student’s t test确定统计学意义，**P<0.01。

图3为实验例2中融合外泌体转染MC38细胞实验结果。

n＝3，数据用mean±SD表示，Student’s t test确定统计学意义，**P<0.01。

图4为实验例2中Transwell实验结果。

n＝3，数据用mean±SD表示，Student’s t test确定统计学意义，**P<0.01。

图5为实验例2中融合外泌体解除VEGF对cDC1抑制的实验结果。

A：VEGF存在下，流式检测融合外泌体对cDC1的激活情况；B：流式统计图，n＝3，数据用mean±SD表示，Student’s t test确定统计学意义，*P<0.05，**P<0.01。

图6为实验例2中融合外泌体处理的cDC1对CD8⁺T细胞的影响。

A、B：不同药物组与cDC1孵育4h后，再与CFSE标记的CD8⁺T细胞共培养72h，流式检测CD8⁺T细胞的增殖情况；C：ELISA检测共培养后CD8⁺T细胞的IFN-γ分泌量，n＝3，数据用mean±SD表示，Student’s t test确定统计学意义，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图7为实验例3中融合外泌体体外靶向肿瘤细胞的实验结果。

A：荧光标记的融合外泌体与细胞孵育3h后的共聚焦成像，细胞核：Hoechest33258(蓝色通道)标记，融合外泌体：DID(红色通道)标记，比例尺50μm；B、C：荧光标记的融合外泌体与细胞孵育3h后的流式图和统计结果，n＝3，数据用mean±SD表示，Student’s t test确定统计学意义，***P<0.001。

图8为实验例3中融合外泌体体内靶向肿瘤的实验结果。

A：尾静脉注射后，游离DIR及DIR标记的融合外泌体在荷有MC38细胞系瘤的小鼠体内随着时间变化的分布情况；B、C：72h后取出小鼠的部分器官检测游离DIR及DIR标记的融合外泌体在器官中的分布，n＝3，数据用mean±SD表示，Student’s t test确定统计学意义，**P<0.01。

图9为实验例4中融合外泌体体内抑制肿瘤生长的实验结果。

A：动物实验治疗方案；B：治疗期间肿瘤体积变化曲线；C：治疗期间小鼠体重变化曲线；D：不同给药组的肿瘤重量；E：不同给药组的肿瘤照片；F：小鼠心肝脾肺肾H&E染色结果，比例尺50μm；n＝5，数据用mean±SD表示，Student’s t test确定统计学意义，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图10为实验例4中融合外泌体对肿瘤中cDC1及CD8⁺T细胞的影响。

A：肿瘤中cDC1的数量；B：肿瘤中cDC1的成熟情况；C：流式细胞仪检测CD8⁺T细胞向肿瘤的浸润；D：流式细胞仪检测CD8⁺T细胞IFN-γ的分泌情况；n＝5，数据用mean±SD表示，Student’s t test确定统计学意义，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图11为实验例4中融合外泌体对脾脏和淋巴结中免疫细胞的影响。

A：脾脏中cDC1的成熟情况；B：脾脏中CD8⁺T细胞IFN-γ的分泌情况；C：淋巴结中cDC1的成熟情况；D：淋巴结中CD8⁺T细胞IFN-γ的分泌情况；n＝5，数据用mean±SD表示，Student’s t test确定统计学意义，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图12为本发明的抗肿瘤融合外泌体的合成及体内作用原理示意图。

A：p-FX质粒设计示意；B：融合外泌体组分示意；C：融合外泌体体内作用原理示意，①融合外泌体进入肿瘤微环境后表面AS16肽被MMP-2酶切，质粒进入肿瘤细胞表达出XCL1和FLT3L，②③趋化因子XCL1招募cDC1进入肿瘤微环境，④⑤肿瘤中FLT3L诱导前cDC1分化成cDC1，⑥cDC1上NRP-1被AS16肽竞争性结合，阻断VEGF对cDC1的抑制，同时融合外泌体上负载的MPLA重新激活cDC1，⑦激活后的cDC1激活CD8⁺T细胞，⑧CD8⁺T细胞分泌IFN-γ杀伤肿瘤细胞，⑨肿瘤细胞死亡，释放肿瘤抗原，⑩释放的肿瘤抗原被cDC1摄取后加工呈递给CD8⁺T细胞。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。但本领域技术人员应当理解，实施例仅用于说明本发明的技术方案，而不应视为限制本发明的保护范围。基于下述实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其他所有实施例方案，例如修改、简单替换后得到的实施方案，均属于本发明的保护范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的原料、试剂、仪器等如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

实施例1

本实施例提供了一种抗肿瘤融合外泌体，所述融合外泌体以肿瘤细胞来源的外泌体与脂质体融合形成的杂合纳米颗粒作为载体，所述融合外泌体中携带表达趋化因子XCL1(NM_008510.2)和生长因子FLT3L(NM_013520.3)的质粒，融合外泌体的表面负载脂肪酸链修饰的MMP-2酶响应多肽(C₁₆-RRKKPLGLAG-ATWLPPRAANLLMAAS，分子量为2998.65Da)，融合外泌体膜磷脂双分子层的疏水腔中负载激动剂MPLA。

本实施例还提供了一种抗肿瘤融合外泌体在抑制肿瘤生长中的应用。

实施例2

本实施例提供了一种融合外泌体及其制备方法，包括：

1.1外泌体提取

挑选生长状态良好的结直肠癌MC38细胞系，待细胞长到70％左右，换成无血清DMEM培养基(Biological Industries)；培养2-3天后收集细胞上清；利用聚乙二醇沉淀法，按照上清液：提取试剂为3：1的比例加入提取试剂，冰上温和摇晃2h；12000rpm，4℃，离心15min，重悬沉淀；将重悬的溶液装入100kD透析袋后，在PBS(pH值7.2)溶液中过夜透析，通过BCA蛋白定量法测定外泌体浓度，于-20℃保存备用。

1.2质粒合成与提取

将XCL1(NM_008510.2)与FLT3L(NM_013520.3)基因的CDS区克隆到plvx-puro载体的EcoRI和BamHI两个酶切位点中(全基因及亚克隆由华大基因公司合成)；将质粒转入DH5α穿刺菌中，在LB培养基中进行扩增；按照质粒提取试剂盒(康为世纪)提取质粒，检测浓度后于-20℃保存备用。

1.3融合外泌体构建

将20μL的Lipo2000与10μg质粒各自均匀分散到PBS(pH值7.2)溶液中5min，然后将Lipo2000与质粒分散液混合孵育20min。使Lipo2000与质粒形成稳定复合物；向稳定复合物中添加40μg外泌体以及40ng的MPLA(Invivogen，tlrl-mpla)与4μg的AS16肽；37℃孵育12h后，使用外泌体提取试剂盒(贝贝生物)进行重新提取，以去除游离的MPLA、DNA以及AS16肽，弃上清后用PBS(pH值7.2)重悬；使用纳米挤出器将重悬后的融合外泌体反复挤压11次，通过200nm的滤膜，制备完成后于-80℃保存。

实验例

实施例2中融合外泌体的合成及体内作用原理示意图如图12所示，主要实验内容如下：

(1)融合外泌体的制备与表征

对制备的融合外泌体AS16-EL@MPLA/p-FX的物理性质进行表征：DLS检测融合外泌体的电位和粒径，透射电镜考察融合外泌体的形貌特征，WB验证融合外泌体中膜蛋白的完整性，CLSM验证融合外泌体的融合效果，HPLC、鲎试剂及荧光分光光度计Qubit考察融合外泌体的包封率和载药量。

(2)融合外泌体体外招募和激活cDC1

首先，验证融合外泌体处理的MC38肿瘤细胞能否成功表达出趋化因子XCL1和生长因子FLT3L。其次以小鼠骨髓来源的cDC1作为细胞模型，通过Transwell实验验证融合外泌体对cDC1的招募能力。以XCR1抗体标记cDC1，CFSE标记CD8⁺T细胞，不同药物处理cDC1后，以CD40和CD80的表达作为cDC1成熟的标志。经过不同药物处理过的cDC1与CFSE标记的CD8⁺T细胞共孵育后，通过CFSE荧光变化检测CD8⁺T细胞的增殖情况，并通过IFN-γ的分泌评估CD8⁺T细胞的功能。

(3)融合外泌体体外和体内靶向

利用MC38肿瘤作为模型，用DID对融合外泌体进行荧光标记，采用CLSM观察DID标记的融合外泌体和CT26、4T1和MC38细胞的共定位来确定AS16-EL@MPLA/p-FX被不同肿瘤细胞的摄取情况，同时用流式细胞仪对不同细胞摄取的融合外泌体进行定量考察。在C57BL/6N小鼠上构建MC38肿瘤模型，待肿瘤长到合适的体积时，通过尾静脉给小鼠注射DID标记的融合外泌体，然后利用小动物活体成像观察融合外泌体在小鼠体内的分布情以及在不同器官中的积累情况，以此来表征融合外泌体在体内靶向肿瘤的效果。

(4)融合外泌体抗肿瘤效果评价

以MC38肿瘤作为考察融合外泌体AS16-EL@MPLA/p-FX抗肿瘤效果的模型。通过测量治疗期间不同实验组小鼠的瘤体积、瘤重和体重的变化观察融合外泌体抑制肿瘤生长的效果。通过H&E染色考察融合外泌体对各实验组小鼠器官(心、肝、脾、肺、肾)的毒性作用。利用流式细胞仪检测肿瘤部位cDC1的数量和成熟情况以及CD8⁺T细胞的浸润活化情况，同时检测脾脏和淋巴结中cDC1的成熟情况及CD8⁺T细胞IFN-γ的分泌情况等综合评价AS16-EL@MPLA/p-FX在体内的抗肿瘤效果。

主要试剂和溶液：

MTT溶液：称取MTT粉末0.25g于遮光纸包裹的50mL离心管中，加入50mL的PBS(pH值7.2)，充分溶解后用0.22μm滤膜过滤除菌，分装在遮光纸包裹的1.5mL的离心管中。配制完成后置于-20℃避光保存。

细胞冻存液：先取适量的培养基，然后向培养基中添加培养基体积8％的DMSO，混匀。配制后立即使用。

1×SDS上样缓冲液(Loading Buffer)：取5mL 0.5M Tris-HCl(pH值6.8)，1g SDS，5mL甘油，0.05g溴酚蓝以及2.5mLβ-巯基乙醇，用双蒸水定容到50mL。

10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：取30.3g Tris，187.65g Glycine以及10g SDS溶于超纯水中，定容到1000mL。

PBS(pH值7.2)缓冲溶液：分别称取KCl 0.2g，KH₂PO₄ 0.2g，NaCl 8g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.08g于烧杯中，用超纯水定容至1000mL，搅拌溶解，高压蒸汽(121℃，30min)灭菌后备用。

4％多聚甲醛：称取4g多聚甲醛粉末，加入100mL PBS(pH值7.2)溶液，于37℃溶解后置于4℃保存。

5％大鼠血清：将50μL的大鼠血清加入到1.5mL的EP管中，再加入950μL PBS(pH值7.2)溶液，混合均匀后置于4℃保存。同理，配制10％大鼠血清。

ELISA终止液：将1mL 1mM H₃PO₄溶液加入到EP管中，用双蒸水定容到15mL，4℃密闭保存。

实验例1融合外泌体的制备与表征

1、实验方法

1.1AS16肽的合成及酶切验证

利用Fmoc固相合成法合成脂肪酸链修饰的MMP-2酶响应多肽C₁₆-RRKKPLGLAG-AS16(分子量2998.65Da，[M+3H]⁺999.55Da，[M+4H]⁺749.66Da)。其中，C₁₆会插入到融合外泌体磷脂双分子层的疏水腔中，用于将AS16肽锚定到融合外泌体上；RRKK序列为正电氨基酸，与负电位的外泌体膜正负电荷吸引后也可帮助AS16肽在融合外泌体上的固定。

(1)C端第一个氨基酸与树脂反应

a)称取0.282g Rink(取代值0.709)树脂加入合成仪，然后加入2mL的DMF和2mL的DCM，使树脂溶胀30min。b)DMF洗两次。c)脱保护：加入脱保护液后置于摇床上震荡10min，2次。d)洗涤：按DMF、DCM、DMF各三遍的顺序洗涤。e)茚检：取一干净细铁丝挑取少量树脂放入茚检管中，加茚检液，将茚检管固定好放入沸水浴30s左右。取出观察如颗粒呈蓝色即可。f)第一个氨基酸、HOBT、DIC(或者HCTU和DIEA)的计算和称取：其量＝m树脂×当量×加取代基分子量×取代值。g)将氨基酸和HOBT溶于最少量的DMF，然后加入合成仪中，用移液器加入DIC。h)茚检同上，树脂成无色。i)洗涤同上。

(2)多肽链的延长

a)脱保护：加入脱保护液后置于摇床上震荡10min，2次。b)洗涤同上。c)茚检同上。d)氨基酸、HOBT、DIC的计算和称取：其量＝m树脂×当量×分子量×取代值。e)将氨基酸和HOBT溶于DMF，然后加入合成仪中，用移液器加入DIC。f)将合成仪放在摇床上震荡2.5h。g)洗涤同上。h)茚检：沸水浴30s左右，观察如颗粒为无色且蓝色颗粒混杂即可。

(3)从树脂上切割肽链

a)脂肪酸链按照氨基酸的方式加入合成仪中，茚检成功后无需脱保护。b)洗涤：按DMF、DCM、DMF各三遍的顺序洗涤。c)按以下配方配制切割试剂：三蒸水0.3mL，苯酚0.3mL，苯甲硫醚0.3mL，1,2-二硫醇0.15mL，TFA定容到5mL(以上原料按照顺序加入，最后定容到5mL，每管中加3mL)。d)将切割试剂倒入合成仪中反应3h。e)反应结束后，将液体倒入50mL离心管中，利用DCM冲洗树脂，直到液体为无色。f)在离心管中加入冰乙醚，静置30min，有白色沉淀出现即为粗肽(时间可延长，乙醚可多加)。g)静置完成后，按照2000rpm，离心2min，倒掉上清，再用冰乙醚将粗肽重悬离心，洗3遍。h)在通风橱中晾干肽后制备精肽。

为验证合成的C₁₆-RRKKPLGLAG-AS16肽能否被MMP-2酶切，设计MMP-2酶切实验，并通过质谱鉴定酶切产物，结果如图1所示。

1.2融合外泌体的包封率和载药量

将制备的融合外泌体按照100000g，60min，4℃进行离心，收集上清，上清分别用液质联用仪、鲎试剂检测试剂盒以及荧光分光光度计进行检测，并采用下述公式1-2进行包封率和载药量的计算。

式1：

式2：

1.3融合外泌体的表征

(1)融合外泌体的TEM图

将制备的融合外泌体用PBS(pH值7.2)溶液调整浓度到200μg/mL。用移液枪吸取融合外泌体样品并添加到铜网上，37℃烘干后在交流电压80kV、发射电流10μA条件下用TEM进行观察拍照，结果如图2A所示。

(2)测定融合外泌体Zeta电位和粒径

分别取1mL超声混匀的融合外泌体样品(20μg/mL)，利用马尔文粒度仪进行检测，结果如图2B、图2C所示。

(3)SDS-PAGE分析外泌体膜蛋白保留情况

在融合外泌体样品中加入Loading Buffer，于水浴锅中煮沸20min，点样后进行电泳；电泳结束后进行转膜，将浓缩胶与剪好的PVDF膜按照顺序放入转膜夹中，再放入电泳仪中，300mA、2.5h进行电转；转膜后依次进行一抗、二抗(一抗为兔单克隆抗体，购自Abcam，二抗为羊抗兔，购自索莱宝)孵育，用PBST清洗后进行显影，结果如图2D所示。

(4)激光共聚焦检测融合外泌体的融合情况

将MC38肿瘤细胞按5×10⁵cells/mL、每皿1mL铺于激光共聚焦培养皿中；使用DID标记外泌体、DIO标记Lipo2000，制备荧光标记的纳米颗粒，每皿细胞中加入100μg/mL荧光标记的纳米颗粒，孵育3h；孵育后收集不同的肿瘤细胞，并用PBS(pH值7.2)溶液洗涤，加入浓度为4％的多聚甲醛固定，固定后清洗2遍；加入终浓度为5μg/mL的Hoechest 33258染细胞核8min，用PBS溶液清洗两遍；置于CLSM下观察拍照，结果如图2E所示。

(5)融合外泌体对细胞的毒性评价

收集处于对数生长期且状态良好的MC38细胞，按照3×10³个/孔接种于96孔板中，每组4个重复，于细胞培养箱中培养；抽去细胞培养液，并加入150μL无血清DMEM饥饿处理细胞8h；设置实验分组：PBS组、MPLA组、p-FX质粒组、Lipo组、EL组、AS16组、AS16-EL@MPLA/p-FX组，每组4个复孔，每孔加入20μL药物，药物剂量按照MPLA的终浓度计算；在加入融合外泌体后的24h、48h、72h，每孔加入20μL的MTT溶液孵育4h，用抽泵抽去旧培养基后，在每孔中加入150μL的DMSO，并在室温下避光震荡15min；震荡结束后，在酶标仪的490nm波长处测定各实验组的吸光值，结果如图2F所示。

2、实验结果及分析结论

2.1AS16肽的酶切验证

从图1可以看出，在MMP-2酶存在下AS16肽被成功切开，得到C₁₆-RRKKPLG(分子量1092Da，[M+2H]⁺546Da)和LAG-AS16(分子量1924Da，[M+2H]⁺962Da)片段。

2.2融合外泌体的包封率和载药量

实验结果表明，融合外泌体对质粒、AS16肽、MPLA的包封率分别为64±4％、43±5％、38±3％，载药量分别为31.97±1.79％、4.3±0.5％、0.38±0.03％。

2.3融合外泌体的表征

从图2A可以看出，提取的外泌体及制备的融合外泌体都具有良好的形态特征，粒径在230nm左右，分散性良好。

从图2B、图2C可以看出，外泌体和Lipo2000在PBS中的粒径分别为80nm和110nm左右，而外泌体与Lipo2000孵育后经过挤压通过200nm的膜得到的融合外泌体的粒径为230nm；外泌体呈轻微负电荷，与带正电的Lipo2000融合后，负电荷减小，在加入MPLA后，负电荷略微增大，而加入AS16肽后，由于AS16肽带正电，负电荷被中和后减小，最后加入带负电荷的质粒，融合外泌体的负电荷增大，整体带负电；以上变化均表明融合外泌体制备成功。

从图2D可以看出，融合外泌体制备完成后其上携带的CD9、TSG101等膜蛋白并未损失，表明融合外泌体膜蛋白的完整性。

从图2E可以看出，外泌体与Lipo2000具有良好的融合效果。

从图2F可以看出，外泌体与Lipo2000融合后，降低了Lipo2000对细胞产生的毒性，表明融合外泌体具有良好的生物安全性。

实验例2融合外泌体体外招募和激活cDC1

1、实验方法

1.1融合外泌体转染MC38实验

收集处于对数生长期且状态良好的MC38细胞，按照3×10⁵个/孔均匀铺于6孔板中，在细胞培养箱中培养过夜使细胞贴壁；第二天上午进行转染，将融合外泌体(含有4μg质粒)等添加到贴壁后的MC38细胞中，培养24h；抽去旧培养基，加入PBS(pH值7.2)溶液洗涤2次，加入胰酶消化1min，消化完全抽去胰酶，加入含双抗DMEM重悬细胞，3500rpm，4℃，离心5min；轻微涡旋细胞沉淀，加入200μL固定剂(赛默飞)重悬细胞，室温避光固定30min；固定后加入800μL破膜剂(赛默飞)，按照3500rpm，4℃，离心5min，弃去上清；加入破膜剂配制的抗体anti-mFLAG-PE(L5)(Biolegend)和anti-mHis-APC(J095G46)(eBioscience)，混匀后冰上避光孵育30min；加入PBS(pH值7.2)溶液洗涤，离心弃去上清，用200μL的PBS(pH值7.2)重悬细胞，然后流式上机检测，结果如图3所示。

1.2Transwell实验

将对数期状态良好的MC38细胞按照3×10⁵个/孔铺于24孔板中，在细胞培养箱中培养过夜使细胞贴壁；第二天抽去旧培养基，将制备的融合外泌体等加入到MC38细胞中，放入Transwell小室；将FLT3L诱导12天的C57BL/6N小鼠骨髓来源的cDC1按照5×10⁵个/孔加入到上层小室中；待融合外泌体加入24h后，收取下层培养基，进行流式检测；于3500rpm，4℃，离心5min，弃上清，加入40μL5％大鼠血清封闭10min，然后用10μL体系孵育细胞表面流式抗体anti-CD11c-APC(N418)(eBioscience)和anti-mXCR1-BV650(ZET)(Biolegend)，涡旋混匀后冰上避光孵育30min，加入PBS(pH值7.2)溶液洗涤，离心弃去上清，洗去多余的细胞表面抗体，用200μL FACS buffer重悬细胞，流式上机检测，结果如图4所示。

1.3融合外泌体对cDC1解除抑制和激活的影响

将FLT3L诱导12天的C57BL/6N小鼠骨髓来源的cDC1按照2×10⁵个/孔铺于24孔板中；设置实验分组：对照组1PBS，实验组MPL、VEGF+MPLA、VEGF+EL@MPLA、VEGF+AS16-EL@MPLA、VEGF+AS16-EL@MPLA/p-FX、VEGF+AS16-EL@MPLA/p-FX+MMP-2，每组3个复孔；在每孔中分别加入含有40ng/mL MPLA的融合外泌体，于细胞培养箱中培养；培养至48h时，收集细胞至干净的EP管中；收集的细胞用PBS(pH值7.2)溶液洗涤1次，按照3500rpm，4℃，离心5min，弃上清；分别加入40μL 10％大鼠血清，孵育10min，然后按照10μL体系加入细胞表面抗体anti-mCD40-FITC(HM40-3)(eBioscience)和anti-mCD80-eflour710(16-10A1)(Biolegend)，混匀后冰上避光孵育30min；加入PBS(pH值7.2)溶液洗涤，离心弃去上清，用200μL PBS(pH值7.2)溶液重悬细胞，流式上机检测，结果如图5所示。

1.4融合外泌体处理的cDC1对CD8⁺T细胞的影响

cDC1与CSFE标记CD8⁺T细胞的共培养：将上述实验组的药物与cDC1共孵育4h，离心收集细胞，并调整细胞密度为1×10⁵cells/mL；将CFSE染色后的CD8⁺T细胞用排枪按照100μL/well加入到U型底的96孔板中，15min后将已调整好细胞密度的cDC1细胞同样按照100μL/well加入到U型底的96孔板中，混匀后于37℃共孵育72h。

流式检测CFSE标记CD8⁺T细胞的增殖：用移液枪收集U型底96孔板中共培养的cDC1与CD8⁺T细胞，3500rpm，4℃，离心5min，弃上清，用100μL PBS(pH值7.2)溶液重悬细胞；加入细胞表面流式抗体，不同组细胞分别加入anti-mCD3-PerCP-eflour710(17A2)(eBioscience)、anti-mCD8α-APC(53-6.7)(eBioscience)各0.3μL，于冰上避光孵育30min；孵育完成后，加入PBS(pH值7.2)溶液，按照3500rpm，4℃，离心5min，弃上清，用200μL PBS(pH值7.2)重悬细胞，过滤细胞悬液后上机检测，结果如图6A、图6B所示。

ELISA检测CD8⁺T细胞IFN-γ分泌：向ELISA板每孔加入100μL Capture antibody，4℃孵育过夜；洗涤3次，向每孔加入200μL 1×ELISA/ELISPOT diluent，室温孵育1.5h；洗涤3次后，在样品孔中加入100μL的样品，将标准品稀释成8个浓度梯度，每孔加入100μL，室温孵育1.5h；洗涤3次后，每孔加入100μL稀释(1:1000)的detection antibody；洗涤3次后，每孔加入100μL稀释(1:50)的Avidin-HRP，室温孵育30min；洗涤5次后，每孔100μL 1×TMBSolution，室温下静置20min；加入50μL ELISA终止液，使用酶标仪在450nm处读取各组的吸光值，结果如图6C所示。

2、实验结果及分析结论

2.1融合外泌体转染MC38实验

从图3可以看出，与空载质粒组相比，在添加了表达质粒的组中MC38细胞成功表达出XCL1和FLT3L两种细胞因子。

2.2融合外泌体对cDC1的招募

从图4可以看出，与其他处理组相比，加入了表达质粒的融合外泌体转染MC38细胞后对cDC1具有良好的招募效果。

2.3融合外泌体对cDC1解除抑制和激活的影响

从图5可以看出，与对照组(7.29％)相比，单独加入MPLA的组显示出了对cDC1的激活(13.6％)，然而这种激活在VEGF的存在下被抑制(8.49％)；同时在VEGF存在下，加入携带MPLA的载体发现，cDC1有轻微的激活(11.2％)，这可能是载体含有与肿瘤细胞相似的抗原所致。在载体中引入AS16肽后，VEGF对cDC1激活的抑制被完全解除(17.0％)，并且在引入质粒p-FX后，cDC1的激活被进一步增强(29.5％)。在MMP-2酶作用下，AS16肽与融合外泌体脱离，具有更好的阻断VEGF对cDC1抑制的作用，因而显示出对cDC1最强的激活效果(33.0％)。

2.4融合外泌体处理的cDC1对CD8⁺T细胞的影响

从图6A、图6B可以看出，与PBS组(4.31％)相比，单独使用MPLA并不能刺激CD8⁺T细胞的增殖(5.09％)，这可能是由于缺乏抗原刺激所产生的第一刺激信号所致。VEGF存在下，加入包含MPLA的载体并没增加CD8⁺T细胞的增殖(5.56％)，这可能是由于cDC1的激活所产生的第二刺激信号被抑制，导致cDC1不能正常刺激CD8⁺T细胞的增殖分化。但在添加AS16肽后，CD8⁺T细胞的增殖恢复(16.9％)，表明AS16肽解除了VEGF对cDC1的抑制。更重要的是，在添加了质粒p-FX的组中，CD8⁺T细胞的增殖进一步增加(23.3％)，表明生长因子FLT3L对cDC1具有促进作用。进一步添加MMP-2后，CD8⁺T细胞的增殖程度最为显著(38.9％)。

从图6C可以看出，上清中CD8⁺T细胞的IFN-γ分泌量与CD8⁺T细胞的增殖趋势保持一致。

在抗肿瘤免疫反应中，cDC1在肿瘤部位摄取抗原后将抗原呈递给CD8⁺T细胞，引起CD8⁺T细胞的分化和激活，激活后的CD8⁺T细胞分泌IFN-γ杀伤肿瘤细胞。在这一系列反应中，cDC1激活CD8⁺T细胞必须同时给予第一信号和第二信号，其中肿瘤来源的外泌体作为第一信号，MPLA作为增强第二信号的药物，双管齐下对CD8⁺T细胞进行有效的激活。

实验例3融合外泌体体外和体内靶向

1、实验方法

1.1融合外泌体的体外靶向实验

荧光标记融合外泌体的制备：将荧光素DID用PBS(pH值7.2)溶液配置成浓度10μg/mL的荧光溶液，与制备的融合外泌体在培养箱中孵育20min，全程避光；孵育完成后，按照外泌体提取方法重新提取融合外泌体，以除去未结合的荧光素。

激光共聚焦检测荧光标记外泌体对不同肿瘤细胞靶向：将B16、MC38、4T1肿瘤细胞的密度调整为5×10⁵cells/mL，按照每皿1mL加入到激光共聚焦小皿中；每皿细胞加入100μg/mL的荧光标记融合外泌体DID-AS16-EL@MPLA/p-FX，在细胞培养箱中孵育3h；除去旧的培养基，用PBS(pH值7.2)溶液洗涤2次，加入4％多聚甲醛固定细胞15min，固定后抽去多聚甲醛，用PBS(pH值7.2)溶液洗涤2次；加入终浓度为5μg/mL的Hoechest 33258标记B16、MC38、4T1细胞的细胞核8min，用PBS(pH值7.2)溶液洗涤2次，弃上清；加入20μL防荧光猝灭剂，在CLSM下拍照观察，结果如图7A所示。

流式细胞仪定量检测不同细胞对融合外泌体的摄取：将B16、MC38、4T1肿瘤细胞的密度调整为5×10⁵cells/mL，1mL/well铺于24孔板中；每孔加入包含1μg质粒的DID-AS16-EL@MPLA/p-FX，在细胞培养箱中培养3h；收集细胞，加入200μL 4％多聚甲醛固定剂重悬细胞，室温避光固定30min；固定后加入800μL破膜剂，离心弃上清；用200μL PBS(pH值7.2)溶液重悬细胞沉淀，制备成单细胞悬液，用筛网过滤后转移到流式套管中上机检测，结果如图7B、图7C所示。

1.2融合外泌体的体内靶向实验

小动物活体成像观察融合外泌体体内靶向性：用1mL注射器将MC38肿瘤细胞通过皮下荷瘤的方式接种到事先剃毛的小鼠背部右侧靠下的位置，每只小鼠200μL，即1×10⁶个/只；每两日利用游标卡尺测量小鼠肿瘤，按照公式V＝1/2×a(长)×b(宽)×c(高)计算肿瘤体积；将荧光素DIR配制成1μg/mL的PBS(pH值7.2)荧光溶液，与制备好的融合外泌体在培养箱中孵育20min，全程避光；待肿瘤体积长至200mm³时，通过尾静脉注射荧光素标记的融合外泌体以及游离的荧光素；等到注射30min、2h、4h、24h、48h、72h后，给小鼠腹腔注射水合氯醛300μL，待小鼠完全麻醉后放入动物活体成像仪中拍照观察荧光在不同位置处的积累情况，结果如图8A所示；72h后将小鼠脱颈处死，取出心、肝、脾、肺、肾和肿瘤，在小动物活体成像仪中观察荧光在不同器官的积累情况，结果如图8B、图8C所示。

2、实验结果及分析结论

2.1融合外泌体体外靶向实验

从图7A可以看出，红色为荧光标记的融合外泌体，蓝色为肿瘤细胞的细胞核，荧光叠加后可以观察到，MC38细胞对荧光标记的融合外泌体吞噬的更多。

从图7B、图7C可以看出，MC38肿瘤细胞对同样来源的融合外泌体摄取的更多。激光共聚焦检测和流式细胞检测结果都表明，融合外泌体在体外具有同源靶向的作用。

2.2融合外泌体体内靶向实验

从图8A可以看出，荧光标记的融合外泌体相较于游离荧光染料能够更快和更多的蓄积到肿瘤部位。

从图8B、图8C可以看出，荧光标记的融合外泌体尽管在肝脏和脾脏中有积累，但是在肿瘤中的积累更多，表明融合外泌体在体内仍具有良好的肿瘤靶向性。

实验例4融合外泌体抗肿瘤效果评价

1、实验方法

1.1融合外泌体对MC38肿瘤生长的抑制作用

将荷瘤成功的小鼠随机分为5组，每组5只小鼠，在接种MC38细胞后的第8天通过尾静脉注射不同药物：PBS、MPLA、EL@MPLA、AS16-EL@MPLA、AS16-EL@MPLA/p-FX，每3天注射1次，治疗期间共给药4次，注射剂量均按照载体所负载的MPLA(400ng/只)计算；每2天称量每只小鼠的体重，同时使用游标卡尺测量每只小鼠肿瘤大小，按照公式V＝1/2×a(长)×b(宽)×c(高)计算肿瘤体积，绘制肿瘤体积变化曲线和体重变化曲线；从每组选择1只小鼠，分别取出小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏等器官，浸泡在组织固定液中，并送到武汉赛维尔公司进行H&E染色。结果如图9所示。

1.2融合外泌体对肿瘤中cDC1的招募及激活

检测肿瘤cDC1的细胞数量及活化比例：取出小鼠背部肿瘤，制成肿瘤单细胞样本；将单细胞样本按照3500rpm，4℃，离心5min，在细胞沉淀中加入细胞表面抗体anti-mCD45-PE(eBioscience)、anti-mXCR1-BV650(ZET)(Biolegend)和anti-mCD11c-APC(N418)(eBioscience)，anti-mCD40-FITC(HM40-3)(Biolegend)和anti-mCD80-eflour710(16-10A1)(Biolegend)到对应的组中，冰上避光孵育30min，并设置条件管；孵育后加入PBS(pH值7.2)溶液洗去未结合的抗体，离心弃上清；用适量PBS溶液重悬细胞沉淀，制成单细胞悬液，筛网过滤后上机检测，结果如图10A、图10B所示。

检测肿瘤CD8⁺T细胞浸润：将小鼠肿瘤的单细胞样本离心，在细胞沉淀中加入细胞表面抗体anti-mCD45-FITC(30-F11)(eBioscience)、anti-mCD3-PerCP-eflour710(17A2)(eBioscience)和anti-mCD8α-PE(53-6.7)(eBioscience)到对应的组中，冰上避光孵育30min，并设置条件管；孵育后加入PBS(pH值7.2)溶液洗去未结合的抗体，离心弃上清；用适量PBS溶液重悬细胞沉淀，制成单细胞悬液，筛网过滤后上机检测，结果如图10C所示。

检测肿瘤CD8⁺T细胞IFN-γ分泌：将小鼠肿瘤的单细胞样本离心，在细胞沉淀中加入细胞表面抗体anti-mCD45-FITC(30-F11)(eBioscience)、anti-mCD3-PerCP-eflour710(17A2)(eBioscience)和anti-mCD8α-PE(53-6.7)(eBioscience)到对应的组中，冰上避光孵育30min，并设置条件管；孵育后用PBS(pH值7.2)溶液洗去未结合的抗体，离心弃上清；每管加入200μL 4％多聚甲醛，室温避光固定30min；直接加入800μL 1×破膜剂，离心；加入细胞内抗体anti-mIFN-γ-APC(XMG1.2)(eBioscience)，冰上避光孵育30min；孵育后用PBS(pH值7.2)溶液洗去未结合的抗体，离心弃上清；用适量PBS溶液重悬细胞沉淀，制成单细胞悬液，筛网过滤后上机检测，结果如图10D所示。

1.3融合外泌体对脾脏和淋巴结中cDC1和CD8⁺T细胞的激活

检测脾脏和淋巴结中cDC1的激活：将小鼠脾脏和淋巴结的单细胞样本离心，在细胞沉淀中加入细胞表面抗体anti-mXCR1-BV650(ZET)(Biolegend)和anti-mCD11c-APC(N418)(eBioscience)，anti-mCD40-FITC(HM40-3)(Biolegend)和anti-mCD80-eflour710(16-10A1)(Biolegend)到对应的组中，冰上避光孵育30min，并设置条件管；孵育后加入PBS(pH值7.2)溶液洗去未结合的抗体，离心弃上清；用适量PBS溶液重悬细胞沉淀，制成单细胞悬液，筛网过滤后上机检测，结果如图11A、图11C所示。

检测脾脏和淋巴结中IFN-γ分泌：将小鼠脾脏和淋巴结的单细胞样本离心，在细胞沉淀中加入细胞表面抗体anti-mCD3-PerCP-eflour710(17A2)(eBioscience)和anti-mCD8α-PE(53-6.7)(eBioscience)到对应的组中，冰上避光孵育30min，并设置条件管；孵育后用PBS(pH值7.2)溶液洗去未结合的抗体，离心弃上清；每管加入200μL 4％多聚甲醛，室温避光固定30min；直接加入800μL 1×破膜剂，离心；加入细胞内抗体anti-mIFN-γ-APC(XMG1.2)(eBioscience)，冰上避光孵育30min；孵育后用PBS(pH值7.2)溶液洗去未结合的抗体，离心弃上清；用适量PBS溶液重悬细胞沉淀，制成单细胞悬液，筛网过滤后上机检测，结果如图11B、图11D所示。

2、实验结果及分析结论

2.1融合外泌体对MC38肿瘤生长的抑制作用

从图9C可以看出，治疗期间，各组小鼠体重无明显差异，表明融合外泌体具有良好的生物安全性。

从图9B、图9D、图9E可以看出，PBS组与游离MPLA组的肿瘤体积无显著差异，这可能是由于MPLA剂量低的缘故，而EL@MPLA组表现出明显的抑制肿瘤生长效果，抑制率达到35.6％。加入AS16肽(AS16-EL@MPLA)后，抑瘤效果进一步增强，抑制率为57％，而全载组(AS16-EL@MPLA/p-FX)显示出最强的抑瘤效果，肿瘤抑制率达到75.1％。

从图9F可以看出，治疗后小鼠主要器官组织与对照组相比无明显异常，这也表明融合外泌体具有良好的生物安全性。

2.2融合外泌体对肿瘤中cDC1的招募及激活

从图10A可以看出，与对照组相比，未添加质粒的三组MPLA、EL@MPLA和AS16-EL@MPLA中，cDC1在肿瘤中的数量并未增加，而添加质粒的全载组AS16-EL@MPLA/p-FX中，肿瘤中cDC1的数量显著增加(8.53％)。

从图10B可以看出，单独的MPLA组与对照组相比，cDC1的成熟率并无差异，这可能是MPLA剂量小且无法特异的递送到肿瘤部位的缘故。而添加质粒的EL@MPLA组显著刺激了cDC1的成熟(23.2％)。由于肿瘤微环境中存在丰富的VEGF，从而会导致cDC1的功能缺陷，而在载体上添加AS16肽可以解除VEGF对cDC1的抑制，从而促进cDC1的成熟(30％)。而全载组AS16-EL@MPLA/p-FX具有最强的cDC1成熟率(37.4％)。

从图10C、图10D可以看出，融合外泌体AS16-EL@MPLA/p-FX能够增加CD8⁺T细胞在肿瘤组织中的浸润(41.0％)，并且CD8⁺T细胞中IFN-γ的分泌也显著提高(85.8％)。

2.3融合外泌体对脾脏和淋巴结中cDC1和CD8⁺T细胞的激活

从图11A、图11C可以看出，融合外泌体全载组对脾脏中cDC1的激活及CD8⁺T细胞IFN-γ分泌均有显著的促进作用(63.2％和27.2％)。

从图11B、图11D可以看出，融合外泌体全载组对淋巴结中cDC1的激活及CD8⁺T细胞IFN-γ分泌也均有显著的促进作用(77.8％和25.0％)。

本发明成功构建了抗肿瘤融合外泌体AS16-EL@MPLA/p-FX，TEM和DLS结果显示，融合外泌体的粒径约为230nm，分散性良好。融合外泌体对MC38肿瘤细胞没有直接的毒性杀伤作用，在体内外具有良好的的同源靶向性。融合外泌体能够在体外招募cDC1，解除VEGF对cDC1的抑制。并且，融合外泌体处理的cDC1与CD8⁺T细胞共培养后，能够有效刺激CD8⁺T细胞的增殖和IFN-γ的分泌。动物肿瘤模型实验证明，融合外泌体在体内能够有效抑制肿瘤生长，增加cDC1和CD8⁺T细胞在肿瘤部位的数量，增强肿瘤部位、脾脏和淋巴结中cDC1和CD8⁺T细胞的功能。

虽然上文中已经用一般性说明、具体实施方式及实验例对本发明的技术方案做了详尽的描述，但需要说明的是，实施例和实验例仅用于说明本发明的技术方案和技术效果，而不应视为对本发明保护范围的任何限制。基于本发明技术构思所做的简单变形、修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种抗肿瘤融合外泌体，其特征在于：所述融合外泌体以肿瘤细胞来源的外泌体与脂质体融合形成的杂合纳米颗粒作为载体，所述融合外泌体中携带表达趋化因子XCL1和生长因子FLT3L的质粒；

所述融合外泌体的表面负载脂肪酸链修饰的MMP-2酶响应多肽，所述脂肪酸链修饰的MMP-2酶响应多肽为C₁₆-RRKKPLGLAG-ATWLPPRAANLLMAAS；

所述融合外泌体膜磷脂双分子层的疏水腔中负载激动剂MPLA；

所述脂质体采用Lipo2000。

2.一种抗肿瘤融合外泌体，其特征在于：所述融合外泌体以肿瘤细胞来源的外泌体与脂质体融合形成的杂合纳米颗粒作为载体，所述融合外泌体中携带表达趋化因子XCL1和生长因子FLT3L的质粒；

所述融合外泌体的表面负载脂肪酸链修饰的MMP-2酶响应多肽，所述脂肪酸链修饰的MMP-2酶响应多肽为C₁₆-RRKKPLGLAG-ATWLPPRAANLLMAAS；

所述融合外泌体膜磷脂双分子层的疏水腔中负载激动剂MPLA；

所述脂质体采用mRNA疫苗的脂质递送系统LNP，所述LNP的材料包括阳离子脂质、磷脂、胆固醇和聚乙二醇脂质。

3.根据权利要求1或2所述的抗肿瘤融合外泌体，其特征在于：所述肿瘤细胞包括结直肠癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、卵巢癌细胞。

4.一种如权利要求1或2所述的抗肿瘤融合外泌体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）将表达趋化因子XCL1和生长因子FLT3L的质粒与脂质体混合，得到复合物；

（2）将肿瘤细胞来源的外泌体与所述复合物、脂肪酸链修饰的MMP-2酶响应多肽、MPLA混合，于35-40℃孵育10-16h，得到融合外泌体。

5.根据权利要求4所述的抗肿瘤融合外泌体的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述混合后孵育15-30min，得到复合物。

6.根据权利要求5所述的抗肿瘤融合外泌体的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述孵育后，对融合外泌体进行纯化处理，之后利用纳米挤出器反复挤压5-15次，过膜后即得。

7.一种如权利要求1-3中任一项所述的抗肿瘤融合外泌体在制备抑制肿瘤生长的药物中的应用。

8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述抗肿瘤融合外泌体在肿瘤组织中招募cDC1、促进cDC1成熟、和/或激活CD8⁺ T。