CN113181349A - 靶向m细胞的多表位口服疫苗及其在包虫疫苗中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于疫苗技术领域，具体公开了靶向M细胞的多表位口服疫苗,包括载体、M细胞的靶向肽Co1、特异性针对犬DLA限制性位点的CD4+T细胞表位肽，特异性针对犬DLA限制性位点的CD4+T细胞表位肽的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示。本发明还公开了上述靶向M细胞的多表位口服疫苗在包虫疫苗中的应用。本发明提供的靶向M细胞的多表位口服疫苗有效降低小鼠体内包虫包囊，生产方便，不受免疫操作人员限制。

Description

靶向M细胞的多表位口服疫苗及其在包虫疫苗中的应用
技术领域
本发明属于疫苗技术领域，尤其涉及靶向M细胞的多表位口服疫苗及其在包虫疫苗中的应用。
背景技术
包虫病(cystic echinococcosis；CE)又称棘球蚴病，是细粒棘球绦虫(Echinococcusgranulosus；Eg)的幼虫棘球蚴寄生于人体及某些动物的肝、肺等脏器所致的一种严重的人畜共患慢性寄生虫疾病。目前，治疗时，疫苗预防是防止包虫病流行的有效措施。
鉴于新疆地区包虫病高发，严重危害牧民健康，又缺乏有效的保护性疫苗的背景，发明人曾作出以下探索：(1)从细粒棘球蚴中克隆EgG1Y162抗原基因，发现无论在基因序列上，还是在氨基酸序列、蛋白结构上，EgG1Y162抗原基因均与国外研究者已研发的用于终末宿主保护的候选疫苗具有高度的相似性，很可能也是终末宿主的保护性抗原；(2)在2009年申请的申请公开号为CN101475938A的中国发明专利申请公开了一种包虫病抗原基因即EgG1Y162抗原基因及其重组蛋白和应用；(3)在2013年申请的申请公开号为CN103041382A的中国发明专利申请公开了一种细粒棘球蚴重组BCG疫苗及制备方法。
在前述研究的基础上，发明人发现，基于EgG1Y162抗原基因的注射疫苗具有生产技术限制和对实施免疫操作人员的限制，希望寻求一种能够有效降低包虫包囊，生产工艺简单，可以口服的包虫病疫苗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够有效降低小鼠体内包虫包囊，生产工艺简单，不受免疫操作人员限制的靶向M细胞的多表位口服疫苗及其在包虫疫苗中的应用。
为了达到上述目的，本发明提供一种靶向M细胞的多表位口服疫苗，包括载体、M细胞的靶向肽Co1、特异性针对犬DLA限制性位点的CD4+T细胞表位肽，特异性针对犬DLA限制性位点的CD4+T细胞表位肽的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示。
本发明还公开了上述靶向M细胞的多表位口服疫苗的制备方法，包括以下步骤：
S1、获取特异性针对犬DLA限制性位点的CD4+T细胞表位肽：获取EgG1Y162抗原的cDNA序列、犬DLA限制性位点DLA-DRB1*011:01蛋白和犬DLA限制性位点DLA-DRB1*015:01蛋白的氨基酸序列，确定特异性针对犬DLA限制性位点的CD4+T细胞表位肽；
S2、获取Co1-Multi-EgG1Y162：将特异性针对犬DLA限制性位点的CD4+T细胞表位肽和M细胞的靶向肽Co1通过linker连接，得到Co1-Multi-EgG1Y162；
S3、构建pcDNA3.1-Co1-Multi-EgG1Y162真核表达系统；
S4、获得pcDNA3.1-Co1-Multi-EgG1Y162蛋白；
S5、制备Co1-Multi-EgG1Y162载体纳米颗粒：将S4得到的Co1-Co1-Multi-EgG1Y162蛋白缓慢加入到载体溶液中，肉眼可观察到容器中的透明液体逐渐转变为呈现淡蓝色乳光的胶体溶液体系，再经过磁力搅拌，得到Co1-Multi-EgG1Y162载体纳米颗粒。
本发明还提供了上述靶向M细胞的多表位口服疫苗在包虫疫苗中的应用。
本发明的原理和有益效果在于：
(1)鉴于新疆地区包虫病高发，严重危害牧民健康，又缺乏有效的保护性疫苗的背景，并针对终末宿主犬细粒棘球蚴绦虫感染的靶向递送黏膜疫苗研究的空白，基于黏膜M细胞在抗原转运中的主导地位，本发明构建出首个针对犬的，用于治疗包虫病的多表位口服疫苗，能够靶向M细胞的新型黏膜递送系统，通过口服的方式就可以进行免疫，与之前的注射疫苗相比，减少了生产技术的限制和对实施免疫操作人员的限制，方便了疫苗的推广应用，对于包虫病的防治具有重要意义。
(2)由于包虫传播的终末宿主是犬，所以在预测表位时，本发明筛选出来的是特异性针对犬DLA限制性位点的CD4+T细胞表位肽。本发明选择靶向M细胞，是基于新型递送系统构建的理念进行的一个创新，选择载体是因为多表位口服疫苗在肠道内极易被降解，因此需要载体来进行递送，避免多表位口服疫苗在肠道内的损耗。最终得到的靶向M细胞的多表位口服疫苗预计给犬类服用。
(3)本发明提供的靶向M细胞的多表位口服疫苗预先服用能够有效的减少感染小鼠体内包虫包囊的数量，抑制包囊生长，且有降低脾脏肿大的作用。
附图说明
图1为6条特异性针对犬DLA限制性位点的CD4+T细胞表位肽ELISPOT的实验结果图；
图2为S4中Western-blot鉴定图，其中1、4和7为空白组；2、5和8为空载组；3、6和9为重组质粒组(pcDNA3.1-EgG1Y162)；
图3为S4中pcDNA3.1-HisA-Co1-multi-EgG1Y162蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳检测结果图，其中1为上样液；2为流出液；3为第一次洗脱液；4为第二次洗脱液；
图4为实验一中Eg在各组小鼠中的生长情况，A：感染组；B：疫苗组；C：对照组；
图5为实验一中小鼠肠道在感染后25周时的情况，A：感染组；B：疫苗组；C：对照组；
图6为实验二中体外攻击细粒棘球绦虫的伊红染色结果图，其中A：对照组(NC组)；B：低浓度组(L组)；C：高浓度组(H组)；
图7为实验三中ELISPOT的实验结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
一、实施例
本实施例公开了一种靶向M细胞的多表位口服疫苗，包括载体、M细胞的靶向肽Co1、特异性针对犬DLA限制性位点的CD4+T细胞表位肽，特异性针对犬DLA限制性位点的CD4+T细胞表位肽的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6所示。
载体为壳聚糖、乳酸杆菌或卡介苗中的一种或两种以上混合物，本实施例优选载体为壳聚糖(缩写为CS，购买自Sigma)。
M细胞的靶向肽Co1的氨基酸序列为：CGGCAGAGGCGACCGCGCCGGCAGCTGATGAAACGA。
M细胞的靶向肽Co1和特异性针对犬DLA限制性位点的CD4+T细胞表位肽通过linker连接后的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
本实施例还公开了上述靶向M细胞的多表位口服疫苗在包虫疫苗中的应用。
上述靶向M细胞的多表位口服疫苗具体制备思路在于：基于M细胞靶向肽Co1的氨基酸序列和6条特异性针对犬DLA限制性位点的CD4+T细胞表位肽，采用在线软件PAProC(蛋白酶体裂解预测软件)编排6条特异性针对犬DLA限制性位点的CD4+T细胞表位肽和1条M细胞靶向肽Co1的排列顺序，并根据连接表位的连接桥(Linker)进行连接，经小鼠和犬密码子优化后确定串联表位核苷酸序列。另外，串联表位核苷酸序列的5’端引入EcoRⅠ酶切位点和保护性碱基(CCGGAATTC)，3’端引入AhlⅠ酶切位点和保护性碱基(CGCACTAGT)，构成新型的靶向M细胞的Co1-Multi-EgG1Y162，再将基于新型设计的疫苗进行pcDNA3.1真核表达载体的构建(获得pcDNA3.1-Co1-Multi-EgG1Y162)，诱导表达蛋白质后，用壳聚糖作为载体制备得到。
具体包括以下步骤：
S1、获取6条特异性针对犬DLA限制性位点的CD4+T细胞表位肽；
(1)在NCBI获得EgG1Y162抗原的cDNA序列(登录号：AB462014.1)；在网站IPD-MHC获取犬DLA限制性位点DLA-DRB1*011:01蛋白和犬DLA限制性位点DLA-DRB1*015:01蛋白的氨基酸序列。
(2)三级结构预测：使用软件I-TASSER预测EgG1Y162抗原和DLA-DRB1*011:01蛋白和DLA-DRB1*015:01蛋白的三级结构，并使用软件Discover studio(DS)进行蛋白三级结构的可视化绘图，以及绘制蛋白对应的Ramachandran图，通过蛋白质三级结构评估结构和预测的合理可行性。
(3)初步筛选候选CD4+T细胞表位肽：根据CD4+T细胞表位的理论长度，以及蛋白质氨基酸序列的长度特征设计12个氨基酸长度的候选CD4+T细胞表位。
(4)确定特异性针对犬DLA限制性位点的CD4+T细胞表位肽：采用软件Hex 8.0将候选CD4+T细胞表位肽分别进行分子对接工作的验证，以及使用计算机软件Discover studio(DS)，对Hex8.0软件分子对接初步筛选的抗原表位进一步优化，确定了6条特异性针对犬DLA限制性位点的CD4+T细胞表位肽，6条特异性针对犬DLA限制性位点的CD4+T细胞表位肽的氨基酸序列分别如SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示。
(5)为了检测经生信学方法预测的特异性针对犬DLA限制性位点的CD4+T细胞表位肽的免疫原性，将经过筛选后的特异性针对犬DLA限制性位点的CD4+T细胞表位肽合成人工肽后，与正常犬和Eg感染犬血清共培养并进行ELISPOT。
在ELISPOT板上的PVDF膜上涂布采用PBS溶液稀释好的特异性抗人IFN-γ抗体，4℃条件下过夜。
过夜孵育的ELISPOT板用PBS溶液反复洗涤5次，弃去PBS溶液，每孔加入100μL含10％胎牛血清(购买自Excell Bio)的RPMI 1640培养基，在37℃孵育箱中封闭1h后，取出用PBS溶液洗涤1次，加入细粒棘球绦虫感染人外周血PBMC悬浮液(2×105)和5μg/mL的Co1-Multi-EgG1Y162，每个样品设置三个复孔。
PBMC和RPMI 1640培养基共培养作为阴性对照，PBMC加植物血凝素(PHA)(2μg/mL)用作阳性对照。将板在37℃，5％CO2下温育19h。
ELISPOT板与IFN-γ特异性生物素化抗体和链霉亲和素-HRP一起温育，使用ELISPOT自动酶标仪对板上的每个孔进行吸光度的检测。
如图1所示，结果表明，这6条特异性针对犬DLA限制性位点的CD4+T细胞表位肽均能够刺激Eg感染犬的T细胞产生IFN-γ，表明这6条特异性针对犬DLA限制性位点的CD4+T细胞表位肽均可以诱导T细胞免疫应答，且6条特异性针对犬DLA限制性位点的CD4+T细胞表位肽免疫反应强度不一。
因此，实验证明特异性针对犬DLA限制性位点的CD4+T细胞表位肽经过前期优化后均可以激活T细胞产生IFN-γ，说明表位信息的筛选对于表位的鉴定是有意义和价值的。
S2、获取Co1-Multi-EgG1Y162：委托上海生工生物公司将6条特异性针对犬DLA限制性位点的CD4+T细胞表位肽和M细胞的靶向肽Co1通过linker连接，得到Co1-Multi-EgG1Y162，氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
S3、构建pcDNA3.1-Co1-Multi-EgG1Y162；
委托乌鲁木齐欧易生物构建pcDNA3.1-Co1-Multi-EgG1Y162。
S4、获得pcDNA3.1-Co1-Multi-EgG1Y162蛋白；
①取出制备好的大肠杆菌菌种，将大肠杆菌菌种(pcDNA3.1-Co1-Multi-EgG1Y162和真核表达载体pcDNA3.1)在无菌条件下，接种到LB培养基中过夜培养。挑取出来培养后生长良好的pcDNA3.1-Co1-Multi-EgG1Y162单菌落和真核表达载体pcDNA3.1单菌落，置于预先加入1％浓度的氨苄抗生素的液体LB培养基中过夜培养。
②质粒小量抽提试剂盒(购买自天根公司)对过夜培养的细菌进行质粒提取,置于-20℃保存或用于后续试验。
③收集生长良好的293T细胞，用胰酶(0.25％Trypsin-EDTA)消化293T细胞，消化后加入未添加任何抗生素的DMEM(高糖)培养基(购买自GIBCO)，将细胞浓度调整到1×105cells/mL的细胞悬液，将该细胞悬液分别接种到无菌的24孔培养板中，每孔加入500μL，在37℃、饱和湿度、5％CO2的培养箱中进行24h培养。
④将实验分为三组，每个实验组做3个重复，这三组分别为①空白组：未进行转染质粒的细胞组；②空载组：转染pcDNA3.1空载体质粒细胞组；③重组质粒组(pcDNA3.1-EgG1Y162)：转染pcDNA3.1-EgG1Y162质粒细胞组。
⑤将转染293T细胞48h后的细胞更换G418细胞培养液再培养24h，三组细胞样本中分别加入100μL含有蛋白酶抑制剂和广谱磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液充分混匀。在4℃条件下静置60min后混匀，在离心机中以12000rpm，4℃，离心15min后收集上清，获得目的蛋白。
⑥采用Western Blot(WB)法检测目的蛋白；
A、蛋白变性：向目的蛋白中加入5×SDS-PAGE loading buffer，在100℃沸水中煮5min，待蛋白完全变性后，在离心机中12000rpm离心5min，留存上清备用。
B、分别配制12％的分离胶和5％的浓缩胶，配方如下表1所示。
表1 12％分离胶配方和5％的浓缩胶配方
Figure BDA0003037559550000051
Figure BDA0003037559550000061
C、制胶：在玻璃板中先配制12％的分离胶溶液达板子的2/3处，用蒸馏水轻柔平稳的封胶，室温待分离胶凝固后将蒸馏水吸出，再加入配制好的浓缩胶至玻璃板的顶部，在此处插入梳齿，静置待胶凝固。
D、上样：预留一个孔加入预染蛋白marker 8μL，其余每个孔分别上样不同组的细胞蛋白7μL。
E、电泳：先用80V恒压跑胶，蛋白到达至分离胶处，转变为恒压100V，跑胶时间为90min，当蛋白到达至底部时，结束电泳。
F、转膜：待SDS-PAGE电泳结束，裁剪与胶块大小基本相同的PVDF膜，预先放置于甲醇浸泡10s，取出后用蒸馏水反复漂洗1min，用电泳后的聚丙烯酰胺凝胶、滤纸和甲醇浸泡后的PVDF膜在转膜液中浸泡10min，按照夹子的黑色面置于最底层，依次加入海绵、滤纸，凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵，然后夹子的透明面置于最上层，将准备好的夹子放入转移槽中，夹槽红色与红色相对应，黑色与黑色相对应。采用恒压方式来转模(使用0.22μm PVDF膜)，用100V电压转模60min。
取出转好的PVDF膜，用水漂洗3次。
G、封闭：采用5％脱脂奶粉的溶液对PVDF膜进行封闭，TBST反复清洗3次。
H、孵育一抗：用TBST将一抗(Anti-6×His Tag mouse monoclonal antibody)进行稀释，稀释比例按1：800进行稀释，在4℃条件下孵育过夜。
I、将膜漂洗3次，加入稀释的二抗，室温条件下孵育1h，再漂洗3次。用混合好的ECL化学发光法显色试剂盒(购买自北京索莱宝)A液和B液混合后加1mL至膜上，化学放光法进行检测、拍照，实验结果如图2所示。
⑥纯化蛋白；
A、提取总蛋白：收集经WB检测已成功表达目的蛋白的重组质粒组的细胞，提取总蛋白。
B、将提取的蛋白上清液经0.45μm滤膜进行过滤后，收集体积约为3mL左右的蛋白样品备用。
C、纯化：取1mL Ni-NTA蛋白纯化试剂盒(购买自Sangon Biotech)中的Ni-NTA树脂预装柱，静置3min，3000rpm离心2min，轻柔吸去上清。加入2倍柱体积的Binding/WashBuffer对镍柱做一个平衡处理，将装有Buffer的柱子温和颠倒混匀3min，3000rpm离心2min后轻柔吸去上清。
样品过柱：3mL样品过柱，在旋转振荡器混匀30min，使混合液与树脂混匀，3000rpm离心2min，吸出上清液(留存部分样品用于电泳分析的上样液)。
加入2倍柱体积的Binding/Wash Buffer清洗，3000rpm离心2min，吸出上清液(留存部分清洗后的上清液用于电泳分析的流出液)。
重复清洗步骤，通过测量在280nm吸光度，直到洗出液值达到基线值。
取大约树脂柱体积两倍的Elution Buffe，将吸附柱上的标签目的蛋白洗脱，3000rpm离心2min，然后小心的吸出上清液保存，此步骤重复两次，每次的洗脱液单独保存，将两次的洗脱液都配合SDS-PAGE电泳检测。
SDS-PAGE电泳同时检测上样液、流出液和洗脱液，看洗脱条件是否合适，然后样品进行BCA法测定蛋白浓度。
纯化后检测样本数量：1细胞*1组*3重复*4样本(上样液、流出液、一次洗脱液和二次洗脱液)，实验结果如图3所示。
S5、制备CS-Co1-Multi-EgG1Y162纳米颗粒；
(1)配制壳聚糖溶液：将0.16g壳聚糖溶于40ml 1％冰醋酸，45℃加热溶解，配制成0.4％的壳聚糖溶液。
(2)配制0.6％三聚磷酸钠(缩写为STPP，购买自上海阿拉丁)：0.6g STPP溶于100ml dd H2O。
(3)取1.5mg/mL Co1-Multi-EgG1Y162蛋白250μL与500μL 0.6％TPP混合，ddH2O定容至lmL，通过磁力搅拌器以1000rpm/min的速度搅拌下，将纯化后的蛋白缓慢加入到3mL0.4％壳聚糖溶液中，肉眼可观察到容器中的透明液体逐渐转变为呈现淡蓝色乳光的胶体溶液体系，再用1000rpm/min的速度磁力搅拌l小时。
(4)Cs-Co1-Multi-EgG1Y162粒径及电位的检测：取适量Cs-Co1-Multi-EgG1Y162溶液，用马尔文电位/粒径分析仪分析其粒径大小和电位，粒径为223.3nm，电位为45.3mV。
(5)包裹率测定：将4mL CS-Co1-Multi-EgG1Y162溶液在离心机中4℃，12000rpm条件下离心30min，取上清液，BCA法检测离心后的上清液中蛋白含量。按以下公式计算Cs-Co1-Multi-EgG1Y162的包裹率：包裹率＝(蛋白总投入量-上清蛋白量)/蛋白总投入量×100％。实验结果：平均蛋白包裹率为56.14％。
二、实验一
(1)设置感染组、疫苗组和对照组；
将30只Balb/C雌性小鼠进行分组，所有小鼠饲养环境和饮食状况均一致，随机分为三组，前期处理为疫苗组小鼠口腔灌胃Cs-Co1-Multi-EgG1Y162纳米颗粒，每2周免疫一次，每次连续口腔灌胃3天，早晚各一次，口腔灌胃的蛋白量0.15μg，溶液量为0.5mL。感染组小鼠和对照组小鼠前期均口腔灌胃生理盐水，灌胃时间与疫苗组时间保持一致，每次生理盐水灌胃的液体量与疫苗组也一样为0.5mL。
待4个免疫周期过去后，将三组小鼠分别进行后期处理，疫苗组小鼠和感染组小鼠均进行细粒棘球绦虫的攻虫感染，每只小鼠腹腔内注射经处理的细粒棘球蚴原头节2000只，对照组注入等量生理盐水，此后的饲养三组小鼠生活、饮食状态均一致。
(2)剖检三组小鼠，发现感染组小鼠肝小叶、肠道附近有成簇聚集的透明的细粒棘球绦虫感染的囊泡，部分囊泡压迫肝脏；疫苗组小鼠精神尚可，运动相对迟缓，毛皮略粗糙，光泽度较好，腹部肿大不明显，部分小鼠可以摸到腹腔内的小结节，剖检后发现腹腔内肠道附近及肝脏也可发现细粒棘球蚴囊泡组织；对照组小鼠腹部平坦，精神状态良好，运动比感染组小鼠灵活，皮毛比感染组小鼠光泽度较好，剖检结果显示该组小鼠腹腔内无包虫包囊的产生。
(3)测定免疫小鼠产生的包囊数量及囊泡感染率；
解剖实验小鼠，目测观察Eg在各组小鼠中的生长情况，主要观察Eg包囊在小鼠体内出现的数量和体积。
如图4中A所示，通过目测可以观察到，感染组小鼠腹腔内多发囊泡和小水泡，主要位于肝脏或者腹壁上，质地坚硬，与周围组织粘连，不易推动，且呈现满腹腔的种植生长。
如图4中的B所示，在疫苗组小鼠腹腔平均发现2个乳白色成团的囊泡和2-3个透明的小水泡，这些囊泡多位于肝脏部位和肠系膜上，这些囊泡质地较硬且与周围组织粘连。
如图4中的C所示，对照组小鼠体内没有任何细粒棘球绦虫感染。
脾脏作为小鼠体内的免疫器官，可以直接反映病原体刺激机体产生的特异性免疫状况，因此通过称重解剖后小鼠脾脏，以及测量解剖后小鼠脾脏的大小，能够评价三组小鼠在包虫攻击后的免疫情况，经称重发现，感染组小鼠脾脏重量为0.489±0.03，疫苗组小鼠脾脏重量为0.309±0.02，对照组常小鼠脾脏重量为0.212±0.03。如图4中的D所示，同时将三组小鼠的脾脏取出进行对比，明显观察到感染组小鼠的脾脏巨大，约达到2.8cm，疫苗组小鼠脾脏大小为2cm，对照组为1.5cm，说明疫苗组小鼠的脾脏受免疫保护作用影响后有所减小，Cs-Co1-Multi-EgG1Y162纳米颗粒有降低脾脏肿大的作用。
各组小鼠体内的包囊数量及囊泡感染率(感染囊泡的数量)均不同，分别进行计数和称量，结果见下表2。
表2 免疫小鼠产生的包囊数量及囊泡感染率
组别 小鼠总数 有包囊的小鼠 平均包囊数量(个) 包囊直径(mm) 囊泡感染率(％)
感染组 10 10 8.23±0.15 0.53±0.16 88.12
疫苗组 10 6 5.82±0.17*▼ 0.26±0.12*▼ 50.05
对照组 10 - - - -
注：*表示与感染组比较，P＜0.05；▼表示与对照组比较，P＜0.05。
三组小鼠在疫苗免疫后的第3天腹腔内注射棘球蚴，进行攻虫实验，在感染后第25周处死，进行数据处理检测出各组小鼠包囊数量和尺寸信息，实验结果发现：与NS组相比，发现CS-Co1-Multi-EgG1Y162可诱导小鼠产生囊泡抵抗棘球蚴的感染，按实验方法中的公式计算得出疫苗组的小鼠囊泡感染率降低了38.07％，说明CS-Co1-Multi-EgG1Y162对包囊的生长有明显的抑制作用。疫苗组和感染组相比，具有显著性的差异，有统计学意义(P＜0.05)。
(4)测定小鼠肠道在感染后25周时情况；
因本实验主要围绕小鼠肠道黏膜免疫进行，因此，特将三组小鼠的肠道获取后进行观察，在小鼠感染25周时，取晚期感染小鼠的肠道进行观察，可以观察到感染组小鼠的肠道与疫苗组和对照组均有不同，局部颜色深红，有局部的坏死(见图5中的A)。疫苗组小鼠因受到靶向肠道M细胞的疫苗的影响，肠道局部派氏结节明显(见图5中的B)，而对照组小鼠的肠道则明显通透健康，无局部的坏死状况(见图5中的C)。不同组小鼠肠道派氏结节数量也有区别(见图5中的D)，由图5-B的圈中可以明显看到：小鼠肠道内的派氏结节数量增多。
三、实验二：抗血清体外干扰细粒棘球蚴实验
(1)用本实验构建的多表位疫苗免疫新西兰兔后获得的抗体用于体外干扰细粒棘球蚴的实验，首先，设置三个实验组对头节进行干预。
(2)根据干预条件要求，将原头节分为对照组(NC组)、抗血清实验组分别分为高浓度组(H组)和低浓度组(L组)。
(3)无菌环境中用加入抗生素的PBS溶液液反复清洗原头节样本，将活力低下的头节弃去，保证剩余头节活力达到95％以上。
(4)取六孔板，每孔加入2.5mL含10％胎牛血清浓度的1640细胞培养液，处空白组不加入抗血清，低浓度组加入抗血清浓度为10％，高浓度组抗血清浓度为30％。另外每个实验组设立1个复孔对照。每组/孔培养液中加入约2000～3500个头节。在37℃、5％CO2环境中培养。
(3)将培养板置于37℃恒温箱培养，每天用倒置显微镜观察，每3.5d换液并加入抗血清1次，在培养的14天后终止实验，吸除液体，原头节用4％多聚甲醛固定处理，观察比较同一培养时间内不同抗血清浓度干扰实验结果。
Eg头节抗虫实验伊红染色，用含有10％胎牛血清的1640培养液对原头蚴进行培养，在培养的过程中加入Cs-Co1-Multi-EgG1Y162纳米颗粒的抗血清进行培养，进一步验证Cs-Co1-Multi-EgG1Y162在体外对虫体的影响，通过激光共聚焦检测结果显示(实验结果如图6所示)，随着培养天数的增加，部分原头蚴的头节逐渐外翻，在培养14天后，发现该抗血清对虫体造成了杀伤作用，原头节在血清抗体的作用下开始出现虫体的损伤，用伊红染色进行对比发现高浓度的血清干预组虫体死亡率较高。
四、实验三：对比实验
由于市面上尚无此类口服包虫疫苗，所以在具体验证时，本发明无法将CS-Co1-Multi-EgG1Y162纳米颗粒与市面上的口服包虫疫苗进行对比。但是为证实CS-Co1-Multi-EgG1Y162纳米颗粒的免疫原性，并比较其与非M细胞靶向性的EgG1Y162核酸口服疫苗以及EgG1Y162核酸疫苗免疫原性的差异，本实验设置三组对比：①将CS-Co1-Multi-EgG1Y162纳米颗粒以口服的形式进行4次免疫；②将Cs-EgG1Y162以口服的形式进行4次免疫；③将pcDNA3.1-EgG1Y162采用肌肉注射的方式进行免疫，通过不同抗原对小鼠进行免疫后激活T细胞产生特异性免疫应答。
在三组小鼠完成4次免疫后的第二周，获取小鼠的脾脏淋巴细胞，用Cs-Co1-Multi-EgG1Y162纳米颗粒、Cs-EgG1Y162和pcDNA3.1-EgG1Y162进行抗原特异性刺激，在经过培养后的IFN-γELISPOT的实验中发现Cs-Co1-Multi-EgG1Y162纳米颗粒能与免疫小鼠的脾淋巴细胞产生较强的反应(实验结果如图7所示)，说明靶向M细胞的多表位疫苗具有增强表位特异性Th1应答反应和激活CTL应答的潜能，也进一步说明经过生物信息学方法筛选的表位疫苗的构建能够比原始抗原诱导T细胞产生更强的应答。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
序列表
<110>新疆医科大学
<120>靶向M细胞的多表位口服疫苗及其在包虫疫苗中的应用
<160>7
<170> Patentln version 3.3
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus）
<400>1
LPEHFRWIHV GSRSLELGWN 20
<210>2
<211>17
<212>DNA
<213>细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus）
<400>2
KLTANLYTTY VTFKYRN 17
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus）
<400>3
FKGGSQVFKY TGFIRTLAP 19
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus）
<400>4
PEHFRWIHVG SRSLELGW 18
<210>5
<211>17
<212>DNA
<213>细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus）
<400>5
YVTFKYRNVP IERQKLT 17
<210>6
<211>19
<212>DNA
<213>细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus）
<400>6
LKPSTFYEVV VQAFKGGSQ 19
<210>7
<211>194
<212>DNA
<213>细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus）
<400>7
CCGGAATTCC GGCAGAGGCG ACCGCGCCGG CAGCTGATGA AACGAEAAAK LPEHFRWIHV
60
GSRSLELGWN GPGPGPEHFR WIHVGSRSLE LGWGPGPGKL TANLYTTYVT FKYRNGPGPG
120
YVTFKYRNVP IERQKLTGPG PGFKGGSQVF KYTGFIRTLA PGPGPGLKPS TFYEVVVQAF
180
KGGSQCGCAC TAGT
194

Claims (5)

1.靶向M细胞的多表位口服疫苗，其特征在于，包括载体、M细胞的靶向肽Co1、特异性针对犬DLA限制性位点的CD4+T细胞表位肽，特异性针对犬DLA限制性位点的CD4+T细胞表位肽的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示。
2.根据权利要求1所述的靶向M细胞的多表位口服疫苗，其特征在于，M细胞的靶向肽Co1和特异性针对犬DLA限制性位点的CD4+T细胞表位肽通过linker连接后的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
3.根据权利要求1所述的靶向M细胞的多表位口服疫苗，其特征在于，载体为壳聚糖、乳酸杆菌或卡介苗中的一种或两种以上混合物。
4.根据权利要求1-3任一权利要求所述的靶向M细胞的多表位口服疫苗，其特征在于，通过以下步骤获得：
S1、获取特异性针对犬DLA限制性位点的CD4+T细胞表位肽：获取EgG1Y162抗原的cDNA序列、犬DLA限制性位点DLA-DRB1*011:01抗原和犬DLA限制性位点DLA-DRB1*015:01抗原氨基酸序列，确定特异性针对犬DLA限制性位点的CD4+T细胞表位肽；
S2、获取Co1-Multi-EgG1Y162：将特异性针对犬DLA限制性位点的CD4+T细胞表位肽和M细胞的靶向肽Co1通过linker连接，得到Co1-Multi-EgG1Y162；
S3、构建pcDNA3.1-Co1-Multi-EgG1Y162真核表达系统；
S4、获得pcDNA3.1-Co1-Multi-EgG1Y162蛋白；
S5、制备Co1-Multi-EgG1Y162载体纳米颗粒：将S4得到的pcDNA3.1-Co1-Multi-EgG1Y162蛋白缓慢加入到载体溶液中，肉眼可观察到容器中的透明液体逐渐转变为呈现淡蓝色乳光的胶体溶液体系，再经过磁力搅拌，得到Co1-Multi-EgG1Y162载体纳米颗粒。
5.根据权利要求1-4任一权利要求所述的靶向M细胞的多表位口服疫苗在包虫疫苗中的应用。
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