ES2305816T3 - Transfeccion de celulas sanguineas con mrna para inmunoestimulacion y terapia genetica. - Google Patents
Transfeccion de celulas sanguineas con mrna para inmunoestimulacion y terapia genetica. Download PDFInfo
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Abstract
Composición farmacéutica que contiene células sanguíneas transfectadas con como mínimo un mRNA junto con un excipiente y/o vehículo farmacéuticamente aceptable, incluyendo el mRNA como mínimo un área que codifica como mínimo un antígeno y consistiendo las células sanguíneas en una mezcla de glóbulos rojos, granulocitos, células mononucleares y plaquetas con no más de un 5% de células dendríticas.
Description
Transfección de células sanguíneas con mRNA para
inmunoestimulación y terapia genética.
La presente invención se refiere a una
composición farmacéutica que contiene células sanguíneas o células
hematopoyéticas, por ejemplo glóbulos rojos (eritrocitos),
granulocitos, células mononucleares (PBMC) y/o plaquetas, junto con
un excipiente y/o vehículo farmacéuticamente compatible, estando
transfectadas las células con como mínimo un mRNA que incluye como
mínimo un área que codifica como mínimo un antígeno. Además, de
acuerdo con la invención se da a conocer un procedimiento para la
preparación de la composición farmacéutica arriba mencionada y la
utilización de células transfectadas de este modo para la producción
de medicamentos o composiciones farmacéuticas para la
inmunoestimulación contra los antígenos codificados por el mRNA. Los
objetos de la invención sirven sobre todo para la terapia y/o la
profilaxis del cáncer o de enfermedades infecciosas, y también se
pueden utilizar en la terapia genética.
La terapia genética y la vacunación genética son
procedimientos de la medicina molecular, cuyo empleo en la terapia
y en la prevención de enfermedades va a tener importantes
consecuencias para la práctica médica. Ambos métodos se basan en la
introducción de ácidos nucleicos en células o tejidos del paciente,
y también en el posterior procesamiento de la información
codificada por los ácidos nucleicos introducidos, es decir, la
expresión de los polipéptidos deseados. En principio, los
procedimientos ventajosos se basan en la incorporación directa o
indirecta (a través de células adecuadas para la transfección) de
(m)RNA codificador de la proteína correspondiente.
Actualmente, en la utilización de mRNA para la
vacunación, en particular para la vacunación contra antígenos
tumorales, el mRNA codificador del antígeno correspondiente
normalmente se transfecta in vitro en células presentadoras
de antígeno (profesionales) (en inglés: "antigen presenting
cell" APC), en particular células dendríticas (DC) (Boczkowski
et al. (1996) J. Exp. Med. 184 (2): 465-472;
WO 97/41210). Las DC se obtienen de la sangre del paciente
diferenciando monocitos correspondientes en DC mediante la
utilización de un cóctel de citoquinas especial. Sin embargo, este
procedimiento es largo. Sobre todo, entre la extracción de la sangre
y la transfección normalmente transcurren aproximadamente 7 días
(es decir, aproximadamente 1 semana de cultivo in vitro para
la diferenciación de las DC), por lo que generalmente se requieren 9
días (2 días de maduración de las DC después de la transfección)
hasta que las células son inyectadas de vuelta en el paciente. Para
este largo intervalo de tiempo es decisiva la duración del cultivo
in vitro para la diferenciación de las DC entre la
extracción de la sangre y la transfección. Además, durante la
producción de DC se han de mantener condiciones GMP (en inglés:
"good manufacturing practice"). Por ello, este procedimiento
resulta extremadamente costoso, debiendo tenerse también en cuenta
que durante la producción de las DC el paciente quizá deba ser
alojado por separado.
Por consiguiente, la presente invención tiene
por objetivo poner a disposición un nuevo sistema para la
inmunoestimulación de pacientes contra antígenos específicos, sobre
todo de antígenos de tumores y gérmenes infecciosos, que supere los
problemas de los procedimientos conocidos en el estado actual de la
técnica, en particular que evite una producción costosa y cara de
APC in vitro.
Este objetivo se resuelve mediante las formas de
realización de la presente invención caracterizadas en las
reivindicaciones.
De acuerdo con la invención se pone a
disposición una composición farmacéutica.
La composición farmacéutica contiene células
sanguíneas transfectadas con como mínimo un mRNA junto con un
excipiente y/o vehículo farmacéuticamente compatible, incluyendo el
mRNA como mínimo un área que codifica como mínimo un antígeno y
consistiendo las células sanguíneas en una mezcla de glóbulos rojos,
granulocitos, células mononucleares y plaquetas con no más de un 5%
de células dendríticas.
La presente invención se basa en el sorprendente
conocimiento de que para la vacunación de pacientes contra
determinados antígenos, que son codificados por el mRNA según la
invención, no es necesario diferenciar células sanguíneas, por
ejemplo PBMC, obtenidas por ejemplo de la sangre de un individuo, en
particular del paciente a tratar, mediante técnicas de cultivo
celular costosas, duraderas y caras en una población de células con
alta proporción de células presentadoras de antígeno profesionales
(en inglés: "antigen presenting cell" APC), en particular
células dendríticas (DC), sino que, para lograr una
inmunoestimulación con éxito, basta con transfectar células
sanguíneas directamente con el mRNA que codifica uno o más antígenos
con el fin de obtener una composición farmacéutica que provoca por
ejemplo en el propio paciente del que se han obtenido las células
sanguíneas, en particular las poblaciones parciales de éstas
anteriormente mencionadas, una inmunoestimulación adecuada dirigida
preferentemente contra uno o más antígenos de un tumor o contra uno
o más antígenos de un germen o agente
patógeno.
patógeno.
Las células sanguíneas, en particular las
poblaciones parciales de éstas anteriormente mencionadas, de la
composición farmacéutica según la invención se caracterizan
principalmente porque contienen una proporción pequeña de APC
profesionales diferenciadas, como DC. Preferentemente, cuando están
contenidas en la composición farmacéutica de la presente invención,
las células transfectadas incluyen menos de un 5%, preferentemente
no más de un 2%, de DC.
Por consiguiente, de acuerdo con la invención,
por "células sanguíneas" se entiende preferentemente una mezcla
o una población enriquecida o esencialmente pura de glóbulos rojos,
granulocitos, células mononucleares (PBMC) y plaquetas, que procede
de sangre total, suero sanguíneo u otra fuente, por ejemplo del bazo
o de ganglios linfáticos, y que sólo presenta una pequeña
proporción de APC profesionales. Preferentemente, a diferencia del
estado actual de la técnica, las células sanguíneas de la presente
invención consisten en células sanguíneas frescas, es decir, entre
la obtención de las células sanguíneas (en particular la extracción
de la sangre) y la transfección sólo transcurre un breve tiempo,
por ejemplo menos de 12 horas, preferiblemente menos de 6 horas, de
forma más preferente menos de 2 horas y de forma especialmente
preferente menos de 1 hora.
Como ya se ha mencionado anteriormente, para la
composición farmacéutica según la invención se utilizan
preferentemente células sanguíneas procedentes del propio paciente
tratado con la composición farmacéutica de la presente invención.
Por ello, la composición farmacéutica según la invención contiene
preferentemente células sanguíneas autólogas.
De acuerdo con otra forma de realización
preferente de la presente invención, el mRNA utilizado para la
transfección de las células según la invención incluye un área que
codifica como mínimo un antígeno de un tumor o de un agente
patógeno o un germen patógeno.
De acuerdo con la invención, el concepto
"antígeno de un tumor" significa que el antígeno
correspondiente es expresado en células asociadas con un tumor. Por
ello los antígenos de tumores según la invención son principalmente
los antígenos producidos en las propias células degeneradas.
Preferentemente se trata de antígenos localizados en la superficie
de las células. No obstante, también son antígenos de tumores
aquellos antígenos que son expresados en células que no están
degeneradas (o que originalmente no estaban degeneradas), pero que
están asociadas con el tumor en cuestión. A este grupo pertenecen,
por ejemplo, antígenos relacionados con vasos que alimentan tumores
o con su (nueva) formación, en particular los antígenos asociados
con la neovascularización o angiogénesis, por ejemplo factores de
crecimiento como VEGF, bFGF, etc. Estos antígenos relacionados con
un tumor también incluyen antígenos de células del tejido que rodea
el tumor. En este contexto se pueden mencionar los antígenos
correspondientes de células de tejido conjuntivo, por ejemplo
antígenos de la matriz extracelular. Para la inmunoestimulación
según la invención, las moléculas de mRNA también pueden representar
una biblioteca de cDNA de un tejido tumoral. También se puede
tratar de una parte de una biblioteca correspondiente,
preferentemente de la parte de la biblioteca de cDNA que codifica
los antígenos específicos del tumor.
A continuación se explican detalladamente
procedimientos de preparación correspondientes en relación con el
procedimiento según la invención para la preparación de la
composición farmacéutica.
De acuerdo con la invención, la composición
farmacéutica que contiene células sanguíneas (PBMC, glóbulos rojos,
granulocitos y plaquetas) transfectadas con uno o más mRNA se
utiliza para la terapia o vacunación, en particular para el
tratamiento o la prevención (profilaxis) de enfermedades cancerosas.
La vacunación se basa en la introducción de un antígeno (o varios
antígenos) de un tumor, en el presente caso de la información
genética para el antígeno en forma del mRNA que codifica el
antígeno o los antígenos, en las células sanguíneas. El mRNA
contenido en la composición farmacéutica se traduce en el antígeno
(tumoral) en las células, es decir, se expresa el polipéptido o
péptido antigénico codificado por el mRNA modificado, con lo que,
después de la introducción de la composición farmacéutica que
contiene las células transfectadas, se estimula una respuesta inmune
dirigida contra este polipéptido o péptido antigénico. Por
consiguiente, en el presente caso de utilización como vacuna
genética para el tratamiento del cáncer, la respuesta inmune se
logra mediante la introducción de la información genética de
antígenos de un tumor, principalmente proteínas, que son expresados
exclusivamente en células cancerosas, a través de la administración
de una composición farmacéutica según la invención que contiene
células sanguíneas, por ejemplo glóbulos rojos, granulocitos, PBMC
y/o plaquetas, transfectadas con un mRNA que codifica un antígeno
de cáncer de este tipo. De este modo se presentan células inmunes al
antígeno o los antígenos de cáncer en el organismo, con lo que se
provoca una respuesta inmune que es eficaz contra las células
cancerosas.
Por ello, en la vacunación contra un germen
patógeno, como un virus, una bacteria o un germen protozoológico,
preferentemente se utiliza un antígeno de superficie de un germen de
este tipo para la vacunación con ayuda de la composición
farmacéutica según la invención que contiene células sanguíneas
transfectadas con el mRNA que codifica el antígeno de superficie.
Por ello, la composición farmacéutica según la invención también se
utiliza principalmente contra enfermedades infecciosas (por ejemplo
enfermedades infecciosas virales, como el SIDA (VIH), hepatitis A,
B o C, herpes, herpes zoster (varicelas), rubeola (virus de la
rubeola), fiebre amarilla, dengue, etc. (Flavivirus), gripe
(Influenzavirus), enfermedades infecciosas hemorrágicas (virus de
Marburg o virus Ebola), enfermedades infecciosas bacterianas, como
la enfermedad de los legionarios (Legionella), úlcera de estómago
(Helicobacter), cólera (Vibrio), infecciones por E. coli,
infecciones por estafilococos, infecciones por Salmonella o
infecciones por estreptococos (tétanos), enfermedades infecciosas
protozoológicas (malaria, enfermedad del sueño, leishmaniasis,
toxoplasmosis, es decir, infecciones por Plasmodium, Trypanosoma,
Leishmania, Toxoplasma, y también infecciones clamidiales, por
ejemplo por Chlamydia pneumoniae o Chlamydia
trachomatis). Preferentemente, en el caso de las enfermedades
infecciosas el mRNA también codifica los antígenos de superficie
correspondientes con el potencial antigénico más fuerte. En los
genes mencionados de gérmenes patógenos u organismos, en particular
en caso de genes virales, se trata típicamente de una forma
segregada de un antígeno de superficie.
\newpage
En el caso de la inmunoestimulación contra un
germen patógeno, las moléculas de mRNA transfectadas también pueden
incluir una biblioteca de cDNA o una parte de la misma de
determinados tipos de células. De acuerdo con la invención, en este
caso se utilizan preferentemente bibliotecas (parciales) de cDNA de
células infectadas por el agente patógeno. Por ejemplo, en caso de
una infección por VIH se puede utilizar una población de mRNA de
células T, preferentemente autólogas, infectadas por VIH para lograr
una inmunoestimulación contra los productos de los genes huésped
regulados hacia arriba por el agente patógeno, en el ejemplo
mencionado el
VIH.
VIH.
Además, de acuerdo con la invención
preferentemente se utilizan mRNA codificadores de polipéptidos,
consistiendo los polipéptidos en poliepítopes, por ejemplo de los
antígenos anteriormente mencionados, en particular antígenos de
superficie de gérmenes patógenos u organismos o células tumorales,
preferentemente formas proteínicas segregadas.
En su utilización como vacuna, la composición
farmacéutica según la invención entra en consideración
principalmente para el tratamiento de enfermedades cancerosas
(codificando el mRNA preferentemente un antígeno de superficie
específico de tumor (TSSA)), por ejemplo para el tratamiento de
melanoma maligno, carcinoma de colon, linfomas, sarcomas, carcinoma
pulmonar de células pequeñas, blastomas, etc. Los ejemplos
específicos de antígenos tumorales son entre otros:
707-AP, AFP, ART-4, BAGE,
\beta-catenina/m, Bcr-abl, CAMEL,
CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m,
CEA, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M,
ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100,
HAGE, HER-2/neu,
HLA-A*0201-R1701,
HPV-E7, HSP70-2M,
HAST-2, hTERT (o hTRT), iCE, KIAA0205, LAGE,
LOLR/FUT, MAGE, MART-1/Melan-A,
MC1R, Myosin/m, MUC1, MUM-1, -2, -3,
NA88-A, NY-ESO-1,
p190 minor bcr-abl, Pml/RAR\alpha, PRAME, PSA,
PSM, RAGE, RU1 o RU2, SAGE, SART-1 o
SART-3, TEUAML1, TPIIm, TRP-1,
TRP-2, TRP-2/INT2 y WT1.
De acuerdo con otra forma de realización
preferente, el antígeno o los antígenos de un tumor o de un agente
patógeno son un poliepítope del antígeno o de los antígenos de un
tumor o de un agente patógeno. Un "poliepítope" de un antígeno
o de varios antígenos es una secuencia de aminoácidos en la que
están representadas varias o muchas regiones del antígeno o de los
antígenos, que interactúan con la parte de un anticuerpo a la que
se une el antígeno o con un recepto de células T. El poliepítope
puede estar completo y no modificado. No obstante, de acuerdo con
la presente invención también puede estar modificado, sobre todo
para optimizar la interacción de anticuerpo/antígeno o receptor de
células T/antígeno. Una modificación con respecto al poliepítope
natural puede incluir por ejemplo una deleción, adición y/o
sustitución de uno o más residuos de aminoácido. En consecuencia,
en el mRNA de la presente invención que codifica el poliepítope
modificado se eliminan, añaden y/o sustituyen uno o más nucleótidos
con respecto al mRNA que codifica el poliepítope natural.
Además, la composición farmacéutica según la
invención se puede utilizar en el marco de la terapia genética, en
cuyo caso el RNA codifica por ejemplo una proteína, por ejemplo una
enzima, que falta o no está operativa en las células sanguíneas o
hematopoyéticas de un paciente.
Para aumentar la estabilidad y la eficacia de
transfección del (m)RNA, preferentemente cada uno de los
(m)RNA a introducir en las células sanguíneas de la presente
invención presenta una o varias modificaciones, en particular
modificaciones químicas, que mejoran la transferencia del
(m)RNA o de los (m)RNA en las células a transfectar
y/o aumentan la expresión del antígeno o los antígenos
codificados.
Por ejemplo, en las secuencias hay elementos de
secuencia desestabilizadores (DSE) de mRNA eucariotas, a los que se
unen proteínas señal que regulan la descomposición enzimática del
mRNA in vivo. Por consiguiente, para lograr una
estabilización adicional del mRNA, en caso dado en el área que
codifica el antígeno o los antígenos de un tumor o de un agente
patógeno se llevan a cabo una o más modificaciones con respecto al
área correspondiente del mRNA natural, de modo que ya no contenga
ningún elemento de secuencia desestabilizador. Evidentemente, de
acuerdo con la invención también es preferible eliminar los DSE del
mRNA dado el caso presentes en las áreas no traducidas (3'- y/o
5'-UTR).
Estas secuencias desestabilizadoras son por
ejemplo secuencias ricas en AU ("AU-RES"), que
están presentes en secciones de 3'-UTR de numerosos
mRNA inestables (Caput et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
1986, 83: 1670 a 1674). Por ello, las moléculas de mRNA utilizadas
en la presente invención preferiblemente están modificadas con
respecto al mRNA natural de tal modo que no presentan ninguna
secuencia desestabilizadora de este tipo. Esto también es aplicable
a los motivos de secuencia que son reconocidos por posibles
endonucleasas, por ejemplo la secuencia GAACAAG, que está incluida
en el segmento 3'-UTR del gen que codifica el
receptor de transferrina (Binder et al., EMBO J. 1994, 13:
1969 a 1980).
Preferentemente, en el mRNA modificado utilizado
para la transfección de las células sanguíneas también se eliminan
estos motivos de secuencia.
Los especialistas conocen diferentes
procedimientos que son adecuados para la sustitución de codones en
el mRNA modificado según la invención. En caso de áreas
codificadoras más cortas (que codifican péptidos con efecto
biológico o antígenos), el mRNA total se puede sintetizar por
ejemplo químicamente utilizando técnicas estándar.
\newpage
Sin embargo, preferentemente se introducen
sustituciones de bases utilizando una matriz de DNA para producir
el mRNA modificado con ayuda de técnicas de la mutagénesis selectiva
usual (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3ª edición, Cold Spring
Harbor, NY, 2001).
Por consiguiente, en este procedimiento, para
producir el mRNA se transcribe in vitro una molécula de DNA
correspondiente. Esta matriz de DNA posee un promotor adecuado para
la transcripción in vitro, por ejemplo un promotor T7 o SP6,
al que siguen la secuencia de nucleótidos deseada para el mRNA a
producir y una señal de terminación para la transcripción in
vitro. De acuerdo con la invención, la molécula de DNA que
constituye la matriz de la construcción de RNA a producir se prepara
normalmente mediante reproducción por fermentación y aislamiento
subsiguiente como parte de un plásmido replicable en bacterias. Como
plásmidos adecuados para la presente invención se pueden mencionar
por ejemplo los plásmidos pT7TS (número de acceso GenBank U26404;
Lai et al., Development 1995, 121: 2349 a 2360), la serie
pGEM®, por ejemplo pGEM®-1 (número de acceso GenBank X65300; de
Promega) y pSP64 (número de acceso GenBank X65327) (véase también
Mezei y Storts, Purification of PCR Products, en: Griffin y Griffin
(eds.), PCR Technology: Current Innovation, CRC Press, Boca Raton,
FL, 2001).
De este modo, utilizando oligonucleótidos de DNA
sintéticos cortos que presentan transiciones de cadena simple
cortas en los puntos de intersección formados, o empleando genes
producidos mediante síntesis química, la secuencia de nucleótidos
deseada se puede clonar en un plásmido adecuado mediante métodos de
biología molecular conocidos por los especialistas (Maniatis et
al., véase más arriba). Después, la molécula de DNA se recorta
del plásmido, en el que puede estar presente en copia simple o
múltiple, mediante digestión con endonucleasas de restricción.
El mRNA modificado que puede ser utilizado para
la transfección de las células sanguíneas puede presentar además
una caperuza-5' (un nucleótido guanosina
modificado). Como ejemplos de caperuzas se pueden mencionar:
m7G(5')ppp (5'(A,G(5')ppp(5')A y
G(5')ppp(5')G.
De acuerdo con otra forma de realización
preferente de la presente invención, el mRNA modificado contiene
una cola de poli(A^{+}) de como mínimo aproximadamente 25
nucleótidos, en particular como mínimo aproximadamente 30
nucleótidos, preferentemente como mínimo aproximadamente 50
nucleótidos, de forma más preferente como mínimo aproximadamente 70
nucleótidos, de forma especialmente preferente como mínimo
aproximadamente 100 nucleótidos. No obstante, la cola de
poli(A^{+}) también puede incluir 200 o más
nucleótidos.
Para una traducción eficiente del mRNA también
se requiere una unión eficaz de los ribosomas al sitio de unión de
ribosomas (secuencia de Kozak: GCCGCCAC-CAUGG, el
AUG constituye el codón de iniciación). A este respecto se ha
comprobado que un contenido elevado de A/U alrededor de dicho sitio
posibilita una unión más eficiente de los ribosomas al mRNA.
También es posible insertar en el mRNA uno o
más, así llamados, IRES (en inglés: "internal ribosomal entry
side"). Un IRES puede actuar como único sitio de unión de
ribosomas, pero también puede servir para la producción de un mRNA
que codifica varios (por ejemplo dos) péptidos o polipéptidos que
han de ser traducidos independientemente entre sí a las PBMC por
los ribosomas (mRNA "multicistrónico" o "policistrónico",
por ejemplo bicistrónico)). Las secuencias de IRES utilizables
según la invención son por ejemplo las procedentes de picornavirus
(por ejemplo FMDV), pestivirus (CFFV), poliovirus (PV), virus de la
encefalomiocarditis (ECMV), virus de la fiebre aftosa (FMDV), virus
de la hepatitis C (HCV), virus de la fiebre porcina clásica (CSFV),
virus de la leucemia murina (MLV), virus de la inmunodeficiencia
del simio (SIV) o virus de la parálisis cricket (CrPV).
De acuerdo con otra forma de realización
preferente de la presente invención, el mRNA presenta en las áreas
no traducidas en 5' y/o 3' secuencias estabilizadoras que pueden
aumentar la vida media del mRNA en el citosol.
Estas secuencias estabilizadoras pueden
presentar una secuencia homóloga en un 100% a las secuencias
naturales presentes en virus, bacterias y eucariotas, pero también
pueden ser de índole parcial o totalmente sintética. Como ejemplos
de secuencias estabilizadoras utilizables en la presente invención
se pueden mencionar las secuencias no traducidas (UTR) del gen de
\alpha- y \beta-globina, por ejemplo de Homo
sapiens o Xenopus laevis. Otro ejemplo de una secuencia
estabilizadora presenta la fórmula general
(C/U)CCAN_{x}CCC(U/A)Py_{x}UC(C/U)CC,
que está incluida en el 3'UTR del mRNA muy estable que codifica
\alpha-globina,
\alpha-(I)-colágeno,
15-lipoxigenasa o
tirosina-hidroxilasa (véase Holcik et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94: 2410 a 2414). Evidentemente,
estas secuencias estabilizadoras se pueden utilizar de forma
individual o en combinación entre sí o con otras secuencias
estabilizadoras conocidas por los especialistas.
Para una mayor estabilización del mRNA también
es preferible que éste presente como mínimo un análogo de
nucleótidos naturales. Esto se debe a que las enzimas que
descomponen RNA presentes en las células sanguíneas reconocen
preferentemente nucleótidos naturales como substrato. Por
consiguiente, mediante la inserción de análogos de nucleótidos se
puede dificultar la descomposición del RNA. La inserción de estos
análogos, en particular en el área codificadora del mRNA, puede
tener un efecto positivo o negativo en la eficiencia de
traducción.
En una enumeración en modo alguna definitiva,
como ejemplos de análogos de nucleótidos utilizables según la
invención se pueden mencionar fosforamidatos, fosforotioatos,
peptidonucleótidos, metil-fosfonatos,
7-deazaguanosina,
5-metil-citosina e inosina. La
preparación de estos análogos es conocida por los especialistas y se
da a conocer por ejemplo en las patentes US 4,373,071, US
4,401,796, US 4,415,732, US 4,458,066, US 4,500,707, US 4,668,777,
US 4,973,679, US 5,047,524, US 5,132,418, US 5,153,319, US 5,262,530
y 5,700,642. De acuerdo con la invención, estos análogos pueden
estar presentes en áreas no traducidas y en áreas traducidas del
mRNA modificado.
Además, la eficacia de la transferencia del mRNA
(preferentemente modificado) en las células se puede mejorar si el
mRNA está asociado o unido con un agente catiónico o policatiónico,
en particular un péptido o proteína correspondiente, antes de la
transfección de las células sanguíneas previamente obtenidas. Por
ello, antes de la transfección de las PBMC, el mRNA preferentemente
está complejado o condensado con un agente de este tipo. En este
contexto, la utilización de protamina como proteína policatiónica de
unión de ácido nucleico es especialmente eficaz. También es posible
utilizar otros péptidos catiónicos o proteínas, como
poli-L-lisina,
poli-L-arginina o histonas. Este
procedimiento para estabilizar el mRNA modificado está descrito en
el documento EP-A-1083232, cuyo
contenido publicado a este respecto está incluido en toda su
extensión en la presente invención. Además, el mRNA para la
transfección en las células puede estar asociado o mezclado con
otras sustancias para lograr una transferencia eficaz. Como ejemplo
se puede mencionar la inclusión en micropartículas o nanopartículas,
principalmente las basadas en PLGA
(poli(D,L-lactida-co-glicolida)),
y lípidos.
De acuerdo con la invención, además del péptido
o polipéptido antigénico o eficaz para la terapia genética, el mRNA
también puede contener como mínimo otra sección funcional que
codifique por ejemplo una citoquina promotora de la respuesta
inmune (monoquina, linfoquina, interleuquina o quimioquina, como
IL-1, IL-2, IL-3,
IL-4, IL-5, IL-6,
IL-7, IL-8, IL-9,
IL-10, IL-12,
IFN-\alpha, IFN-\gamma,
GM-CFS, LT-\alpha) o factores de
crecimiento, como hGH. Alternativa o adicionalmente, el mRNA
previsto para la transfección de las células sanguíneas o células
hematopoyéticas, en particular glóbulos rojos, PBMC, granulocitos
y/o plaquetas, también puede codificar como mínimo una molécula
coestimuladora (por ejemplo CD40, CD80, CD86 o ligando
4-1 BB) y/o como mínimo un factor de transcripción
(por ejemplo NF-kappaB o ICSBP (en inglés:
"interferon consensus binding protein")), que facilita una
expresión especialmente eficaz de moléculas inmunoestimuladoras en
las células transfectadas, y/o como mínimo un receptor homing (por
ejemplo CCR7), que conduce las células transfectadas por ejemplo a
los ganglios linfáticos, y/o como mínimo una molécula suicida (por
ejemplo timidina quinasa del virus Herpes Simplex
(HSV-tk, citocromo P450 4B1 (cyp4B1) y/o
folil-poliglutamato sinteasa (FPGS)), que es
expresada en las células transfectadas y que transforma un
profármaco normalmente no activo en su forma activa (por ejemplo
análogos de nucleósido como ganciclovir o aciclovir a través de
HSV-tk y/o 4-ipomeanol o
2-amino-antraceno a través de
cyp4B1), o que refuerza el efecto de un agente quimioterapéutico ya
eficaz (por ejemplo agentes alquilantes como metotrexato a través
de FPGS), induciendo de este modo una muerte celular necrótica y/o
apoptósica, lo que conduce a la liberación del contenido celular que
incluye el antígeno codificado por el mRNA.
Otro objeto de la presente invención se refiere
a un procedimiento para producir la composición farmacéutica
anteriormente definida, que incluye los siguientes pasos:
- (a)
- obtención de células sanguíneas, y
- (b)
- transfección in vitro de las células sanguíneas con como mínimo un mRNA que incluye como mínimo un área que codifica como mínimo un antígeno.
La obtención de células sanguíneas de un
paciente animal o humano tiene lugar por ejemplo mediante
procedimientos estándar. Se puede obtener sangre total fácilmente
mediante punción de un vaso adecuado. El suero se obtiene de forma
conocida mediante coagulación de los componentes sólidos de la
sangre. Como ejemplo de una población parcial enriquecida de
células sanguíneas se pueden mencionar las PBMC. Normalmente, éstas
se aíslan mediante un procedimiento descrito por primera vez por
Bøyum (Nature 204: 793-794, 1964; Scan. J. Lab.
Clin. Invest. Suppl. 97, 1967). Para ello, generalmente se extrae
sangre del individuo y se añade por ejemplo a una solución con una
densidad de 1,077 g/ml (25ºC), que contiene normalmente Ficoll y
diatrizoato de sodio, para la centrifugación en gradiente de
densidad. Durante la centrifugación cuidadosa a temperatura
ambiente, las PBMC se acumulan en la capa límite Ficoll/sangre,
mientras que los glóbulos rojos y los demás glóbulos blancos se
sedimentan. Después se extrae la capa límite con las PBMC y
normalmente se lava con un tampón adecuado, por ejemplo PBS
estéril. Preferentemente, las PBMC se someten a un breve tratamiento
isotónico con una solución acuosa, por ejemplo de cloruro amónico.
Finalmente, las PBMC se lavan de nuevo una o más veces con un
tampón, como PBS (estéril). En caso dado, las células así obtenidas
se pueden guardar bajo condiciones adecuadas, normalmente a -70ºC,
hasta su utilización.
De acuerdo con la invención, las células
sanguíneas consisten preferentemente en células sanguíneas frescas
inmediatamente antes de la transfección, es decir, entre la
obtención de las células sanguíneas (en particular la extracción de
la sangre) en el paso (a) y la transfección según el paso (b) sólo
transcurre un breve tiempo, por ejemplo menos de 12 horas,
preferiblemente menos de 6 horas, de forma más preferente menos de 2
horas y de forma especialmente preferente menos de 1 hora.
La transfección de las células sanguíneas
también se lleva a cabo de acuerdo con procedimientos usuales, por
ejemplo mediante electroporación o procedimientos químicos, en
particular lipofección.
En lo que respecta a las formas de realización
preferentes de las células sanguíneas, véanse las explicaciones
anteriores referentes a la composición farmacéutica de la presente
invención. Del mismo modo, en lo que respecta a las formas de
realización preferentes del mRNA en el paso (b) del procedimiento
según la invención, véanse las formas de realización
correspondientes de la composición farmacéutica según la
invención.
De acuerdo con otra forma de realización
preferente, después del paso (b) las células transfectadas se
someten a un paso (c) para la estimulación con agentes
inmunoestimuladores, como LPS, TNF\alpha, ligandos de receptor de
tipo peaje ("toll-like") como RNA de cadena
doble, DNA estabilizado o CpG, etc.
Como ejemplo de células sanguíneas utilizables
según la invención, tal como se ha explicado detalladamente más
arriba las PBMC se pueden obtener mediante centrifugación en
gradiente de densidad de Ficoll-Hypaque. En caso
necesario se llevan a cabo uno o más pasos de lavado subsiguientes
con solución salina tampón fosfato (PBS). La producción de mRNA
para la transfección según la invención tiene lugar mediante un
procedimiento conocido por los especialistas, principalmente
mediante síntesis química o de forma especialmente preferente
mediante procedimientos de biología molecular, ya mencionados más
arriba.
Como ya se ha mencionado más arriba, durante la
transfección in vitro según el paso (b) el mRNA está
complejado o condensado con como mínimo un agente catiónico o
policatiónico para aumentar la estabilidad del mRNA, lo que conduce
a una mayor eficacia de transfección y sobre todo a un aumento de la
tasa de expresión en las células transfectadas. Los agentes
catiónicos o policatiónicos adecuados son por ejemplo protamina,
poli-L-lisina,
poli-L-arginina o histonas (a este
respecto, véase el contenido de la publicación
EP-A-1083232 arriba mencionada).
De acuerdo con una forma de realización
preferente, el procedimiento arriba indicado para la producción de
la composición farmacéutica anteriormente definida incluye los
siguientes pasos:
- (1)
- producción de una biblioteca de cDNA o de una parte de la misma a partir de tejido tumoral o a partir de células de un paciente infectadas por un agente patógeno;
- (2)
- producción de una matriz para la transcripción in vitro de RNA mediante la biblioteca de cDNA o una parte de la misma; y
- (3)
- transcripción in vitro de la matriz.
El tejido tumoral del paciente se puede obtener
por ejemplo mediante una simple biopsia. No obstante también se
puede preparar mediante extirpación quirúrgica de tejido atacado por
el tumor. Del mismo modo, a partir de biopsias de cualquier tejido
infectado, por ejemplo de los ganglios linfáticos, se pueden obtener
células infectadas por un agente patógeno (evidentemente, de
acuerdo con la invención las células también pueden estar afectadas
por varios gérmenes). Otras fuentes especialmente adecuadas de
células infectadas pueden ser, por ejemplo, sangre, suero, linfa y
líquido sinovial. Además, dado el caso también se pueden obtener
células infectadas de otros fluidos corporales, como esputo,
esperma, líquido vaginal, orina, heces, sudor, etc. Por otra parte,
la producción de una biblioteca de cDNA o de una parte de la misma
de acuerdo con el paso (1) de la forma de realización preferente
del procedimiento de preparación de la presente invención se puede
llevar a cabo después de congelar el tejido correspondiente o las
células para su almacenamiento, preferentemente a temperaturas
inferiores a -70ºC.
Para producir la biblioteca de cDNA o una parte
de la misma, primero se lleva a cabo un aislamiento del RNA total
de las células de tejido tumoral, por ejemplo de las células
infectadas. Por ejemplo en Maniatis et al. (véase más
arriba) se describen procedimientos para dicho aislamiento. Además,
en el mercado se pueden obtener kits para ello, por ejemplo
de la firma Roche AG (por ejemplo el producto "High Pure RNA
Isolation Kit"). A partir del RNA total se aísla el
poli(A^{+})-RNA correspondiente de acuerdo
con un procedimiento conocido por los especialistas (por ejemplo
Maniatis et al., véase más arriba). En el mercado también se
pueden adquirir los kits correspondientes para ello, por
ejemplo el "High Pure RNA Tissue Kit" de la firma Roche AG. A
partir del poli(A^{+})-RNA así obtenido se
produce después la biblioteca de cDNA (a este respecto véase
también por ejemplo Maniatis et al., más arriba). Los
especialistas también pueden adquirir en el mercado kits
para este paso de la producción de la biblioteca de cDNA, por
ejemplo el "SMART PCR cDNA Synthesis Kit" de la firma Clontech
Inc.
De acuerdo con el paso (2) de la forma de
realización preferente del procedimiento de preparación arriba
descrita, a partir de la biblioteca de cDNA (o de una parte de
ésta) se sintetiza una matriz para la transcripción in
vitro. De acuerdo con la invención, esto se lleva a cabo en
particular clonando los fragmentos de cDNA obtenidos en un vector
de producción de RNA adecuado. La matriz de DNA adecuada y los
plásmidos preferentes según la invención ya han sido indicados más
arriba en relación con la producción del mRNA previsto para la
transfección de las
células.
células.
Para la transcripción in vitro de la
matriz producida en el paso (2) arriba indicado, si ésta se
encuentra en forma de (c)DNA plásmido circular primero se
linealiza con una enzima de restricción correspondiente.
Preferentemente, antes de la transcripción in vitro
propiamente dicha, la construcción configurada de este modo se
purifica de nuevo, por ejemplo mediante mezclas correspondientes de
fenol/cloroformo y/o cloroformo/fenol/alcohol isoamílico. Esto
sirve principalmente para asegurar que la matriz de DNA esté libre
de proteínas. A continuación se lleva a cabo la síntesis enzimática
del RNA a partir de la matriz purificada. Esta subetapa tiene lugar
en una mezcla de reacción correspondiente, que contiene la matriz
de DNA linealizada y libre de proteínas en un tampón adecuado, al
que se añade preferentemente un inhibidor de ribonucleasa,
utilizando una mezcla de los trifosfatos de ribonucleótido
necesarios (rATP, rCTP, rUTP y rGTP) y una cantidad suficiente de
una RNA-polimerasa, por ejemplo polimerasa T7. En
este proceso, la mezcla de reacción se encuentra en agua libre de
RNasa. Preferentemente, en la síntesis enzimática propiamente dicha
del RNA también se añade un análogo CAP. Después de una incubación
a 37ºC durante el tiempo correspondiente, por ejemplo 2 horas, la
matriz de DNA se descompone mediante adición de DNasa libre de
RNasa, para lo que preferentemente se vuelve a incubar a 37ºC.
Preferentemente, el RNA así preparado se
precipita mediante acetato amónico/etanol y en caso dado se lava
una o varias veces con etanol libre de RNasa. Finalmente, el RNA
purificado se seca y, de acuerdo con una forma de realización
preferente, se recoge en agua libre de RNasa.
Además, el RNA así producido se puede someter a
varias extracciones con fenol/cloroformo o cloroformo/fenol/
alcohol isoamílico.
alcohol isoamílico.
De acuerdo con otra forma de realización
preferente de la presente invención sólo se produce una parte de
una biblioteca de cDNA total y se transforma en moléculas de mRNA
correspondientes. Por consiguiente, de acuerdo con la invención
también se puede utilizar una, así llamada, biblioteca de
sustracción como parte de la biblioteca de cDNA total para preparar
las moléculas de mRNA según la invención. Una parte preferente de la
biblioteca de cDNA del tejido tumoral codifica los antígenos
específicos del tumor. En el caso de ciertos tumores ya se conocen
los antígenos correspondientes. En el caso de las células infectadas
por un agente patógeno (o varios agentes patógenos diferentes), la
biblioteca parcial de cDNA codifica preferentemente los productos
(polipéptidos) de los genes de la célula (huésped) regulados hacia
arriba a causa de la infección. De acuerdo con otra forma de
realización preferente, en primer lugar (por ejemplo antes del paso
(1) del procedimiento anteriormente definido) se puede determinar
la parte de la biblioteca de cDNA que codifica los antígenos
específicos del tumor o la parte de la biblioteca de cDNA que
codifica los productos de los genes regulados hacia arriba.
Preferentemente, esto se lleva a cabo determinando las secuencias de
los antígenos específicos del tumor o de los productos de los genes
regulados hacia arriba debido a la infección con el agente patógeno
mediante una alineación con una biblioteca correspondiente de cDNA
de tejido sano o de células no infectadas.
La alineación según la invención incluye
principalmente una comparación del patrón de expresión del tejido
sano con el del tejido tumoral en cuestión o, en el caso de la
inmunoestimulación contra un germen patógeno, una comparación del
patrón de expresión de células sanas con el de células infectadas.
Los patrones de expresión correspondientes se pueden determinar a
nivel de ácido nucleico por ejemplo con ayuda de experimentos de
hibridación adecuados. Para ello, por ejemplo, las bibliotecas de
(m)RNA o cDNA correspondientes de los tejidos o de las
células se pueden separar en cada caso en geles de agarosa o
poliacril-amida adecuados, trasladar a membranas e
hibridar con sondas de ácido nucleico correspondientes,
preferentemente sondas de oligonucleótido, que representen los
genes correspondientes (Northern-Blot o
Southern-Blot). De este modo, una comparación de las
hibridaciones correspondientes permite determinar los genes
especialmente adecuados para la inmunoestimulación, es decir, genes
expresados exclusivamente por tejido tumoral o expresados con más
intensidad dentro de éste, o genes regulados hacia arriba en
células infectadas.
De acuerdo con otra forma de realización
preferente, los experimentos de hibridación mencionados se llevan a
cabo con ayuda de un diagnóstico por microarrays (biochips)
(uno o más microarrays). Un microarray de DNA
correspondiente incluye una disposición definida, en poco espacio o
en el menor espacio posible, de sondas de ácido nucleico, en
particular sondas de oligonucleótido, representando cada sonda por
ejemplo un gen cuya presencia o ausencia se ha de investigar en la
biblioteca de (m)RNA o cDNA correspondiente. En una
microdisposición correspondiente pueden estar representados cientos,
miles o incluso decenas o centenas de miles de genes. Para analizar
el patrón de expresión del tejido correspondiente o de las células
correspondientes, el poli(A^{+})-RNA o
preferentemente el cDNA correspondiente se marca con un marcador
adecuado, para lo que se utilizan en particular marcadores
fluorescentes, y se pone en contacto con el microarray bajo
condiciones de hibridación adecuadas. Si una especie de cDNA se une
a una molécula de sonda presente en el microarray, en
particular una molécula de sonda de oligonucleótido, se observa una
señal de fluorescencia correspondiente más o menos intensa que
puede ser medida con un aparato de detección adecuado, por ejemplo
un espectrómetro de fluorescencia correspondientemente diseñado.
Cuanto mayor sea la representación de la especie de cDNA (o RNA) en
la biblioteca, mayor será la señal, por ejemplo la señal de
fluorescencia. El experimento de hibridación con microarray
(o varios o muchos de ellos) se lleva (se llevan) a cabo por
separado para el tejido tumoral y para el tejido sano, o para las
células infectadas y las no infectadas. La diferencia entre las
señales seleccionadas de los experimentos con microarray
permite deducir qué genes son expresados de forma exclusiva o
incrementada por el tejido tumoral, o qué genes están regulados
hacia arriba a causa de la infección por el agente patógeno. Por
ejemplo en Schena (2003), Microarray Analysis, ISBN
0-471-41443-3, John
Wiley & Sons, Inc., New York, se describen análisis con
microarray de DNA de este tipo, quedando incluido en la
presente invención el contenido correspondiente de dicha
publicación en toda su extensión.
Sin embargo, la preparación de patrones de
expresión específicos de infección o de tejido tumoral no está
limitada en modo alguno al análisis a nivel de ácido nucleico.
Evidentemente, los especialistas también conocen procedimientos del
estado actual de la técnica que sirven para el análisis de expresión
a nivel de proteínas. En este contexto se han de mencionar en
particular las técnicas de la electroforesis en gel 2D y la
espectrometría de masas, pudiendo combinarse ventajosamente estas
técnicas también con biochips de proteína (es decir,
microarrays a nivel de proteínas, en los que por ejemplo un
extracto proteínico de tejido sano o de tejido tumoral, o de
células infectadas o células no infectadas, se pone en contacto con
anticuerpos y/o péptidos aplicados sobre el substrato del
microarray). En lo que respecta a los procedimientos de
espectrometría de masas se han de mencionar principalmente los
procedimientos MALDI-TOF ("matrix assisted laser
desorption/ionisation-time of flight"). Las
técnicas mencionadas para el análisis químico proteínico para la
obtención del patrón de expresión de tumores en comparación con
tejido sano, o de células infectadas en comparación con células
correspondientes no infectadas, se describen por ejemplo en Rehm
(2000) Der Experimentator: Proteinbiochemie/Proteomics, Editorial
Spektrum Akademischer, Heidelberg, 3ª edición, a cuyo contenido
correspondiente se hace referencia explícita expressis
verbis en la presente invención. Además, en cuanto a los
microarrays de proteínas se remite de nuevo a las
explicaciones al respecto dadas en Schena (2003), véase más
arriba.
Además de las células transfectadas, la
composición farmacéutica según la invención contiene uno o más
excipientes farmacéuticamente compatibles y/o uno o más vehículos
farmacéuticamente compatibles. Los excipientes o vehículos
adecuados son preferentemente medios estériles o soluciones tampón
adaptados a las células sanguíneas correspondientes.
En "Remington's Pharmaceutical Sciences"
(Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980), cuyo contenido completo forma
parte de la exposición de la presente invención, se dan a conocer
métodos para la formulación y producción adecuada de las
composiciones farmacéuticas según la invención. Como excipientes
para la administración parenteral, además de agua estéril,
soluciones tampón estériles o medios estériles, también entran en
consideración polialquilén-glicoles, naftaleno
hidrogenado y principalmente polímeros de lactida biocompatibles,
copolímeros de lactida/glicolida o copolímeros de
polioxietileno/polioxipropileno. Las composiciones según la
invención pueden contener sustancias de relleno o sustancias como
lactosa, manitol, sustancias para el enlace covalente de polímeros,
como por ejemplo polietilén-glicol, complejación
con iones metálicos o inclusión de materiales en o sobre
preparaciones especiales de compuestos poliméricos, como por
ejemplo polilactato, ácido poliglicólico, hidrogel, o sobre
liposomas, microemulsiones, micelas, vesículas unilaminares o
multilaminares, fragmentos de eritrocitos o esferoplastos. Las
formas de realización correspondientes de las composiciones se
eligen en función de comportamientos físicos, por ejemplo teniendo
en cuenta la solubilidad, la estabilidad, la biodisponibilidad o la
degradabilidad. La liberación controlada o constante de los
componentes de principio activo según la invención en la composición
incluye formulaciones basadas en depósitos lipófilos (por ejemplo
ácidos grasos, ceras o aceites). En el marco de la presente
invención también se dan a conocer revestimientos de sustancias o de
composiciones según la invención que contienen estas sustancias, a
saber: revestimientos con polímeros (por ejemplo poloxámeros o
poloxaminas). Además, las sustancias o composiciones según la
invención también pueden presentar revestimientos protectores, por
ejemplo inhibidores de proteasa o amplificadores de permeabilidad.
Los excipientes acuosos preferentes son por ejemplo agua para
inyección (WFI) o agua tamponada con fosfato, citrato o acetato,
etc., o medios celulares correspondientes, ajustándose el pH
típicamente a un valor de 5,0 a 8,0, preferentemente de 6,0 a 7,0.
Preferentemente, el o los excipientes, o el o los vehículos,
contendrán adicionalmente componentes salinos, por ejemplo cloruro
sódico, cloruro potásico u otros componentes, que hacen que la
solución por ejemplo se vuelva isotónica.
Además de los componentes anteriormente
mencionados, el o los excipientes, o el o los vehículos, también
pueden contener componentes adicionales, como suero bovino fetal,
factores de crecimiento, albúmina sérica humana (HSA), polisorbato
80, azúcares o aminoácidos.
El modo de administración y la dosificación de
la composición farmacéutica según la invención dependen de la
enfermedad a tratar y el estado de avance de la misma, y también del
peso corporal, la edad y el sexo del paciente.
Por consiguiente, la concentración de las
células transfectadas en este tipo de formulaciones puede variar
dentro de amplios márgenes, por ejemplo de 5 x 10^{4} a 1 x
10^{8} células/ml. La composición farmacéutica según la invención
se administra al paciente preferentemente por vía parenteral, por
ejemplo intravenosa, intraarterial, subcutánea, intramuscular.
Además, la composición farmacéutica de la presente invención se
puede inyectar localmente, por ejemplo en un tumor.
En consecuencia, de acuerdo con la invención
también se pone a disposición un procedimiento para la producción
de un medicamento para el tratamiento de enfermedades cancerosas o
enfermedades infecciosas, por ejemplo de las enfermedades
anteriormente mencionadas, o un procedimiento de vacunación para la
prevención de dichas enfermedades, incluyendo estos procedimientos
la administración de la composición farmacéutica según la invención
a un paciente, en particular a un ser humano.
De acuerdo con una forma de realización
preferente del procedimiento de tratamiento o vacunación, o en la
utilización anteriormente definida de las células sanguíneas
transfectadas según la invención, es decir, una mezcla de glóbulos
rojos, granulocitos, células mononucleares y plaquetas, para
preparar una composición farmacéutica para el tratamiento y/o la
prevención de enfermedades cancerosas o enfermedades infecciosas, al
paciente se le administran una o más citoquinas y/o una o mas
moléculas coestimuladoras además de la composición farmacéutica
según la invención.
En lo que respecta a las especies administradas
de forma adicional, véanse las realizaciones arriba descritas en
relación con las moléculas codificadas adicionalmente junto con el o
los antígenos del mRNA.
Por consiguiente, de acuerdo con la invención
también se pone a disposición en general un procedimiento de
tratamiento o vacunación que incluye la administración de las
células sanguíneas transfectadas según la invención y como mínimo
una citoquina, por ejemplo una o más de las citoquinas anteriormente
mencionadas, en particular GM-CSF, a un paciente,
en particular a un ser humano. El procedimiento sirve principalmente
para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades cancerosas
correspondientes (por ejemplo las enfermedades cancerosas arriba
indicadas) o enfermedades infecciosas. En consecuencia, la presente
invención también está orientada en general a una composición
farmacéutica que incluye células transfectadas (tal como se definen
más arriba) y como mínimo una citoquina, por ejemplo una o más de
las citoquinas arriba mencionadas, como GM-CSF,
preferentemente junto con un excipiente y/o vehículo
farmacéuticamente compatible. Por consiguiente, de acuerdo con la
invención también se da a conocer la utilización de citoquinas, por
ejemplo una o más de las citoquinas anteriormente mencionadas, en
particular GM-CSF, en combinación con las células
sanguíneas transfectadas tal como se definen más arriba, para el
tratamiento y/o la prevención de enfermedades cancerosas (por
ejemplo las enfermedades cancerosas anteriormente indicadas) o
enfermedades infecciosas (por ejemplo las enfermedades infecciosas
anteriormente indicadas).
De acuerdo con otra forma de realización
preferente de la presente invención, la citoquina, por ejemplo
GM-CSF, se administra al mismo tiempo que la
composición farmacéutica que contiene las células transfectadas, o
preferentemente se administra antes o después de ésta (o se utiliza
para producir un medicamento correspondiente para ser administrado
simultáneamente con las células sanguíneas anteriormente indicadas o
para ser administrado antes o después de éstas). De forma
totalmente preferente, la administración de la citoquina, en
particular GM-CSF, tiene lugar poco antes (por
ejemplo aproximadamente 2 horas o menos, por ejemplo hasta
aproximadamente 5 minutos), poco después (por ejemplo
aproximadamente 5, 10, 15, 30, 45 ó 60 minutos) o mucho después (por
ejemplo aproximadamente 2, 6, 12, 24, ó 36 horas) de la
administración de la composición farmacéutica anteriormente
definida, o en general después de las células transfectadas según
la invención.
La administración de la citoquina, por ejemplo
GM-CSF, puede tener lugar del mismo modo que las
composiciones farmacéuticas según la invención o las células
sanguíneas transfectadas según la invención, o de un modo diferente.
Las vías de administración adecuadas y también las posibilidades de
formulación adecuadas con respecto a la citoquina o las citoquinas
se desprenden de las anteriores explicaciones con respecto a las
composiciones farmacéuticas según la invención. En caso de un
paciente humano es recomendable en particular una dosis de
GM-CSF de 100 microgramos/m^{2}. De forma
especialmente preferente, la citoquina, por ejemplo
GM-CSF, se administra mediante una inyección
subcutánea.
Preferentemente, las composiciones farmacéuticas
de la presente invención o las células sanguíneas transfectadas
según la invención, y en caso dado junto con ellas la o las
citoquinas u otras moléculas coestimuladoras, se administran en
forma de dosis periódicas. Por ejemplo, se puede administrar una
dosis de la composición farmacéutica según la invención a
intervalos cortos, por ejemplo a diario, cada dos días, cada tres
días, etc., o preferiblemente a intervalos más largos, por ejemplo
semanalmente, cada dos semanas, cada tres semanas, mensualmente,
etc. Los intervalos también pueden ser variables, para lo que se han
de tener en cuenta principalmente los parámetros inmunológicos del
paciente. Por ejemplo, la administración de una composición
farmacéutica según la invención (y en caso dado junto con ella la
administración de la citoquina o las citoquinas o de la o las
moléculas coestimuladoras) puede seguir un esquema de tratamiento en
el que al principio el intervalo es más corto, por ejemplo cada dos
semanas, y después, en función del desarrollo del tratamiento o de
los parámetros inmunológicos del paciente determinados
correspondientemente, el intervalo se puede prolongar por ejemplo a
una vez al mes.
De este modo, dependiendo del paciente, en
particular de su estado y sus parámetros inmunológicos, se puede
emplear un esquema terapéutico a medida del individuo
correspondiente.
Por consiguiente, de acuerdo con la invención
también se pone a disposición un procedimiento de tratamiento en el
que en primer lugar se obtienen células sanguíneas (tal como se
definen más arriba) de un paciente (animal o humano), después se
someten a transfección in vitro según la invención con el
mRNA arriba definido y finalmente se administran a un paciente
correspondiente, preferentemente el mismo paciente del que se han
tomado las células sanguíneas correspondientes en el primer paso,
para lo que se aplican las realizaciones correspondientes con
respecto a la formulación y administración de la composición
farmacéutica según la invención.
En consecuencia, de acuerdo con la invención se
utilizan células sanguíneas transfectadas con como mínimo un mRNA
que incluye como mínimo un área que codifica como mínimo un antígeno
para producir un medicamento correspondiente para estimular una
respuesta inmune contra el antígeno o los antígenos codificados por
el mRNA.
De acuerdo con la invención se comprobó
sorprendentemente que para la vacunación contra determinados
antígenos no es necesario diferenciar las células sanguíneas
adecuadas en células presentadoras de antígeno (APC), en particular
células dendríticas (DC), mediante costosas técnicas de cultivo
celular antes de la transfección con un mRNA codificador del
antígeno correspondiente, con el fin de provocar una respuesta
inmune correspondiente en el paciente. Las APC se caracterizan
principalmente porque, mediante la expresión de moléculas
coestimuladoras y la secreción de citoquinas, pueden interactuar
con linfocitos y provocar a través de éstos una respuesta inmune
específica del antígeno. Las APC también pueden ser macrófagos o
linfocitos B además de DC. Las células sanguíneas utilizadas según
la invención incluyen células B, monocitos, linfocitos T,
granulocitos y una pequeña cantidad de DC, que se pueden dividir
entre DC plasmacitoideas (pDC) y DC mieloideas (mDC). Sin establecer
ningún compromiso con una teoría determinada con respecto al modo
de acción de las células sanguíneas así transfectadas, de acuerdo
con los conocimientos actuales según la invención se supone que las
células transfectadas administradas al paciente por ejemplo
mediante inyección expresan la proteína codificada por el mRNA y
estimulan una inmunidad específica del antígeno bien directamente
(a través de las APC presentes en las células sanguíneas como las
PBMC), bien indirectamente (a través de las células transfectadas
que no son APC, pero que mueren y son absorbidas por fagocitosis
por las APC presentes en el organismo; o a través de proteínas
segregadas por las células transfectadas, que son absorbidas por
fagocitosis por las APC presentes en el organismo). Por
consiguiente, al contrario que en el estado actual de la técnica, en
la presente invención no se requiere ninguna etapa de procedimiento
costoso, por ejemplo pasos de cultivo celular y similares, para
obtener poblaciones de APC enriquecidas o para producir de otro
modo por ejemplo APC artificiales. Además, tampoco es necesario
utilizar grandes cantidades de citoquinas. De acuerdo con la
invención, entre la obtención de las células sanguíneas, por
ejemplo la extracción de sangre, y la administración de la
composición farmacéutica utilizada por ejemplo como vacuna contra
tumores o contra infecciones sólo transcurre típicamente una hora o
pocas horas, por ejemplo 2 horas. Al contrario que en los
procedimientos conocidos hasta ahora, según la invención se utilizan
células sanguíneas, en general una mezcla de glóbulos rojos,
células mononucleares, granulocitos y plaquetas, o poblaciones
enriquecidas o esencialmente puras de estas células sanguíneas, y no
APC generadas in vitro, lo que conduce a las ventajas
anteriormente mencionadas.
Las figuras muestran:
La figura 1 muestra una representación gráfica
de los resultados de experimentos FACS con respecto a la expresión
de EGFP en células T colaboradoras específicas de CD4 o en células B
específicas de CD19. Un mRNA codificador de EGFP (gráficos
izquierdos) o un mRNA codificador de la proteína de matriz de
influenza (control; gráficos derechos) se transfectó in
vitro mediante electroporación en PBMC humanas frescas. Después
se examinó la expresión de EGFP mediante FACS sobre la base de la
fluorescencia del EGFP. La detección de células positivas de CD4 o
CD19 se llevó a cabo mediante anticuerpos fluorescentes
anti-CD4 (gráficos superiores) o
anti-CD19 (gráficos inferiores). Los resultados
muestran que algunas de las células positivas de CD4 contenidas en
las PBMC habían absorbido el mRNA y expresaban EGFP.
La figura 2 también muestra representaciones
gráficas de los resultados de experimentos FACS, que demuestran que
las PBMC transfectadas con mRNA pueden activar células T contra
antígenos codificados por el mRNA. Los experimentos se llevaron a
cabo con 2 procedimientos de electroporación diferentes, por un lado
con el aparato Nucleofector de la firma AMAXA y por otro con el
sistema de electroporación estándar EASY JECT PLUS de la firma
Equibio. Unas PBMC humanas frescas se sometieron a transfección con
mRNA EGFP o con un mRNA que codifica la proteína de matriz de
influenza. Como controles positivos se utilizaron PBMC cargadas con
el péptido GILGFVFPL de la proteína de matriz de influenza. Después
de la transfección, o después de la carga en el caso de los
controles positivos, las células se cocultivaron durante una semana
con PBMC autólogas frescas. A continuación, las células se marcaron
con ayuda de anticuerpos monoclonales específicos de CD8 marcados
con PercP (para la detección de células T citotóxicas) y mediante
marcado PE de tetrámeros MHC fluorescentes (que reconocen
exclusivamente las células T citotóxicas específicas del epítope de
la proteína de matriz de influenza, que es presentado por
HLA-A*0201). En los dos procedimientos de
electroporación se comprueba que, cuando las PBMC utilizadas para
la estimulación se sometían a transfección con mRNA EGFP, sólo un
0,1% o un 0,7% de las células T citotóxicas positivas de CD8 eran
específicas del epítope dominante de la proteína de matriz de
influenza. En cambio, en el caso de la transfección de PBMC con el
mRNA que codifica la proteína de matriz de influenza, después de
una semana se observa una frecuencia de un 1,6% o un 2,5% de células
T citotóxicas positivas de CD8 que son específicas del epítope
dominante de la proteína de matriz de influenza. Por consiguiente,
de acuerdo con la invención se puede constatar que la
electroporación de PBMC con mRNA que codifica la proteína de matriz
de influenza induce la proliferación de células T citotóxicas que
son específicas del epítope dominante de la proteína de matriz de
influenza, pero que esto no se logra a través de la transfección con
mRNA EGFP. Además, este resultado es independiente del tipo de
electroporación.
La presente invención se explica más
detalladamente mediante los siguientes ejemplos no limitativos.
Se aislaron células mononucleares de la sangre
periférica de donantes positivos de HLA-A0201 sanos.
Las células mononucleares se obtuvieron mediante centrifugación en
gradiente de Ficoll-Hypaque. Las PBMC se lavaron
tres veces con PBS.
Las PBMC obtenidas se sometieron a reacción con
el dispositivo Nucleofector y el Human B-Cell
Nucleofector Kit (ambos de AMAXA GmbH, Colonia, Alemania) de
acuerdo con las instrucciones del fabricante. En cada transfección
se transfectaron 4 x 10^{6} células con 5 microgramos de RNA.
Para la fenotipización inmunológica de PBMC
transfectadas con el mRNA EGFP se utilizaron los anticuerpos
monoclonales CD4-PerCP y CD19-PE
(en ambos casos, anticuerpos monoclonales de BD Pharmingen).
Después de la transfección, 1,5 x 10^{6}
células se incubaron para su maduración en placas de cultivo con 24
pocillos (Greiner) en 1,5 ml de X-Vivo 15 Medium
(Bio Whittaker, Bélgica), que contenía 100 mg/ml de LPS (Sigma,
Deisenhofen, Alemania) y 2,5 mg/ml de TNF-\alpha
(R&D Systems). Como control positivo se utilizaron PBMC maduras
no transfectadas, que se cargaron durante 1 hora con 1 mg/ml del
péptido restringido de HLA-A*0201 (GILGFVFTL) de la
proteína de matriz de influenza. Después de 24 horas de incubación,
las PBMC maduras se lavaron con medio. A continuación, las células
se utilizaron para la estimulación de PBMC singeneicas descongeladas
(10^{7} células por pocillo). Cuatro días después se añadió medio
fresco y 10 u/ml de IL-2 recombinante y 5 mg/ml de
IL-7 recombinante (ambos de R&D Systems).
Después de 6 días de cultivo, las células se marcaron con un
tetrámero de HLA-A*0201 humano marcado con PE, que
es específico de la proteína de matriz de influenza. Para la
detección de células específicas de CD8 se utilizó un anticuerpo
anti-CD4 marcado con FITC y dirigido contra un
anticuerpo CD-8 marcado con PercP.
Un mRNA codificador de EGFP se transfectó
mediante electroporación (o mediante lipofección, datos no
mostrados) en PBMC humanas frescas. Un día después de la
transfección se examinó mediante análisis FACS la expresión de EGFP
en células con anticuerpos monoclonales fluorescentes
(anti-CD4 en el caso de las células T colaboradoras
o anti-CD19 en el caso de las células B). Como
muestra la figura 1, algunas células positivas de CD4 han absorbido
el mRNA y expresado EGFP. En algunos casos también se ha podido
comprobar una expresión de EGFP en células B y también en otras
células que no son células B ni T, por ejemplo monocitos (no
mostrado).
Unas PBMC de donantes sanos positivos de
HLA-A*0201 se sometieron a transfección con mRNA
codificador de la proteína de matriz de influenza. Las
transfecciones se llevaron a cabo utilizando el dispositivo
Nucleofector de AMAXA o un sistema de electroporación estándar
(EASYJECT PLUS) de la firma Equibio. Las PBMC transfectadas se
cocultivaron in vitro durante una semana junto con PBMC
frescas autólogas y, en caso dado, a lo largo de la noche se llevó
a cabo una maduración por incubación con LPS y
TNF-\alpha. Sin embargo, con PBMC transfectadas
no estimuladas se obtuvieron los mismos resultados. Después, las
células se marcaron utilizando anticuerpos monoclonales
(anti-CD8 para células T citotóxicas positivas de
CD8) y tetrámeros de MHC fluorescentes, reconociendo estos últimos
exclusivamente las células T citotóxicas que son específicas del
epítope de la proteína de matriz de influenza presentado por
HLA-A*0201. Como muestran los resultados de la
figura 2, únicamente la electroporación de mRNA que codifica la
proteína de matriz de influenza induce una proliferación de células
T citotóxicas que son específicas del epítope dominante derivado de
la proteína de matriz de influenza, mientras que la transfección de
mRNA EGFP no provoca ninguna proliferación correspondiente de
células T citotóxicas positivas de CD8. Además, este resultado es
independiente del sistema de electroporación utilizado y tampoco
depende de si las PBMC transfectadas han sido tratadas o no a lo
largo de la noche con LPS y TNF-\alpha antes del
cocultivo.
Además, mediante experimentos in vivo con
ratones se puede demostrar que unos esplenocitos frescos
transfectados por electroporación como células sanguíneas en el
sentido de la presente invención pueden provocar una respuesta
inmune. Esto es aplicable sobre todo al mRNA bicistrónico, que
codifica el antígeno de interés y al mismo tiempo una citoquina, un
receptor coestimulador, una molécula homing y/o una molécula suicida
(que provoca una necrosis o apoptosis).
Claims (37)
-
\global\parskip0.950000\baselineskip
1. Composición farmacéutica que contiene células sanguíneas transfectadas con como mínimo un mRNA junto con un excipiente y/o vehículo farmacéuticamente aceptable, incluyendo el mRNA como mínimo un área que codifica como mínimo un antígeno y consistiendo las células sanguíneas en una mezcla de glóbulos rojos, granulocitos, células mononucleares y plaquetas con no más de un 5% de células dendríticas. - 2. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que las células sanguíneas no incluyen más de un 2% de células dendríticas (DC).
- 3. Composición farmacéutica según la reivindicación 1 ó 2, que contiene células sanguíneas autólogas.
- 4. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el mRNA incluye un área que codifica como mínimo un antígeno de un tumor o de un agente patógeno.
- 5. Composición farmacéutica según la reivindicación 4, en la que el antígeno o los antígenos son un poliepítope de antígenos de un tumor o de un agente patógeno.
- 6. Composición farmacéutica según la reivindicación 5, en la que el poliepítope está modificado por deleción, adición y/o sustitución de uno o más residuos de aminoácido.
- 7. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 4 a 6, en la que las células sanguíneas están transfectadas con varias moléculas de mRNA que representan una biblioteca de cDNA o una parte de la misma de un tejido tumoral o de una células infectada por un agente patógeno.
- 8. Composición farmacéutica según la reivindicación 7, en la que la parte de la biblioteca de cDNA codifica los antígenos específicos del tumor o los productos de los genes regulados hacia arriba a causa de la infección por el agente patógeno.
- 9. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 4 a 8, en la que el antígeno o los antígenos tumorales se seleccionan entre 707-AP, AFP, ART-4, BAGE, \beta-catenina/m, Bcr-abl, CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/neu, HLA-A*0201-R1701, HPV-E7, HSP70-2M, HAST-2, hTERT (o hTRT), iCE, KIAA0205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-1/Melan-A, MC1R, Myosin/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA88-A, NY-ESO-1, p190 minor bcr-abl, Pml/RAR\alpha, PRAME, PSA, PSM, RAGE, RU1 o RU2, SAGE, SART-1 o SART-3, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2 y WT1.
- 10. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 4 a 8, en la que el agente patógeno se selecciona entre el grupo consistente en virus, bacterias y protozoos.
- 11. Composición farmacéutica según la reivindicación 10, en la que el antígeno viral, bacteriano o protozoológico procede de una proteína segregada.
- 12. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 1 a 11, en la que el área que codifica el antígeno o los antígenos y/o el área no traducida en 5' y/o 3' están modificadas con respecto al mRNA natural de tal modo que no presentan ningún elemento de secuencia desestabilizador.
- 13. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 1 a 12, en la que el mRNA incluye un área de secuencia que sirve para aumentar la tasa de traducción.
- 14. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 1 a 13, en la que el mRNA codifica adicionalmente como mínimo una citoquina y/o como mínimo una molécula coestimuladora y/o como mínimo un factor de transcripción y/o como mínimo un receptor homing y/o como mínimo un gen suicida.
- 15. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 1 a 14, en la que el mRNA presenta una caperuza-5' y/o una cola de poli(A^{+}) de como mínimo aproximadamente 25 nucleótidos y/o como mínimo un IRES y/o como mínimo una secuencia estabilizadora 5' y/o como mínimo una secuencia estabilizadora 3'.
- 16. Composición farmacéutica según la reivindicación 15, en la que la secuencia estabilizadora 5' y/o la secuencia estabilizadora 3' se seleccionan entre el grupo consistente en secuencias no traducidas (UTR) del gen de \alpha-globina o \beta-globina y una secuencia estabilizadora de la fórmula general (C/U)CCAN_{x}CCC(U/A)Py_{x}UC(C/U)CC.
- 17. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 1 a 16, en la que el mRNA presenta como mínimo un análogo de nucleótidos naturales.
- 18. Composición farmacéutica según la reivindicación 17, en la que el análogo se selecciona entre el grupo consistente en fosforotioatos, fosforamidatos, peptidonucleótidos, metil-fosfonatos, 7-deazaguanosina, 5-metil-citosina e inosina.
\global\parskip1.000000\baselineskip
- 19. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 1 a 18 para la terapia y/o la profilaxis contra el cáncer o enfermedades infecciosas.
- 20. Procedimiento para la producción de una composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 1 a 19, que incluye los siguientes pasos:
- (a)
- obtención de células sanguíneas, consistiendo las células sanguíneas en una mezcla de glóbulos rojos, granulocitos, células mononucleares y plaquetas con no más de un 5% de células dendríticas; y
- (b)
- transfección in vitro de las células sanguíneas con como mínimo un mRNA que incluye como mínimo un área que codifica como mínimo un antígeno.
- 21. Procedimiento según la reivindicación 20, en el que las células sanguíneas no incluyen más de un 2% de DC directamente antes de la transfección según el paso (b).
- 22. Procedimiento según la reivindicación 20 ó 21, en el que entre la obtención de las células sanguíneas en el paso (a) y la transfección en el paso (b) transcurren menos de 12 horas, preferentemente menos de 6 horas y en particular menos de 2 horas.
- 23. Procedimiento según una de las reivindicaciones 20 a 22, en el que las células sanguíneas son autólogas.
- 24. Procedimiento según una de las reivindicaciones 20 a 23, en el que el mRNA es tal como se define en una de las reivindicaciones 4 a 18.
- 25. Procedimiento según una de las reivindicaciones 20 a 24, en el que, durante la transfección según paso (b), el mRNA está presente en forma complejada o condensada con como mínimo un agente catiónico o policatiónico.
- 26. Procedimiento según la reivindicación 25, en el que el agente catiónico o policationico se selecciona entre el grupo consistente en protamina, poli-L-lisina, poli-L-arginina e histonas.
- 27. Procedimiento según una de las reivindicaciones 20 a 26, en el que el mRNA se produce mediante un procedimiento que incluye los siguientes pasos:
- (1)
- producción de una biblioteca de cDNA o de una parte de la misma a partir de tejido tumoral o a partir de células de un paciente infectadas por un agente patógeno;
- (2)
- producción de una matriz para la transcripción in vitro de RNA mediante la biblioteca de cDNA o una parte de la misma; y
- (3)
- transcripción in vitro de la matriz.
- 28. Procedimiento según la reivindicación 27, en el que la parte de la biblioteca de cDNA del tejido tumoral codifica los antígenos específicos de tumor o los productos de los genes regulados hacia arriba a causa de la infección por el agente patógeno.
- 29. Procedimiento según la reivindicación 28, en el que antes del paso (1) se determinan las secuencias de los antígenos específicos de tumor o las secuencias de los productos de los genes regulados hacia arriba a causa de la infección por el agente patógeno.
- 30. Procedimiento según la reivindicación 29, en el que la determinación de las secuencias de los antígenos específicos del tumor o las secuencias de los productos de los genes regulados hacia arriba debido a la infección con el agente patógeno incluye una alineación con una biblioteca correspondiente de cDNA de tejido sano o de células no infectadas.
- 31. Procedimiento según la reivindicación 30, en el que la determinación de las secuencias de los antígenos específicos del tumor o las secuencias de los productos de los genes regulados hacia arriba debido a la infección con el agente patógeno incluye un diagnóstico mediante un microarray.
- 32. Composición farmacéutica que se puede obtener mediante el procedimiento según una de las reivindicaciones 20 a 31.
- 33. Utilización de células sanguíneas transfectadas con como mínimo un mRNA que incluye como mínimo un área que codifica como mínimo un antígeno y consistiendo las células sanguíneas en una mezcla de glóbulos rojos, granulocitos, células mononucleares y plaquetas con no más de un 5% de células dendríticas, dado el caso junto con un excipiente y/o vehículo farmacéuticamente aceptable, para producir un medicamento para estimular una respuesta inmune contra el antígeno o los antígenos codificados por el mRNA.
\newpage
- 34. Utilización según la reivindicación 33, en la que las células sanguíneas no incluyen más de un 2% de células dendríticas (DC).
- 35. Utilización según la reivindicación 33 ó 34, en la que las células sanguíneas son autólogas.
- 36. Utilización según una de las reivindicaciones 33 a 35, en la que el mRNA es tal como se define en una de las reivindicaciones 4 a 18.
- 37. Utilización según una de las reivindicaciones 33 a 36, en la que la inmunoestimulación sirve para la terapia y/o la profilaxis contra el cáncer o enfermedades infecciosas.
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