CN114729369A - 最小mRNA及其用途 - Google Patents

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CN114729369A CN202080060514.XA CN202080060514A CN114729369A CN 114729369 A CN114729369 A CN 114729369A CN 202080060514 A CN202080060514 A CN 202080060514A CN 114729369 A CN114729369 A CN 114729369A
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史蒂夫·帕斯科洛
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Universitaet Zuerich
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Abstract

本发明涉及完全化学合成的RNA分子(以下也称为“ChemRNA”)，其具有用于表达编码序列的最小结构。本发明的ChemRNA具有通用结构5’‑W‑X‑Y‑(编码序列)‑Z‑3’，其中W选自由5’‑端帽、游离5’‑三磷酸基团、游离5’‑二磷酸基团、游离5’‑单磷酸基团、游离5’‑OH基团、以及所述5’端帽、所述5’‑三磷酸基团、所述游离5’‑二磷酸基团或所述游离5’‑单磷酸基团的化学修饰类似物组成的组，X是可选的5’UTR序列，Y是可选的起始密码子，并且Z直接连接编码序列并选自由游离的3’‑OH基团、终止密码子和可选地经由3’UTR序列与poly(A)尾相连的终止密码子组成的组。本发明还涉及：至少85％或更多与本发明的RNA具有相同的化学组成的RNA群；以及包含本发明的RNA的RNA群，其中，存在至少1％的RNA的比全长RNA短1个核苷酸。本发明的RNA和RNA群用于在细胞或生物体中或在无细胞表达系统中表达由编码序列编码的氨基酸序列。本发明还涉及包含RNA或RNA群的药物组合物、疫苗和诊断工具。

Description

最小mRNA及其用途
技术领域
本发明涉及完全化学合成的RNA分子(以下也称为“ChemRNA”)，其具有对编码序列的表达有用的最小结构。本发明的ChemRNA具有通用结构5’-W-X-Y-(编码序列)-Z-3’，其中，W选自由5’端帽、游离5’-三磷酸基团、游离5’-二磷酸基团、游离5’-单磷酸基团、游离5’-OH基团、以及所述5’端帽、所述5’-三磷酸基团、所述游离5’-二磷酸基团或所述游离5’-单磷酸基团的化学修饰类似物组成的组，X是可选的5’UTR序列，Y是可选的起始密码子，并且Z直接连接到编码序列并且选自由游离3’-OH基团、终止密码子和可选地通过3’UTR序列与poly(A)尾相连的终止密码子组成的组。本发明还涉及至少85％或更多具有与本发明的RNA相同的化学组成的RNA群，且本发明还涉及包含本发明的RNA的RNA群，其中存在至少1％的RNA比全长RNA短1个核苷酸。本发明的RNA和RNA群用于在细胞或生物体中或者在无细胞表达系统中表达由编码序列编码的氨基酸序列。本发明还涉及包含RNA或RNA群的药物组合物、疫苗以及诊断工具。
背景技术
合成信使RNA(mRNA)正被集中开发作为表达用于疫苗接种(即抗原的表达)和治疗的蛋白质的载体，例如蛋白质(如细胞因子或抗体)的表达、遗传疾病中缺陷或异常蛋白质的替代或使用例如CRISPR-CAS修复DNA。根据现有技术，mRNA是通过酶法在体外产生的：通常，模板DNA通过RNA聚合酶转录成RNA(体外转录的mRNA：ivt mRNA)，然后DNA由DNase降解，mRNA最终被poly-A-聚合酶多聚腺苷酸化(Tusup et al.,(2019)Chimia(Aarau)73(6),391-394)。mRNA的酶法生产是有效的、稳健的，并允许生产大量的治疗性mRNA。然而，它有两个主要缺点：(i)由于通过生物过程的生成，所产生的RNA通常被监管机构归类为基因治疗产品，以及(ii)mRNA的酶法生产通常需要将DNA转录成RNA的额外步骤，使该过程间接进行，因为还需要预先生成DNA模板。对于抗癌疫苗等目的，特别是当mRNA疫苗旨在触发针对突变的T细胞免疫时，mRNA可能相对较短，因为它只需要编码一个表位(可以短至3到8个氨基酸)。
发明内容
本发明的技术问题是提供克服酶法产生的RNA所遇到的上述问题的mRNA。
上述技术问题的解决方案是提供如权利要求以及本说明书和附图中所定义的本发明的实施例。
特别地，本发明提供了具有以下通式(1)的结构的完全化学合成的RNA(本文也称为“ChemRNA”)：
5’-W-X-Y-(编码序列)-Z-3’ (1)
其中，
W选自由5’端帽、游离5’-三磷酸基团、游离5’-二磷酸基团、游离5’-单磷酸基团、游离5’-OH基团、以及所述5’端帽、所述5’-三磷酸基团、所述游离5’-二磷酸基团或所述游离5’-单磷酸基团的化学修饰的类似物组成的组；
X可能存在或不存在，如果X存在，X为5’UTR序列；
Y可能存在或不存在，如果Y存在，Y为起始密码子；且
Z直接连接编码序列并且选自由游离3’-OH基团、终止密码子和可选地经由3’UTR连接到poly(A)尾的终止密码子组成的组。
本发明优选的ChemRNA具有根据以下式(2)至式(61)的结构中的一个：
5’-N7MeGppp-UTR-AUG-(编码序列)-stop-polyA-3’ (2)
5’-N7MeGppp-UTR-AUG-(编码序列)-stop-3’ (3)
5’-N7MeGppp-UTR-AUG-(编码序列)-3’ (4)
5’-N7MeGppp-UTR-(编码序列)-stop-polyA-3’ (5)
5’-N7MeGppp-UTR-(编码序列)-stop-3’ (6)
5’-N7MeGppp-UTR-(编码序列)-3’ (7)
5’-N7MeGppp-AUG-(编码序列)-stop-polyA-3’ (8)
5’-N7MeGppp-AUG-(编码序列)-stop-3’ (9)
5’-N7MeGppp-AUG-(编码序列)-3’ (10)
5’-N7MeGppp-(编码序列)-stop-polyA-3’ (11)
5’-N7MeGppp-(编码序列)-stop-3’ (12)
5’-N7MeGppp-(编码序列)-3’ (13)
5’-triP-UTR-AUG-(编码序列)-stop-polyA-3’ (14)
5’-triP-UTR-AUG-(编码序列)-stop-3’ (15)
5’-triP-UTR-AUG-(编码序列)-3’ (16)
5’-triP-UTR-(编码序列)-stop-polyA-3’ (17)
5’-triP-UTR-(编码序列)-stop-3’ (18)
5’-triP-UTR-(编码序列)-3’ (19)
5’-triP-AUG-(编码序列)-stop-polyA-3’ (20)
5’-triP-AUG-(编码序列)-stop-3’ (21)
5’-triP-AUG-(编码序列)-3’ (22)
5’-triP-(编码序列)-stop-polyA-3’ (23)
5’-triP-(编码序列)-stop-3’ (24)
5’-triP-(编码序列)-3’ (25)
5’-diP-UTR-AUG-(编码序列)-stop-polyA-3’ (26)
5’-diP-UTR-AUG-(编码序列)-stop-3’ (27)
5’-diP-UTR-AUG-(编码序列)-3’ (28)
5’-diP-UTR-(编码序列)-stop-polyA-3’ (29)
5’-diP-UTR-(编码序列)-stop-3’ (30)
5’-diP-UTR-(编码序列)-3’ (31)
5’-diP-AUG-(编码序列)-stop-polyA-3’ (32)
5’-diP-AUG-(编码序列)-stop-3’ (33)
5’-diP-AUG-(编码序列)-3’ (34)
5’-diP-(编码序列)-stop-polyA-3’ (35)
5’-diP-(编码序列)-stop-3’ (36)
5’-diP-(编码序列)-3’ (37)
5’-mP-UTR-AUG-(编码序列)-stop-polyA-3’ (38)
5’-mP-UTR-AUG-(编码序列)-stop-3’ (39)
5’-mP-UTR-AUG-(编码序列)-3’ (40)
5’-mP-UTR-(编码序列)-stop-polyA-3’ (41)
5’-mP-UTR-(编码序列)-stop-3’ (42)
5’-mP-UTR-(编码序列)-3’ (43)
5’-mP-AUG-(编码序列)-stop-polyA-3’ (44)
5’-mP-AUG-(编码序列)-stop-3’ (45)
5’-mP-AUG-(编码序列)-3’ (46)
5’-mP-(编码序列)-stop-polyA-3’ (47)
5’-mP-(编码序列)-stop-3’ (48)
5’-mP-(编码序列)-3’ (49)
5’-OH-UTR-AUG-(编码序列)-stop-polyA-3’ (50)
5’-OH-UTR-AUG-(编码序列)-stop-3’ (51)
5’-OH-UTR-AUG-(编码序列)-3’ (52)
5’-OH-UTR-(编码序列)-stop-polyA-3’ (53)
5’-OH-UTR-(编码序列)-stop-3’ (54)
5’-OH-UTR-(编码序列)-3’ (55)
5’-OH-AUG-(编码序列)-stop-polyA-3’ (56)
5’-OH-AUG-(编码序列)-stop-3’ (57)
5’-OH-AUG-(编码序列)-3’ (58)
5’-OH-(编码序列)-stop-polyA-3’ (59)
5’-OH-(编码序列)-stop-3’ (60)
5’-OH-(编码序列)-3’ (61)
其中：
polyA是poly(A)尾；
stop是终止密码子；
UTR是5’UTR；
triP是游离三磷酸基团；
diP是游离二磷酸基团；
mP是游离单磷酸基团。
如本文所定义，N7MeGppp是N7-甲基鸟苷三磷酸。
特别优选的是根据式(58)的本发明的ChemRNA。
其他特别优选的本发明的ChemRNA包括式(3)的ChemRNA。
在本发明进一步优选的实施例中，ChemRNA是式(15)的RNA。
在本发明的其它优选实施例中，ChemRNA具有根据式(39)的结构。
在本发明进一步优选的实施例中，ChemRNA具有根据式(51)的结构。
在本发明的进一步优选的实施例中，ChemRNA具有根据式(61)的结构。
在本发明的一个实施例中，RNA包含5’端帽、5’UTR、起始密码子、编码序列和终止密码子，如式(3)中进一步优选的细节中所述。一般而言，该本发明实施例的此类RNA可替代地由以下通用结构定义：
5’-端帽-5’UTR-(起始密码子)-(编码序列)-(终止密码子)-3’
终止密码子，如果存在，优选地选自UAA、UAG和UGA。
如果存在，本发明的RNA优选包含相对短的5’UTR序列。本发明中所使用的特别优选的5’UTR序列选自不超过10个核苷酸(nt)、更优选2nt至10nt的5’UTR序列，即，本发明中使用的高度优选的5’UTR序列所具有的长度为2nt、3nt、4nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt或10nt。
用于本发明的优选5’UTR序列的例子是，例如Elfakess和Dikstein(2008)PLoSONE 3(8),e3094中披露的。高度优选的5’UTR序列包括序列5’-AAG-3’。更具体地，本发明的RNA的5’UTR序列包含基序5’-AAG-3’并具有5nt的长度，其中，更优选的是，基序5’-AAG-3’直接在起始密码子之前。用于本发明的优选5’UTR序列是序列5’-ACAAG-3’。在使用该基序，特别优选5nt、6nt、7nt或8nt的5’UTR序列的其他实施例中，5’UTR也可包含该序列，其中，优选地，5nt序列5’-ACAAG-3’直接在起始密码子之前。
在本发明的其他实施例中，5’UTR选自WO 2017/167910 A1中公开的5’UTR序列。特别地，5’UTR优选分别包含序列5’-CGCCACC-3’或由序列5’-CGCCACC-3组成，其中，位置6处的C核苷酸(从5’端开始计数)可以被腺苷核苷酸取代，和/或位置7处的C核苷酸(从5’端开始计数)可以被鸟苷核苷酸取代，和/或位置5处的A核苷酸可以被鸟苷核苷酸取代。这种包含此类序列的特别优选的5’UTR序列选自：序列5’-CGCCACC-3’直接位于起始密码子之前的那些序列。在其他优选的实施例中，5’UTR分别包含序列5’-CNGCCACC-3’或由序列5’-CNGCCACC-3’组成，其中，N选自A、C、G和U，并且其中，位置7处的C核苷酸(从5’端开始计数)可以被A核苷酸取代，和/或位置8处的核苷酸(从5’端开始计数)可以被G核苷酸取代，和/或位置6的A核苷酸(从5’端开始计数)可以被G核苷酸取代。这种包含此类序列的此类5’UTR序列选自：序列5’-CNGCCACC-3’直接位于起始密码子之前的那些序列。
本发明的一个令人惊讶的发现在于，本文公开和描述的可用于表达编码序列的RNA不需要3’poly(A)尾。因此，本文公开的RNA分子的优选实施例在3’端不包含poly(A)尾。在本发明的其他实施例中，RNA在3’端含有poly(A)尾。如果存在poly(A)尾，则poly(A)尾优选相对较短。优选的poly(A)尾具有的长度为最多30nt(例如2nt至30nt)、更优选最多20nt(例如5nt至20nt)、甚至更优选最多15nt(例如5nt至15nt)、进一步优选最多10nt(例如5nt至10nt)。poly(A)尾的特别优选长度为5nt、10nt、15nt、20nt、25nt和30nt。
根据本发明的另一个甚至更令人惊讶的发现是，ChemRNA的优选实施例不需要用于表达编码序列(特别是在细胞或生物体中)的5’-端帽结构。
此外，另一个非常令人惊讶的发现是，本发明的ChemRNA在5’端也可以缺少用于表达编码序列的5’端磷酸基团(即，5’端基团是OH)。
本发明的另一个非常令人惊讶的发现是，ChemRNA甚至不需要用于表达编码序列的起始密码子和/或终止密码子。
此外，根据本发明的RNA及RNA群由于其完全化学生产过程可能不被视为基因治疗产品(参见Hinz et al.(2017)Methods in Mol.Biol.1499,203-222)，从而使程序更加简单快捷。
本发明优选的RNA是RNA寡核苷酸。本发明的RNA寡核苷酸优选具有不超过200nt的长度(即，由不超过200nt组成)，更优选长度为至多100nt，更优选至多80nt，甚至更优选至多70nt。本发明特别优选的寡核苷酸RNA具有24nt、25nt、26nt、27nt、28nt、29nt或30nt至200nt的长度，更优选24nt、25nt、26nt、27nt、28nt、29nt或30nt至120nt的长度，更优选24nt、25nt、26nt、27nt、28nt、29nt或30nt至100nt的长度。
还优选的是，RNA是单链的。
在本发明的其他实施例中，本文定义和公开的RNA也可以是部分或完全双链的。由于形成发夹的单链RNA中的自身互补序列段，本发明的部分双链RNA可以只包含双链结构的、形成双链部分或区域的一条链、或一个部分或区域。因此应理解，在由自身互补性产生的本发明的部分双链RNA的情况下，本发明的这种部分双链RNA也是单链RNA。本发明的其他部分双链RNA由多于一条、通常是两条具有互补序列的链组成，据此应理解，虽然本发明的RNA的式中仅显示一条链，但链的序列与本文各个实施例中所示的链是完全或部分互补是由本领域已知的RNA碱基配对的互补性规则确定的。由多于一条、通常是两条链形成的本发明的部分双链RNA可以采用任何形式，例如交错的双链、具有一个平头末端和具有突出粘性末端的一端的双链RNA、具有两个突出粘性末端的双链RNA(其中突出粘性末端由相同的链形成)等。根据本发明还考虑到双链RNA由多于两条链形成，例如其中存在两条链与第三条RNA链的不同区域互补的物种。在本发明的某些实施例中，RNA也可以是具有两个平头末端的完全双链。在某些实施例中，双链RNA(特别是由多于一条、优选两条单链组成的双链RNA)例如可用作提供单链的前体，单链通过所包含的编码序列编码肽。
本发明的完全或部分双链RNA还可以为RNA提供进一步的功能。在优选的实施例中，如上定义的本发明的双链RNA被考虑具有连接到本发明双链RNA的平末端的一条链上的游离5’三磷酸，从而其可以作为RIG-I的配体发挥作用。其他实施例涉及能够触发TLR的RNA(例如，长度为45bp或更长，通常为50bp或更长的本发明的双链RNA，可触发TLR3)。
本发明的RNA含有编码序列，并且优选用于在体外或体内细胞中或者在无细胞体外表达系统中表达编码序列。对于在无细胞表达系统中的应用，特别优选的是本发明的不具有5’端帽的RNA或含有本发明的缺少5’端帽的此类RNA的第一或第二RNA群。根据本发明，本文定义和公开的RNA也称为“编码RNA”。尽管本发明的RNA无需包含3’poly(A)尾和/或5’端帽和/或起始密码子和/或终止密码子，但本发明的RNA也表示为“mRNA”。
如本文所公开的RNA分子的编码序列没有特别限制。选择优选的编码序列使得RNA的总长度基本上符合如前所述的RNA寡核苷酸的总长度边界。优选的编码序列编码4至65个氨基酸。用于本发明的特别优选的编码序列相对较短，并且编码4至40个氨基酸。更优选地，编码序列编码8至30个氨基酸的氨基酸序列。
如以下更详细地概述的，由编码序列编码的优选的肽是源自癌症或肿瘤蛋白(本文也称为“肿瘤抗原”)或源自感染因子(例如优选病毒、细菌或真菌)的肽，例如优选的表位。
源自癌症或肿瘤的肽、相关蛋白、多肽或寡肽在本文中定义为“癌症肽”，并且在某些优选实施例中，可以具有至少一个与非癌症野生型序列的氨基酸序列不同的氨基酸。
由包含在本发明的RNA种类中的编码序列编码的进一步优选的肽是由自身免疫细胞所识别的组织的肽。
本发明的另一个优点在于，能够在精确核苷酸位置提供具有位点特异性化学修饰的mRNA，这在通过酶法合成制备的mRNA的情况下通常是不可能的。例如，可行的是，提供具有特定化学修饰(无论是在磷酸骨架、核糖还是碱基部分)的单个核苷酸。在优选的实施例中，RNA在单个核苷酸处具有化学修饰。优选的化学修饰存在于3’-末端核苷酸和/或5’-末端核苷酸。
因此，根据本发明的优选实施例，RNA包含至少一种化学修饰，即它包含至少一种化学修饰的核苷酸类似物。在本文中，“医学修饰”和“化学修饰的核苷酸类似物”是指与相应的规范的(即，未修饰的)核苷酸a、c、g和u相比，核苷酸分别被化学修饰。化学修饰可以在磷酸、核糖或核苷酸的碱基部分。应当理解，如在整个本说明书中所使用的，如果没有另外说明，术语“核苷酸”是指“核糖核苷酸”。修饰可以在化学合成过程中引入或通过酶(例如来自甲基化酶和脱氨酶家族)添加到ChemRNA上。酶修饰的另一个优选示例是通过使用Poly(A)聚合酶(例如来自大肠杆菌的Poly(A)聚合酶)培养ChemRNA而将Poly(A)添加到RNA的3’端，其中，ChemRNA优选具有根据式(3)、(6)、(9)、(12)、(15)、(18)、(21)、(24)、(27)、(30)、(33)、(36)、(39)、(42)、(45)、(48)、(51)、(54)、(57)或(60)的结构，特别优选具有式(3)、(15)、(39)或(51)的结构。
与规范的核苷酸相比，核苷酸类似物的化学修饰可以在核糖、磷酸和/或碱基部分。相对于稳定性增加的分子、特别是相对于RNA降解酶，核糖和/或磷酸部分的修饰是特别优选的。
核糖修饰的核糖核苷酸的优选示例是类似物，其中，选自H、OR、R、卤素、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN的基团取代2’-OH基团，其中，R为C1-C6烷基、烯基或炔基，卤素为F、Cl、Br或I。高度优选的核苷酸类似物是甲基化和氟化的核苷酸类似物，最优选2’-O-甲基和2’-F类似物。
如前所述，至少一种修饰的核糖核苷酸可以选自在碱基部分具有化学修饰的类似物。此类类似物的示例包括但不限于5-氨基烯丙基-尿苷、6-氮杂-尿苷、8-氮杂-腺苷、5-溴-尿苷、7-脱氮-腺苷、7-脱氮-鸟苷、N6-甲基-腺苷、5-甲基-胞苷、假尿苷、N1-甲基-假-尿苷、N1-甲基-腺苷、胸腺嘧啶和4-硫代尿苷。
骨架修饰的核糖核苷酸(其中相邻核糖核苷酸之间的磷酸酯基团被修饰)的示例是硫代磷酸酯基团。
根据本发明的含有修饰的核苷酸类似物的RNA的进一步优选实施例选自其中修饰位于RNA的3’端的RNA。
优选的修饰包括下表中所示的修饰之一(左栏：修饰的核苷酸类似物的名称；右栏：缩写)，各个核苷酸类似物的最优选位置是3’末端：
2’-氧甲基腺苷A mA
2’-氧甲基胞嘧啶C mC
2’-氧甲基鸟苷G mG
2’-氧甲基尿苷U mU
2’-氟脱氧腺苷(2’-F-A) 2-F-A
2’-氟脱氧腺苷(2’-F-C) 2-F-C
2’-氟脱氧鸟苷(2’-F-G) 2-F-G
2’-氟脱氧尿苷(2’-F-U) 2-F-U
丙炔dC脱氧胞嘧啶 pdC
丙炔dU脱氧尿苷 pdU
L-DNA
L-RNA
反向dA(5’-5’或3’-3’连接) inv-dA
反向dC(5’-5’或3’-3’连接) inv-dC
反向dG(5’-5’或3’-3’连接) inv-dG
反向dT(5’-5’或3’-3’连接) inv-dT
反向rA(5’-5’或3’-3’连接) rev-rA
反向rC(5’-5’或3’-3’连接) rev-rC
反向rG(5’-5’或3’-3’连接) rev-rG
反向rU(5’-5’或3’-3’连接) rev-rU
反向2’，3’双脱氧dT(5’反向ddT) ddT-5’
硫代磷酸酯(PS)键 *
甲基磷酸酯 MP
磷酸化 P
C3间臂 SPC3
本发明的RNA还可以包含5’端帽或游离5’-磷酸基团的化学类似物，即，游离5’-三磷酸、游离5’-二磷酸或5’-单磷酸，如包含在根据式(1)的基团W的定义中。典型且优选的含磷酸根的5’基团的类似物是硫代磷酸根，其中，优选的硫代磷酸根中每个磷酸基团含有一个硫原子。应当理解，具有多于一种磷酸根的那些5’含磷酸根的基团(即，游离5’-二磷酸基团、游离5’-三磷酸基团或5’端帽)可以包含多于一种硫代磷酸根，例如，优选两个硫代磷酸根部分。将硫代磷酸根分别引入5’端帽和游离5’-磷酸基团是本领域已知的。对于含有硫代磷酸根的5’端帽结构，例如参考Strenkowska et al.(2016)Nucleic Acids Research 44(20),pages 9578-9590。
本发明的RNA的化学合成方案在本领域中通常是已知的，并且通常通过基于亚磷酰胺方法的固相程序进行(参见例如，Beaucage和Iyer(1992)Tetrahedron Vol.48.No.12,pp.2223～2311；Beaucage和Reese(2009)Curr.Protoc.Nucleic Acid Chem.38:2.16.1-2.16.31)。
本发明的另一主题是(第一)RNA群，其中，所述群中至少85％、优选至少90％、更优选至少95％的RNA具有与如上定义的RNA相同的化学组成，其中，RNA可以理解为被定义为完全化学合成的，或者可以如前所述定义的但没有“完全化学合成”的明确属性。
本发明的另一个方面是另一(第二)RNA群，其包含如上文定义的具有n nt全长的RNA以及至少1％如下定义的RNA：具有与全长的RNA的化学组成具有至少95％、优选至少96％、更优选至少97％、还更优选至少98％、甚至更优选至少99％的同一性的化学组成但具有(n-1)nt的长度，其中，长度(n-1)的RNA的化学组成与全长的RNA的化学组成的同一性的百分比是相对于长度n的全长的RNA的(n-1)个核苷酸的化学组成而言的(即，以至少1％的量存在的具有(n-1)个nt的RNA与长度为n的全长的RNA相比短一个核苷酸，但除此之外，核苷酸序列与长度n的全长的RNA的核苷酸序列具有至少为95％、优选地至少96％、更优选至少97％、还更优选至少98％、甚至更优选至少99％的同一性)。在进一步优选的实施例中，该RNA群还包含至少1％的如下定义的RNA：具有与全长的RNA的化学组成具有至少93％、优选至少95％、更优选至少96％、甚至更优选至少97％、还更优选至少98％、甚至更优选至少99％的同一性的化学组成但具有(n-2)的长度，其中，长度(n-2)的RNA的化学组成与全长的RNA的化学组成的同一性的百分比是相对于长度n的全长的RNA的(n-2)个核苷酸的化学组成而言的(即，以至少1％的量存在的具有(n-2)个nt的RNA与长度为n的全长的RNA相比短两个核苷酸，但除此之外，核苷酸序列与长度n的全长的RNA的核苷酸序列具有至少93％、优选至少95％、更优选至少96％、甚至更优选至少97％、还更优选至少98％、甚至更优选至少99％的同一性)。在更进一步优选的实施例中，RNA群进一步包含至少1％的如下定义的RNA：具有与全长的RNA的化学组成具有至少93％、优选至少95％、更优选至少96％、甚至更优选至少97％、还更优选至少98％、甚至更优选至少99％的同一性的化学组成但具有(n-3)的长度，其中，长度(n-3)的RNA的化学组成与全长的RNA的化学组成的同一性的百分比是相对于长度n的全长的RNA的(n-3)个核苷酸的化学组成而言的(即，以至少1％的量存在的具有(n-3)个nt的RNA与长度为n的全长的RNA相比短一个核苷酸，但除此之外，核苷酸序列与长度n的全长的RNA的核苷酸序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少96％、甚至更优选至少97％、还更优选至少98％、甚至更优选至少98.5％的同一性)。同样在本发明的这个实施例中，RNA可以被理解为被定义为完全化学合成的，或者可以被定义为如前所述，但没有“完全化学合成”的明确属性。根据本发明，关于如本文公开的第二RNA群的“n”的所有引用应理解为“n”是整数，例如至少10的整数，在本发明的某些实施例中为至少20，在本发明的其他优选实施例中为至少30、优选20至200、更优选30至200、甚至更优选30至120个、还更优选30至100。
本发明还涉及药物组合物，其包含本文定义的RNA或本文定义的第一RNA群或本文定义的第二RNA群，任选地与一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂组合。优选地，药物组合物是以疫苗的形式，该疫苗包含本文定义的RNA或本文定义的第一RNA群或本文定义的第二RNA群。
为了进一步提高有效性，根据本发明的疫苗优选包含一种或多种佐剂，优选实现疫苗接种的协同作用。本文中的“佐剂”包括促进免疫应答的任何化合物。取决于佐剂的不同类型，在这方面可能有多种机制。例如，允许DC成熟的化合物，例如脂多糖或CD40配体形成第一类合适的佐剂。通常，任何影响免疫系统的“危险信号”(LPS、GP96、dsRNA等)或细胞因子(例如GM-CSF)类型的试剂都可以用作能够使免疫应答增强和/或以受控的方式受影响的佐剂。CpG寡脱氧核苷酸也可以任选地用于这种情况，尽管要考虑它们在某些情况下发生的副作用。特别优选的佐剂是细胞因子，例如单核因子、淋巴因子、白细胞介素或趋化因子，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、INFα、INF-γ、GM-CFS、LT-α或生长因子，例如hGH。其他已知的佐剂是氢氧化铝、弗氏佐剂(Freund'sadjuvant)或诸如
Figure BDA0003521477380000121
最优选
Figure BDA0003521477380000122
ISA51的油。脂肽(例如Pam3Cys)也特别适合用作本发明的疫苗和/或药物组合物中的佐剂。
在一个优选的实施例中，根据本发明的疫苗也可以与另一种治疗试剂结合使用。本发明的疫苗可以与其他治疗协同作用，其他治疗例如是用于癌症患者的化学治疗药物、免疫检查点抑制剂或用于HIV患者的三联疗法或氯喹、用于对抗疟疾感染且已知可改善交叉启动的药物。
本发明的疫苗组合物用于基因疫苗接种，其中通过向生物体中引入如本文公开的RNA或第一或第二RNA群来刺激免疫应答，其中RNA可以以裸露形式(即，特别是未复合形式)施用或包含在例如与阳离子、脂质体或聚合物复合的颗粒中，或进入细胞中(例如，通过体外电穿孔，随后通过依赖针或无针装置的过继转移或直接注射)。本发明的疫苗组合物可以全身注射，优选通过静脉内或皮下注射以及在所需的mRNA递送部位局部注射，例如注射到肿瘤、肌肉、真皮或注射到淋巴节点中。其他优选的给药途径是鼻内给药和口服给药。在一个替代实施例中，制备来自待治疗患者的抗原呈递细胞如DC(或先从其中分离或至少富集DC的祖细胞群样PBMC)(通常来自取自患者的血样)，其中引入了本发明的RNA或本发明的RNA群。任选地，在温育步骤之后，将负载RNA的DC重新引入患者体内，优选通过静脉内给药。
根据本发明的疫苗适用于治疗癌症和肿瘤。优选地，本发明的RNA或本发明的第一或第二RNA群中的RNA包含编码肿瘤特异性抗原(TSA)的表位的编码序列。表位由RNA/RNA群编码的肿瘤抗原的具体例子包括707-AP、AFP、ART-4、BAGE、β-连环蛋白/m、Bcr-abl、CAMEL、CAP-1、CASP-8、CDC27/m、CDK4/m、CEA、CT、Cyp-B、DAM、ELF2M、ETV6-AML1、G250、GAGE、GnT-V、Gp100、HAGE、HER-2/neu、HLA-A*0201-R170I、HPV-E7、HSP70-2M、HAST-2、hTERT(或hTRT)、iCE、KIAA0205、LAGE、LDLR/FUT、MAGE、MART-1/Melan-A、MC1R、肌球蛋白/m、MUC1、MUM-1、-2、-3、NA88-A、NY-ESO-1、p190 minor bcr-abl、Pml/RAR.α.、PRAME、PSA、PSM、RAGE、RU1或RU2、SAGE、SART-1或SART-3、TEL/AML1、TPI/m、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2和WT1。关于源自肿瘤抗原的MHC相关表位的特定序列，参见https://syfpeithi.de。本发明的RNA中特别优选的编码序列编码HLA-A*02:01相关的表位，更具体地，来自MAGE-A1的KVLEYVIKV(SEQ IDNO:1)、来自MAGE-A3的FLWGPRALV(SEQ ID NO:2)、来自HER-2/neu的HLYQGCQVV(SEQ ID NO:3)和YLVPQQGFFC(SEQ ID NO:4)、来自MUC1的APDTRPAP(SEQ ID NO:5)和/或NLTISDVSV(SEQID NO:6)。在本发明的其他优选实施例中，RNA的编码序列编码在肿瘤中发现的包含一个或多个突变的肿瘤表位。这种优选的肿瘤表位的具体示例例如包含在Sahin et al.(2017)Nature 547,222-226，更具体地说，是在补充表1的名为“AA序列(AA sequence)”、“预测的MHC I表位(Predicted MHC I epitope)”和“预测的MHC II表位(Predicted MHC IIepitope)”的列中和该公开出版物的补充表2的“氨基酸序列(Amino acid sequence)”的列中，这些序列是本文明确提及的。癌肽也可以是例如来自TCR或免疫球蛋白链的高变环的表位，特别是那些对克隆型淋巴瘤或白血病细胞具有特异性的表位。
本发明的疫苗还可用于对抗传染病。将由本发明实施例的编码序列编码的优选表位包含在引以下疾病的感染因子中：艾滋病(HIV)，甲型、乙型或丙型肝炎，疱疹，带状疱疹(水痘)，德国麻疹(风疹病毒)，黄热病，登革热等虫媒病毒，感冒病毒，冠状病毒，出血性传染病(马尔堡病毒或埃博拉病毒)，细菌性传染病(例如军团病(军团菌)，胃溃疡(螺杆菌)，霍乱(弧菌)，大肠杆菌、葡萄球菌、沙门氏菌或链球菌(破伤风)；原生动物病原体的感染(如疟疾、昏睡病、利什曼病)；弓形虫病，即，分别由疟原虫、锥虫、利什曼原虫和弓形虫引起的感染；或真菌感染，例如由新型隐球菌、荚膜组织胞浆菌、免疫球孢子菌、皮炎芽生菌或白色念珠菌引起的真菌感染。本发明的RNA的优选实施例编码来自这些病原体的HLA-A*02:01呈递的表位，例如：源自HIV-1的表位优选地选自PLTFGWCYKL(SEQ ID NO:7)、SLYNTVATL(SEQID NO:8)、TLNAWVKVV(SEQ ID NO:9)、RGPGRAFVTI(SEQ ID NO:10)、AFHHVAREL(SEQ ID NO:11)、VLEWRFDSRL(SEQ ID NO:12)、ILKEPVHGV(SEQ ID NO:13)、VIYQYMDDL(SEQ ID NO:14)、KYTAFTIPSI(SEQ ID NO:15)和KLTPLCVTL(SEQ ID NO:16)；或源自HPV11的表位，优选地例如RLVTLKDIV(SEQ ID NO:17)；或源自HPV16的表位优选地选自TIHDIILECV(SEQ ID NO:18)、YMLDLQPETT(SEQ ID NO:19)、LLMGTLGIV(SEQ ID NO:20)或TLGIVCPI(SEQ ID NO:21)。优选表位的进一步示例包括流感病毒的表位，更优选甲型和乙型流感亚型，特别是源自甲型流感的表位，和冠状病毒，更优选源自SARS-CoV-1、SARS-CoV-2和MERS-CoV的表位。肽、更优选病原菌的表位的优选示例是结核分枝杆菌的肽、更优选表位。如在肿瘤抗原的情况中一样，由根据本发明的RNA的编码序列编码的表位的许多特定序列是本领域技术人员已知的，并且可以从可从https://syfpeithi.de获得的数据库中选择。
对于本文明确公开的以及分别通过参考出版物和公共表位数据库公开的所有特定表位，应理解，根据某些实施例，本发明的RNA的编码序列可以编码包含特定表位序列、特别是特定MHC I类表位序列或特定MHC II类表位序列的序列。在其他实施例中，根据本发明的RNA的编码序列由编码这种特定表位的核苷酸序列组成。
根据本发明的疫苗可以与氯喹联合使用，氯喹是一种增加交叉呈递从而诱导抗原特异性效应T细胞的药物化合物。
本发明的实施例，特别是RNA、第一RNA群和第二RNA群可用作药物。本发明的实施例，特别是RNA、第一RNA群和第二RNA群特别适用于治疗癌症和肿瘤，以及治疗和/或预防传染病，例如病毒、原核和真菌感染因子引起的感染。
本发明还提供如本文所公开的RNA和/或第一RNA群和/或第二RNA群在制备用于治疗癌症和肿瘤的药物中的用途。本发明还提供如本文所公开的RNA和/或第一RNA群和/或第二RNA群在制备用于治疗和/或预防传染病的药物中的用途。
本发明还提供治疗受试者的癌症或肿瘤的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的根据本发明的药物组合物。
本发明还提供了一种治疗和/或预防受试者的传染病的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的本发明的疫苗。
本发明的进一步主题是包含本发明的至少一种RNA和/或第一RNA群和/或第二RNA群的诊断试剂盒。优选地，各RNA编码感染因子的肽，例如，优选地，病毒、细菌或真菌的肽。优选的肽是这种感染因子的表位。上文就本发明的疫苗概述了特定的和优选的表位的示例。
诊断试剂盒优选地进一步包含至少一种转染试剂(例如脂质体试剂)，和/或用于执行检测和/或分离方法的设备或设备部件(例如用于电穿孔的电极)。
本发明还涉及一种用于诊断癌症、自身免疫病、传染病和/或在怀疑患有所述疾病和/或被所述感染因子感染的受试者中引起这种疾病的感染因子的存在的方法，包括步骤：用至少一种RNA和/或至少一种第一RNA群和/或至少一种第二RNA群刺激受试者的T细胞群，所述至少一种RNA和/或至少一种第一RNA群和/或至少一种第二RNA群包含编码所述癌症、来自自身免疫疾病或感染因子的靶向组织的肽、优选表位的编码序列，以及检测对所述肽、优选所述表位特异的T细胞的存在。在本发明的上下文中，“T细胞群”是受试者的包含T细胞的细胞群。典型的T细胞群是从受试者获得的PBMC。
刺激T细胞的步骤优选包括以下步骤：用包含编码所述感染因子的肽(优选所述感染因子的表位)的编码序列的至少一种RNA和/或至少一种第一RNA群和/或至少一种第二RNA群转染受试者的细胞群，以及检测对所述肽(优选所述表位)有特异性的T细胞的存在。转染后，细胞通常在适当条件下培养优选1至30的时间段。
受刺激的T细胞的检测通常涉及以已知方式对培养物进行FACS分析，优选分析对待检测抗原特异的CD3+CD4+或CD3+CD8+T细胞。或者，T细胞分泌的细胞因子可用于评估它们是否受到ChemRNA编码的肽的刺激(ELISA或ELISpot以测量例如白细胞介素-2(IL-2)或干扰素-γ(IFN-γ)生产)。
对特定抗原(优选肿瘤或癌症抗原)特异的T细胞的刺激也可用于如已经提及的用于治疗肿瘤和癌症的方法(以及根据本发明的RNA或RNA群的用途)中。在某些实施例中，用适当的癌肽转染从患有癌症或肿瘤的受试者获得的T细胞，即，通常如上所述的T细胞群，优选地通过FACS检测和富集阳性T细胞，并将富集的抗癌肽刺激的T细胞回注到患有癌症或肿瘤疾病的受试者中。优选地，检测和富集的T细胞在被重新注射入受试者之前进行扩增。适宜的扩增技术在本领域中是已知的。上述方法还可用于刺激可用于控制自身免疫性疾病的特异性调节性T细胞(Treg)。
关于所有和任何公开的、定义的和描述的使用具有如本文定义的结构的RNA的应用、用途和方法，本发明还涉及这样的应用、用途和方法，其中RNA是与以上定义的完全化学合成的RNA具有相同或基本相同的结构的酶法合成的RNA，除了RNA是完全或基本上酶法制备的。RNA的酶法合成方法是本领域已知的。通常使用诸如T7或Sp6 RNA聚合酶的RNA聚合酶，并且包括试剂盒在内的各种方案可从各种供应商商购获得(例如，New EnglandBiolabs Inc.,Ipswich,MA,USA；Promega Corp,Madison,WI,USA；和其他各种试剂盒)
附图说明
附图示出了：
图1示出了用指定试剂转染的仅OT1小鼠脾细胞(图1A)或OT1小鼠脾细胞加B16细胞(图1B)在培养18小时后，在细胞上清液中测量的IL-2释放的图示。
图2示出了用指定试剂转染的仅OT1小鼠脾细胞(图2A)或OT1小鼠脾细胞加B16细胞(图2B)在培养18小时后，在细胞上清液中测量的IFN-γ释放的图示。
图3示出了用指定试剂转染的OT1小鼠脾细胞在培养18小时后，在细胞上清液中测量的IL-2释放的图示，其中，图3A示出了用未处理的RNA获得的结果，图3B示出了用酶法多腺苷酸化的RNA获得的结果。试剂如下：封端的5n SIINFEKL：5’-N7-MeGppp,7mGppp-acaagAUGaguauaaucaacuuugaaaaacugUAA-3’(SEQ ID NO:22)；ppp 5n SIINFEKL：5’-ppp-acaagAUGaguauaaucaacuuugaaaaacugUAA-3’(SEQ ID NO:22)；p 5nSIINFEKL：5’-p-acaagAUGaguauaaucaacuuugaaaaacugUAA-3’(SEQ ID NO:22)；OH 5n SIINFEKL：5’-OH-acaagAUGaguauaaucaacuuugaaaaacugUAA-3’(SEQ ID NO:22)；Kif18b封端的寡核苷酸：5’-N7-MeGppp，7mGppp-acaagAUGuuccaggaauuuguugacugggaaaacguuUAA-3’(SEQ ID NO:23)。
图4示出了用指定试剂转染的OT1小鼠脾细胞在培养44小时后，在细胞上清液中测量的IL-2释放的图示。试剂如下：封端的5n UTR：5’-N7-MeGppp,7mGppp-acaagAUGaguauaaucaacuuugaaaaacugUAA-3’(SEQ ID NO:22)；3P 5nUTR：5’-ppp-acaagAUGaguauaaucaacuuugaaaaacugUAA-3’(SEQ ID NO:22)；P5n UTR：5’-p-acaagAUGaguauaaucaacuuugaaaaacugUAA-3’；OH 5n UTR：5’-OH-caagAUGaguauaaucaacuuugaaaaacugUAA-3’(SEQ ID NO:24)；Min SIINFEKL：5’-AUGAGUAUAAUCAACUUUGAAAAACUG-3’(SEQ ID NO:25)；No STOP：5’-ACAAGAUGAGUAUAAUCAACUUUGAAAAACUG-3’(SEQ ID NO:26)；No AUG：5’-AGUAUAAUCAACUUUGAAAAACUG-3’(SEQ ID NO:27)；Kif18b封端的寡核苷酸：5’-N7-MeGppp，7mGppp acaagAUGuuccaggaauuuguugacugggaaaacguuUAA-3’(SEQ ID NO:23)。
图5示出了用指定试剂转染的OT1小鼠脾细胞在培养24小时后，在细胞上清液中测量的IL-2释放的图示。试剂如下：封端的5n UTR：5’-N7-MeGppp，7mGppp-acaagAUGaguauaaucaacuuugaaaaacugUAA-3’(SEQ ID NO:22)；3P 5nUTR：5’-ppp-acaagAUGaguauaaucaacuuugaaaaacugUAA-3’(SEQ ID NO:22)；P5n UTR：5’-p-acaagAUGaguauaaucaacuuugaaaaacugUAA-3’(SEQ ID NO:22)；OH 5n UTR：5’-OH-caagAUGaguauaaucaacuuugaaaaacugUAA-3’(SEQ ID NO:24)；Min SIINFEKL：5’-AUGAGUAUAAUCAACUUUGAAAAACUG-3’(SEQ ID NO:25)；No STOP：5’-ACAAGAUGAGUAUAAUCAACUUUGAAAAACUG-3’(SEQ ID NO:26)；No AUG：5’-AGUAUAAUCAACUUUGAAAAACUG-3’(SEQ ID NO:27)；Kif18b封端的寡核苷酸：5’-N7-MeGppp，7mGppp-acaagAUGuuccaggaauuuguugacugggaaaacguuUAA-3’(SEQ ID NO:23)。
图6示出了在未转染RNA(图6A)、用编码流感病毒表位GILGFVFTL(SEQ ID NO:30)(其前面是蛋氨酸)的RNA Oligo Flu matrix(5’OH-AUGGGGAUUUUGGGGUUUGUGUUCACGCUC-3’；SEQ ID NO:28)转染(图6B)、以及用编码CMV表位NLVPMVATV(SEQ ID NO:33)(其之前是蛋氨酸)的RNAOligo CMV pp65(5-OH AUGAACCUGGUGCCCAUGGUGGCUACGGUU-3’；SEQ ID NO:31)转染的健康供体的PBMC培养物在培养7天后的FACS分析的图示。
图7示出了未转染RNA(图7A)、用编码流感病毒表位GILGFVFTL(SEQ ID NO:30)(其前面是蛋氨酸)的RNA Oligo Flu matrix(5’OH-AUGGGGAUUUUGGGGUUUGUGUUCACGCUC-3’；SEQ ID NO:28)转染(图7B)、以及用编码CMV pp65表位MNLVPMVATV(SEQ ID NO:32)(其前面是蛋氨酸)的RNA Oligo CMV pp65(5-OH AUGAACCUGGUGCCCAUGGUGGCUACGGUU-3’；SEQ IDNO:31)转染(图7C)的健康供体的PBMC培养物在培养14天后的FACS分析的图示的。图7D示出了在没有RNA转染的对照培养物的情况下，前向散射和侧向散射中淋巴细胞以及CD3+和CD4+群的设门策略。图7E为设门后无RNA培养物的点图分析，图7F为设门后转染Oligo Flumatrix RNA的培养物的点图分析，图7G为设门后转染Oligo CMV pp65 RNA的培养物的点图分析。
图8示出了用指定试剂转染的OT1小鼠脾细胞在培养40小时后，在细胞上清液中测量的IL-2释放的图示。试剂如下：SIINFEKL-CF：5’-AUGAGUAUAAU[2’-F-C]AA[2’-F-C]UUUGAAAAA[2’-F-C]UG-3’(其中2’-F-C表示2’-氟脱氧胞嘧啶；SEQ ID NO:25)；SIINFEKL：5’-AUGAGUAUAAUCAACUUUGAAAAACUG-3’(SEQ ID NO:25)。
本发明通过以下非限制性实施例进一步说明。
具体实施例
示例1
以下RNA寡核苷酸由商业供应商(Bio-Synthesis,Inc.,Lewisville，TX，USA)使用常规寡核苷酸合成化学合成：
5’-ACAAGAUGGAGAGUAUAAUCAACUUUGAAAAACUGUAA-3’(SEQ ID NO:22；起始和终止密码子如下划线所示)
基于Sekine等人((1996)J.Org.Chem.61,4412-4422)的方法化学生成5’端帽，产生了以下结构(起始和终止密码子如下划线所示)：
5’-N7-MeGppp-ACAAGAUGGAGAGUAUAAUCAACUUUGAAAAACUGUAA-3’(SEQ ID NO:22)(“SIINFEKL ChemRNA”)
该编码序列编码氨基酸序列MESIINFEKL，该氨基酸序列含有卵清蛋白的表位SIINFEKL(卵清蛋白中的位置257至264；UniProt Acc.No.P01012)。
在另一个实施例中，制备了具有上述相同序列的、完全化学合成的RNA，但具有3’-(A)20尾(同样，起始密码子和终止密码子以大写字母显示)：
5’N7-MeGppp-ACAAGAUGGAGAGUAUAAUCAACUUUGAAAAACUGUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’(SEQ ID NO:35)
在比较例(“SIINFEKL ChemRNA Poly-A”)中，根据制造商的说明，使用市售酶(大肠杆菌poly(A)聚合酶，目录号M0276，New England Biolabs Inc.,Ipswich,MA,USA)在ATP存在下通过与poly-A-聚合酶一起培养2小时，使上述没有poly(A)尾的RNA(SIINFEKLChemRNA)多聚腺苷酸化。
使用以下RNA作为对照：
阳性对照：酶法制备的编码卵清蛋白的mRNA(Trilink Biotechnologies,LLC,SanDiego,CA,USA)。
阴性对照：酶法制备的编码荧光素酶的mRNA(在发明人实验室制备)。
使用lipofectamine试剂MessengerMax(Thermo Fischer Scientific Corp,Waltham MA,USA)，通过在每个培养孔中混合200ng的RNA和400ng的MessengerMax或者混合20ng的RNA和40ng的MessengerMax或者混合2ng的RNA和4ng的MessengerMax，配制RNA。根据MessengerMax试剂的制造商说明，通过在每孔中加入在100μl培养基中的100000个脾细胞(仅脾细胞)或通过每孔中加入在100μl培养基中的100000个脾细胞中以及100μl培养基中的50000个B16细胞(脾细胞加B16细胞)，将混合物分别转染到单独的RAG2 KO C57Bl/6小鼠OT1脾细胞和所述脾细胞加同源B16肿瘤细胞中。
培养18小时后，使用市售测定实验(ELISA MAXTM标准组小鼠IFN-γ和ELISA MAXTM标准组小鼠IL-2，均来自BioLegend Inc,San Diego,CA，USA)分别测定IFN-γ和IL-2。当T淋巴细胞被激活时，即当它们识别H-2Kb小鼠I类分子上的SIINFEKL肽时，细胞因子由OT1细胞产生并释放在培养基中。结果如图1(IL-2释放；A：仅脾细胞；B：脾细胞加B16细胞)和图2(IFN-γ释放；A：仅脾细胞；B：脾细胞加B16细胞)所示。
图1和2示出了完全化学合成的RNA SIINFEKL ChemRNA分别由OT1细胞产生强烈的IL-2和IFN-γ释放。产生的信号比阳性对照OVA mRNA(酶法合成的编码全长卵清蛋白的mRNA)产生的信号更强。用poly-A聚合酶处理SIINFEKL ChemRNA不会提高化学合成的寡核苷酸的功效。此外，非常令人惊讶的是，要产生强烈的细胞因子反应是不需要poly(A)尾的。
示例2
以下RNA由商业供应商(分别为Bio-Synthesis,Inc.,Lewisville,TX,USA或Microsynth AG,Balgach,Switzerland)通过化学合成制备，并在需要时按实施例1中的所述的进行封端：
在以下序列中，大写字母分别表示起始密码子和终止密码子。构建体包含直接在起始密码子之前的5’UTR序列(acaag)。
(a)封端的5n SIINFEKL：5’-N7-MeGppp,7mGppp-acaagAUGaguauaaucaacuuugaaaaaacugUAA-3’(编码如上文实施例1中所述的SIINFEKL表位)。
因此，该构建体包含5’端帽结构，但没有poly(A)尾(也参见实施例1)
(b)ppp 5n SIINFEKL：5’-ppp-acaagAUGaguauaaucaacuuugaaaaacugUAA-3’(SEQID NO:22；编码如上文实施例1所述的SIINFEKL表位)。
该构建体缺少5’端帽结构和poly(A)尾。该构建体在5’端有一个三磷酸基团(表示为5’-ppp)。
(c)p 5n SIINFEKL：5’-p-acaagAUGaguauaaucaacuuugaaaaacugUAA-3’(SEQ IDNO:22；编码如上文实施例1所述的SIINFEKL表位)。
该构建体缺少5’端帽结构和poly(A)尾。该构建体在5’端有一个单磷酸基团(表示为5’-p)。
(d)OH 5n SIINFEKL：5’-OH-acaagAUGaguauaaucaacuuugaaaaacugUAA-3’(SEQ IDNO:22；如上文实施例1所述编码SIINFEKL表位)；
该构建体缺少5’端帽，甚至在5’末端核糖的C-5’处也没有磷酸根，因此仅带有5’-OH基团。此外，该构建体缺少poly(A)尾。
(e)Kif18b封端寡核苷酸：5’-N7-MeGppp,7mGppp-acaagAUGuuccaggaauuuguugacugggaaaacguuUAA-3’(SEQ ID NO:23；编码突变的抗驱动蛋白家族成员18b的MFQEFVDWENV(SEQ ID NO:34))。
寡核苷酸在此用作阴性对照。
卵清蛋白mRNA作为阳性对照。没有转染任何RNA的仅脾细胞用作另一阴性对照。
如实施例1中所述，用上述寡核苷酸转染小鼠OT1脾细胞(每孔100μl中100000个细胞)，不同之处在于每孔分别使用200ng、20ng和5ng的RNA。
在进一步的实验中，RNA(a)、(c)和(e)如实施例1中所述被多聚腺苷酸化，然后以如上所述的量(如ChemRNA的量，不考虑添加的poly(A))尾的附加重量)用于转染。
将细胞温育18小时，并如实施例1所述测量培养上清液中的IL-2。
结果显示在图3A(无多腺苷酸化的RNA)和图3B(多腺苷酸化的构建体(a)、(c)和(e))中。
非常令人惊讶的是，与全长卵清蛋白mRNA相比，所有构建体(a)至(d)都通过OT1脾细胞更高释放IL-2。因此，即使本发明的RNA缺乏5’-端帽和poly(A)尾，它也会在脾细胞中表达并导致强烈的IL-2表达。更令人惊讶的是，在RNA只有一个5’-三磷酸或甚至在5’-末端核苷酸处没有磷酸化时恰好是这种情况。如图3B所示，与相应的非多聚腺苷酸化的RNA相比，添加短的poly(A)尾在较低量的测试构建体下提供稍高的IL-2。
示例3
为了进一步阐明RNA是否具有更少结构要求(这通常归因于mRNA在免疫细胞中引发IL-2反应)，由商业供应商(Microsynth AG,Balgach,Switzerland)合成了其他构建体：
(f)Min SIINFEKL：5’-AUGAGUAUAAUCAACUUUGAAAAACUG-3’(SEQ ID NO:25；编码上述如实施例1中所述的SIINFEKL表位)。
除了5’末端的端帽或磷酸基团(为OH)和poly(A)尾外，该构建体还缺少5’UTR序列，甚至没有终止密码子。
(g)NoSTOP：5’-ACAAGAUGAGUAUAAUCAACUUUGAAAAAC UG-3’(SEQ ID NO:26；编码上述如实施例1中所述的SIINFEKL表位)。
该构建体除了包含5’UTR ACAAG以外，对应于构建体(6)。
(h)NoAUG：5’-AGUAUAAUCAACUUUGAAAAACUG-3’(SEQ ID NO:27；编码上述如实施例1中所述的SIINFEKL表位)。
该构建体(h)是绝对最小ChemRNA，因为其仅由指定表位的编码序列组成(其在5’端没有端帽结构或磷酸基团，因此连接到5’-末端核苷酸的5’-C的基团是OH)。其没有规范的起始密码子。
使用实施例1中概述的方法，但使用200ng、20ng或5ng的RNA，将构建体(a)至(h)转染到OT1小鼠脾细胞中。培养44小时后，如实施例1中所概述的，测量培养上清液中的IL-2水平。结果如图4所示。完全出乎意料的是，构建体(f)、(g)甚至(h)(即没有起始密码子的编码序列)也导致OT1细胞的IL-2释放明显高于阴性对照，甚至高于阳性对照：卵清蛋白mRNA。
重复实验，但在24小时后测量IL-2，结果如图5所示，证实了培养44小时后获得的结果。有趣的是，构建体(f)(其特征在于仅具有起始密码子但没有真正的mRNA的其他属性)在培养24小时后在200ng时产生最高的IL-2浓度。
示例4
进一步研究了用于表达肽、尤其是寡肽(优选感染因子和癌肽的表位)的本发明的RNA是否也在人类细胞中提供此类肽的表达。
作为用于表达病毒肽的示例性构建体，以下构建体由商业供应商(MicrosynthAG,Balgach,Switzerland)使用化学合成制备：
(i)Oligo Flu matrix：5-OH-AUGGGGAUUUUGGGGUUUGUGUUCACGCUC-3’(SEQ ID NO:28)，编码MGILGFVFTL(SEQ ID NO:29)，即，流感病毒M肽GILGFVFTL(SEQ ID NO:30)，通常用于刺激人类流感特异性CD8+T细胞。
(j)Oligo CM pp65：5’-OH AUGAACCUGGUGCCCAUGGUGGCUACGGUU-3’(SEQ ID NO:31)，编码MNLVPMVATV(SEQ ID NO:32)，即，巨细胞病毒(CMV)pp65肽(NLVPMVATV；SEQ IDNO:33)，通常用于刺激人类CMV特异性CD8+T细胞。
两种构建体都仅由一个起始密码子(在5’末端没有端帽且没有磷酸基团)和编码序列(没有终止密码子，没有poly(A)尾)组成。
PBMC是从健康的HLA-A2自愿者阳性供体的血液中分离出来的。1000万个PBMC用于启动三个每个在10ml完全培养基中的培养物。对于转染，使用lipofectamine试剂MessengerMax(Thermo Fischer Scientific Corp.,Waltham MA,USA)，通过在25μl的OptiMEM培养基中混合1μg的RNA以及在25μl的OptiMEM培养基中混合2μg的Messenger Max来配制RNA。将每种混合物添加到各个PBMC培养物中。第三种培养物用相同的50μl混合物处理，但未添加RNA。培养一周后，在2ml细胞培养物中进行抗体和四聚体染色。使用以下设置进行FACS分析：
FACS：FSC-SSC中的淋巴细胞上设门
藻红蛋白(PE)：FLU基质四聚体(HLA-A2与肽：GILGFVFTL；SEQ ID NO:30)
别藻蓝蛋白(APC)：CMVpp65四聚体(HLA-A2与肽：NLVPMVATV；SEQ ID NO:33)
结果如图6所示。
在FACS分析之前，将实验再延长一周至总共2周的细胞培养，其中，在第7天重复转染方案并将培养基替换为补充有5ng/ml重组人IL-2的新鲜培养基。在第9天和第12天重复更换补充有5ng/ml重组人IL-2的新鲜培养基。
结果如图7所示。
实验证明，本发明的未封端ChemRNA不具有5’-端帽结构、不具有5’-磷酸根、缺少5’UTR、缺少终止密码子以及poly(A)尾，由PBMC表达并呈递给人类T细胞。
图6B所示的FACS分析(与未转染RNA的培养物相比)表明，一周后，在用编码FLU表位的RNA转染的PBMC培养物中，FLU特异性T细胞明显增殖。这表明产生了RNA编码的表位并将其呈递给T细胞。
两周后，用Oligo Flu matirx转染的培养物中的信号显着增加(图7B)，并且在用Oligo CMV pp65 RNA转染的培养物中也检测到阳性信号(图7C)。后者的信号与用OligoFlu matrix RNA转染的培养物相比较弱，这可能是由于细胞无反应性或非最佳肽序列。
示例5
进一步研究了：如果修饰的核苷酸包含在RNA序列中，特别是在编码序列中，则用于表达肽、尤其是寡肽(例如优选感染因子和癌症肽的表位)的本发明的RNA是否也提供这种肽的表达。
使用的结构如下：
SIINFEKL：5’-AUGAGUAUAAUCAACUUUGAAAAACUG-3’(SEQ ID NO:25；编码上述如实施例1中所述的SIINFEKL表位)。该构建体对应于示例2的构造(f)。
SIINFEKL CF：5’-AUGAGUAUAAU[2’-F-C]AA[2’-F-C]UUUGAAAAA[2’-F-C]UG-3’(SEQ ID NO:25，编码上述如实施例1中所述的SIINFEKL表位)，其中，[2’-F-C]表示2’-氟脱氧胞嘧啶)。
作为对照，使用以下RNA：
阳性对照：酶法制备的编码卵清蛋白的mRNA(Trilink Biotechnologies,LLC,SanDiego,CA,USA)。
阴性对照：酶法制备的编码荧光素酶的mRNA(在发明人实验室制备)。
如实施例1中所述，用上述寡核苷酸转染小鼠OT1脾细胞(每孔100μl中100000个细胞)，除了每孔分别使用200ng、20ng和(作为阴性对照)0ng的RNA之外。培养40小时后，如实施例1所述测量培养上清液中的IL-2水平。结果如图8所示。
如图8所示，将2-F-C包含到RNA中不会干扰被编码的肽的表达。
本发明显示具有编码序列(其优选地编码肽，更优选地编码诸如病毒等感染因子的表位的表位或肿瘤抗原的表位)但缺少一个、多个或甚至任何信使RNA特异性结构特征的各种化学合成的RNA种类可由活细胞(特别是哺乳动物细胞)表达，这是一个完全出乎意料的发现，并为各种诊断和治疗应用开辟了最小ChemRNA的使用。
首先，出乎意料的是，在非Kozak(TISU)周围具有AUG起始密码子且缺乏poly(A)尾的5’-封端RNA显示对特定T细胞的刺激(在转染的小鼠OT1脾细胞中产生IL-2)。本发明的进一步研究得出更令人惊讶的结果：没有端帽实际上对于刺激OT1小鼠脾细胞释放IL-2是必需的。甚至可以使用不含5’磷酸基团但具有5’-OH基团的RNA。本发明的进一步结果表明，5’UTR不是编码序列的表达的绝对要求。尽管起始密码子的存在对于优化编码序列的表达是优选的，但起始密码子也不是绝对要求。如果RNA的3’端的最后一个核苷酸是编码序列的最后一个核苷酸，则也不需要存在终止密码子。
序列表
<110> 苏黎世大学
<120> 最小mRNA及其用途
<130> U 0052 WO
<160> 35
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Lys Val Leu Glu Tyr Val Ile Lys Val
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val
1 5
<210> 3
<211> 9
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<213> 智人
<400> 3
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1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Tyr Leu Val Pro Gln Gln Gly Phe Phe Cys
1 5 10
<210> 5
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<212> PRT
<213> 智人
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Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro
1 5
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<213> 智人
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<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人类免疫缺陷病毒1型
<400> 7
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<213> 人类免疫缺陷病毒1型
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<213> 人类免疫缺陷病毒1型
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Ala Phe His His Val Ala Arg Glu Leu
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<213> 人乳头瘤病毒16型
<400> 19
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<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒16型
<400> 20
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1 5
<210> 21
<211> 8
<212> PRT
<213> 人乳头瘤病毒16型
<400> 21
Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile
1 5
<210> 22
<211> 35
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码肽SIINFEKL的RNA
<400> 22
acaagaugag uauaaucaac uuugaaaaac uguaa 35
<210> 23
<211> 41
<212> RNA
<213> 人工序列
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<223> 编码突变Kif18b的肽MFQEFVDVEV的RNA
<400> 23
acaagauguu ccaggaauuu guugacuggg aaaacguuua a 41
<210> 24
<211> 34
<212> RNA
<213> 人工序列
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<223> 编码肽SIINFEKL的RNA
<400> 24
caagaugagu auaaucaacu uugaaaaacu guaa 34
<210> 25
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码肽SIINFEKL的RNA
<400> 25
augaguauaa ucaacuuuga aaaacug 27
<210> 26
<211> 32
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码肽SIINFEKL的RNA
<400> 26
acaagaugag uauaaucaac uuugaaaaac ug 32
<210> 27
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码肽SIINFEKL的RNA
<400> 27
aguauaauca acuuugaaaa acug 24
<210> 28
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码流感病毒表位GILGFVFTL的RNA
<400> 28
auggggauuu ugggguuugu guucacgcuc 30
<210> 29
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含流感病毒M肽GILGFVFTL的肽
<400> 29
Met Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu
1 5 10
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> 流感病毒
<400> 30
Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu
1 5
<210> 31
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码肽MNLVPMVATV的RNA
<400> 31
augaaccugg ugcccauggu ggcuacgguu 30
<210> 32
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有巨细胞病毒的肽NLVPMVATV的肽
<400> 32
Met Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val
1 5 10
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> 巨细胞病毒
<400> 33
Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val
1 5
<210> 34
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 34
Met Phe Gln Glu Phe Val Asp Trp Glu Asn Val
1 5 10
<210> 35
<211> 58
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码肽SIINFEKL的RNA
<400> 35
acaagaugga gaguauaauc aacuuugaaa aacuguaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 58

Claims (39)

1.一种完全化学合成的RNA，具有按照以下通式(1)的结构：
5’-W-X-Y-(编码序列)-Z-3’ (1)
其中，
W选自由5’端帽、游离5’-三磷酸基团、游离5’-二磷酸基团、游离5’-二磷酸基团、游离5’-单磷酸基团、游离5’-OH基团、以及所述5’端帽、所述5’-三磷酸基团、所述游离5’-二磷酸基团或所述游离5’-单磷酸基团的化学修饰类似物组成的组；
X是存在或不存在的，并且如果X存在，X为5’UTR序列；
Y是存在或不存在的，并且如果Y存在，Y为起始密码子；且
Z直接连接所述编码序列并且选自由游离3’-OH基团、终止密码子和可选地经由3’UTR序列连接到poly(A)尾的终止密码子组成的组。
2.根据权利要求1所述的mRNA，其具有选自由以下通式(2)至通式(61)组成的组的结构：
5’-N7MeGppp-UTR-AUG-(编码序列)-stop-polyA-3’ (2)
5’-N7MeGppp-UTR-AUG-(编码序列)-stop-3’ (3)
5’-N7MeGppp-UTR-AUG-(编码序列)-3’ (4)
5’-N7MeGppp-UTR-(编码序列)-stop-polyA-3’ (5)
5’-N7MeGppp-UTR-(编码序列)-stop-3’ (6)
5’-N7MeGppp-UTR-(编码序列)-3’ (7)
5’-N7MeGppp-AUG-(编码序列)-stop-polyA-3’ (8)
5’-N7MeGppp-AUG-(编码序列)-stop-3’ (9)
5’-N7MeGppp-AUG-(编码序列)-3’ (10)
5’-N7MeGppp-(编码序列)-stop-polyA-3’ (11)
5’-N7MeGppp-(编码序列)-stop-3’ (12)
5’-N7MeGppp-(编码序列)-3’ (13)
5’-triP-UTR-AUG-(编码序列)-stop-polyA-3’ (14)
5’-triP-UTR-AUG-(编码序列)-stop-3’ (15)
5’-triP-UTR-AUG-(编码序列)-3’ (16)
5’-triP-UTR-(编码序列)-stop-polyA-3’ (17)
5’-triP-UTR-(编码序列)-stop-3’ (18)
5’-triP-UTR-(编码序列)-3’ (19)
5’-triP-AUG-(编码序列)-stop-polyA-3’ (20)
5’-triP-AUG-(编码序列)-stop-3’ (21)
5’-triP-AUG-(编码序列)-3’ (22)
5’-triP-(编码序列)-stop-polyA-3’ (23)
5’-triP-(编码序列)-stop-3’ (24)
5’-triP-(编码序列)-3’ (25)
5’-diP-UTR-AUG-(编码序列)-stop-polyA-3’ (26)
5’-diP-UTR-AUG-(编码序列)-stop-3’ (27)
5’-diP-UTR-AUG-(编码序列)-3’ (28)
5’-diP-UTR-(编码序列)-stop-polyA-3’ (29)
5’-diP-UTR-(编码序列)-stop-3’ (30)
5’-diP-UTR-(编码序列)-3’ (31)
5’-diP-AUG-(编码序列)-stop-polyA-3’ (32)
5’-diP-AUG-(编码序列)-stop-3’ (33)
5’-diP-AUG-(编码序列)-3’ (34)
5’-diP-(编码序列)-stop-polyA-3’ (35)
5’-diP-(编码序列)-stop-3’ (36)
5’-diP-(编码序列)-3’ (37)
5’-mP-UTR-AUG-(编码序列)-stop-polyA-3’ (38)
5’-mP-UTR-AUG-(编码序列)-stop-3’ (39)
5’-mP-UTR-AUG-(编码序列)-3’ (40)
5’-mP-UTR-(编码序列)-stop-polyA-3’ (41)
5’-mP-UTR-(编码序列)-stop-3’ (42)
5’-mP-UTR-(编码序列)-3’ (43)
5’-mP-AUG-(编码序列)-stop-polyA-3’ (44)
5’-mP-AUG-(编码序列)-stop-3’ (45)
5’-mP-AUG-(编码序列)-3’ (46)
5’-mP-(编码序列)-stop-polyA-3’ (47)
5’-mP-(编码序列)-stop-3’ (48)
5’-mP-(编码序列)-3’ (49)
5’-OH-UTR-AUG-(编码序列)-stop-polyA-3’ (50)
5’-OH-UTR-AUG-(编码序列)-stop-3’ (51)
5’-OH-UTR-AUG-(编码序列)-3’ (52)
5’-OH-UTR-(编码序列)-stop-polyA-3’ (53)
5’-OH-UTR-(编码序列)-stop-3’ (54)
5’-OH-UTR-(编码序列)-3’ (55)
5’-OH-AUG-(编码序列)-stop-polyA-3’ (56)
5’-OH-AUG-(编码序列)-stop-3’ (57)
5’-OH-AUG-(编码序列)-3’ (58)
5’-OH-(编码序列)-stop-polyA-3’ (59)
5’-OH-(编码序列)-stop-3’ (60)
5’-OH-(编码序列)-3’ (61)
其中：
polyA是poly(A)尾；
stop是终止密码子；
UTR是5’UTR
triP是游离三磷酸基团；
diP是游离二磷酸基团；
mP是游离单磷酸基团。
3.根据权利要求2所述的RNA，其具有选自由通式(3)、(15)、(39)、(51)和(58)组成的组的结构。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的RNA，其中，如果所述UTR存在，则所述UTR具有2nt至10nt的长度。
5.根据权利要求4所述的RNA，其中，所述UTR具有2nt至5nt的长度。
6.根据权利要求4或5所述的RNA，其中，所述UTR包含序列aag。
7.根据权利要求6所述的RNA，其中，所述UTR由序列acaag组成。
8.根据权利要求1、2、4、5、6、7或8中任一项所述的RNA，其中，如果所述poly(A)尾存在，则所述poly(A)尾的长度最多为30nt，优选为5nt至30nt。
9.根据权利要求8所述的RNA，其中，所述poly(A)尾的长度最多为20nt，优选为5nt至20nt。
10.根据权利要求9所述的RNA，其中，所述poly(A)尾的长度最多为10nt，优选为5nt至10nt。
11.根据前述权利要求中任一项所述的RNA，其中，所述编码序列编码至多65个氨基酸、优选4至40个氨基酸的氨基酸序列。
12.根据权利要求11所述的RNA，其中，所述编码序列编码4至30个氨基酸，优选8至20个氨基酸。
13.根据前述权利要求中任一项所述的RNA，其中，所述RNA是RNA寡核苷酸。
14.根据权利要求13所述的RNA，由至多200nt、优选至多120nt、更优选至多100nt组成。
15.根据前述权利要求中任一项所述的RNA，其包含至少一种化学修饰，所述至少一种化学修饰优选在单个核苷酸处、更优选在末端核苷酸处。
16.根据前述权利要求中任一项所述的RNA，其中，所述RNA是酶修饰的。
17.根据前述权利要求中任一项所述的RNA，其中，所述编码序列编码感染因子的肽或癌肽或由自身免疫细胞所识别的组织的肽。
18.根据权利要求17所述的RNA，其中，所述感染因子选自病毒、细菌和真菌。
19.根据权利要求17所述的RNA，其中，所述癌肽具有的氨基酸序列包含至少一种与所述非癌野生型的氨基酸序列不同的氨基酸。
20.根据前述权利要求中任一项所述的RNA，其中，当所述RNA存在于细胞或生物体或无细胞表达系统中时，表达所述RNA的所述编码序列。
21.根据前述权利要求中任一项所述的RNA，其中，所述RNA是单链的。
22.一种RNA群，其中，所述群中至少85％、优选至少90％、更优选至少95％的RNA具有与根据前述权利要求中任一项所述的RNA相同的化学组成。
23.一种RNA群，包含：
根据权利要求1至21中任一项所定义的具有n nt全长的RNA；以及
至少1％的如下定义的RNA：具有与所述全长的所述RNA的化学组成有至少95％、优选地至少96％、更优选地至少97％、更优选地至少98％、甚至更优选地至少99％的同一性的化学组成但具有(n-1)nt的长度，其中，长度为(n-1)的所述RNA的化学组成与全长的所述RNA的化学组成的同一性的百分比是指相对于长度为n的所述全长的所述RNA的(n-1)个核苷酸的化学组成而言的。
24.根据权利要求22或23所述的RNA群，包含至少1％的如下定义的RNA：具有与所述全长的RNA的化学组成有至少93％、优选至少95％、更优选地至少97％、更优选地至少98％、甚至更优选地至少99％的同一性的化学组成但具有(n-2)的长度，其中，长度(n-2)的所述RNA的化学组成与所述全长的RNA的化学组成的同一性的百分比是关于长度n的所述全长的RNA的(n-2)个核苷酸的化学组成而言的。
25.根据权利要求22至24中任一项所述的RNA群，其包含至少1％的如下定义的RNA：具有与所述全长的RNA的化学组成有至少90％、优选地至少95％、更优选地至少97％、更优选地至少98％、甚至更优选地至少98.5％的同一性的化学组成但具有(n-3)的长度，其中，长度为(n-3)的所述RNA的化学组成与全长的所述RNA的化学组成的同一性的百分比是指相对于长度为n的所述全长的所述RNA的(n-3)个核苷酸的化学组成而言的。
26.一种药物组合物，包含根据权利要求1至21中任一项所述的RNA或根据权利要求22至25中任一项所述的RNA群。
27.一种诊断试剂盒，其包含至少一种根据权利要求1至21中任一项所述的RNA或至少一种根据权利要求22至25中任一项所述的RNA群。
28.根据权利要求27所述的试剂盒，其中，所述编码序列编码感染因子的肽。
29.根据权利要求28所述的试剂盒，还包含对所述感染因子特异的T细胞。
30.一种疫苗，包含根据权利要求1至21中任一项所述的RNA或根据权利要求22至25中任一项所述的RNA群。
31.根据权利要求1至21中任一项所述的RNA或根据权利要求22至25中任一项所述的RNA群，其用作药物。
32.根据权利要求1至21中任一项所述的RNA或根据权利要求22至25中任一项所述的RNA群用于诊断目的的用途。
33.根据权利要求1至21中任一项所述的RNA或根据权利要求22至25中任一项所述的RNA群用于在无细胞表达系统、细胞或生物体中表达所述编码序列的用途。
34.一种在细胞或生物体中表达氨基酸序列的方法，包括将根据权利要求1至21中任一项所述的RNA或根据权利要求22至25中任一项所述的RNA群引入到所述细胞或生物体中的步骤。
35.一种在无细胞表达系统中表达氨基酸序列的方法，包括以下步骤：在所述无细胞表达系统存在的条件下，培养根据权利要求1至21中任一项所述的RNA或根据权利要求22至25中任一项所述的RNA群。
36.根据权利要求1至21中任一项所述的RNA或根据权利要求22至25中任一项所述的RNA群，其用于癌症和肿瘤的治疗。
37.根据权利要求36使用的所述RNA或所述RNA群，其中，所述治疗包括为癌症患者接种针对所述患者所患癌症的疫苗。
38.用于根据权利要求36或37的所述RNA，其中，所述RNA如权利要求19所定义。
39.根据权利要求1至21中任一项所述的RNA或根据权利要求22至25中任一项所述的RNA群，其用于在感染性疾病的治疗和/或预防中。
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