KR20160095185A

KR20160095185A - 마이코플라즈마 보비스 백신

Info

Publication number: KR20160095185A
Application number: KR1020167020694A
Authority: KR
Inventors: 마이클 벡; 제프리 크니텔
Original assignee: 베링거잉겔하임베트메디카인코퍼레이티드
Priority date: 2007-10-29
Filing date: 2008-10-29
Publication date: 2016-08-10
Also published as: CN101827605B; CA2699218A1; US20090130148A1; WO2009058833A2; EP2214702A2; JP5789897B2; KR20100084626A; JP2013223511A; EP2214702B1; CN103667125A; JP2011500093A; CN101827605A; AR069087A1; AU2008318793A1; UY31437A1; BRPI0819149A2; EP2214702A4; NZ585588A; SG185932A1; BRPI0819149B1

Abstract

본 발명은 신규 약독화된 엠.보비스(M. bovis) 세균 균주에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 약독화된 엠.보비스 세균 균주의 생 세균을 포함하는 면역원성 조성물, 이의 제조방법 및 엠.보비스 감염의 치료 및 예방을 위한 용도도 제공한다.

Description

마이코플라즈마 보비스 백신{Mycoplasma bovis vaccine}

관련출원

본 출원은 2007년 10월 29일에 출원된 미국 임시 특허출원번호 60/983,482 및 2008년 6월 25일에 출원된 미국 임시 특허출원번호 61/075,552를 우선권으로 주장하는 출원이며, 상기 출원들의 교시 및 내용은 본 발명에 참고인용된다.

서열목록

본 출원은 서면 및 컴퓨터판독 형식의 서열목록을 포함하며, 이의 교시와 내용은 본 명세서에 참고인용된다.

마이코플라즈마 보비스(엠.보비스)(Mycoplasma bovis(M. bovis))는 마이코플라즈마의 병원성이 강한 종의 하나로 생각되는 것으로, 세계적으로 상당한 경제적 손실을 일으킨다. 마이코플라즈마는 모든 연령의 소에서 심각한 임상 징후를 일으킨다. 엠.보비스는 소에서 폐렴, 유방염 및 관절염을 유발하는 것으로 발견된 가장 흔한 마이코플라즈마 병원체이며, 이의 병인적 역할은 또한 암소와 황소의 이염, 각결막염, 활액막염 및 생식장애와도 관련이 있다. 일반적으로, 마이코플라즈마는 세포벽이나 막이 없기 때문에 일반적으로 사용되는 광범위 항생제 치료의 여러 부류에 내성을 만드는 경향이 있어 치료하기가 곤란하다. 마이코플라즈마는 대부분의 바이러스보다 커서 세포 내로 유입되기보다는 세포 표면에 부착하여 세포를 파괴함으로써 조직 세포를 손상시킨다는 점에서 바이러스와 다르다. 엠.보비스로 감염된 동물은 면역반응이 저하되고 열, 우울, 식욕부진, 노작성호흡, 비강 및 안구 배출물, 기침, 재채기, 가쁜호흡, 그렁거림, 절름발이 및 부종 관절, 유방염, 중이염, 유산, 횡와 및 사망과 같은 엠.보비스 감염의 징후를 나타낼 수 있다. 이 유기체는 비위생적이고 따뜻하며 습한 환경에서 존속한다. 마이코플라즈마는 젖에서 생존할 수 있고, 심지어 감염에 대한 반응으로 생산되는 다수의 백혈구의 존재 하에서도 증식하는 것으로 보인다.

엠.보비스 백신을 개시하고 있는 당업계에서 이용가능한 문헌은 여러 가지가 있다. 특허 6,548,069는 적어도 2종의 사멸된 엠.보비스 균주를 함유하는 전세포 불활성화된 박테린(bacterin)을 포함하는 백신 조성물을 개시한다. 이용가능한 다른 문헌들은 불활성화 백신을 제조하기 위해 엠.보비스 균주를 10회 미만으로 계대배양하는 것을 개시하지만, 감염성 또는 병원성 엠.보비스 균주의 연속 계대배양을 통한 약독화 또는 무독성 생(生) 배양 백신의 본질로서 임의의 그러한 약독화된 생(生) 엠.보비스 균주에 대해서는 설명한 것이 없다.

종래기술은 사멸형 엠.보비스가 마이코플라즈마 보비스 감염과 관련된 임상 증상의 중증도를 경감시키는데 효과적이거나 효능적이지 않다는 점에서 부족하다. 심지어 낮은 수준의 계대는 임상 증상이 급감될 정도로 효능이 높은 마이코플라즈마 백신을 생산하지 못한다. 이용가능한 매우 적은 횟수 계대의 불활성화된 엠.보비스 백신은 임상 증상의 중증도에 큰 감소를 나타내지 않는다. 또한, '069 특허는 "마이코플라즈마 분리물은 배양물에서 그 항원들을 빠르게 변경시킬 수 있기 때문에, 계대 횟수가 약 50회가 넘는 고계대 균주는 감염성을 상실할 수 있고 본 발명의 박테린에 사용될 때 더욱 불량한 면역반응을 유도할 수 있다. 따라서, 신선 균주 또는 여전히 독성인 배양 균주, 즉 숙주 동물에서 감염성인 능력을 보유하는 균주를 이용하는 것이 바람직하다. 절대적인 세대 수가 존재하는 것으로 알려진 것은 없지만, 본 발명은 대량 생산 전에 약 10회 이하, 바람직하게는 단지 약 5회 이하로 계대배양된 마이코플라즈마 균주로 시작하는 것이 바람직하다. 배양 세대가 더 낮은 균주를 사용하면, 항원이 자신의 천연 상태를 유지하여, 감염성 미생물에 대한 보호면역반응을 유도해낼 것으로 생각된다."고 교시하면서 면역원성 또는 백신 조성물에 사용되는 엠.보비스의 고계대성 약독화 균주의 사상과 다른 교시를 강력하게 교시한다.

따라서, 당업계에 필요한 것은 엠.보비스에 대한 면역학적 반응을 유도하는데 효과적인 면역원성 조성물이다. 또한, 엠.보비스 감염의 징후의 중증도를 경감시키거나 발생률을 감소시키는데 효과적인 면역원성 조성물도 필요로 한다. 또한, 엠.보비스 감염 징후의 발생률을 감소시키거나 제거하는데 효과적인 백신도 필요로 한다. 또한, 필요로 하는 동물에게 안전하게 투여할 수 있는 엠.보비스 감염 징후의 발생률을 감소시키거나 중증도를 경감시키는데 효과적인 면역학적 조성물도 필요로 한다. 또한, 조성물에 사용된 엠.보비스 균주 또는 분리물보다 다른 엠.보비스 균주 및 분리물에 대하여 면역반응을 유발하고 교차보호를 유도하는 전술한 면역학적 조성물도 필요로 한다. 또한, 1회 용량, 2회 용량 또는 수회 용량(초회 용량 이후 추가 접종(들))의 면역화 요법으로 적당한 안전하고 효과적인 면역학적 조성물, 여러 경로들로 투여하기에 적합하고 편리한 면역학적 조성물, 및 복합 백신의 제조를 위한 다른 면역원 및 면역학적 조성물에 적합한 면역학적 조성물도 필요로 한다. 마지막으로, 필요로 하는 동물에게 보호의 조속한 개시 및 장기 지속적인 보호를 제공하는 전술한 면역학적 조성물도 필요로 한다.

발명의 요약

본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신은 엠.보비스 감염의 징후 및/또는 엠.보비스 감염 자체 및/또는 발생률 또는 중증도가 야생형 엠.보비스 균주에 의한 감염에 비해, 바람직하게는 뿐만 아니라 시판 백신에 비해서도 감소될 정도로 효능이 향상된 면역원성 조성물로 사용될 수 있는, 약제학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 담체와 배합될 수 있는, 엠.보비스의 무독성 및 약독화된 균주, 바람직하게는 고계대성 균주를 제공함으로써 종래 기술에 존재했던 문제를 극복한다. 다른 말로 하면, 본 발명에 따른 백신이 제공된 소는 엠.보비스 감염의 징후를 발생시킬 위험이 낮고, 초래되는 임상 징후들도 어떠한 백신도 투여받지 않았지만 엠.보비스에 감염된 동물 또는 본 발명에 따르지 않는 백신을 투여받은 동물에서보다 징후가 덜 심각하거나 덜 우세할 것이다. 또한, 동물 무리에서 본 발명에 따른 백신이 투여된 동물의 감염 수는 백신접종없이 감염된 동물, 바람직하게는 시판 백신이 접종된 동물에서보다 적게 나타날 것이다. 바람직하게도, 본 발명의 백신은 조속한 개시와 장기 지속적인 보호를 제공하는 고효능의 안정한 백신 제형이다. 종래 기술의 교시로 인해, 본 발명의 조성물은 엠.보비스의 균주, 바람직하게는 엠.보비스의 고도 계대성 균주가 약독성이며 살아있고, 면역원성 조성물의 성분으로서 더 더욱 효과적이었다는 점에서 놀라운 결과를 제공했다.

여기에 개시된 본 발명은 동물에게 투여했을 때 면역반응을 유도하거나 유발하는 엠.보비스의 무독성 및 약독화된 균주 또는 분리물, 바람직하게는 엠.보비스의 고계대성(high passaged) 약독화 균주를 제공한다. 바람직하게, 당해 면역반응은 본 발명의 조성물이 투여된 동물을, 엠.보비스 감염의 징후를 발생시킬 위험이 낮고 이러한 징후가 조성물이 투여되지 않은 동물 또는 본 발명에 따라 제조되지 않은 백신이나 조성물이 투여된 동물에서보다 덜 심각하거나 덜 우세할 정도로 보호한다.

본 출원인들은 본 발명의 목적상, "분리물" 및 "균주(strain)"란 용어가 호환 사용되고 각 균주 또는 분리물 간의 차이는 DNA 핑거프린팅을 통해 검출할 수 있음을 언급한다(즉, 다른 균주 또는 분리물은 다른 핑거프린트를 나타낼 것이다).

한 양태에서, 본 발명은 엠.보비스의 고 계대 (high passage) 균주 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 면역원성 조성물을 개시한다. 상기 엠.보비스 균주는 약독성 및 무독성인 것이 바람직하다. 본 발명의 면역원성 조성물은 소의 엠.보비스 감염에 대하여 면역원성 반응을 생산한다. 면역원성 조성물의 투여에 의해 생성되거나 유도된 엠.보비스 감염에 대한 면역원성 반응은 엠.보비스 감염의 징후들의 중증도 또는 발생률을 크게 감소시킨다. 다른 양태에 따르면, 엠.보비스의 고 계대 균주, 바람직하게는 고계대성, 약독성, 무독성 엠.보비스 균주를 포함하는 면역원성 조성물의 제조방법이 개시된다. 또 다른 양태에 따르면, 송아지에 상기 면역원성 조성물을 사용하여 빠르고 장기 지속적인 혈청학적 체액성 면역반응을 자극하여, 결과적으로 질환으로부터 보호하기 위한 방법을 개시한다. 또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 면역원성 조성물을 유효량으로 투여하여 엠.보비스 감염에 대하여 송아지를 면역화시키는 방법이 개시된다. 본 발명의 면역원성 또는 백신 조성물을 송아지에게 투여하고 이어서 야생형 엠.보비스 균주의 공격을 받았을 때 임상 증상, 폐 병리, 절름발이 및 엠.보비스 감염과 일반적으로 관련된 관절 병리의 감소를 비롯해서 엠.보비스 징후의 감소를 나타냈다. 구체적으로, 폐 병리의 감소 및 관절 임상 증상 및 관련 절름발이의 인지가능한 감소가 백신접종된 그룹에서 관찰되었다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 엠.보비스 감염의 징후를 감소시키는 방법이, 바람직하게는 본 발명에 따른 및/또는 당해 특허출원에 개시된 임의의 약독화된 무독성 엠.보비스 세균을 투여함으로써 엠.보비스 감염의 징후를 감소시키는 방법이 개시된다. 엠.보비스 감염의 징후의 감소는 본 발명의 면역원성 조성물의 투여에 의해 달성된다.

본 발명의 바람직한 한 양태에 따르면, 각각 엠.보비스의 고 계대성 약독화된 균주와 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 3종의 생(生) 백신 또는 면역원성 조성물 중 하나를 송아지에게 투여했다. 상기 엠.보비스 고 계대 균주는 바람직하게는 시험관내 세포 배양물에서 바람직하게는 10회 이상, 바람직하게는 적어도 20회, 더욱 바람직하게는 적어도 30회, 더 더욱 바람직하게는 적어도 40회, 더 더욱 바람직하게는 적어도 50회, 더 더욱 바람직하게는 적어도 55회, 더 더욱 바람직하게는 적어도 60회, 더 더욱 바람직하게는 적어도 70회, 더 더욱 바람직하게는 적어도 80회, 더 더욱 바람직하게는 적어도 90회, 더 더욱 바람직하게는 적어도 95회, 더 더욱 바람직하게는 적어도 100회, 더 더욱 바람직하게는 적어도 102회, 가장 바람직하게는 적어도 106회 계대배양한 것이다. 백신 또는 면역원성 조성물에 유용한 엠.보비스의 균주는 임의의 균주 또는 분리물일 수 있다. 3가지 대표 균주는 부다페스트 조약에 의거하여 2007년 10월 16일에 버지니아주 마나사스에 소재하는 ATCC에 수탁번호 PTA-8694로 기탁된 052823A106; 부다페스트 조약에 의거하여 2007년 10월 16일에 버지니아주 마나사스에 소재하는 ATCC에 수탁번호 PTA-8696으로 기탁된 05249A102; 및 부다페스트 조약에 의거하여 2007년 10월 16일에 버지니아주 마나사스에 소재하는 ATCC에 수탁번호 PTA-8695로 기탁된 0519021B106을 포함한다. 이 균주들은 계대배양하기 전에 각각 병원성이지만, 각 균주를 전술한 바와 같이 계대배양한 후, 특히 100회 이상 계대배양한 후에 수득되는 계대배양된 균주는 약독화된 무독성이었고, 이 균주의 면역원성 조성물의 투여를 받은 동물에서 면역반응을 생산했다. 이어서, 송아지에게 자연발생의 질환 발생으로부터 수득된 엠.보비스 분리물로 항원공격(challenge)했다. 본 발명의 모든 경우에 있어서, 항원공격(challenge) 분리물은 백신접종에 사용된 분리물과 다른 "핑거프린트"(이하에 측정됨)를 나타냈다(즉, 이종의 항원공격임). 바람직하게, 계대배양된 균주의 투여는 엠.보비스의 병원성 균주 또는 야생형 균주로 항원공격된 후 엠.보비스 감염의 임상 증상들의 중증도 및/또는 발생률을 감소시키는 면역반응을 초래했다.

따라서, 다른 관점에 따라 본 발명은 수탁번호 PTA-8694; PTA-8695; 또는 PTA-8696 하에 ATCC에 기탁된 임의의 약독화된 엠.보비스 세균 균주; 바람직하게는 뿐만 아니라 엠.보비스 감염의 징후 및/또는 엠.보비스 감염 자체 및/또는 발생률 또는 중증도가 야생형 엠.보비스 균주에 의한 감염 시에 비해, 바람직하게는 뿐만 아니라 시판 백신과 비교했을 때 감소되었을 정도의 향상된 효능, 및 조속한 개시 및 장기 지속적인 보호를 제공하는 높은 효능을 보유하는 면역원성 조성물에 사용될 수 있는, 상기 기탁된 엠.보비스 세균 균주 중 임의의 균주의 임의의 약독화된 자손 엠.보비스 세균 균주에 관한 것이다.

다른 관점에 따르면, 본 발명은 또한 수탁번호 PTA-8694; PTA-8695; 또는 PTA-8696 하에 ATCC에 기탁된 임의의 약독화된 엠.보비스 세균 균주, 또는 상기 기탁된 임의의 엠.보비스 세균 균주의 임의의 약독화된 자손 엠.보비스 세균 균주를 함유하는 본 명세서에 기술된 면역원성 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 면역원성 조성물은 수탁번호 PTA-8694; PTA-8695; 또는 PTA-8696 하에 ATCC에 기탁된 임의의 약독화된 엠.보비스 세균 균주를 함유한다. 상기 엠.보비스 세균 균주 중 임의의 특정 균주가 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 엠.보비스의 병원성 균주 또는 야생형 균주로 항원공격(challenge) 후에 엠.보비스 감염의 임상적 증상들의 중증도 및/또는 발생률의 감소 등에 사용되는, 본 명세서에 기술된 임의의 상기 특정 약독화된 엠.보비스 균주의 수의학적 용도에 관한 것이다.

다른 관점에 따르면, 본 발명은 수탁번호 PTA-8694; PTA-8695; 또는 PTA-8696 하에 ATCC에 기탁된 엠.보비스 세균 균주와 동일한 특징을 가진 약독화된 엠.보비스 세균에 관한 것이다. "수탁번호 PTA-8694; PTA-8695; 또는 PTA-8696 하에 ATCC에 기탁된 엠.보비스 세균 균주와 같은 특징을 가진"이란 용어는 이 세균 균주가 약독화되고 송아지에게 피하 또는 비내 경로를 통해 2.1E9 CFU의 1회 용량을 투여한 후 14일 내에 송아지에서 체액성 면역반응을 유도할 수 있으며, 병원성 엠.보비스 야생형 균주로의 감염에 의해 일반적으로 일어나는 임상적 징후를 일으키지 않는 것을 의미한다. 참조 방법으로, 체액성 면역반응은 BIOVET 엠.보비스 ELISA-Kit로 이 검사 키트에서 제공하는 프로토콜에 따라 측정되어야 한다. 상기 각 균주는 송아지에게 피하 또는 비내 경로를 통해 2E9 CFU의 1회 용량을 투여한 후 14일 내에, BIOVET 엠.보비스 ELISA-Kit에서 여기서 제공하는 프로토콜에 따라 측정한 상대적 ELISA 스코어가 광학밀도(O.D.) 판독값으로 나타냈을 때 적어도 1.5인 체액성 면역반응을 유도하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물은 임의의 통상적으로 방식으로 투여할 수 있다. 투여 방법의 예로는 면역계의 세포가 면역원성 조성물에 접근할 수 있게 하는 임의의 방법, 즉 구강, 경피/피내, 정맥내, 피하, 근육내, 안내, 복강내, 직장내, 질내, 비내, 위내, 기관내, 폐내 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 바람직한 투여 방식은 근육내, 피하 및 비내 투여이며, 피하 및 비내 투여가 특히 바람직하다. 원한다면 또는 필요하다면 추가접종 면역화를 한번 또는 다양한 간격 하에 여러 번 제공할 수 있다. 이러한 백신의 투여 후에는 동물 내에 면역반응이 유발되어, 독성형 엠.보비스로 항원공격(challenge) 후의 야생형 세균 또는 분리물에 노출되었을 때 엠.보비스 감염의 징후가 발생률 및/또는 중증도 면에서 감소된다. 또한, 본 발명의 백신 또는 면역원성 조성물은 약독화를 위해 계대배양된 균주 외에 다른 엠.보비스 균주에 대해 효과적인 교차보호를 나타내어, 항원성 성분으로서 사용했다.

바람직한 형태로, 백신의 용량 용적은 5ml 이하, 더욱 바람직하게는 3ml 이하, 더욱 바람직하게는 2ml 이하이다. 가장 바람직한 양태에서, 용량은 2ml로, 바람하게는 1ml씩 각 콧구멍으로 투여되는 비내 투여되거나, 더 더욱 바람직하게는 피하 투여되거나, 가장 바람직하게는 1회 용량으로서 한번에 피하 및 비내로 투여될 수 있다. 일부 바람직한 형태에서, 1차 투여 후에는 면역원성 조성물의 2차 또는 후속 투여가 실시될 수 있다. 이러한 후속 투여는 1차 투여 후 적어도 10일째에 투여되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 적어도 10 내지 32일 사이이고, 더 더욱 바람직하게는 적어도 12 내지 30일 사이이며, 더 더욱 바람직하게는 적어도 14일, 가장 바람직하게는 적어도 14 내지 28일 사이이다. 가장 바람직한 형태로, 백신은 1회 용량으로 0일째 투여되거나, 또는 대안적 형태로 0일째 및 14 내지 28일 사이에 투여될 수 있고, 그 후 엠.보비스의 병원성 형태에 노출은 면역요법의 완료시까지 일으키지 않는다. 가장 바람직한 형태에서, 추가접종이 전혀 필요하지 않으며, 백신은 1회만 투여한다. 백신은 1일령부터 성인시기의 동물에게 투여하고, 바람직하게는 1일령 내지 2년령인 어린 소에게, 더욱 바람직하게는 1일령부터 16주령의 소에게, 가장 바람직하게는 6주 내지 12주령의 소에게 투여한다. 이러한 투여는 이하에 기술되는 바와 같이 엠.보비스 감염의 징후를 감소시켰다. 실제로, 본 발명의 연구들은 전술한 바와 같이 백신접종된 그룹에서 엠.보비스 감염의 징후들이 백신 미접종 그룹에 비해 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 60%, 더 더욱 바람직하게는 적어도 70%, 더 더욱 바람직하게는 적어도 75% 감소했다. 폐 병리 평가, 구체적으로 다양한 종마다 통상적으로 기록되는 엠.보비스로 인한 병변에 기인하는 폐 경화 백분율이 부검후 이루어졌고, 백신 미접종 그룹과 비교했을 때 적어도 33%, 더욱 바람직하게는 적어도 50%, 더 더욱 바람직하게는 적어도 70%, 더 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 더 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95% 감소했다.

다른 바람직한 양태에서, 본 발명의 백신은 적당한 보강제(adjuvant))와 배합된다. 본 명세서에 사용된 "보강제"는 수산화알루미늄 및 인산알루미늄, 사포닌, 예컨대 Quil A, QS-21(Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL), 유중수 에멀젼, 수중유 에멀젼, 수중유중수 에멀젼을 포함할 수 있다. 에멀젼은 특히 경질 액체 파라핀 오일(유럽 약전 형태); 이소프레노이드 오일, 예컨대 스쿠알란 또는 스쿠알렌; 알켄, 특히 이소부텐 또는 데센의 올리고머화로부터 산출되는 오일; 선형 알킬 기를 함유하는 알콜 또는 산의 에스테르, 더욱 구체적으로 식물 오일, 에틸 올레이트, 프로필렌 글리콜 디-(카프릴레이트/카프레이트), 글리세릴 트리-(카프릴레이트/카프레이트) 또는 프로필렌 글리콜 디올레이트; 분지형 지방산 또는 알콜의 에스테르, 구체적으로 이소스테아르산 에스테르를 기초로 할 수 있다. 오일은 에멀젼의 형성을 위해 유화제와 함께 사용한다. 유화제는 비이온성 계면활성제가 바람직하고, 구체적으로 소르비탄의 에스테르, 만나이드의 에스테르(예, 안하이드로만니톨 올레이트), 글리콜의 에스테르, 폴리글리세롤의 에스테르, 프로필렌 글리콜의 에스테르, 선택적으로 에톡시화된 올레산, 이소스테아르산, 리신올레산 또는 하이드록시스테아르산의 에스테르, 및 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 공중합체 블록, 구체적으로 플루로닉(Pluronic) 제품, 특히 L121이 있다[예컨대, Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants(Ed. Stewart-Tull, D.E.S.), JohnWiley and Sons, NY, pp51-94(1995) 및 Todd et al., Vaccine 15: 564-570(1997) 참조].

예를 들어, 문헌["Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" edited by M.Powell and M. Newmann, Plenum Press, 1995]의 147쪽에 기술된 SPT 에멀젼 및 이와 동일한 서적의 183쪽에 기술된 에멀젼 MF59를 사용할 수 있다.

보강제의 또 다른 예는 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체 및 말레산 무수물과 알케닐 유도체의 공중합체 중에서 선택되는 화합물이다. 유익한 보강제 화합물은 특히 당이나 폴리알콜의 폴리알케닐 에테르와 가교된 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체이다. 이 화합물들은 카르보머라는 용어로 알려져 있다(Pharmeuropa Vol. 8, No. 2, June 1996). 또한, 당업자는 적어도 3개의 하이드록시 기, 바람직하게는 8개 이하를 보유하고 적어도 3개의 하이드록시 기의 수소 원자가 2 이상의 탄소원자를 보유한 불포화 지방족 라디칼로 대체된 폴리하이드록시화된 화합물과 가교된 상기 아크릴계 중합체를 설명하고 있는 미국 특허 2,909,462를 참조할 수도 있다. 바람직한 라디칼은 2 내지 4개의 탄소원자를 함유하는 것으로, 예컨대 비닐, 알릴 및 다른 에틸렌계 불포화 기이다. 불포화 라디칼은 그 자체에 메틸과 같은 다른 치환체를 함유할 수도 있다. 카르보폴(Carbopol)이란 상표로 판매되는 제품(BF Goodrich, Ohio, USA)이 특히 적당하다. 이들은 알릴 수크로오스 또는 알릴 펜타에리트리톨과 가교된다. 이 중에서, Carbopol 974P, 934P 및 971P를 예로 들 수 있다. Carbopol 971P의 사용이 가장 바람직하다. 말레산 무수물과 알케닐 유도체의 공중합체 중에는, 말레산 무수물과 에틸렌의 공중합체인 공중합체 EMA(Monsanto)가 있다. 이 중합체를 물에 용해하면 산 용액이 되고, 이는 면역원성 조성물, 면역학적 조성물 또는 백신 조성물 자체에 혼입될 보강제 용액을 제공하기 위해, 바람직하게는 생리적 pH로 중화될 것이다.

또 다른 적당한 보강제는, 무엇보다도 RIBI 보강제 시스템(Ribi Inc.), 블록 공중합체(CytRx, Atlanta GA), SAF-M(Chiron, Emeryville CA), 모노포스포릴 지질 A, Avridine 지질-아민 보강제, 이.콜라이 유래(재조합체 등)의 열불안정성 장독소, 콜레라 독소, IMS 1314 또는 뮤라밀 디펩타이드, 또는 자연 발생 또는 재조합성 사이토카인 또는 이의 유도체, 또는 내인성 사이토카인 방출의 자극제를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.

보강제는 용량당 약 100㎍ 내지 약 1g의 양으로 첨가하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 보강제의 첨가량은 약 100㎍ 내지 약 500mg/용량이다. 더 더욱 바람직하게는, 보강제의 첨가량은 약 500㎍ 내지 약 250mg/용량이다. 더 더욱 바람직하게는, 보강제의 첨가량은 약 750㎍ 내지 약 100mg/용량이다. 더 더욱 바람직하게는, 보강제의 첨가량은 약 1mg 내지 약 50mg/용량이다. 더 더욱 바람직하게는, 보강제의 첨가량은 약 1mg 내지 약 10mg/용량이다. 가장 바람직하게는, 보강제의 첨가량은 약 1mg/용량이다.

또한, 본 발명의 면역원성 조성물 및 백신 조성물은 하나 이상의 수의학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 "수의학적으로 허용되는 담체"는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장제, 흡수지연제 등을 포함한다. 일부 바람직한 양태에서, 특히 동결된 면역원성 조성물을 포함하는 조성물의 경우, 본 발명에 사용되는 안정제는 동결건조용 안정제를 포함한다.

"희석제"는 물, 식염수, 덱스트로스, 에탄올, 글리세롤 등을 포함할 수 있다. 등장제는 특히 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨 및 락토스를 포함할 수 있다. 안정제는 특히 알부민 및 에틸렌디아민테트라아세트산의 알칼리 염을 포함한다.

"면역원성 또는 면역학적 조성물"은 세포- 및/또는 항체-매개의 면역 반응의 숙주 내에서 당해의 조성물 또는 백신에 대해 면역학적 반응을 유도하는 적어도 하나의 항원을 함유하는 문제의 조성물을 의미한다. 일반적으로, "면역학적 반응"은 다음과 같은 효과 중 하나 이상을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다: 당해의 조성물 또는 백신에 포함된 항원 또는 항원들에 특이적으로 지향성인, 항체, B 세포, 헬퍼 T 세포, 억제인자 T 세포 및/또는 세포독성 T 세포 및/또는 감마-델타 T 세포의 생산 또는 활성화. 숙주는 새로운 감염에 대한 내성이 증강되고/되거나 질환의 임상적 중증도는 감소될 정도로 치료적 또는 보호적 면역학적 반응을 나타내는 것이 바람직하다. 이러한 보호는 감염 숙주에 의해 일반적으로 표시되는 임상적 징후들의 감소 또는 결여, 더욱 빠른 회복 시간 및/또는 감염 숙주의 조직 또는 체액 또는 분비물에 존재하는 세균 역가 또는 지속기간의 저하에 의해 증명될 것이다.

"엠.보비스 감염의 징후"는 야생형 엠.보비스에 감염된 소가 일반적으로 경험하는 임상적 증상(들) 및 병리를 모두 포함하는, 엠.보비스에 의해 유발된 감염 또는 질환의 징후를 의미한다. 이러한 감염 또는 질환의 징후는 다양한 형태로 나타날 수 있으며, 그 예로는 열, 우울, 식욕부진, 노작성호흡, 비강 및 안구 배출물, 기침, 재채기, 가쁜호흡, 그렁거림, 절름발이 및 부종 관절, 중이염, 내이 염증의 분비물, 유산 및 다른 생식 장애, 횡와, 호흡기 감염, 머리 기울임, 운동실조, 관절염, 유방염, 이염, 각결막염, 활액막염, 늑막염, 폐 병변, 폐 경변 및 폐 결절 형성, 활액 증가, 비대 관절낭 및 심지어 사망을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.

본 발명의 목적상, "고 계대 균주"는 시험관내 세포 배양물에서 10회 이상, 바람직하게는 적어도 20회, 더욱 바람직하게는 적어도 30회, 더 더욱 바람직하게는 적어도 40회, 더 더욱 바람직하게는 적어도 50회, 더 더욱 바람직하게는 적어도 55회, 더 더욱 바람직하게는 적어도 60회, 더 더욱 바람직하게는 적어도 70회, 더 더욱 바람직하게는 적어도 80회, 더 더욱 바람직하게는 적어도 90회, 더 더욱 바람직하게는 적어도 95회, 더 더욱 바람직하게는 적어도 100회, 더 더욱 바람직하게는 적어도 102회, 가장 바람직하게는 적어도 106회 계대배양한 엠.보비스 균주를 의미한다.

"폐 병리 평가"는 부검 후의 폐의 관찰, 예컨대 경화, 병변 및 결절 형성의 평가뿐만 아니라 늑막염 및 체류축적을 비롯한 흉강의 평가를 의미한다.

"약독화"는 병원체의 독성을 감소시키는 것을 의미한다. 본 발명에서, "약독화"는 "무독성"과 동의어이다. 본 발명에서, 약독화된 세균은 엠.보비스 감염의 임상적 징후를 일으키지는 않지만, 표적 포유동물에서 면역반응을 유도할 수 있도록 독성이 감소된 것이나, 또한 약독화된 엠.보비스로 감염된 동물에서 임상 징후의 발생률 또는 중증도가 비약독화된 엠.보비스로 감염된 동물 및 약독 세균의 투여를 받지 않은 동물의 "대조군"에 비해 감소된 것을 의미할 수도 있다. 이러한 상황에서, "감소/감소된"이란 용어는 전술한 대조군에 비해 적어도 10%, 바람직하게는 25%, 더 더욱 바람직하게는 50%의 감소, 가장 바람직하게는 100% 이상의 감소를 의미한다. 따라서, 약독화된 무독성 엠.보비스 균주는 변형 생(生) 엠.보비스 세균을 함유하는 면역원성 조성물에 혼입시키기에 적합한 것이다.

본 발명의 목적에서 "유효량"은 동물에서 엠.보비스 감염의 발생률을 감소시키거나 중증도를 경감시키는 면역 반응을 유도할 수 있는 면역원성 조성물의 양을 의미한다. 특히, 유효량은 용량당 10E3 내지 10E10, 바람직하게는 10E6 내지 10E10 콜로니 형성 단위(CFU)를 의미한다.

"백신접종체가 엠.보비스에 노출되거나 야생형 엠.보비스 균주에 의해 감염될 때, 엠.보비스 감염과 관련된 임상적 징후 및/또는 엠.보비스 감염 자체가 시판 백신에 비해 감소될 정도로 향상된 효능"은 본 발명에 의해 교시된 바와 같이 계대배양된 균주로부터 제조된 백신을 본 발명 전에 이용할 수 있었던 엠.보비스 백신과 비교했을 때 엠.보비스 감염의 임상적 징후의 발생률 또는 중증도의 감소를 의미한다. 이러한 상황에서, 백신접종되지 않은 동물 또는 본 발명 전에 이용할 수 있었던 엠.보비스 백신으로 백신접종된 동물은 본 발명에 따른 엠.보비스 면역원성 조성물을 투여받은 동물에서보다 적어도 30%, 가능하다면 더 바람직하게 적어도 40%, 더 더욱 바람직하게 적어도 50%, 더 더욱 바람직하게 적어도 60%, 더 더욱 바람직하게 적어도 70%, 더 더욱 바람직하게 적어도 75%, 더 더욱 바람직하게 적어도 80%, 더 더욱 바람직하게 적어도 85%, 더 더욱 바람직하게 적어도 90%, 가장 바람직하게 적어도 95% 이상 중증이거나 우세한 엠.보비스 감염의 임상 징후를 보유할 것이다.

"장기 지속적인 보호"는 식육용 동물의 경우 적어도 3주 동안, 더욱 바람직하게는 적어도 6개월 동안, 더 더욱 바람직하게는 적어도 1년, 더 더욱 바람직하게는 적어도 2년 동안 지속적이고, 낙농용 동물의 경우에는 적어도 6개월, 더욱 바람직하게는 적어도 1년, 더 더욱 바람직하게는 적어도 2년, 더 더욱 바람직하게는 적어도 3년, 더 더욱 바람직하게는 적어도 4년 동안 지속적인 "향상된 효능"을 의미할 것이다. 낙농용 동물 및 식육용 동물에서 장기 지속적인 보호는 식육용 동물이 고기로 판매되는 평균 연령 및 낙농용 동물이 우유 생산 수명이 끝나는 연령까지 지속될 수 있는 것이 가장 바람직하다.

본 명세서에 사용된 "그러한 투여를 필요로 하는" 또는 "그러한 투여 치료를 필요로 하는"이란 용어는 투여/치료가 본 발명에 따른 면역원성 조성물을 투여받은 동물의 건강에 있어서의 부양이나 향상 또는 그 동물의 건강에 미치는 임의의 다른 의학적 양성 효과와 관련이 있다는 것을 의미한다.

본 명세서에 사용된 "DNA 핑거프린팅"은 WO2008-030619에 기술된 바와 같이 삽입 서열 사이의 DNA를 증폭시키고 증폭된 산물의 패턴을 측정하여 실시되는 세균 균주의 신속한 동정방법을 의미한다. 간략히 설명하면, 세균 삽입 서열에 대하여 설계된 외향성(outwardly facing) 프라이머 조합(전위요소) 및 PCR을 사용하면 세균 종 분리물에 고유한 패턴이 수득된다. 이 패턴을 그 다음 유행병학 또는 계통발생과 같은 일을 위해 비교할 수 있다. DNA 핑거프린팅의 바람직한 방법 중 하나는 PCR 및 단일 또는 여러 세균 삽입 서열에 대하여 설계된 외향성 프라이머의 조합을 이용한다. 이러한 방법은 인접 IS로부터 증폭 산물을 생산한다. PCR 증폭이 완료된 후, 산물을 분리(한천 겔)하여 증폭 산물의 분자량에 따라 밴딩 패턴을 수득하고, 이는 세균 종 분리물의 고유 성질이다. 바람직한 방법은 외향성 프라이머를 이용하여 멀티플렉스(multiplex) PCR을 수행하는 것이다. 멀티플렉스 PCR은 다수의 프라이머 세트를 이용해서 한 반응 중에 당해의 다수의 표적을 동시에 증폭시킬 수 있는 변형 PCR이다. 물론, 당업계에 공지된 다른 분자 기반의 핑거프린팅 방법도 이용할 수 있다.

"삽입 서열"(IS)은 전위요소로 작용하는 짧은 DNA 서열이다. IS는 일반적으로 길이가 약 700 내지 2500bp로, 다른 종류의 전위요소에 비해 비교적 작다. 이들은 전위 활성에 연관된 단백질을 암호화하고, 이 단백질은 IS를 이동시키는 효소 반응을 촉진시킨다. IS 요소는 특정 종에 고유하거나 분류 그룹 간에 공유될 수 있다. 일반적으로, 상기 삽입 서열은 다수의 카피가 있지만, 특정 전위요소마다 고유의 위치에 존재한다.

따라서, 다른 관점에 따르면, 본 발명은 의약으로서, 바람직하게는 수의학용 의약으로서 사용되는, 다수의 계대 또는 연속 약독화를 통해 약독화된 엠.보비스 균주의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 다른 관점에 따르면, 전술한 바와 같이 약독화된 엠.보비스 균주는 엠.보비스에 의해 유발된 감염을 예방 또는 치료하기 위해 본 명세서에 기술된 바와 같이 약제학적 조성물의 제조에 사용될 수 있다. 전술한 바와 같이, 이러한 약제학적 조성물/백신 조성물은 엠.보비스에 의한 감염에 민감한 동물의 치료 및/또는 예방에 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 관점에서, 본 발명은 본 발명 전에 사용되던 백신으로 백신접종되거나 백신접종되지 않은 동물에 비해 본 발명에 따른 면역원성 조성물을 투여한 야생형 엠.보비스 감염 동물과 관련된, 엠.보비스 감염 징후의 중증도 감소 또는 동물 무리 중의 야생형 감염의 발생률의 경감을 포함하는 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 또한, 본 발명에 따른 백신의 투여는 엠.보비스로 감염되기 시작하는 무리 중의 동물 수를 감소시킨다. 이러한 방법은 일반적으로 앞서 개시한 방법을 통해 약독화된 엠.보비스 균주의 치료적 유효량을 그러한 치료를 필요로 하는 피검체 또는 피검체 무리에게 투여하는 것을 수반한다. 임상 증상은 발생률 또는 중증도가 백신접종되지 않거나 본 발명 전에 이용할 수 있었던 엠.보비스 면역원성 조성물이 백신접종된 후 야생형 엠.보비스로 감염된 동물에 비해, 적어도 10%, 더욱 바람직하게는 적어도 20%, 더 더욱 바람직하게는 적어도 30%, 더 더욱 바람직하게는 적어도 40%, 더 더욱 바람직하게는 적어도 50%, 더 더욱 바람직하게는 적어도 60%, 더 더욱 바람직하게는 적어도 70%, 더 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 더 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95% 정도 경감되는 것이 바람직하다.

도 1: 비강, 편도 및 폐 샘플로부터의 배양물 회수 빈도(0일, 14일, 28일, 35일 및 사후).
도 2: 비강, 편도 및 폐 샘플로부터의 PCR 검출 빈도(0일, 14일, 18일, 35일 및 사후)
도 3: 혈청 샘플로부터의 엠.보비스 특이적 항체의 평균 그룹 스코어(0일, 14일, 28일, 35일 및 42일)
도 4: 생 백신 I, II, III 및 백신 없음 그룹(SQ+IN 단독)의 혈청학 비교
도 5: 다양한 투여 경로를 이용한 생 백신 I의 혈청학 비교

이하 실시예는 본 발명의 바람직한 양태를 나타낸다. 여기에 어떠한 것도 본 발명의 전체 범위에 대한 제한으로 간주하지 않아야 한다.

실시예 1

본 실시예는 표적 종의 2가지 다른 항원공격(challenge) 모델을 이용해서 실험용 생(生) 엠.보비스 백신의 효능을 평가했다.

재료 및 방법

연령이 4 내지 8주령인 35마리의 초유 무섭취(CD) 홀스타인 송아지를 사용했다. 모든 동물은 포함 기준을 만족시켰고, 즉 엠.보비스 음성인지, 그리고 항원공격 시에 건강이 양호한지를 검사했다. 송아지는 먼저 4개의 그룹 중 하나로 무작위로 지정했다. 그룹 1 내지 3은 각각 송아지 9마리, 그룹 4는 송아지 8마리를 함유했다. 그룹 1과 2의 송아지에게는 106회 계대배양한 엠.보비스 분리물 052823의 배양 원액인 생 백신 1(05-2823-1A-3A P106+)(ATCC 수탁번호 PTA-8694)을 백신접종한 반면, 그룹 3과 4의 송아지에게는 배지만을 백신접종했다. 그룹 1과 2의 백신 분리물은 자연 발생의 질병 발생으로부터 수득해서, 그 다음 엠.보비스에 적당한 배지에서 106회 연속 계대배양했다. 배양물은 연구 전에 결정된 접종 배양물의 적당한 용적을 접종한 후 37℃에서 24±2시간 동안 증식시켰다. 이 분리물은 희석없이 사용했다. 백신접종 전 및 후 평균 농도는 2.1E9 CFU/ml인 것으로 확인되었다. 백신은 피하로 2ml 용량, 비내로 2ml 용량(각 콧구멍당 1ml씩)을 투여했다. 모든 연구 송아지들에게 독성 엠.보비스를 항원공격하여 자연발생의 감염 및 질환을 유도했고, 그룹 1과 3에게는 높은 항원공격 용량을, 그룹 3과 4에게는 낮은 항원공격 용량을 투여했다.

시험 물질의 용량과 투여는 표 1에 정리했다.

비강 면봉채취 샘플과 혈액 샘플은 0일, 14일, 28일, 35일 및 42일에 채취했다. 부검 시, 폐 샘플을 취하고, 편도 면봉채취 샘플은 모든 송아지로부터 수집하고 관절 면봉채취 샘플은 임상적 이상이 있는 동물로부터 채취했다. 또한, 샘플은 침습 부위를 나타내는 특정 동물의 다른 위치에서 채취했다. 모든 경우마다, 3개의 멸균 면봉채취물은 가능한 한 무균적으로 각 부위 주위를 수초 동안 문지른 다음 제거했다. 면봉채취물 중 2개는 배지가 담긴 개별 수송 용기에 넣고 하나는 배지가 없는 수송 용기에 넣었다. 표 2는 각 송아지에서 채취한 샘플을 정리한 것이다.

검사

미생물 검사를 위해, 면봉채취물을 수송 배지에 넣고, 엠.보비스 분리를 위해 조직 샘플을 이동시켰다. 간략히 설명하면, 면봉채취물은 5ml 마이코플라즈마 선택 브로쓰에 넣고 휘저었다. 폐 조직에서는 소량의 샘플(약 5mm)을 절단해서 마이코플라즈마 배지 2ml에서 균질화했다. 균질화액 100㎕를 마이코플라즈마 선택 브로쓰에 첨가했다. 배양물은 37℃/5% CO₂에서 항온처리했다. 4 내지 14일 후, 브로쓰를 증식에 대해 조사하고 분리용 평판에 계대배양했다. 모든 양성의 계대배양 샘플은 -70℃에서 보관했다.

PCR을 위해, 수송 배지에 넣지 않은 각 송아지의 면봉채취물과 조직 샘플을 DNA 추출 및 엠.보비스의 uvrC 유전자에 특이적인 프로브 및 프라이머를 이용한 PCR 검사를 위해 이동시켰다. PCR 검사 결과는 엠.보비스 DNA 검출에서 양성 또는 음성으로 표현되었다.

혈청 검사를 위해서는 혈청 샘플을 시판 ELISA(Biovet, Canada)로 이 검사 키트에 제공된 프로토콜을 이용해서 검사했다. ELISA 결과는 광학밀도(OD) 판독값으로 나타냈다. 샘플의 OD는 검사 키트에 포함된 양성 대조군에 의해 확립된 양성도(Positivity) 수준(평균 ODp x 0.3)과 비교했다. 그 다음, 양성 결과는 다음과 같은 스케일로 해석되었다:

조직병리/IHC 검사를 위해, 포르말린 고정된 조직을 헤마톡실린/에오신 염색 슬라이드 및 엠.보비스에 특이적인 모노클로날 항체를 이용한 면역조직화학법으로 검사했다.

임상 검사를 위해, 일반적인 관찰은 0일부터 28일까지 매일 실시하고, 그 다음 임상적 관찰은 28일부터 안락사 및 부검 시까지 실시했다. 기준에서 벗어난 임상적 및 일반적인 관찰을 메모해서 기록했다.

부검 시에, 각 송아지마다 흉강과 기관지를 조사하여 육안 관찰을 기록했다. 추가 검사와 샘플 수집을 위해 각 송아지로부터 폐와 약 6인치의 기관지를 본래대로 분리했다. 폐의 각 세트마다 등쪽과 배쪽의 폐 표면을 각 사진마다 적당한 이표를 달아 사진촬영했다.

폐 병리를 위해, 각 폐엽을 육안과 촉진으로 조사하여 엠.보비스로 인해 각 폐엽마다 존재하는 병리 정도(백분율)를 측정했다. 각 폐엽 백분율을 칭량하고 이를 합하여 병리가 있는 총 폐의 백분율을 측정했다.

관절 병리는 감염 관절을 조사하고 총 관찰을 기록해서 검사했다.

데이터 분석을 위해, 데이터를 정리했다. 임상 증상 및 육안 병리의 감소 백분율은 다음 식으로 계산했다: 감소율% = [1-(처리/무처리)]*100

또한, 그룹 2와 3 각각의 동물 1마리와 그룹 4의 동물 2마리는 37일째 인도적 이유 때문에 제거했다.

결과

항원공격전(pre-challenge) 임상 평가는 1일부터 26일까지 실시했다. 이 시기의 연구 동안에는 묽은/수분성 대변, 우울, 귀 처짐 및 기면을 관찰했다. 적당한 수의학적 치료를 처치했다. 모든 관찰일에 모든 그룹에서 부작용이나 마이코플라즈마 특이적 임상 증상은 관찰되지 않았다. 항원공격후(post-challenge) 임상 평가는 27일에서 43일까지 실시했다. 이 시기의 연구 동안 확인된 모든 임상적 관찰은 기침, 노작성호흡, 우울, 식욕부진, 관절 부종, 절름발이 및 처진 귀였다. 항원공격후 기간 동안 임상 점수의 발생률은 이하 표 3에 정리했다. 그룹 1은 송아지 9마리 중 2마리가 적어도 하나의 감염 임상 징후를 나타냈고, 2마리는 호흡기 징후를 나타냈으며, 1마리는 관절 감염의 징후를 나타냈다. 그룹 3은 모든 송아지가 적어도 하나의 임상 징후를 나타냈고, 7마리는 호흡기 징후를 나타냈으며 3마리는 관절에 감염 징후를 나타냈다. 그룹 2는 송아지 9마리 중 4마리가 적어도 하나의 임상 징후를 나타냈고, 호흡기 징후를 나타내는 송아지는 없었으며, 4마리는 관절 감염의 징후를 나타냈다. 그룹 4는 송아지 7마리가 적어도 하나의 임상 징후를 나타냈고, 1마리가 호흡기 징후를 나타냈으며 7마리가 관절 감염 징후를 나타냈다.

폐는 부검시에 수집하고 엠.보비스 감염과 관련된 병변에 대해 관찰했다. 동물은 경화 및 결절 형성과 같은 병리학적 특징의 변동성을 나타냈다. 폐 침습 결과는 육안 병리가 엠.보비스 감염과 관련된 총 폐의 백분율을 반영하는 스코어링 시스템을 이용한 백분율로 나타냈다. 몇몇 경우에, 폐 백분율의 측정은 유착 또는 병변의 비정형성에 의해 방해되었다. 표 4는 임의의 양의 폐 병변을 나타내는 개체 비, 폐 침습의 범위 백분율/평균 백분율을 정리한 것이다. 폐 병리 점수에서 그룹 3은 대부분의 송아지의 감염을 나타냈고(9/9), 그룹 2는 감염 송아지 수가 가장 적었다(2/9).

부검 시에, 전에 임상 증상(부종 또는 절름발이)을 나타냈던 동물의 관절을 육안 병리 상태에 대해 조사했다. 감염 부위는 동물마다 달랐고, 손목뼈, 비절, 네발무릎관절, 구절 및/또는 팔꿈치를 포함할 수 있다. 동물들은 심한 부종, 활액 증가, 비정상적 유체 출현 및 관절낭 비대를 나타냈다. 더욱 심하게 감염된 송아지에서는 관절 표면의 미란으로 피브린이 나타났다. 관절액 및/또는 표면 면봉채취물의 샘플은 배양하여 엠.보비스의 존재에 대해 검사했다. 관절에 육안 병리적 특징의 존재는 이하 표 5에 정리했다.

비강 계대배양물은 0일, 14일, 28일 및 35일에 면봉으로 샘플을 채취한 다음, 부검 시에 샘플을 채취했다(43일). 또한, 사후에 편도 샘플은 면봉으로 채취했고, 대표 폐 조직을 회수했다. 도 1과 2는 마이코플라즈마 선택 배양에 의한 회수 빈도 또는 엠.보비스 특이적 PCR에 의한 검출 빈도를 나타낸다. 도 1에 도시된 바와 같이, 부검 후 편도를 샘플 채취했을 때 모든 그룹에서 100% 회수율을 나타냈다. 부검 후 폐에서도 그룹 1과 3에서 100% 회수율을 나타냈다. 그룹 2는 폐에서 최소량(약 60%)이 회수되었고, 그룹 4는 약 90% 회수되었다. 연구 35일째 비강에서 샘플을 채취할 때까지 세균 엠.보비스가 회수되는 그룹은 없었으며, 35일째 회수를 나타내는 유일한 그룹은 그룹 4였다(25%). 그룹 2를 제외한 모든 그룹은 부검 후 비강 샘플에서 회수를 나타냈다.

모든 샘플은 엠.보비스에 대한 혈청 반응을 모니터하기 위해 Biovet 엠.보비스 ELISA로 검사했다. 혈청전환은 양성도 OD의 그룹별 승수에 따라 점수를 매겼다. 다음 표는 0일, 14일, 28일, 35일 및 42일에 각 그룹에서 검출된 평균 혈청 점수를 나타낸다. 도 3은 혈청 샘플로부터 엠.보비스 특이적 항체에 대한 평균 그룹 점수를 나타낸 것이다. 유효 체액성 면역반응을 나타내는 혈청전환은 백신 1차 용량 이후 14일 이내에 검출되었고, 이 면역반응의 양호한 지속은 1차 백신접종 이후 적어도 42일 동안, 그리고 백신 2차 용량 이후 28일 동안 엠.보비스에 대한 측정할 수 있는 혈청학적 반응에 의해 분명하게 나타났다. 그룹 1의 점수는 28일째 시작하는 다른 모든 그룹보다 일정하게 높았다. 그룹 1과 2는 14일째 동일했다(1.5 ELISA 점수). 그룹 4는 14 내지 35일 중에서 가장 낮았고, 42일째 세 번째(약 2.2)가 되었다.

결론

본 연구는 2회 투여로, 각각 피하 및 비내로 제공된 송아지, 및 표적 종의 항원공격 모델 중의 생(生) 엠.보비스 백신의 효능을 평가했다. 항원공격 모델은 고 용량 호흡기 투여 및 저 용량 호흡기 투여를 포함했다. 또한, 본 연구는 효능, 면역성 개시 및 백신의 1회 투여 및 2회 투여 이후의 간접 평가에 의한 면역성의 지속기간, 혈청전환 또는 체액성 면역반응을 평가했다. 면역성의 개시 및 백신접종 이후 면역성의 지속기간도 이와 같이 증명했다.

항원공격 분리물 및 백신 엠.보비스 분리물은 다른 자연 감염된 동물에서 유래되었다. 항원공격물로 사용된 분리물은 이전에 실험 항원공격 동안 폐 및 관절 질환을 모두 유발하는 것으로 밝혀져 있고, 복합 분리물 항원공격 연구에서 주로 사용되었다. 백신 분리물은 본래 진단 샘플에서 유래된 고 계대배양 분리물(계대배양 106회)이다. 또한, 항원공격 분리물 및 백신 분리물의 유전자형은 본 명세서에 기술된 핑거프린팅법을 사용할 때 상이한 것으로 밝혀졌다.

고용량 호흡기 항원공격된 그룹(1 및 3)에서, 호흡기 임상 증상(72%) 및 폐 병리상태(33%)의 감소가 백신접종된 그룹에서 관찰되었다. 백신접종되지 않은 그룹에서는 항원공격 후 2 내지 3일 사이에 대부분의 호흡기 임상 증상들이 나타났다. 표 3에 제시된 바와 같이, 백신은 엠.보비스에 의한 관절 질환의 발생률도 감소시켰다.

저용량 호흡기 항원공격된 그룹(2 및 4)에서, 폐 병리 상태의 감소율(96%)이 백신접종된 그룹에서 관찰되었다. 또한, 백신접종된 그룹은 관절 임상 증상의 인지가능한 감소율(50%)을 나타냈다.

폐 샘플(IHC, PCR 및 배양물) 및 관절 샘플(PCR 및 배양물)의 실험실 검사는 대부분 육안 병리상태와 일치했다. 불일치는 샘플채취 부위에서의 세균 분포 또는 검사를 위해 제공된 샘플 간의 세균 분포 때문일 수 있다. 백신 분리물은 항원공격 분리물이 아닌 백신 후보를 검출하기 위해 설계된 실험용 PCR 분석법에 의해 검사된 임의의 폐 샘플로부터 검출되지 않았다.

2주 간격으로 비내 및 피하 경로를 통해 2회 백신접종한, 고 계대배양으로 약독화된 신규 생 엠.보비스 백신 후보(05-2823 P106)는 다양한 항원공격 조건을 이용한 초유 무섭취 송아지의 마이코플라즈마 보비스 감염과 관련된 임상 증상 및 병리 상태(호흡기 및 관절)를 비롯한 엠.보비스 감염의 징후들의 감소를 제공하여 안전하고 효과적인 것으로 입증되었다. 엠.보비스 백신 및 면역학적 조성물은 또한 단일 용량 이후 14일 이내에 면역성의 개시를 자극하는데 효과적이었고 단일 용량 이후 적어도 42일의 지속기간을 나타냈다.

실시예 2

본 연구의 목적은 3가지 생 백신 후보들의 안전성 및 효능을 측정하는 것이었다.

재료 및 방법

본 연구에 사용된 송아지는 6±2주령의 송아지로, 6 그룹으로 나누었다. 표 7에 제시된 바와 같이, 그룹 1은 연구 0일(D0)과 D14에 엠.보비스 생 백신 I을 백신접종한 동물 10마리를 포함했다. 그룹 1은 D0 및 D14에 피하로 2ml, 비내로 2ml씩 백신접종되었다. 그룹 2는 동물 10마리를 포함했고, 본 연구 D0 및 D14에 2ml의 엠.보비스 생 백신 I을 피하로 백신접종했다. 그룹 3은 D0 및 D14에 엠.보비스 생 백신 I을 백신접종한 송아지 9마리를 포함했다. 그룹 3은 비내로 2ml를 백신접종했다. 그룹 4는 대조군으로, 어떠한 백신도 투여하지 않았다. 그룹 5는 엠.보비스 생 II 백신을 백신접종한 송아지 2마리를 포함했다. 그룹 5는 D0 및 D14에 피하로 2ml, 비내로 2ml씩 백신접종했다. 그룹 6은 엠.보비스 생 백신 III을 투여한 송아지 2마리를 포함했다. 그룹 6의 송아지는 D0 및 D14에 피하로 2ml, 비내로 2ml씩 투여받았다. 모든 그룹은 이어서 120ml의 항원공격 물질로 항원공격을 받았다. 모든 동물은 D28에 항원공격을 받았다.

표 8에 지적된 것처럼, 비강 면봉채취물은 0일, 14일, 27일, 35일 및 41일째 모든 송아지로부터 수집했다. 부검 시에, 편도 면봉채취물은 모든 송아지로부터 수집했다. 관절 면봉채취물은 임상 이상이 있는 동물에서 채취했다. 또한, 샘플은 부위 침습을 나타내는 특정 동물들의 다른 위치들에서 채취했다. 혈액은 0일, 14일, 27일, 35일 및 41일째 모든 송아지로부터 수집했다. 혈액은 각 송아지의 목정맥으로부터 무균적으로 수집했다. 부검 후, 폐는 폐 병변에 대해 기록했다.

결과 및 고찰

항원공격전 임상 징후

임상 평가는 -1일부터 28일까지 실시했다. 이 시기의 연구 동안에는 묽은/수분성 대변, 안구 분비물, 우울 및 기면과 같은 임상적 관찰이 눈에 띄었고, 백신접종의 효과로 인한 것은 없었다. 주사 부위의 관찰은 14일째 1차 주사 부위에서의 부종을 나타낸 송아지 6134(그룹 6)를 제외하고는 기록된 부작용은 없었다.

항원공격 후 임상 징후

임상적 관찰은 28일부터 42일까지 실시했다. 이 시기의 연구 동안 확인된 임상적 관찰은 기침, 노작성호흡, 우울, 관절 부종, 절름발이 및 처진 귀였다. 임상 징후는 마이코플라즈마 보비스 감염의 전형적인 3종류(호흡기, 관절 및 기타)로 분류되었다. 호흡기 징후는 기침, 빠른/노작성 호흡 및 비강 분비물을 포함했다. 관절 징후는 관절 부종 및 절름발이를 포함했다. 다른 징후는 귀 처짐, 머리 기울어짐, 우울 및 식욕부진을 포함했다. 각 결과를 보여주는 표 9는 다음과 같다:

표 10은 호흡기로 세분하고, 마이코플라즈마 보비스 감염에 전형적인 관절 임상 징후를 확인시켜 주었다(배양물 및/또는 PCR). 또한, 심한 관절 침습으로 인한 조기 제거율도 기록했다.

폐 병리상태

부검 시에 폐를 수집해서 엠.보비스와 관련된 병변에 대해 관찰했다. 동물은 경화 및 결절 형성과 같은 병리학적 특징의 가변성을 나타냈다. 폐 침습의 결과는 마이코플라즈마 보비스 감염과 관련된 육안 병리상태를 보유한 총 폐의 백분율을 반영하는 스코어링 시스템을 이용하여 백분율로 나타냈다. 일부 증례에서, 폐 백분율의 측정은 유착 또는 병변의 비정형성으로 인해 방해되었다. 이하의 표는 폐 병변의 임의의 양을 보여주는 개체들의 비 및 범위 백분율/평균 폐 침습 백분율을 보여준다.

관절 병리상태

이전에 임상 징후(부종 및/또는 절름거림)를 나타냈던 동물의 관절은 부검 시에 육안 병리상태에 대해 조사했다. 영향을 받은 부위는 동물마다 달랐고 팔목, 비절, 네발무릎관절, 구절 및/또는 팔꿈치를 포함할 수 있다. 동물은 육안 부종, 활액 증가, 비정상 유체 출현 또는 관절낭 비대를 나타냈다. 더 심한 영향을 받은 송아지에서는 피브린이 존재했고 관절 표면의 미란이었다. 관절 액 및/또는 표면의 면봉채취물 샘플은 마이코플라즈마 보비스의 존재에 대해 배양 및 PCR로 검사했다. 임의의 약독화된 생 백신을 이용한 백신접종은 영향을 받은 송아지의 총 수를 성공적으로 감소시켰다.

비강, 편도 및 폐 샘플로부터 엠.보비스의 PCR 검출

비강 계대배양물은 0일, 14일, 27일, 35일 및 41일 또는 부검일에 각 동물로부터 면봉채취법으로 샘플채취되었다. 또한, 편도의 샘플은 사후에 면봉으로 채취하고, 대표 폐 조직을 회수했다. 다음 표는 일반 엠.보비스 마커(uvrC)를 표적으로 하는 실시간 PCR을 이용한 검출 빈도를 나타낸다. 또한, 편도 및 폐 조직은 최근 개발된 엠.보비스 항원공격 분리물에서는 발견되지 않고 모든 백신 후보들에서 발견되는 마커를 표적화하는 종점 PCR 분석법을 이용하여 분석했다. 예상한 바와 같이 PCR은 다양한 비강 면봉 샘플에서 엠.보비스 백신 및/또는 항원공격 미생물을 검출했다.

또한, 예상한 바와 같이 PCR은 비내 백신접종 후의 편도에서 약독화된 생 백신을 성공적으로 검출했고, 이에 반해 항원공격 미생물은 폐 및 편도 샘플에서 모두 높은 백분율로 검출되었다.

엠.보비스 혈청학

모든 샘플은 엠.보비스에 대한 혈청 반응을 모니터하기 위해 Biovet 엠.보비스 ELISA로 검사했다. 혈청전환은 양성도 OD의 그룹별 승수에 따라 점수를 매겼다. 다음 표는 0일, 14일, 27일, 35일 및 사후(사후는 특정 동물의 조기 제거로 인한 37일부터 41일까지의 연구일 범위를 나타낸다)에 각 그룹에서 검출된 평균 혈청 점수를 나타낸다. 백신접종 이후 관찰된 혈청전환은 상기 신백신이 빠른 개시 및 긴 지속기간을 보유한 송아지와 같이 백신접종된 동물에서 적당한 면역반응을 유발한다는 결론을 강화시킨다(도 4 참조).

고찰

본 연구의 목적은 표적 종에서 이중 항원공격(challenge) 모델 및 14일 간격의 다양한 2ml 투여 경로(SQ, IN, SQ+IN)를 이용한 백신(05-2823 P106)(PTA-8694)을 비롯한 3가지 신규의 실험적 생 마이코플라즈마 보비스 백신의 효능을 평가하는 것이었다. 항원공격 모델은 비경구 투여와 함께 기도를 통한 투여를 사용했다. 또한, 2가지 다른 생 백신 후보(05-249 P102(PTA-8696) 및 05-1902-1 P106(PTA-8695))은 SQ+IN 경로만을 이용해서 효능을 평가했다.

항원공격 및 백신 후보 마이코플라즈마 보비스 분리물은 여러 자연 감염된 농장에서 유래되었다. 총 용적 120ml의 항원공격 분리물을 이용한 절차는 앞에서 실험적 항원공격 동안 폐 병리와 관절 질환을 모두 유발하기 위해 투여했을 때 제시되었고, 복합 분리물 항원공격 연구에서 지배적이었다. 생 백신 후보는 본래 진단 샘플에서 유래된 고 계대배양 분리물이다. 백신 후보들의 고 계대배양은 마이코플라즈마 적합 배지에서 연속 한계 희석 동반에 의해 수행했다. 고 계대배양 백신 후보 05 2823 P106은 일부 마이코플라즈마 선택 한천 포뮬레이션에서 증식 제한을 나타냈지만, 저 계대배양 모 분리물은 동일한 특징을 나타내지 않았음을 유의한다. 또한, 항원공격 분리물 및 백신 분리물의 유전자형은 다른 것으로 밝혀졌다(핑거프린팅법에 의해).

백신 장점을 평가하기 위해 본 연구 동안 다수의 매개변수를 조사했다. 이 매개변수 중에서, 동물 제거율과 관절 임상 증상은 관절 보호의 1차 지표로 사용했다. 폐 병리상태(총 폐 병변 백분율)는 폐 보호의 1차 지표로 사용했다. 조직으로부터 유기체의 검출, 관절 분포 및 혈청학과 같은 기타 데이터는 백신접종 후 엠.보비스에 대한 혈청전환과 마찬가지로, 확인용 추가 데이터를 제공했다.

모든 그룹은 폐 병변의 감소, 관절 임상 증상 및 동물 제거율에 의해 입증되는 것처럼 경로 또는 경로 조합에 상관없이 백신 후보 마이코플라즈마 보비스 생백신 I(05-2823 P106)을 투여받은 후에 질환 경감성 폐 및 관절 보호 장점을 보여주었다. SQ와 IN의 조합 경로(그룹 1)는 단일 경로만의 그룹에 비해 폐 병변의 최대 감소(86%)를 초래했다. 또한, 폐 병변, 관절 임상 증상 및 제거율 감소의 결과는 SQ 및 IN 복합 경로를 통한 2종의 다른 백신 후보 생백신 II(05-249 P102) 및 생백신 III(05-1902-1 P106)에 의한 유익을 확인시켜준다. ELISA 결과는 단일 백신접종 후 면역성의 개시가 14일이 되자마자 시작되고 면역성의 지속기간이 적어도 41일임을 확인시켜주면서 모든 백신 후보들로의 백신접종에 대한 강한 체액성 반응을 증명했다(도 5 참조).

모든 백신 후보들은 안전성인 것으로 증명되었다. 백신을 투여받은 모든 그룹의 동물들은 백신접종 기간 동안 임상 증상을 전혀 나타내지 않았고, 생백신 III(05-1902-1 P106)을 투여받은 동물 1마리만이 주사 부위에서 반응성을 나타냈지만, 이 반응성은 무시할만한 것이었다. 또한, PCR 결과는 IN 경로를 통해 백신 후보를 투여받은 그룹만의 편도 조직으로부터 비항원공격 엠.보비스 검출 및 IN과 SQ 경로를 통해 생백신 I(05-2823 P106)을 투여받은 한 동물에서만 폐 조직으로부터 비항원공격 엠.보비스의 검출을 나타냈다.

이 데이터는, 일반적으로 본 발명에 따라 제조되고 다양한 투여 경로를 통해 제공된 신규 약독화된 생 엠.보비스 백신이 독성 야생형 엠.보비스에 의한 감염으로 유발된 다양한 질환의 임상증상을 방어하고 감소시키기 위한 송아지의 백신접종용 면역학적 조성물로서 안전하고 효과적이며 조속한 개시와 장기 지속적인 보호를 나타낸다는 결론을 지지한다.

실시예 3

본 실시예는 WO 2008-030619에 개시된 바와 같은 방법 및 프라이머를 이용하여 DNA를 분리, 증폭 및 검출하여 엠.보비스 균주를 구별하는데 사용된 DNA 핑거프린팅법을 설명한다.

재료 및 방법

본 연구에는 마이코플라즈마 종 분리물을 사용했다. 분리물은 내부 공급원(in-house source) 또는 감염 동물에서 수득한 야생 분리물로부터 수득했다. 분리물은 1 내지 7일 동안 마이코플라즈마 선택 한천 및 브로쓰의 조합을 이용해서 증식시켰다. DNA를 분리하기 위해, 브로쓰 배양물을 침전시켜 펠릿화했다. 펠릿으로부터 DNA를 추출했다(Qiagen DNeasy Tissue Kit를 이용하고 분자등급의 물에 재현탁시킴). 게놈 DNA는 Picogreen(Invitrogen)을 이용해서 정량분석했다. 프라이머는 세균 게놈(마이코플라즈마 보비스)에 존재하는 공지된 삽입 서열(전위 요소)을 기반으로 설계하였고 WO 2008-030619에 개시되어 있다. 외향성 프라이머는 55-58℃의 Tm에서 요소 말단으로부터 수작업으로 선택했다(말단 반복 영역은 배제함). 그 다음, PCR 반응은 멀티플렉스 PCR 마스터 혼합물(Qiagen Multiplex PCR Kit)을 이용해서 수행했다. 반응물은 1x 마스터 혼합물, 각 프라이머 300nM 및 주형 DNA 1ng을 함유했다. 열순환 조건은 다음과 같다: 95℃ 15분; 94℃ 30초, 56.1℃ 90초, 72℃ 2분간 35회 순환; 72℃ 4분 동안 최종 연장 및 4℃ 유지. 증폭된 산물은 에티디움 브로마이드(Invitrogen E-gel)를 이용한 4% 아가로스 겔에서 분리하고 실온에서 50분 동안 진행시킨 뒤, UV광 하에 영상화했다.

결과 및 고찰

결과는 본 출원에 사용된 각 분리물이 독특한 핑거프린트를 갖고 있음을 보여주었다. 하지만, 실시예 2에 제시된 바와 같이, 각 분리물은 어떠한 백신 후보들과도 다른 핑거프린트를 가진 항원공격 분리물에 대해 교차보호를 제공하는데 있어서 효과적인, 약독화된 생 배양물 백신이었다. 3가지 야생 분리물, 05-2823 P106(PTA-8694), 05-249 P102(PTA-8696) 및 05-1902-1-P106(PTA-8695)을 증식시키고, 상기 프로토콜에 따라 DNA를 분리했다. 각 분리물의 DNA 2 내지 5ng을 WO 2008-030619에 개시된 서열번호 1 내지 8로 동정된 4 세트의 IS 프라이머 멀티플렉스를 이용하여 상기 프로토콜에 따라 증폭시켰다. 증폭된 산물은 에티디움 브로마이드(제조업체에 따라)를 함유하는 Invitrogen E-겔 4% 아가로스 겔에서 50분 동안 분리하고 UV광 하에 가시화했다. 모든 분리물은 고유한 패턴을 나타냈다. 패턴은 샘플 PCR 반응 조건 하에 독립된 분취량의 사용 시 재현되었다.

ATCC

PTA-8694

20071016

ATCC

PTA-8695

20071016

ATCC

PTA-8696

20071016

<110> Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. <120> Mycoplasma bovis vaccine <130> 40051-PCT <150> US 60/983,482 <151> 2007-10-29 <150> US 61/075,552 <151> 2008-06-25 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Mycoplasma bovis <400> 1 ccgcaagtta acttgtggtg c 21 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Mycoplasma bovis <400> 2 ggccattttc ttgtcagaac cacc 24 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Mycoplasma bovis <400> 3 gcttttactc tggtactaga tggtcttgg 29 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Mycoplasma bovis <400> 4 gtggcgttct tgacaataga acaattagtg 30 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Mycoplasma bovis <400> 5 gatgttcttc attgtctttt gcatcg 26 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Mycoplasma bovis <400> 6 cgacgagtta caagaaagtt ggc 23 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Mycoplasma bovis <400> 7 gaaacaccta tcccagtagg tacaagatc 29 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Mycoplasma bovis <400> 8 gtctacattg ttcaaaatgc gacattttgt ata 33

Claims

약독화된 무독성 엠.보비스(M. bovis) 세균 균주.
제1항에 있어서, 세균이 10회 이상 계대배양된, 약독화된 무독성 엠.보비스 세균 균주.
제1항 또는 제2항에 있어서, 세균이 50회 이상 계대배양된, 약독화된 무독성 엠.보비스 세균 균주.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, ATCC에 수탁번호 PTA-8694, PTA-8695 또는 PTA-8696 하에 기탁된 약독화된 엠.보비스 세균 균주, 이의 임의의 약독화된 자손 엠.보비스 세균 균주, 및 ATCC에 수탁번호 PTA-8694, PTA-8695 또는 PTA-8696 하에 기탁된 임의의 엠.보비스 세균 균주와 동일한 특징을 가진 임의의 약독화된 무독성 엠.보비스 세균 균주로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 약독화된 무독성 엠.보비스 세균 균주.
a. 엠.보비스 세균을 10회 이상 계대배양하는 단계;
b. 배양된 엠.보비스 세균을 수득하는 단계;
c. 단계 b)에서 수득한 배양된 엠.보비스 세균을 이의 병원성 및 면역원성에 대해 검사하는 단계; 및
d. 비병원성이지만 면역원성인 엠.보비스 세균을 증식시켜, 약독화된 엠.보비스 세균을 수득하는 단계
를 포함하는, 엠.보비스의 약독화 방법.
제5항에 있어서, 엠.보비스 세균이 50회 이상 계대배양되는 방법.
제5항 또는 제6항에 있어서, 엠.보비스 세균이 시험관내에서 계대배양되는 방법.
제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 병원성 검사가
a. 소를 계대배양된 엠.보비스 세균으로 감염시키는 단계; 및
b. 감염된 소를 엠.보비스 감염의 임상 증상들의 발생에 대해 모니터하는 단계를 포함하는 방법.
제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 검사가
a. 소를 계대배양된 엠.보비스 세균으로 감염시키는 단계; 및
b. 감염된 소에서 엠.보비스에 대한 체액성 항체반응의 발생을 모니터하는 단계를 포함하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 임의의 약독화된 무독성 엠.보비스 세균 균주의 생 세균을 포함하는 면역원성 조성물.
제10항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
제10항 또는 제11항에 있어서, 약독화된 무독성 엠.보비스 세균의 생 세균을 용량당 10E3 CFU 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제12항에 있어서, 약독화된 무독성 엠.보비스 세균의 생 세균을 용량당 10E3 내지 10E10 CFU 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제12항에 있어서, 약독화된 무독성 엠.보비스 세균의 생 세균을 용량당 10E6 내지 10E10 CFU 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물의 1회 용량이 1 또는 2ml로 제형화되는 면역원성 조성물.
제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 용량 투여 후 14일 내에 면역성의 개시를 자극하는데 효과적인 면역원성 조성물.
제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물의 단일 용량 투여 후 적어도 42일의 면역성 지속기간을 자극하는데 효과적인 면역원성 조성물.
제10항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 동물에게 투여되었을 때 면역반응을 유도하거나 유발하는 면역원성 조성물.
제10항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 백신인 면역원성 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 약독화된 무독성 엠.보비스 균주의 세균을 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합함을 포함하는, 제10항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물의 생산방법.
제10항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물의 유효량을 동물에게 투여함을 포함하여, 엠.보비스에 의해 유발된 감염을 치료 또는 예방하는 방법.
제10항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물의 유효량을 동물에게 투여함을 포함하여, 엠.보비스 감염의 징후를 감소시키는 방법.
제10항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물의 유효량을 동물에게 투여함을 포함하여, 엠.보비스 감염의 임상 징후의 중증도 또는 발생률을 감소시키는 방법.
제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 용량만이 동물에게 투여되는 방법.
제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성 조성물이 동물에게 1일령부터 투여되는 방법.
제25항에 있어서, 면역원성 조성물이 동물에게 1일령부터 16주령까지 투여되는 방법.
제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 2회 용량이 동물에게 투여되는 방법.
제27항에 있어서, 2차 용량이 1차 투여 후 적어도 10일 후에 투여되는 방법.
제28항에 있어서, 2차 용량이 1차 투여 후 14일 내지 28일에 투여되는 방법.
제21항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 동물이 소인 방법.