DE102004025452A1 - Vakzine enthaltend BVDV - Google Patents

Vakzine enthaltend BVDV Download PDF

Info

Publication number
DE102004025452A1
DE102004025452A1 DE102004025452A DE102004025452A DE102004025452A1 DE 102004025452 A1 DE102004025452 A1 DE 102004025452A1 DE 102004025452 A DE102004025452 A DE 102004025452A DE 102004025452 A DE102004025452 A DE 102004025452A DE 102004025452 A1 DE102004025452 A1 DE 102004025452A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
bvdv
term
pro
mutation
rns
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE102004025452A
Other languages
English (en)
Inventor
Gregor Meyers
Christiane Fetzer
Andreas T. Ege
Martina Von Freyburg
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc
Original Assignee
Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=34967522&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=DE102004025452(A1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH, Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc filed Critical Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
Priority to DE102004025452A priority Critical patent/DE102004025452A1/de
Priority to PL05741681T priority patent/PL1751276T3/pl
Priority to AU2005243488A priority patent/AU2005243488B2/en
Priority to CA2561719A priority patent/CA2561719C/en
Priority to DE602005012381T priority patent/DE602005012381D1/de
Priority to KR1020067026800A priority patent/KR100908798B1/ko
Priority to PT05741681T priority patent/PT1751276E/pt
Priority to NZ552088A priority patent/NZ552088A/en
Priority to CN201310269097.1A priority patent/CN103352030B/zh
Priority to ARP050102032A priority patent/AR049176A1/es
Priority to RS20090106A priority patent/RS50753B9/sr
Priority to AT05741681T priority patent/ATE420949T1/de
Priority to CN200580024345XA priority patent/CN1989240B/zh
Priority to MEP-2009-56A priority patent/ME01119B/me
Priority to SI200530619T priority patent/SI1751276T1/sl
Priority to UY28905A priority patent/UY28905A1/es
Priority to BRPI0510396-7A priority patent/BRPI0510396B1/pt
Priority to EP05741681.0A priority patent/EP1751276B9/de
Priority to PCT/EP2005/005377 priority patent/WO2005111201A1/en
Priority to ES05741681T priority patent/ES2321210T3/es
Priority to DK05741681.0T priority patent/DK1751276T5/da
Priority to JP2007517077A priority patent/JP5006782B2/ja
Priority to MXPA06013298A priority patent/MXPA06013298A/es
Priority to US11/132,686 priority patent/US7572455B2/en
Publication of DE102004025452A1 publication Critical patent/DE102004025452A1/de
Priority to CY20091100429T priority patent/CY1109036T1/el
Priority to US12/463,564 priority patent/US20090226488A1/en
Priority to JP2011247652A priority patent/JP5562316B2/ja
Priority to US13/655,278 priority patent/US20130039946A1/en
Priority to NL300745C priority patent/NL300745I1/nl
Priority to NL300743C priority patent/NL300743I2/nl
Priority to NL300744C priority patent/NL300744I1/nl
Priority to BE2015C035C priority patent/BE2015C035I2/fr
Priority to BE2015C036C priority patent/BE2015C036I2/fr
Priority to BE2015C034C priority patent/BE2015C034I2/fr
Priority to CY2015022C priority patent/CY2015022I2/el
Priority to HUS1500033C priority patent/HUS1500033I1/hu
Priority to LU92748C priority patent/LU92748I2/xx
Priority to HUS1500031 priority patent/HUS1500031I1/hu
Priority to LU92747C priority patent/LU92747I2/xx
Priority to LU92749C priority patent/LU92749I2/xx
Priority to CY2015021C priority patent/CY2015021I2/el
Priority to CY2015023C priority patent/CY2015023I2/el
Priority to ARP160101219A priority patent/AR104448A2/es
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/15—Reoviridae, e.g. calf diarrhea virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/543—Mucosal route intranasal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
    • C12N2770/24334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
    • C12N2770/24361—Methods of inactivation or attenuation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft attenuiertes BVDV mit mindestens einer Mutation in der kodierenden Sequenz für das Glycoprotein Erns und mindestens einer weiteren Mutation in der kodierenden Sequenz für Npro, welche vorzugsweise zu einer kombinierten Deaktivierung der von Glycoprotein Erns ausgehenden RNase-Aktivität zusätzlich zu der Deaktivierung der (angenommenen), von Npro ausgehenden immunmodulierenden Aktivität führt. Die Erfindung betrifft ferner auch Verfahren zur Attenuierung von BVDV, Nukleinsäuren, die für das BVDV kodieren, Zusammensetzungen und Vakzine, welche das erfindungsgemäße attenuierte BVDV beinhalten.

Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • 1. Technisches Gebiet
  • Die Erfindung betrifft den Bereich der Veterinärmedizin und insbesondere die Attenuierung des bovinen Virusdiarrhoe-Virus (BVDV).
  • 2. Hintergrundinformation
  • Pestiviren sind Verursacher wirtschaftlich bedeutsamer Tiererkrankungen in vielen Ländern weltweit. Die gegenwärtig bekannten Virusisolate sind in vier unterschiedliche Spezies klassifiziert worden, die gemeinsam einen Genus innerhalb der Familie Flaviviridae bilden.
    • I/II Bovines Virusdiarrhoe-Virus (BVDV) vom Typ 1, (BVDV-1), und vom Typ 2, (BVDV-2), verursachen die bovine Virusdiarrhoe (BVD) und die Mucosal Disease (MD) bei Rindern (Baker, 1987; Moenning und Plagemannn, 1992; Thiel et al., 1996). Die Aufteilung des BVDV in zwei Spezies gründet sich auf die signifikanten Unterschiede hinsichtlich der genomischen Sequenzen (zusammengefasst in Heinz et al., 2000), die auch ersichtlich sind aus der eingeschränkten Kreuzreaktivität mit neutralisierenden Antikörpern (Ridpath et al., 1994).
    • II Das klassische Schweinepestvirus (CSFV), ehemals unter dem Namen Schweinecholeravirus bekannt, ist für die klassische Schweinepest (Classical Swine Fever, CSF) bzw. Schweinecholera (Hog Cholera, HC) verantwortlich (Moenning und Plagemannn, 1992; Thiel et al., 1996).
    • III Das Border Disease-Virus (BDV) ist für gewöhnlich bei Schafen zu finden und verursacht die Border Disease (BD). Nach der intrauterinen Infektion mit BDV bei Lämmern können persistent infizierte, schwache Lämmer geboren werden,. die verschiedene Anomalien aufweisen, unter denen das „Hairy Shaker Syndrom" am bekanntesten ist (Moenning und Plagemannn, 1992; Thiel et al., 1996).
  • Pestiviren sind kleine umhüllte Viren mit einem einzelsträngigen RNA-Genom positiver Polarität, dem sowohl die 5'-Cap- als auch die 3'-Poly(A)-Sequenzen fehlen. Das virale Genom kodiert für ein Polyprotein mit ungefähr 4000 Aminosäuren, das durch co- und posttranslationales Processing unter Beteiligung zellulärer und viraler Proteasen zu den endgültigen Spaltprodukten führt. Die viralen Proteine sind im Polyprotein in der Reihenfolge NH2-Nprp-C-Erns-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NSSA-NS5B-COOH (Lindenbach und Rice, 2001) angeordnet. Protein C und die Glycoproteine Erns, E1 und E2 stellen strukturelle Komponenten des Pestivirus- Virions dar, wie es für den CSFV gezeigt wurde (Thiel et al., 1991). Dies gilt auch für den BVDV. E2 und in etwas geringerem Umfang Erns sind als Targets für die Antikörperneutralisierung identifiziert worden (Donis et al., 1988; Paton et al., 1992; van Rijn et al., 1993; Weiland et al., 1990, 1992). Erns fehlt ein typischer Membrananker und wird in beachtlichen Mengen von den infizierten Zellen sekretiert; diesem Protein wird eine RNase-Aktivität zugeschrieben (Hulst et al., 1994, Schneider et al., 1993; Windisch et al., 1996). Die Funktion dieser enzymatischen Aktivität für den viralen Lebenszyklus ist zur Zeit unbekannt. Die enzymatische Aktivität ist abhängig von der Anwesenheit zweier Aminosäurenabschnitte, die zwischen Pestivirus Erns und verschiedenen bekannten RNasen pflanzlichen oder fungalen Ursprungs konserviert sind. Beide dieser konservierten Sequenzen enthalten einen Histidinrest (Schneider et al., 1993). Der Austausch jeder dieser Reste gegen Lysin im Erns-Protein eines Vakzine-Stammes des CSFV hatte die Zerstörung der RNase-Aktivität zur Folge ( Hulst et al., 1998). Die Einführung dieser Mutationen in das Genom des Vakzine-Stammes des CSF-Virus hatte keinen Einfluss auf die virale Lebensfähigkeit oder die Wachstumseigenschaften, ergab jedoch einen Virus, der einen zytopathogenischen Phänotyp aufwies (Hulst et al., 1998). Auf ähnliche Art und Weise hat Meyer et al. gezeigt, dass eine RNase-negative Variante des virulenten CSFV-Stammes Alfort/Tübingen voll lebensfähig war. Jedoch zeigte die entsprechende Virusmutante keinen zytopathogenen Phänotyp (Meyers et al., 1999).
  • Npro stellt das erste Protein dar, das von dem langen offenen Leserahmen der Pestivirus-RNA kodiert wird. Npro stellt ein nicht-strukturelles Protein dar, das über Protease-Aktivität verfügt und sich selbst vermutlich schon während der Translation vom naszierenden Polyprotein abspaltet (Stark et al., 1993; Wiskerchen et al., 1991). Npro ist eine Cysteinprotease (Rümenapf et al., 1998), die nicht wesentlich für die Virusreplikation ist (Tratschin et al., 1998). Vor kurzem wurde gezeigt, dass Npro irgendwie mit der zellulären antiviralen Verteidigung interferiert, so die Annahme wahrscheinlich erscheint, dass es das Immunsystem eines infizierten Wirts moduliert (Rüggli et al., 2003). Mayer und Kollegen zeigten Indikationen für eine Attenuierung des CSFV in der Folge der Deletion des Npro-Gens auf (Mayer of al., 2004). Vorhandene BVDV-Vakzine zur Vorbeugung und Behandlung von BVDV-Infektionen weisen immer noch Schwachpunkte auf (Oirschot et al., 1999). Vakzine gegen das klassische BVDV-1 bieten nur teilweisen Schutz vor einer BVDV-2-Infektion, und geimpfte Muttertiere können persistent mit dem virulenten BVDV-2 infizierte Kälber gebären (Bolin et al., 1991, Ridpath et al., 1994). Dieses Problem ist wahrscheinlich der großen Unterschiedlichkeit der Antigene zwischen den Typ 1- und Typ 2-Stämmen zuzuschreiben, die am deutlichsten beim Glycoprotein E2, dem Hauptantigen für die Virusneutralisierung, hervortritt (Tijssen et al., 1996). Die meisten monoklonalen Antikörper gegen Typ 1-Stämme können nicht an Typ 2-Viren binden (Ridpath et al., 1994).
  • Zur Zeit verwendete Vakzine, die attenuierte oder abgetötete Viren oder virale Proteine, exprimiert in heterologen Expressionssystemen, umfassen, sind für CSFV und BVDV hergestellt worden. Abgetötete Vakzine (inaktivierter kompletter Virus) oder Untereinheiten-Vakzine (auf herkömmliche Art aufgereinigte oder heterolog exprimierte virale Proteine) sind bezüglich ihrer Fähigkeit, eine vollständige schützende Immunantwort auszulösen, Lebendvakzinen gegenüber sogar in Anwesenheit von Adjuvantien meist unterlegen. Die strukturelle Grundlage der Attenuierung von als Lebendvakzine verwendetem BVDV ist nicht bekannt. Diese Vakzine sind, obwohl attenuiert, meist mit Sicherheitsproblemen verbunden. Die Vakzinviren können bei trächtigen Tieren, beispielsweise bei Kühen, plazentagängig sein und zu klinischen Manifestationen im Fetus führen und/oder Kälber persistent infizieren. Daher können sie bei Zuchtherden mit trächtigen Kühen nicht angewandt werden. Trächtige Kühe sind zum Schutze der Feten getrennt von geimpftem Rind zu halten und dürfen selbst nicht geimpft werden. Des weiteren stellen Revertanten von attenuiertem lebendem BVDV eine ernsthafte Bedrohung der Tiere dar. Für herkömmlich abgeleitete attenuierte Viren, bei denen die Attenuierung mittels mehrfachen Passagen nach herkömmlichen Verfahren erreicht wird, bleibt der molekulare Ursprung sowie die genetische Stabilität der Attenuierung unbekannt und die Umkehr zum bösartigen Wildtyp schwer vorhersehbar.
  • Aufgrund der Bedeutung einer sowohl wirksamen wie sicheren und auch nachweisbaren Prophylaxe und Behandlung von Infektionen mit dem Pestivirus besteht ein starker Bedarf an verbessertem attenuiertem BVDV mit einem hohen Immunitätspotential wie auch an einem definierten Attenuierungsstatus, der sowohl vom pathogenen BVDV als auch von Zusammensetzungen und der BVDV-haltigen Vakzine unterschieden werden kann.
    •
  • Daher ist die der Erfindung zugrunde liegende technische Problemstellung die Bereitstellung eines verbesserten attenuierten BVDV zur Verwendung als attenuierte Lebendvakzine. Ein derart verbessertes attenuiertes BVDV sollte insbesondere (i) nicht plazentagängig sein und (ii) eine Immunität herbeiführen, die der viralen Übertragung durch die Plazenta vorbeugt und hiermit Trächtigkeitsproblemen wie Fetusabort oder Geburt von persistent infizierten Kälbern vorbeugt.
  • Kurzbeschreibung der Abbildungen
  • 1 Serumneutralisation gegen NY93/C (BVDV Typ II).
  • 2 Serumneutralisationsassay gegen KE9 (BVDV Typ I).
  • 3 Serumneutralisationsassay gegen NY93/C (BVDV Typ II).
  • Alle nachfolgenden Sequenzen zeigen auch die deletierten Regionen, mit Trennzeichen (–) bezeichnet, die ebenfalls nummeriert sind, während die Sequenzen des hier beigefügten Sequenzprotokolls fortlaufend nummeriert sind ohne die deletierten Regionen oder Aminosäurecodons.
  • 4 XIKE-A-cDNA-Sequenz
  • 5 XIKE-A-NdN-cDNA-Sequenz
  • 6 XIKE-B-cDNA-Sequenz
  • 7 XIKE-B-NdN-cDNA
  • 8 XIKE-C-NdN-Aminosäuresequenz
  • 9 XIKE-C-NdN-cDNA-Sequenz
  • 10 XIKE-C-cDNA-Sequenz
  • 11 XIKE-C-Aminosäuresequenz
  • 12 XIKE-A-Aminosäuresequenz
  • 13 XIKE-A-NdN-Aminosäuresequenz
  • 14 XIKE-B-Aminosäuresequenz
  • 15 XIKE-B-NdN-Aminosäuresequenz
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft attenuiertes BVDV, wobei zumindest eine Mutation in der kodierenden Sequenz für Glycoprotein Erns und zumindest eine weitere Mutation in der kodierenden Sequenz für Npro ist, welche vorzugsweise zu einer kombinierten Inaktivierung der vom Glycoprotein Erns ausgehenden RNase-Aktivität führt zusätzlich zur Inaktivierung der (vermuteten) von Npro ausgehenden immunmodulierenden Aktivität. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Attenuierung von BVDV, BVDV-kodierende Nucleinsäuren sowie Zusammensetzungen und Vakzine, welche das erfindungsgemäße attenuierte BVDV umfassen.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Definitionen der in der Beschreibung verwendeten Termini:
    Vor den Ausführungsformen der Erfindung soll angemerkt werden, dass die hierin und in den angefügten Ansprüchen verwendeten singulären Formen „ein" und „der/die/das" den Bezug zum Plural einschließen, es sei denn, dass sich aus dem Zusammenhang das Gegenteil ergibt. Folglich schließt der Verweis auf zum Beispiel „ein BVDV" die Vielzahl solcher BVDV ein, der Verweis auf die „Zelle" ist der Verweis auf eine oder mehrere Zellen und Entsprechungen hiervon, die dem Fachmann bekannt sind, usw.. Auch wenn anderweitig definiert, haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Termini dieselben Bedeutungen, wie sie dem üblichen Wissensstand eines Fachmanns auf dem erfindungsgemäßen Gebiet entsprechen. Obwohl alle den hierin verwendeten ähnliche oder entsprechende Verfahren und Materialien in der Praxis oder in den Versuchen der Erfindung verwendet werden können, werden die bevorzugten Verfahren, Vorrichtungen und Materialien nun beschrieben. Alle hierin erwähnten Publikationen werden durch Inbezugnahme inkorporiert zum Zwecke der Beschreibung und Offenbarung der Zelllinien, Vektoren und Methodologien, wie in den Publikationen dargelegt, welche im Zusammenhang mit der Erfindung verwendbar sein könnten. Hierbei ist nichts als Zugeständnis zu interpretieren, dass die Erfindung nicht das Vorrecht als frühere Erfindung gegenüber einer solchen Offenbarung in Anspruch nehmen könnte.
  • Der Ausdruck „Pestivirus", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf alle Mitglieder des Genus Pestivirus, einschließlich BVDV, CSFV und BDV, innerhalb der Familie der Flaviviridae.
  • Der Ausdruck „CSFV", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf alle Viren, die zur Spezies des Klassischen Schweinepestvirus (CSFV) im Genus Pestivirus innerhalb der Familie der Flaviviridae gehören.
  • Der Ausdruck „BVDV", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf alle Viren, die zur Spezies des bovinen Virusdiarrhoe-Virus vom Typ 1, (BVDV-1), und BVDV vom Typ 2, (BVDV-2), des Genus Pestivirus innerhalb der Familie der Flaviviridae gehören (Heinz et al., 2000). Die eher klassischen BVDV-Stämme vom Typ 1 und die dagegen erst vor kurzem entdeckten BVDV-Stämme vorn Typ 2 offenbaren einige wenige jedoch ausgeprägte Unterschiede in den Nucleotid- und Aminosäuresequenzen.
  • „Npro", wie es hier verstanden wird, betrifft das erste Protein, welches von dem viralen offenen Leserahmen kodiert wird und sich selbst von dem restlichen synthetisierten Polyprotein abspaltet (Stark, et al., J. Virol. 67:7088-7093 (1993); Wiskerchen, et al., Virol. 65:4508-4514 (1991)). Der Ausdruck kann in Abhängigkeit vom Kontext auch die verbleibenden „Npro"-Aminosäuren nach Mutation der kodierenden Nucleotidsequenz oder die kodierende Nucleotidsequenz für das Protein selbst betreffen. Die von „Npro ausgehende Protease-Aktivität" betrifft die Polypeptid-Spaltungsaktivität von „Npro".
  • „Erns", wie es hier verwendet wird, betrifft das Glycoprotein Erns, welches einen strukturellen Bestandteil des Pestivirus-Virions darstellt (Thiel et al., 1991). Erns fehlt ein typischer Membrananker und wird in beachtlichen Mengen von den infizierten Zellen sekretiert; diesem Protein wird eine RNase-Aktivität zugeschrieben (Hulst et al., 1994, Schneider et al., 1993; Windisch et al., 1996). Hier ist anzumerken, das der Ausdruck Glycoprotein EO in Publikationen oft gleichbedeutend mit Erns verwendet wird. Der Ausdruck kann in Abhängigkeit vom Kontext auch das mutierte Erns-Protein nach Mutation der kodierenden Nucleotidsequenz oder die kodierende Nucleotidsequenz für das Protein selbst betreffen. Die vom „Glycoprotein Erns ausgehende RNase-Aktivität" betrifft die RNA-Spaltungsaktivität des Glycoproteins, d.h. die Fähigkeit des Glycoproteins Erns, die RNA zu hydrolysieren. Der Ausdruck „Deaktivierung der vom Glycoprotein ausgehenden RNase-Aktivität" bezieht sich auf die Unfähigkeit bzw. eingeschränkte Fähigkeit eines modifizierten Glycoproteins Erns zur Hydrolyse von RNA im Vergleich zum unmodifizierten Wildtyp des Glycoproteins Erns.
  • Attenuierung: „Ein attenuiertes BVDV-Partikel", wie es hier verwendet wird, bedeutet, dass es einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen der Virulenz von erfindungsgemäßen attenuierten BVDV-Partikeln, den attenuierten BVDV-Partikeln, wie sie entsprechend eines erfindungsgemäßen Verfahrens attenuiert wurden, und den Wildtyp-BVDV-Isolaten, von den die BVDV-Partikel abgeleitet wurden, für die vorherrschenden klinischen Parameter Diarrhoe, Pyrexie und Letalität bei Tieren mit derselben Dosis, vorzugsweise 6 × 106 TCID50, gibt. Folglich verursachen die attenuierten BVDV-Partikel weder Diarrhoe, Pyrexie noch Letalität und können demzufolge in Vakzinen verwendet werden.
  • Deaktivierung von Erns, wie es hier verwendet wird, bedeutet RNase-Aktivität, die nicht signifikant über dem Wert liegt, der für nichtinfizierte Kontrollzellen in einem in Meyers et al., 1999, beschriebenen Test gemessen wurde.
  • Deaktivierung von Npro, wie es hier verwendet wird, meint die Vorbeugung oder beträchtliche Reduzierung der immunmodulierenden Aktivität von Npro mittels Mutation. In einer bevorzugten Ausführungsform verhindert oder reduziert diese Mutation beträchtlich die Interferenz von Npro durch die Induktion einer Interferonantwort durch die infizierten Zellen, wie es von Rüggli et al., 2003, beschrieben wurde. In diesem Falle würde die Deaktivierung von Npro den Zellen eine normale Interferonantwort ermöglichen.
  • "Processing-Signal", wie es hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Substanz, die das Erzeugen eines funktionellen N-Terminus des C-Proteins gewährleistet, insbesondere eine Substanz, die ausgewählt ist aus der Gruppe von Ubiquitin, LC3, SUMO-1, NEDD8, GATE-16 und GABA(A)RAP. Auch Proteasen aus der Gruppe Intein, Picorna-Virus 3C , Carido-Virus 2A und Chinaseuchenvirus p15 werden in der hier verwendeten Bedeutung als "Processing-Signal" verstanden. Jedes weitere ähnliche, dem Fachmann bekannte Processing-Signal, welches das Erzeugen eines funktionellen N-Terminus des C-Proteins gewährleistet, soll ebenfalls unter dem Ausdruck Processing-Signal zusammengefasst werden.
  • „Protein C" „C Protein" oder „C-Protein", wie es hier verwendet wird, bezieht sich auf einen strukturellen Bestandteil des Pestivirus-Virions (Thiel et al., 1991). „Protein C" ist das Capsid-Protein des Pestivirus. Der Ausdruck kann in Abhängigkeit vom Kontext auch das „Protein C" mit einem oder mehreren ausgetauschten Aminosäuren als Ergebnis einer Mutation der kodierenden Nucleinsäure betreffen.
  • Ein erfindungsgemäßes „Fragment" ist jede Untereinheit eines erfindungsgemäßen Polynucleotidmoleküls, d.h. jeder Subset. Für DNA ist dieses Fragment dadurch charakterisiert, dass es kürzer ist als die cDNA, die das gesamte virale Genom abdeckt.
  • Eine „funktionelle Variante" des erfindungsgemäßen Nucleotidmoleküls ist ein Nucleotidmolekül, das über eine biologische Aktivität verfügt (entweder funktionell oder strukturell), die im Wesentlichen der des erfindungsgemäßen Nucleotidmoleküls gleicht. Der Ausdruck „funktionelle Variante" schließt ebenso ein „ein Fragment", „eine funktionelle Variante", „Variante auf der Grundlage eines degenerierten Nucleinsäurecodes" oder „chemisches Derivat". Eine solche „funktionelle Variante" kann beispielsweise eine oder mehrere Nucleotidaustausche, -deletionen oder -insertionen tragen. Eine solche funktionelle Variante behält zumindest teilweise ihre biologische Aktivität bei, beispielsweise ihre Funktion als infektiöser Klon oder als Impfstamm, oder zeigt sogar eine verbesserte biologische Aktivität.
  • Eine „Variante auf der Grundlage eines degenerierten genetischen Codes" ist eine Variante, die daraus entsteht, dass eine bestimmte Aminosäure durch mehrere unterschiedliche Nucleotid-Triplets kodiert werden kann. Diese Variante behält zumindest ihre biologische Aktivität teilweise bei oder zeigt sogar eine verbesserte biologische Aktivität.
  • Ein Molekül „gleicht im Wesentlichen" einem anderen Molekül, wenn beide Moleküle über im Wesentlichen gleiche Nucleotidsequenzen oder biologische Aktivität verfügen. Folglich werden unter der Voraussetzung, dass zwei Moleküle über eine ähnliche Aktivität verfügen, in der hier gebräuchlichen Verwendung des Ausdruck als Varianten betrachtet, wenn die Nucleotidsequenz nicht identisch ist, und es werden zwei Moleküle mit ähnlichen Nucleotidsequenzen sogar dann in der hier gebräuchlichen Verwendung des Ausdruck als Varianten betrachtet, wenn ihre biologische Aktivität nicht identisch ist.
  • Eine Mutation, wie hier verwendet, betrifft die Modifikationen in den Nucleinsäuremolekülen, welche die erfindungsgemäßen Proteine/Aminosäuren kodiert. Diese Mutationen betreffen, aber beschränken sich nicht auf Substitutionen (Austausch einer oder mehrerer Nucleotide/Basenpaare), Deletionen (Entfernung von einem oder mehreren Nucleotiden/Basenpaaren) und/oder Insertionen (Addition von einem oder mehreren Nucleotiden/Basenpaaren). In der hier gebräuchlichen Verwendung kann eine Mutation eine einzelne Mutation oder mehrere Mutationen sein, weshalb oft der Ausdruck „Mutation(en)" verwendet wird und sowohl eine einzelne Mutation als auch mehrere Mutationen betrifft. Diese Mutationen umfassen, aber beschränken sich nicht auf Punktmutationen (einzelne Nucleotidmutationen) oder größere Mutationen, worin z. B. Teile der kodierenden Nucleinsäuremoleküle deletiert, substituiert werden und/oder eine zusätzliche kodierende Nucleinsäure insertiert wird. Diese Mutationen können eine Expression eines modifizierten Polypeptids aufgrund der Veränderungen in der kodierenden Sequenz ergeben. Solche modifizierten Polypeptide sind erwünscht, wie in der Offenbarung der Erfindung unten dargelegt.
  • Der Ausdruck „Vakzine", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, die zumindest einen immunologisch aktiven Bestandteil umfasst, der eine Immunantwort in einem Tier hervorruft, sowie möglicherweise, jedoch nicht notwendigerweise, eine oder mehrere zusätzliche Komponenten enthält, welche die immunologische Aktivität dieses Wirkstoffs verstärken. Eine Vakzine kann zusätzlich weitere Komponenten umfassen, die typisch für eine pharmazeutische Zusammensetzung sind. Der immunologisch aktive Bestandteil eines Impfstoffs kann ganze Viruspartikel entweder in ihrer Ursprungsform oder als attenuierte Partikel in sogenannten modifizierten Lebendvakzinen (MLV) umfassen, oder Partikel, die mittels geeigneter Verfahren zu sogenannten Totvakzinen (TV) deaktiviert wurden. In einer anderen Form kann der immunologisch aktive Bestandteil der Vakzine geeignete Elemente der genannten Organismen umfassen (Subunit-Vakzine), wobei diese Elemente erzeugt wurden entweder durch Zerstören des ganzen Partikels oder durch solche Partikel enthaltende Zuchtkulturen und sich optional anschließende Aufreinigungsschritte zur Bereitstellung der gewünschten Struktur(en), oder mittels synthetischer Prozesse, die ein geeignetes Verfahren mittels Verwendung eines geeigneten Systems auf der Grundlage von beispielsweise Bakterien, Insekten, Säugetieren und anderen Spezies zuzüglich sich optional anschließender Isolations- und Aufreinigungsverfahren einschließen, oder durch Herbeiführung solcher synthetischer Prozesse in Tieren, die eines solchen Impfstoffes mit direkter Inkorporation genetischen Materials unter Verwendung geeigneter pharmazeutischer Zusammensetzungen bedürfen (Polynucleotid-Impfung). Eine Vakzine kann eines oder gleichzeitig mehr als eines der oben beschriebenen Elemente umfassen.
  • Der Ausdruck „Vakzine", wie er hier verstanden wird, ist eine Vakzine zur Verwendung im veterinären Bereich, der antigene Substanzen umfasst und zum Zwecke der Herbeiführung einer spezifischen und aktiven Immunität gegen eine durch BVDV hervorgerufene Erkrankung verabreicht wird. Das erfindungsgemäße BVDV verleiht aktive Immunität, die passiv über Antikörper des Muttertieres gegen in ihm vorhandene immunogene und manchmal auch gegen Organismen mit verwandten Antigenen übertragen wird.
  • Zusätzliche Komponenten zur Verstärkung der Immunantwort sind Bestandteile, die gemeinhin als Adjuvantien bezeichnet werden, wie zum Beispiel Aluminiumhydroxid, Mineral- oder andere Öle oder Hilfsmoleküle, die den Vakzinen zugegeben werden oder durch den Körper nach entsprechender Induktion durch eine solche Zusatzkomponente erzeugt werden wie, aber nicht nur, Interferone, Interleukine oder Wachstumsfaktoren.
  • Eine „pharmazeutische Zusammensetzung" besteht im Wesentlichen aus einem oder mehreren Wirkstoffen, die in der Lage sind, physiologische, z. B. immunologische, Funktionen des Organismus, dem sie verabreicht wurden, oder Funktionen von Organismen, die in oder auf dem Organismus leben, zu modifizieren. Der Ausdruck schließt, ohne darauf beschränkt zu sein, Antibiotika oder Antiparasitika genauso ein wie andere Bestandteile, die gewöhnlich zur Erreichung bestimmter anderer Ziele, ohne Beschränkung hierauf, dienen, wie Verarbeitungseigenschaften, Sterilität, Stabilität, Machbarkeit hinsichtlich der enteralen oder parenteralen wie beispielsweise die orale, intranasale, intravenöse, intramuskuläre, subkutane, intradermale oder andere geeignete Verabreichung der Zusammensetzung, die Toleranz nach Verabreichung, die verzögerten Freisetzungseigenschaften. Ein nicht zur Einschränkung sondern allein zur Veranschaulichung dienendes Beispiel einer solchen pharmazeutischen Zusammensetzung könnte wie folgt zubereitet werden: Der Zellkulturüberstand einer infizierten Zellkultur wird mit einem Stabilisator (Spermidin und/oder BSA (bovines Serumalbumin)) gemischt und die Mischung anschließend mittels anderer Verfahren lyophylisiert oder dehydriert. Vor der Impfung wird diese Mischung dann in wässrigen (z. B. Satzlösung, PBS (phosphatgepufferte Salzlösung)) oder nichtwässrigen (Ölemulsion, Adjuvans auf Aluminiumgrundlage) Lösungen rehydratisiert.
  • Eine erfindungsgemäße Vakzine bezieht sich auf eine Vakzine laut obiger Definition, worin eine immunologisch aktive Komponente ein BVDV pestiviraler Abstammung oder eine abgeleitete Nucleotidsequenz ist, die zu mehr als 70% homolog zu jeder bekannten Pestivirussequenz (sense oder antisense) ist. Der Ausdruck „Lebendvakzine" betrifft eine Vakzine, die eine lebende, insbesondere eine lebende aktive virale Komponente umfasst.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Die Lösung der obigen technischen Problemstellung wird mit der Beschreibung und mit den in den Ansprüchen beschriebenen Ausführungsformen erreicht.
  • Überraschenderweise hat sich herausgestellt, dass das BVDV wirksamer attenuiert werden kann, wenn mindestens eine Mutation in die kodierende Sequenz für das Glycoprotein Erns und mindestens eine weitere Mutation in die kodierende Sequenz für Npro eingeführt worden ist, welche vorzugsweise eine kombinierte Deaktivierung der aus dem Glycoprotein Erns stammenden RNase-Aktivität zusätzlich zur Deaktivierung der aus Npro stammenden immunmodulierenden Aktivität zur Folge hat. Eine immunmodulierende Wirkung unter einem Aspekt ist für einen Pestivirus in exemplarischer Weise durch Rüggli et al., 2003, aufgezeigt worden, ohne für die aufgezeigte Funktion eingeschränkt zu sein.
  • Ein erfindungsgemäß attenuiertes BVDV kann vorteilhaft in Vakzinen eingesetzt werden. Dieses attenuierte BVDV stellt nun Lebendvakzine von hoher Immunogenität bereit. Überraschenderweise sind erfindungsgemäße BVDV darüber hinaus sicher für den Einsatz in trächtigen Tieren, da sie nicht plazentagängig sind. Dies ist beispielhaft in nicht einschränkender Form in Beispiel 3 für BVDV dargelegt.
  • Darüber hinaus ermöglichen es Lebendvakzine mit definierten Mutationen als Basis für die Attenuierung, die Nachteile der gegenwärtigen Generation von Vakzinen zu vermeiden. Ein weiterer Vorteil dieser Attenuierungsmutationen liegt in ihrer molekularen Einzigartigkeit, die ihnen die Verwendung als charakteristische Markierungen für ein attenuiertes BVDV und ihre Unterscheidung von BVDV des Umfelds ermöglicht. Daher stellt ein Aspekt der Erfindung ein attenuiertes BVDV bereit, das über mindestens eine Mutation in der kodierenden Sequenz für das Glycoprotein Erns und über mindestens eine Mutation in der kodierenden Sequenz für Npro verfügt. Vorzugsweise führt in einem solchen attenuierten BVDV die Mutation in der kodierenden Sequenz für das Glycoprotein Erns zur Deaktivierung der in Erns vorliegenden RNase-Aktivität und/oder die Mutation in der kodierenden Sequenz für Npro führt zur Deaktivierung des Npro.
  • Die Deaktivierung kann mittels jeder Mutation stattfinden, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Erns- und Npro-kodierenden Sequenzen bekannt sind, wobei die Mutationen jede in dem Abschnitt über „Definitionen" aufgeführte Mutation sein kann, wie Deletionen, Insertationsmutationen und/oder Austauschmutationen. Am meisten bevorzugt ist/sind die Mutation(en) Deletionen, da die Wahrscheinlichkeit einer Rückmutation zum Wildtyp bei Deletionen am geringsten ist.
  • Es wurde gezeigt, dass das Glycoprotein Erns ein disulfid-verbundenes Heterodimer von etwa 97 kD bildet, wobei ein jedes Monomer aus 227 Aminosäuren besteht, die den Aminosäuren 268 bis 494 des CSFV Polyproteins entsprechen, wie bei Rümenapf et al. 1993, beschrieben. Die Genomsequenz des CSFV vom Stamm Alfort/Tübingen ist in der GenBank/EMBL Datenbibliothek unter der Zugangsnummer J04358 hinterlegt. Die Aminosäuresequenz für den BVDV-Stamm CP7 kann ebenfalls bei der GenBank/EMBL Datenbibliothek (Zugangsnummer U63479) abgerufen werden. In dem BDVD CP7 Polyprotein entspricht das Erns-Protein den Aminosäuren 271 bis 497. Zwei von Aminosäuren gebildete Abschnitte sind im Glycoprotein Erns wie auch in einigen RNase-aktiven Proteinen pflanzlichen und fungalen Ursprungs hoch konserviert (Schneider et al., 1993). Diese zwei Abschnitte sind von besonderer Bedeutung für die enzymatische RNase-Aktivität. Wie beispielhaft für den Alfort-Stamm des CSFV in Meyers et al. für das virale Protein beschrieben besteht der erste Abschnitt aus einem Abschnitt gebildet von den Aminosäuren von Position 295 bis 307 (beim BDVD-Stamm CP7: 298 bis 310) und der zweite Abschnitt besteht aus den Aminosäuren von Position 338 bis 357 (beim BDVD-Stamm CP7: 341 bis 360) (Die Nummerierung entspricht der publizierten abgeleiteten Aminosäuresequenz des CSFV-Stammes Alfort/Tübingen [Meyers et al., 1989]). Die Aminosäuren, die von besonderer Bedeutung für die oben aufgeführte RNase-Aktivität sind, sind in keinem Fall auf genau die gleiche Position beschränkt, wie sie für den CSFV-Stamm Alfort/Tübingen bestimmt worden ist, sondern werden hier nur beispielhaft aufgeführt, um zu zeigen, dass die bevorzugten Aminosäuren sich in dieser Position befinden, oder in entsprechender Position bei anderen Stämmen, die bei BVDV, BDV oder im allgemeinen bei Pestiviren aufgrund ihrer hohen Konservierung vorliegen. Für Pestiviren, mit Ausnahme des CSFV-Stammes Alfort/Tübingen, kann die Zählweise der Position der bevorzugten Aminosäuren abweichen. Ein Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie der Pestiviren wird hingegen keine Schwierigkeiten haben, diese bevorzugten Aminosäuren durch den hohen Konservierungsgrad dieser Aminosäuresequenz und die Position dieser Motive im Sequenzkontext zu identifizieren. In einem nicht einschränkenden Beispiel entspricht die Position 346 des CSFV-Stammes Alfort/Tübingen exakt der Position 349 des BVDV-Stammes CP7.
  • Demzufolge betrifft die Erfindung vorzugsweise ein erfindungsgemäßes BVDV worin sich die Mutation(en) in der kodierenden Sequenz für das Glycoprotein Erns in der kodierenden Nucleotidsequenz für Aminosäuren in Position 298 bis 310 und/oder Position 341 bis 360 befinden.
  • Vorzugsweise sind solche Mutationen (Aminosäuren werden durch die Einbuchstabencodes wiedergegeben; die Aminosäure vor dem Positionsindex zeigt die auszutauschende Aminosäure an, die. Aminosäure nach dem Positionsindex zeigt die austauschende Aminosäure an (Del steht für Deletion): beispielsweise bedeutet H300L, dass Histidin in Position 300 durch Leucin ersetzt wurde):
    Einzelne Substitutionen/Deletionen: S298G, H300K, H300L, H300R, H300del, W303G, P304del, E305A, C308G, R343G, E345del, W346G, K348A, H349K, H349L, H349del, H349Q, H349SV (Mutation H349S und Insertion von V), K348R, W351P, W351G, W351L, W351K, W351H
    Doppelte Substitutionen/Deletionen: H300L/H349L, K348del/H349del, H349del/G350del, E345del/H349del, W303G/E305A, H300K/H349K, H300K/H349L
    Dreifache Deletionen: L299del/H300del/G300del, K348del/H349del/G350del
  • Die Nummerierung erfolgt für alle oben aufgeführten Mutanten nach der publizierten Aminosäuresequenz vom BVDV-Stamm CP7 (Die um 3 verringerten Nummern entsprächen den entsprechenden Aminosäuren der Aminosäuresequenz des CSFV-Stammes Alfort/Tübingen). Alle oben aufgeführten Mutanten wurden zumindest als entsprechende CSFV- oder BVDV-Mutanten ohne vorliegende Mutation im Npro-Abschnitt getestet. Es wird jedoch darauf hingewiesen, dass erfindungsgemäß mindestens eine weitere, unten im Detail offenbarte Mutation im Npro-Bereich vorliegen muss.
  • Insbesondere stellte sich heraus, dass eine Deletion oder Substitution des Histidins in Position 346 (CSFV) oder 349 (BVDV) zu einer effektiven Deaktivierung des Erns und daher zu besonders wirksamen Lebendvakzinen führte. Die vorliegende Erfindung zeigt, dass Pestiviren lebensfähig sind und für ein Erns-Protein ohne RNase-Aktivität kodieren können, wenn der Histidinrest, welcher einen der konservierten vermuteten Aktivzentrumsreste der Erns-RNase darstellt, in Position 346 des viralen Polyproteins (Nummerierung nach einer publizierten Sequenz des CSFV-Stammes Alfort/Tübingen [Meyers et al. 1989]) oder in Position 349 (Nummerierung nach einer publizierten Sequenz des BVDV-Stammes CP7 [Meyers et al. 1996b]), falls das Pestivirus BVDV ist, deletiert wird.
  • Daher betrifft die Erfindung vorzugsweise auch ein erfindungsgemäßes BVDV, worin die Mutation in der kodierenden Sequenz für Erns eine Deletion oder eine Substitution des Histidins in Position 349 ist.
  • Insbesondere stellen die konservierten Erns-Sequenzen SLHGIWPEKICTG und/oder LQRHEWNKHGWCNWFHIEPW (beispielhaft aufgeführte Sequenz des BVDV-2 New York'93 Proteins) das vermutete aktive Zentrum der RNase dar, geringfügige Abweichungen in den Sequenzen anderer Pestiviren können möglicherweise vorliegen, aber einem Fachmann aus diesem Bereich wird die Identität der Motive immer offensichtlich sein. Beispielsweise wären die betreffenden Aminosäuresequenzen des BVDV-1 CP7 SLHGIWPEKICTG und/oder LQRHEWNKHGWCNWYNIEPW und die des CSFV Alfort/Tübingen SLHGIWPEKICKG und/oder LQRHEWNKHGWCNWYNIDPW. Daher betrifft die Erfindung des weiteren vorzugsweise ein erfindungsgemäßes BVDV, worin sich die Mutation(en) in der kodierenden Sequenz für das Glycoprotein Erns in der Nucleotidsequenz befinden, welche für die konservierte Erns-Sequenz SLHGIWPEKICTG und/oder LQRHEWNKHGWCNWFHIEPW kodiert. Diese Sequenzen stellen das vermutete aktive Zentrum der RNase dar.
  • Die Sequenzen SLHGIWPEKIC und RHEWNKHGWCNW des vermuteten aktiven Zentrums von Erns sind über Pestiviren hinweg noch höher konserviert. Daher betrifft die Erfindung auch ein erfindungsgemäßes BVDV, worin sich die Mutation(en) in der kodierenden Sequenz für das Glycoprotein Erns in der Nucleotidsequenz befinden, welche für die konservierte Erns-Sequenz SLHGIWPEKIC und/oder RHEWNKHGWCNW kodiert.
  • Die Mutation befindet sich vorzugsweise nur in einer der erwähnten Sequenzen. Daher betrifft die Erfindung des weiteren ein erfindungsgemäßes BVDV, worin sich die Mutation(en) in der kodierenden Sequenz für das Glycoprotein Erns in der Nucleotidsequenz befinden, welche für die konservierte Erns-Sequenz SLHGIWPEKIC oder RHEWNKHGWCNW kodiert.
  • Mutationen dieser Art betreffen vorzugsweise zwei unterschiedliche Aminosäuren, d.h., es handelt sich um Doppelmutationen. Daher können die Mutationen 1 bis 3 Nucleotidmutationen in zwei verschiedenen Tripletts sein, die für zwei Aminosäuren kodieren. Daher betrifft die Erfindung auch ein erfindungsgemäßes BVDV, worin die Mutation(en) in der kodierenden Sequenz für das Glycoprotein Erns zwei Mutationen sind, die sich in der Nucleotidsequenz befinden, welche für die konservierten Erns-Sequenzen SLHGIWPEKIC und/oder RHEWNKHGWCNW kodiert.
  • Mutationen dieser Art betreffen vorzugsweise eine einzelne Aminosäure. Daher kann die Mutation 1 bis 3 Nucleotidmutationen in einem einzelnen Triplett sein, das eine Aminosäure kodiert. Daher betrifft die Erfindung ferner ein erfindungsgemäßes BVDV, worin sich eine einzelne Mutation in der konservierten Erns-Sequenz SLHGIWPEKIC oder RHEWNKHGWCNW befindet.
  • Noch bevorzugter betrifft die Erfindung ein BVDV mit einer definierten Formel, worin zwischen 0 und alle Aminosäuren des Npro vorliegen; Ubiquitin oder LC3 oder eine andere als Processing-Signal wirkende Sequenz (z.B. SUMO-1, NEDD8, GATE-16, GABA(A)RAP oder Proteasen wie beispielsweise Intein, Picornavirus 3C, Caridovirus 2A oder p15 des Chinaseuchenvirus) vorliegen oder abwesend sind. Liegt ein Processing-Signal, vor, wird die kodierende Sequenz für das Processing-Signal bei oder in der Nähe des C-terminalen Endes des (verbleibenden Teils des) Npro-Proteins insertiert. Nur wenn ein Processing-Signal vorhanden ist, kann eine beliebige Anzahl von Npro-Aminosäuren vorliegen. Falls keine Sequenz für das Processing-Signal insertiert wird, können bis zu 12 Aminosäuren, vorzugsweise aminoterminale Aminosäuren, des Npro vorliegen; die übrigen Aminosäuren müssen deletiert werden. Darüber hinaus können andere Erns-Mutationen als die oben offenbarten (wobei mindestens eine in dem erfindungsgemäßen BVDV vorliegen muss) vorhanden sein, die verbleibenden BVDV-Sequenzen können unverändert, d.h. nicht mutiert, bleiben oder sie können auch Mutationen nahe dem N-terminalen Ende des C-Proteins aufweisen. Dies wird anhand von nachfolgend offenbarten Ausführungsbeispielen näher erläutert.
  • Folglich betrifft die Erfindung ein erfindungsgemäßes BVDV, worin die Mutationen in der kodierenden Sequenz für Npro ein kodiertes Polyprotein ergeben, dargestellt durch die Formel: [Npro]x-[PS]y-[C-term] und worin:
    • [Npro]
    den Npro-Anteil des Polyproteins bezeichnet;
    [PS]
    bezeichnet ein Processing-Signal ausgewählt aus Ubiquitin, LC3, SUMO-1, NEDD8, GATE-16 oder GABA(A)RAP) oder Proteasen wie beispielsweise Intein, Picornavirus 3C, Caridovirus 2A oder p15 des Chinasyndromvirus oder jedes andere, dem Fachmann bekannte Processing-Signal, welches die Erzeugung eines funktionellen N-Terminus des C-Proteins gewährleistet;
    [C-term]
    bezeichnet das vollständige BVDV-Polyprotein mit Ausnahme des Npro, einschließlich dem Capsid (C)-Protein und jeglichem anderen in dem BVDV-Polyprotein vorkommenden Protein, einschließlich dem carboxyterminalen NS5B.
  • Jegliches andere Protein bezieht sich insbesondere auf das C-Protein, Erns, welches wie hier offenbart (siehe oben) mutiert ist, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B und NS5A.
  • Das erfindungsgemäße BVDV weist vorzugsweise ein C-Protein auf, welches bis auf die Aminosäure in Position 2, das von D zu N verändert wurde, nicht mutiert ist. Daher stellt [C-term*] dasselbe wie [C-term] dar, nur dass sie eine Mutation (N statt D) in Position 2 trägt.
    x ist 0-12 Aminosäuren wenn y=0, oder 0-168 wenn y=1;
    y ist 0 oder 1 und 0= nicht vorliegend, 1= vorliegend
  • Besonders bevorzugt betrifft die Erfindung auch ein erfindungsgemäßes BVDV, worin die Mutation(en) in der kodierenden Sequenz für das Npro zu einem kodierten Polyprotein führt/führen, dargestellt durch die folgende Formel: [Npro]1-[PS]0-[C-term] und worin die Begriffe wie oben definiert sind.
  • Ein spezifisches Beispiel hiervon wird nachstehend offenbart, worin auf das N-terminale Methionin das C-Protein und jegliches andere im Polyprotein vorkommende Protein, einschließlich dem carboxyterminalen NS5B, folgen.
  • Daher betrifft die Erfindung besonders bevorzugt ein erfindungsgemäßes BVDV, worin die Mutation(en) in der kodierenden Sequenz für Npro zu einem kodierten Polyprotein führt/führen, dargestellt durch die folgende Formel: M[C-term].
  • Besonders bevorzugt betrifft die Erfindung ebenfalls ein erfindungsgemäßes BVDV, worin die Mutation(en) in der kodierenden Sequenz für Npro zu einem kodierten Polyprotein führt/führen, dargestellt durch die folgende Formel: [Npro]3-[PS]0-[C-term] und worin die Begriffe wie oben definiert sind.
  • Ein spezifisches Beispiel hiervon wird nachstehend offenbart, worin auf das N-terminale Methionin die Npro-Sequenz EL und das C-Protein und jegliches andere im Polyprotein vorkommende Protein, einschließlich dem carboxyterminalen NS5B, folgen. Daher betrifft die Erfindung besonders bevorzugt ein erfindungsgemäßes BVDV, worin die Mutation(en) in der kodierenden Sequenz für Npro zu einem kodierten Polyprotein führt/führen, dargestellt durch die folgende Formel: MEL-[C-term].
  • Besonders bevorzugt betrifft die. Erfindung auch ein erfindungsgemäßes BVDV, worin die Mutation(en) in der kodierenden Sequenz für Npro zu einem kodierten Polyprotein führt/führen, dargestellt durch die folgende Formel: [Npro]4-[PS]0-[C-term] und worin die Begriffe wie oben definiert sind.
  • Ein spezifisches Beispiel hiervon wird nachstehend offenbart, worin auf das N-terminale Methionin die Npro-Sequenz ELF und das C-Protein und jegliches andere im Polyprotein vorkommende Protein, einschließlich dem carboxyterminalen NS5B, folgen. Daher betrifft die Erfindung besonders bevorzugt ein erfindungsgemäßes BVDV, worin die Mutation(en) in der kodierenden Sequenz für Npro zu einem kodierten Polyprotein führt/führen, dargestellt durch die folgende Formel: MELF-[C-term]
  • Besonders bevorzugt betrifft die Erfindung auch ein erfindungsgemäßes BVDV, worin die Mutation(en) in der kodierenden Sequenz für Npro zu einem kodierten Polyprotein führt/führen, dargestellt durch die folgende Formel: [Npro]6-[PS]0-[C-term] und worin die Begriffe wie oben definiert sind.
  • Ein spezifisches Beispiel hiervon wird nachstehend offenbart, worin auf das N-terminale Methionin die Npro-Sequenz ELFSN und das C-Protein und jegliches andere im Polyprotein vorkommende Protein, einschließlich dem carboxyterminalen NS5B, folgen. Daher betrifft die Erfindung besonders bevorzugt ein erfindungsgemäßes BVDV, worin die Mutation(en) in der kodierenden Sequenz für Npro zu einem kodierten Polyprotein führt/führen, dargestellt durch die folgende Formel: MELFSN-(C-term]
  • Besonders bevorzugt betrifft die Erfindung auch ein erfindungsgemäßes BVDV, worin die Mutation(en) in der kodierenden Sequenz für Npro zu einem kodierten Polyprotein führt/führen, dargestellt durch die folgende Formel: [Npro]4-[PS]0-[C-term*] und worin die Begriffe wie oben definiert sind – mit Ausnahme der Tatsache, dass das aminoterminale Ende des C-Proteins verändert ist.
  • Ein spezifisches Beispiel hiervon wird nachstehend offenbart, worin auf das N-terminale Methionin die Npro-Sequenz ELF folgt und in der C-Protein-Sequenz bei der Aminosäure in Position 2 D durch N ersetzt wurde. Daher ist die aminoterminale C-Protein-Sequenz SNEGSK... anstelle von SDEGSK. Daher betrifft die Erfindung auch besonders bevorzugt ein erfindungsgemäßes BVDV; worin die Mutation(en) in der kodierenden Sequenz für Npro zu einem kodierten Polyprotein führt/führen, dargestellt durch die folgende Formel: MELF-[C-term*] worin beim C-Protein die Aminosäure in Position 2 D durch N ersetzt wurde. Besonders bevorzugt betrifft die Erfindung auch ein erfindungsgemäßes BVDV worin die Mutation(en) in der kodierenden Sequenz für Npro zu einem kodierten Polyprotein führt, dargestellt durch die folgende Formel: [Npro]x-[PS]1-[C-term] und worin die Begriffe wie oben definiert sind und worin PS irgendeines aus der oben offenbarten PS, vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus Ubiquitin oder LC3, ausgewählt sein kann.
  • Ein spezifisches Beispiel hiervon wird nachstehend offenbart, worin auf das N-terminale Methionin 21 oder 28 Aminosäuren des Npro, Ubiquitin oder LC3 und dem C-Protein folgen. Daher betrifft die Erfindung auch besonders bevorzugt ein erfindungsgemäßes BVDV, worin die Mutation(en) in der kodierenden Sequenz für Npro zu einem kodierten Polyprotein führt/führen, dargestellt durch die folgende Formel:
    [Npro]22-[PS]1-[C-term], worin das PS vorzugsweise Ubiquitin oder LC3 ist oder
    [Npro]29-[PS]1-[C-term], worin das PS vorzugsweise Ubiquitin oder LC3 ist.
  • Ubiquitin ist ein bekanntes hochkonserviertes zelluläres Protein und besteht aus 76 Aminosäuren. Neben anderen Funktionen spielt Ubiquitin eine Schlüsselrolle beim Proteinkatabolismus, da die Konjugation mit Ubiquitin ein Protein für den Abbau durch ein Proteasom markieren kann. Konjugiertes oder über carboxyterminales Glycin mit anderen Proteinen verbundenes Ubiquitin kann durch zelluläre Ubiquitinspezifische Proteasen abgespalten werden. Daher resultiert eine Fusion eines Proteins mit dem carboxyterminalen Teil des Ubiquitins gewöhnlich in einer festgelegten proteolytischen Spaltung des Fusionsproteins nach seiner Expression innerhalb einer Zelle in seine Bestandteile.
  • LC3 (Leichte Kette 3 von Mikrotubuli-assoziierten Proteinen) stellt ein zelluläres Protein aus 125 Aminosäuren dar, welches zahlreiche Funktionen innehat (Länge angegeben für bovines LC3). Es wurde kürzlich festgestellt,, dass dieses Molekül eine grundsätzliche Rolle bei der Autophagie spielt. Bei diesem Vorgang wird LC3 durch eine carboxyterminale Spaltung aktiviert. Dadurch wird ein neuer Aminoterminus erzeugt, der aus Glycin besteht. LC3 wird dann durch dieses carboxyterminalen Glycin an Phosphatidylethanolamin, die an den Membranen von autophagischen Vesikeln vorkommt, konjugiert. Aufgrund dieses Vorgangs werden an dem Carboxyterminus des LC3 fusionierte Proteine durch eine zelluläre Protease an einer bestimmten Stelle abgespalten.
  • Besonders bevorzugt betrifft die Erfindung auch ein erfindungsgemäßes BVDV, worin die Mutation(en) in der kodierenden Sequenz für Npro zu einem kodierten Polyprotein führt, dargestellt durch die folgende Formel, die aus der unten aufgeführten Gruppe gewählt wird:
    [Npro]2-[PS]y-[C-term] und vorzugsweise ME-[PS]y-[C-term];
    [Npro]5-[PS]y-[C-term] und vorzugsweise MELFS-[PS]y-[C-term];
    [Npro]7-[PS]y-[C-term] und vorzugsweise MELFSNE-[PS]y-[C-term];
    [Npro]8-[PS]y-[C-term] und vorzugsweise MELFSNEL-[PS]y-[C-term];
    [Npro]9-[PS]y-[C-term] und vorzugsweise MELFSNELL-[PS]y-[C-term];
    [Npro]10-[PS]y-[C-term] und vorzugsweise MELFSNELLY-[PS]y-[C-term];
    [Npro]11-[PS]y[C-term] und vorzugsweise MELFSNELLYK-[PS]y-[C-term]; und
    [Npro]12-[PS]y-[C-term] und vorzugsweise MELFSNELLYKT-[PS]y-[C-term] und
    worin die Begriffe wie oben definiert sind.
  • Am meisten bevorzugt ist y=0 (PS liegt nicht vor).
  • Besonders bevorzugt ist auch ein erfindungsgemäßes BVDV, welches, wie oben beschrieben, ein BVDV vom Typ 1 ist. Ganz besonders bevorzugt ist das erfindungsgemäße BVDV, welches, wie oben beschrieben, ein BVDV vom Typ 2 ist. BVDV-1 und BVDV-2 unterscheiden sich aufgrund von besonderen Merkmalen in ihrem Genomsequenzen (Heinz et al. und dort aufgeführte Referenzen).
  • Ein erfindungsgemäßes BVDV-2 kann überraschenderweise bei der Herstellung einer Zubereitung für die Prävention und/oder Behandlung einer Infektion durch BVDV vom Typ 1 in Rinderzuchtherden verwendet werden. Insbesondere betrifft die Erfindung den erfindungsgemäßen Einsatz von BVDV vom Typ 2 in der Herstellung einer Zubereitung für die Prävention und/oder Behandlung einer Infektion durch BVDV vom Typ 1 bei trächtigen Kühen.
  • Ein BVDV-1, wie hier offenbart, kann ebenfalls überraschenderweise für die Zubereitung einer Zusammensetzung zum Einsatz bei der Prävention und/oder Behandlung einer Infektion durch BVDV vom Typ 2 in Rinderzuchtherden verwendet werden. Insbesondere betrifft die Erfindung den Einsatz eines erfindungsgemäßen BVDV vom Typ 1 für die Zubereitung einer Zusammensetzung für die Verwendung bei der Prävention und/oder Behandlung einer Infektion durch BVDV vom Typ 2 in trächtigen Kühen. Das erfindungsgemäße BVDV vorn Typ 1 kann vorzugsweise für die Zubereitung einer Zusammensetzung für die Herbeiführung eines fetalen Schutzes gegen eine Infektion durch BVDV vom Typ 2 bei trächtigen Kühen verwendet werden.
  • Besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes BVDV vom Wildtyp, welches, wie hier offenbart, mutiert wird und der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 5 (XIKE A genannt) entspricht oder eine funktionelle Variante hiervon ist. Am meisten bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes BVDV mit einer erfindungsgemäßen Npro-Mutation, das der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 6 (XIKE-A-NdN genannt) entspricht oder eine funktionelle Variante hiervon ist. Eine solche funktionelle Variante ist zu mindestens 65% homolog zu den hier offenbarten Aminosäuresequenzen. Auf der Ebene der Aminosäuren wurden die folgenden sehr groben Homologien gefunden: BVDV-1/-BVDV-1: 93%; BVDV-1/-BVDV-2: 84%; BVDV-2/-BVDV-2: 98%. Daher weist eine solche bevorzugte funktionelle Variante eine Homologie zu mindestens 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% oder 90% der hier offenbarten Aminosäurensequenzen auf. Besonders bevorzugt sind funktionelle Varianten mit einer mindestens 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% oder 98%igen Homologie zu der hier offenbarten Aminosäuresequenz. Am meisten bevorzugt sind funktionelle Varianten mit einer 99% oder 99,9%igen Homologie zu der hier offenbarten Aminosäuresequenz.
  • Ebenfalls besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes BVDV mit einer erfindungsgemäßen Erns-Mutation mit einer Deletion des das Histidin 349 kodierenden Codons, das der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 7 (XIKE-B genannt) entspricht oder eine funktionelle Variante hiervon ist. Ebenfalls besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes BVDV mit sowohl einer erfindungsgemäßen Erns-Mutation und einer erfindungsgemäßen Npro-Mutation, mit einer Deletion beim Histidin 349-kodierenden Codon und der kompletten Deletion des das Npro-kodierenden Codons, mit Ausnahme der Codons 1 bis 4, was zum Verbleib der Aminosäuren MELF beim Npro führt. Diese Mutante entspricht der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr.8 (XIKE-B-NdN genannt) oder ist eine funktionelle Variante hiervon. Eine solche funktionelle Variante ist zu. mindestens 65% homolog zu den hier offenbarten Aminosäuresequenzen. Besonders bevorzugt weist eine solche Variante eine Homologie von mindestens 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% oder 90% zu der hier offenbarten Aminosäurensequenz auf. Auch besonders bevorzugt ist eine funktionelle Variante mit einer mindestens 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% oder 98%igen Homologie zu der hier offenbarten Aminosäuresequenz. Am meisten bevorzugt ist eine funktionelle Variante mit einer 99% oder 99,9%igen Homologie zu der hier offenbarten Aminosäuresequenz.
  • Am meisten bevorzugt ist auch das erfindungsgemäße BVDV mit einer erfindungsgemäßen Erns-Mutation mit einer Substitution von dem Histidin 300-kodierenden Codon durch ein Leucin-kodierendes Codon, das der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 9 (XIKE-C genannt) entspricht oder eine funktionellen Variante hiervon. Ebenfalls besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes BVDV mit sowohl einer erfindungsgemäßen Erns-Mutation und einer erfindungsgemäßen Npro-Mutation, mit einer Substitution von dem Histidin 300-kodierenden Codon durch ein Leucin-kodierendes Codon und der kompletten Deletion des Npro-kodierende Codons; mit Ausnahme der Codons 1 bis 4, was zum Verbleib der Aminosäuren MELF beim Npro führt. Die Mutante entspricht der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr.10 (XIKE-C-NdN genannt) oder ist eine funktionelle Variante hiervon. Eine solche funktionelle Variante ist zu mindestens 65% homolog zu den hier offenbarten Aminosäuresequenzen. Besonders bevorzugt verfügt eine solche Variante über eine Homologie von mindestens 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% oder 90% der hier offenbarten Aminosäurensequenzen. Besonders bevorzugt ist eine solche funktionelle Variante mit einer mindestens 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% oder 98%igen Homologie zu der hier offenbarten Aminosäuresequenz. Am meisten bevorzugt ist eine solche funktionelle Variante mit einer 99% oder 99,9%igen Homologie zu der hier offenbarten Aminosäuresequenz.
  • Eine das erfindungsgemäße BVDV enthaltene Zusammensetzung und eine Lösung stellen ein anderes wichtiges, hier beschriebenes Ausführungsbeispiel dieser Erfindung dar.
  • Dem Fachmann werden weitere Komponenten bekannt sein, die in der aufgeführten Lösung enthalten sein können (siehe: auch Remington's Pharmaceutical Sciences (1990), 18. Aufl. Mack Publ. Easton).
  • Der Fachmann wird bekannte injizierbare, physiologisch verträgliche sterile Lösungen verwenden. Für die Zubereitung einer gebrauchsfertigen Lösung für die parenterale Injektion oder Infusion stehen wässrige isotonische Lösungen, wie z. B.
  • Kochsalzlösungen oder entsprechende Lösungen aus Plasmaproteinen fertig zur Verfügung. Die pharmazeutische Zusammensetzungen können als Lyophylisate oder als trockene Zubereitungen vorliegen, zur Rekonstitution unter sterilen Bedingungen mit bekannten injizierbaren Lösungen (z.B. als Komponente eines Satzes) unmittelbar vor der Verwendung rekonstituiert werden können.
  • Die abschließende Zubereitung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen werden durchgeführt z.B. für Injektionen durch Vermischen des aufgeführten erfindungsgemäßen BVDV mit einer sterilen physiologisch verträglichen Lösung, die mit bekannten Trägersubstanzen und/oder Additiven (z.B. Serumalbumin, Dextrose, Natriumbisulfit, EDTA) versetzt sein kann. Diese aufgeführte Lösung kann aus einem physiologisch verträglichen Lösungsmittel, z.B. einer wässrigen Lösung mit einem pH zwischen 7 und 8, bestehen. Der pH kann mit einem pharmazeutisch verträglichen Puffer stabilisiert werden.
  • Die Lösung kann auch weitere Stabilisatoren enthalten, wie zum Beispiel ein Detergens wie Tween, Serumalbumin wie BSA (bovines Serumalbumin), Ascorbinsäure und/oder Spermidin.
  • Die Zusammensetzung kann auch Adjuvantien enthalten, z.B.
  • Aluminiumhydroxid, Mineral- oder andere Öle, oder Hilfsmoleküle, die der Vakzine zugegeben werden oder vom Körper nach einer Induktion durch eine solche entsprechende Komponente, die Interferone, Interleukine oder Wachstumsfaktoren sein können, aber nicht darauf beschränkt sind, selbst erzeugt wird.
  • In einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung kann BVDV beispielsweise gelöst werden in:
    BVDV 102–108 TCID50
    SGS* 25% V/V
    Zellkulturmedium qsp 1 Dosis
    *SGS: Zusammensetzung pro 2 ml
    Saccharose 75 mg
    Gelatine 20 mg
    Kaliumhydroxid 0,274 mg
    L-Glutaminsäure 0,72 mg
    Kaliumdihydrogenphosphat 0,516 mg
    Dikaliumhydrogenphosphat 1,254 mg
    Wasser für die Injektion qsp 2 ml
  • Wenn die Zusammensetzung zuerst lyophilisiert oder mittels anderer Methoden entwässert wurde, wird die Zusammensetzung vor Vakzination in wässrigen (z.B. Kochsalzlösung, PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung)) oder nicht-wässrigen Lösungen (z.B. Ölemulsion (Mineralöl, oder basierend auf Speise- oder abbaubares Öl bzw. einfacher oder doppelter Emulsion), Aluminiumgrundlage, Adjuvans auf Carbomergrundlage) rehydratisiert.
  • Vorzugsweise induziert die erfindungsgemäße Zusammensetzung in einem Tier eine Immunantwort.
  • Besonders bevorzugt ist eine erfindungsgemäße Zusammensetzung, die eine Vakzine ist. Eine Vakzine, wie sie hier verstanden wird, beinhaltet ein erfindungsgemäßes BVDV und wurde bereits definiert (Abschnitt „Definitionen").
  • Am meisten bevorzugt sind erfindungsgemäße Zubereitungen, die darüber hinaus einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Exzipienten beinhalten.
  • Verschiedene Träger oder Exzipienten sind bereits oben offenbart worden. Die Zusammensetzungen können, wenn sie für Injektionen oder Infusionen gedacht sind, Verbindungen zur Herstellung isotonischer Lösungen, Konservierungsmittel wie p-Hydroxybenzoate, Stabilisatoren, wie Alkalisalze der Ethylendiaminotetraessigsäure, und möglicherweise auch Emulgatoren und/oder Dispergatoren enthalten.
  • Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann intradermal, intratracheal oder intravaginal verabreicht werden. Die Zusammensetzung wird vorzugsweise intramuskulär oder intranasal verabreicht. Die intravenöse Verabreichung oder die direkte Injizierung in das Zielgewebe der oben beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzung kann sich beim Tierkörper als vorteilhaft erweisen. Für eine systemische Verabreichung werden intravenöse, intravaskuläre, intramuskuläre, intranasale, intraarterielle, intraperitonale, orale oder intrathecale Verabreichungen bevorzugt. Eine örtlichere Applikation kann mittels subkutaner, intradermaler, intracutaner, intracardialer, intralobaler, intramedullärer, intrapulmonarer Verabreichung oder durch direkte Verabreichung in das zu behandelnde Gewebe (Binde-, Knochen-, Muskel-, Nerven-, oder Epithelialgewebe) oder in dessen Umgebung erreicht werden. Je nach der gewünschten Dauer und Wirksamkeit der Behandlung, kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung einmal oder mehrfach verabreicht werden. Die Verabreichung kann auch periodisch, beispielsweise täglich, über einen Zeitraum von mehreren Tagen, Wochen, oder Monate und in verschiedenen Dosierungen erfolgen.
  • Die Erfindung betrifft auch den Einsatz eines erfindungsgemäßen BVDV in der Herstellung einer Vakzine für die Prophylaxe und Behandlung BVDV-Infektionen.
  • Ein weiterer, wichtiger, Teil der Erfindung stellt ein Polynucleotidmolekül dar, welches dem Genom des erfindungsgemäßen BVDV, eines Fragments, einer funktionellen Variante, einer Variante auf der Grundlage eines degenerierten Nucleinsäure-Codes, eines Fusionsmoleküls oder eines chemischen Derivats hiervon, entspricht.
  • Das Polynucleotidmolekül ist bevorzugt eine DNA.
  • Am meisten bevorzugt wird das erfindungsgemäße BVDV vom Wilddtyp, das wie hier offenbart mutiert wird, durch die Nucleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 1 (XIKE-A genannt) oder eine funktionelle Variante hiervon codiert. Am meisten bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes BVDV mit einer erfindungsgemäßen Npro-Mutation, das durch die Nucleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 2 (XIKE-A-NdN genannt) oder eine funktionellen Variante hiervon, codiert wird. Auf der Ebene der Nucleinsäuren wurden die folgenden, sehr groben, Homologien gefunden: BVDV-1/-BVDV-1: 80%; BVDV-1/-BVDV-2: 70%; BVDV-2/-BVDV-2: 96%. Daher weist eine solche bevorzugte funktionelle Variante eine Homologie zu mindestens 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% oder 90% der hier offenbarten Nucleinsäurensequenzen auf. Noch mehr bevorzugt ist eine solche funktionelle Variante mit einer mindestens 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% oder 98%igen Homologie zu der hier offenbarten Nucleinsäuresequenz. Am meisten bevorzugt ist eine solche funktionelle Variante mit einer 99% oder 99,9%igen Homologie zu der hier offenbarten Nucleinsäuresequenz.
  • Ebenfalls besonders bevorzugt hat das erfindungsgemäße BVDV eine erfindungsgemäße Erns-Mutation mit einer Deletion in dem Codon H349 und wird durch die Nucleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 7 (XIKE-B genannt) oder eine funktionelle Variante hiervon kodiert. Ebenfalls besonders bevorzugt hat ein erfindungsgemäßes BVDV sowohl eine erfindungsgemäße Erns-Mutation und eine erfindungsgemäße Npro-Mutation, mit einer Deletion des Histidin 349-kodierenden Codon von Erns und der kompletten Deletion des das Npro-kodierenden Codons, mit Ausnahme der Codons 1 bis 4, was zum. Verbleib der Aminosäuren MELF beim Npro führt. Diese Mutante entspricht wird durch die Nucleinsäuresequenz SEQ ID Nr.8 (XIKE-B-NdN genannt) oder eine funktionelle Variante hiervon kodiert. Eine solche funktionelle Variante ist zu mindestens 65% homolog zu den hier offenbarten Nucleinsäuresequenzen. Besonders bevorzugt sind Varianten mit einer Homologie von mindestens 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% oder 90% der hier offenbarten Nucleinsäurensequenz auf. Noch mehr bevorzugt sind funktionelle Varianten mit einer mindestens 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% oder 98%igen Homologie zu der hier offenbarten Aminosäuresequenz. Am meisten bevorzugt sind funktionelle Varianten mit einer 99% oder 99,9%igen Homologie zu der hier offenbarten Nucleinsäuresequenz.
  • Ebenfalls am meisten bevorzugt hat das erfindungsgemäße BVDV eine erfindungsgemäße Erns-Mutation mit einer Substitution des Codons „H300" durch ein Leucin-kodierendes Codon und wird durch die Nucleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 11 XIKE-C genannt) oder eine funktionelle Variante hiervon kodiert. Ebenfalls besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes BVDV mit sowohl einer erfindungsgemäßen Erns-Mutation und einer erfindungsgemäßen Npro-Mutation, mit einer Substitution von dem Histidin 300-kodierenden Codon durch ein Leucin-kodierendes Codon und der kompletten Deletion des Npro-kodierende Codons, mit Ausnahme der Codons 1 bis 4, was zum Verbleib der Aminosäuren MELF beim Npro führt. Diese Mutante wird durch die Nucleinsäuresequenz SEQ ID Nr.12 (XIKE-C-NdN genannt) oder eine funktionelle Variante hiervon kodiert. Eine solche funktionelle Variante ist zu mindestens 65% homolog zu den hier offenbarten Nucleinsäuresequenz. Besonders bevorzugt ist eine solche Varianten mit einer Homologie von mindestens 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% oder 90% der hier offenbarten Nucleinsäurensequenz. Noch mehr bevorzugt ist solche eine funktionelle Variante mit einer mindestens 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% oder 98%igen Homologie zu der hier offenbarten Nucleinsäuresequenz. Am meisten bevorzugt ist eine solche funktionelle Variante mit einer 99% oder 99,9%igen Homologie zu der hier offenbarten Nucleinsäuresequenz.
  • Auch ist das Polynucleotidmolekül vorzugsweise eine RNA.
  • Einen weiteren wichtigen Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren für die Attenuierung des BVDV dar, die dadurch gekennzeichnet ist, dass mindestens eine Mutation in der kodierenden Sequenz für das Glycoprotein Erns und mindestens eine weitere Mutation in der kodierenden Sequenz für Npro in einem BVDV erzeugt wird.
  • Eine weiteres bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren schließt die folgenden Schritte ein:
    • a) Ein BVDV vom Wildtyp wird revers transkribiert und eine cDNA erhalten;
    • b) Die cDNA wird kloniert;
    • c) Mutationen, ausgewählt aus der Gruppe von Deletionen, Insertationsmutationen, und/oder Substitutionsmutationen werden in die cDNA eingeführt, wobei die Mutationen in der Sequenz lokalisert sind, die für das Glycoprotein Erns und die Protease Npro kodieren, und
    • d) Die cDNA wird in ein Plasmid oder in ein DNA-Virus, das in der Lage ist, die Transkription der cDNA des BVDV zur RNA in-vitro oder bei Infektion geeigneter Zellen zu steuern, eingebaut.
  • Eine zusätzliche wichtige Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren für die Behandlung von BVDV-verursachten Erkrankungen, wobei ein erfindungsgemäßes BVDV oder eine erfindungsgemäße Zusammensetzung einem bedürftigen Tier in einer dem Fachmann bekannten geeigneten Dosis verabreicht wird der Rückgang der Symptome einer BVDV-Infektion wie Virämie und Leukopenie und/oder Pyrexie und/oder Diarrhoe beobachtet wird.
  • Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Veranschaulichung der Erfindung, doch kann aus ihnen keine Einschränkung des offenbarten Erfindungsumfangs hergeleitet werden.
    •
  • Beispiel 1
  • BVDV XIKE-B: Abschätzung des Fetopathogenität in trächtigen Färsen BVDV XIKE-B, eine RNase-negative Mutante des hochpathogenen BVDV Typ 2-Isolates mit der Bezeichnung New York'93/C wurde aus dem infektiösen cDNA-Klon pKANE40B gewonnen und wies in Gewebekulturen Wildtyp-ähnliche (rot-ähnliche) Wachstumseigenschaften auf. Im Tierversuch erwies sich die Virusmutante als beträchtlich attenuiert, so dass es als eine vielversprechende Prüfsubstanz für die Entwicklung eines attenuierten Lebendvakzinvirus angesehen wurde (Meyer et al., 2002). Um zu prüfen, ob das Virus die Plazentaschranke überwinden und den Fetus infizieren kann, wurden trächtige Färsen mit XIKE-B infiziert. Als Kontrolle wurde Wildtyp-BVDV, das vom cDNA-Klon pKANE40A gewonnen wurde, eingesetzt. Das entsprechende Virus mit dem Namen XIKE-A exprimiert eine aktive Erns-RNase in der infizierten Zelle.
  • Die Studie hatte zum Ziel, die Sicherheit von XIKE-A und XIKE-B in trächtigen Tieren zu ermitteln.
  • Versuchsbeschreibung
  • Aus einer BVDV-negativen Herde wurden zehn trächtige Färsen ausgewählt. Die folgenden Gruppen zu zehn Färsen wurden in die Studie eingeschlossen:
    Figure 00270001
  • Die Färsen wurden 8 Tage vor der Impfung in die Forschungseinrichtungen verbracht. Die Trächtigkeit wurde nach dem Transport zu den Forschungseinrichtungen bestätigt. Die Färsen befanden sich zum Zeitpunkt der Impfung zwischen dem 60. und dem 90. Tag der Trächtigkeit. Alle Tiere wurden zum gleichen Zeitpunkt geimpft.
  • Die Färsen wurden hinsichtlich des Auftretens klinischer Zeichen einer BVDV-Infektion einschließlich Aborte während der Beobachtungsperiode überwacht. Den Tieren wurden Blutproben für die Serologie, Antigen-Nachweis und Bestimmung der Leukozytenzahl entnommen. Die Versuche wurden 9 Wochen nach der Impfung beendet. Kühe ohne Abort wurden geschlachtet, der Uterus untersucht und entnommen. Fetale Organproben wurden bei der Obduktion entnommen und auf das Vorliegen einer BVDV-Infektion untersucht.
  • Als primärer Auswertungsparameter galt das Vorliegen einer fetalen Infektion, der anhand der BVDV-abhängigen Mortalität, der Anzahl der BVDV-abhängigen Aborte und der Zahl der BVDV-positiven Feten zum Zeitpunkt des Studienendes ermittelt wurde. Als zusätzliche Parameter wurden klinische Symptome, die als typisch für eine BVDV-Infektion gelten, wie Virämie, die Leukozytenanzahl in Kühen und die rektale Temperatur nach der Impfung ausgewertet.
  • Tiere
  • Die Färsen wurden von einem BVDV-freien Gut bezogen. Es kamen nur Tiere zum Einsatz, die den folgenden Einschlusskriterien entsprachen.
  • Einschlusskriterien
    • – Abwesenheit von anti-BVD-Antikörpern; jedes Tier unterläuft vor dem Transport und bei Studienbeginn (in der Forschungseinrichtung) einen Serum-Antikörpertest.
    • – Abwesenheit von BVDV; Plasma und/oder Buffy coat-Präparat von einem jeden Tier werden mit einem geeigneten Test getestet.
    • – Durch ärztliche Untersuchung festgestellte klinische Gesundheit bei Studienbeginn. Die Befunderhebung bei den Tieren wurde gemäß der gegenwärtigen, allgemein anerkannten Veterinärpraxis durchgeführt.
    • – Durch ärztliche Untersuchung festgestellte Trächtigkeit, die vor der Impfung bestand. Wie aus Besamungsunterlagen hervorging, befanden sich die Tiere zwischen dem 60. Tag und dem 90. Tag der Trächtigkeit.
  • Versuch Stamm A
    Figure 00290001
  • Versuch Stamm B
    Figure 00300001
  • Gestationskontrolle
  • Die Trächtigkeit wurde unmittelbar vor der Impfung bestätigt.
  • Impfung der Färsen
  • Der Impftag wurde als Tag 0 des Versuchs definiert. Von dem Testmaterial wurden mit einer nadelfreien Spritze jeweils 3 ml intranasal in jedes Nasenloch verabreicht. Die Verabreichung erfolgte in der Aspirationsphase, um dadurch Flüssigkeitsverluste aufgrund von Expiration des Materials zu verringern.
  • Beobachtungen nach der Impfung
  • Sammeln und Untersuchen der Blutproben
  • Blut wurde mit Hilfe konventioneller aseptischer Verfahren (Desinfizieren der Entnahmestelle) gesammelt. Für jedes Tier wurde eine neue sterile Spritze und Nadel verwendet.
  • Blutsammlung für die Serumgewinnung
  • Mindestens 10 ml Blut wurden von den Färsen unmittelbar vor der Impfung, wöchentlich nach der Infektion, und bei Studienende abgenommen. Das Serum wurde bei –20°C bis zur Verwendung gelagert.
  • Blutproben für die Leukoaytenzählung und die Buffy coat-Präparationen
  • Für die Leukozytenzählung wurden 3 ml Blut unmittelbar nach der Abnahme in geeignete sterile Gefäße (Venoject, Terumo Europe N.V., Leuven, Belgien) überführt, die mit 0,06 ml EDTA (0,235 Mol/L) vorgefüllt waren.
  • Für die Buffy coat-Präparationen wurden mindestens 15 ml Blut unmittelbar nach der Abnahme in geeignete sterile Gefäße überführt, die mit 0,1 ml einer Heparin-Lösung (Na-Heparin für Injektionslösungen, 5 000 IU/ml, Charge: A7V163A, Verfallsdatum: 11/2000: Gedeon Richter RT, Budapest, Ungarn) vorgefüllt waren und somit mindestens 20 IU Heparin pro ml Blut in der Blutprobe ergaben. Der Inhalt wurde danach vorsichtig vermischt.
  • Für die Herstellung von Buffy coats wurde Blut von den Färsen an den folgenden Tagen gesammelt:
    • • an jedem Tag zwischen Tag 0 und Tag 14 nach der Infektion;
    • • an jedem zweiten Tag zwischen Tag 15 und Tag 40 oder bis alle Tiere bei drei
  • Messzeitpunkten hintereinander negativ auf die Isolierung von Viren getestet wurden.
  • Serumpräparation
  • Bei Raumtemperatur geronnenes Blut wurde durch Zentrifugieren aufgetrennt.
  • Jede Serumprobe wurde auf zwei Aliquots zu jeweils mindestens 2 ml aufgetrennt. Ein Aliquotsatz wurde mit ELISA auf BVDV-spezifische Antikörper getestet. Die restlichen Seren wurden eingefroren und bei –20°C bis zur weiteren Verwendung gelagert.
  • Leukozytenzählung
  • Die Leukozytenzahl wurde mit einem halbautomatischen elektronischen Coulter-Zähler (Diatron-Minicell-16, Messtechnik GmbH, Wien, Österreich) mit einer angegebenen Genauigkeit von 0,1 × 109/l, 100/μl bestimmt. Das Gerät wurde nach den Angaben des Herstellers (Eichung und Leukozytenzahl) eingesetzt.
  • Herstellung von Buffy coats
  • Heparinisierte Blutproben wurden so bald wie möglich in das Labor eingeliefert. Die Herstellung der Buffy coats wurde unter aseptischen Bedingungen (sterile Pipetten, Behandlung, sauberer Arbeitsplatz, usw.) gemäß etablierten Laborverfahren durchgeführt.
  • Die erhaltenen Buffy coats wurden in einem kleinen Volumen (2 ml) RPMI 1640 resuspendiert und in zwei Aliquots zu je 0,5 ml bei –70°C eingefroren. Die restlichen 1 ml Buffy coats wurden umgehend für die Bestimmung von Blutzellenassoziertem BVDV mittels Co-Kultivierung in einer permissiven Zellkultur herangezogen.
  • ELISA für BVD-Serumantikörper
  • Jede Serumprobe wurde auf die Anwesenheit von BVD-Antikörpern mit Hilfe eines geeigneten und validierten ELISA (SvanovirTM BVDV Antibody-Test, Artikelnr.: 10-2200-10) geprüft. Der Test wurde nach den Empfehlungen des Herstellers validiert und eingesetzt. Positive Proben wurden auf der log2-Skala verdünnt, um so die BVDV-Antikörpertiter zu bestimmen.
  • BVD-Antigenassay(s)
  • Jede Buffy coat-Probe wurde auf die Anwesenheit von BVDV durch Co-Kultivieren der frisch hergestellten Buffy coats mit einer empfänglichen Zelle oder Zelllinie untersucht. Die Proben wurden vor dem Co-Kultivieren nicht eingefroren. Das bei jeder Probe gewonnene Plasma wurde Man-Gene zur Verfügung gestellt.
  • Klinische Beobachtungen
  • Beobachtung von Färsen
  • Die Tiere wurden täglich von Tag 0 bis Tag 42 nach der Impfung von einem ausreichend geschulten Tierarzt auf die Anwesenheit von klinischen Symptomen hin untersucht.
  • Alle klinische Symptome wurden dokumentiert mit Hinsicht auf ihre Natur, Konsistenz/Berührung, Einstufung (mild, mittel, oder schwer), Ort, Größe der betroffenen Gegend, und der Einstufung nach einer vereinbarten und standardisierten Definition. Besonderes Augenmerk wurde gerichtet auf Respirationssymptomatika (Respiration, deren Geschwindigkeit, nasale oder okulare Ausscheidungen, Konjunktivitis, Niesen, Husten, usw.) und Diarrhoe.
  • Rektale Temperaturen
  • Rektale Temperaturen wurden in jeder Färse täglich zur jeweils gleichen Tageszeit (vorzugsweise am Morgen) von 5 Tagen vor der Impfung bis 21 Tage nach der Infektion gemessen.
  • Das tägliche Messen der rektalen Temperatur wurde fortgesetzt, bis beim jeweiligen Tier an drei aufeinander folgenden Tagen eine rektale Temperatur von unter oder gleich 39°C gemessen wurde.
  • Nachweis einer unterbrochenen Trächtigkeit
  • Das Vorliegen einer Trächtigkeit, die Vermutung eines Aborts und Resorption des Fetus und wurde mittels rektaler Untersuchung gesichert. Ein geschulter Tierarzt untersuchte alle Tiere bei Impfung sowie 1 und 2 Monate nach der Impfung. Die Untersuchungen wurden entsprechend der allgemein anerkannten Veterinärpraxis durchgeführt.
  • Die Färsen wurden täglich bis zum Studienende (8-12 Wochen nach der Impfung) auf Symptome eines Aborts untersucht.
  • Studienende
  • Die Studie wurde mit dem Schlachten der Färsen und der Entnahme der Feten beendet. Die Feten und fetale Proben wurden in geschlossene Transportbehälter überführt, die mit der Nummer der Kuh und dem Datum/Uhrzeit beschriftet waren. Die Behälter wurden zu einem ausgewählten Autopsieraum transportiert.
  • Eine Autopsie der Färsen war nicht erforderlich. Eine Autopsie wird bei den Feten durchgeführt, die Ergebnisse dokumentiert und ein unten aufgeführtes Probenpanel gesammelt.
  • Autopsie
  • Eine ausführliche Autopsie wurde bei den Versuchstieren im Todesfall durchgeführt.
  • Autopsien wurden durch einen erfahrenen Tierarzt durchgeführt und die Ergebnisse auf geeigneten Datenblättern dokumentiert. Weitere Labortests wurden entsprechend der beobachteten klinischen Symptome und Läsionen durchgeführt. Wurde bei der Autopsie eine durch Mikroorganismen verursachte Erkrankung diagnostiziert, wurde die Diagnose durch einen geeigneten, für den Mikroorganismus spezifischen Test bestätigt.
  • Jede Gewebeprobe wurde in mindestens zwei getrennten beschrifteten Behältern aufbewahrt, die in flüssigem Stickstoff schockgefroren wurden. Die Proben wurden bis zu ihrer Verwendung bei –70°C aufbewahrt.
  • Abortierte Feten und Studienende
  • Von den Feten wurden die folgenden Gewebeproben entnommen:
    • • Eventuell vorhandenes Exudat aus der Bauchhöhle oder dem Thorax,
    • • Mesenterial-Lymphknoten,
    • • Milz,
    • • Thymus,
    • • Cerebellum,
    • • Niere,
    • • Knochenmark aus dem Brustbein
    • • Plazentagewebe (falls verfügbar).
  • Tote oder getötete Färsen
  • Zumindest die folgenden Gewebeproben wurden entnommen:
    • • Blut (falls verfügbar) für Herstellung von Buffy coats,
    • • Blut (falls verfügbar) für die Serumgewinnung,
    • • Peyer-Drüsen,
    • • Mesenterial-Lymphknoten,
    • • Milz,
    • • Niere,
    • • Uterus, einschließlich Plazentagewebe (falls verfügbar).
    Transport und Lagerung der Proben
    Proben: Lagerung:
    Serum –20°C
    Buffy coat –70°C
    Virus –70°C
    Färsengewebe –70°C
    Fetales Gewebe –70°C
  • Die Proben wurden nach den Angaben des Auftraggebers zur Laboranalyse verschickt. Die Auswahl der Proben und die Wahl des Versandzeitpunktes wurde mit dem Studienmonitor oder dem Projektleiter abgesprochen. Generell wurden Proben, die von Abortgewebe oder von neugeborenen Kälbern stammte, zum frühestmöglichsten Zeitpunkt untersucht.
  • Ergebnisse
  • Mortalität
  • Färse Nr. 626 (Gruppe 1) starb am Tag 13 NI (nach der Impfung). In der folgenden Tabelle sind die beobachteten klinische Symptome und Läsionen zusammengefasst, die bei der Autopsie bemerkt wurden.
  • Figure 00350001
  • Diese klinischen und vorläufigen pathologischen Befunde stimmen mit BVDV-induzierten Läsionen überein. Daraus kann geschlossen werden, dass der Tod aufgrund eine BVDV-Infektion eingetreten ist.
  • Aborte nach Infektion
  • In jeder Gruppe hatte jeweils eine Färse einen klinischen Abort. Färse Nr. 615 (Gruppe 1) hatte am Tag 38 NI einen Abort, Färse Nr. 469 (Gruppe 2) hatte am Tag 39 NI einen Abort. Beide Feten wiesen Zeichen einer Autolyse auf und starben (geschätzt) mindestens 3-7 Tage vor dem Abort (um den Tag 32-35 NI).
  • In Gruppe 1 wurde bei der Untersuchung nach der Schlachtung der Färse Nr. 526 bei Studienende kein Fetus aufgefunden. Eine vorläufige pathologische Begutachtung des Uterus ergab folgendes:
    • • Leichte Vergrößerung des rechten Uterushorns,
    • • Plazentareste im fortgeschrittenen autolytischen Stadium im Lumen verblieben.
  • Die Befunde zum Uterus der Färse Nr. 526 sind konsistent mit einem „stillen" Abort, der höchstwahrscheinlich durch die BVD-Infektion ausgelöst wurde.
  • Klinische Beobachtung von Färsen
  • Eine Zusammenstellung der klinischen Beobachtungen und der Dauer der klinischen Symptome in den jeweiligen Gruppen sind unten aufgeführt:
  • Klinische Symptome und Zeitpunkt des Auftretens nach dem Tag der Impfung (NI)
  • Gruppe 1 (XIKE-A)
    Figure 00370001
  • Gruppe 2 (XIKE-B)
    Figure 00370002
  • Alle Tiere der Gruppe 1, die mit XIKE-A infiziert wurden, zeigten ein breites Spektrum klinischer Symptome. Nach dem Erscheinen respiratorischen Symptome gefolgt von Appetitsverlust und der einigen Tage späteren Auftreten von Diarrhoe in den Färsen, mit Ausnahme von Färse Nr. 526. Eine Färse starb und eine andere hatte einen Abort (siehe oben) nach der Infektion. Diese Symptome sind konsistent mit den Symptomen, die man nach einer Infektion mit einem virulenten BVDV-Stamm erwarten würde.
  • Alle Tiere der Gruppe 2, die mit dem XIKE-B infiziert wurden, waren frei von klinischen Symptomen. In der gleichen Zeit hatte eine Färse einen Abort während der Beobachtungsphase.
  • Rektale Temperaturen
  • Vor der Infektion der Tieren wurden keine auffälligen Temperaturänderungen festgestellt. In Gruppe 2 blieben alle Temperaturwerte zwischen dem Tag 0 und dem Tag 21 nach der Infektion innerhalb des physiologischen Bereichs. Bei allen Tieren der Gruppe 1 wurden zwischen Tag 7 und Tag 11 nach der Infektion erhöhte Rektaltemperaturen gemessen.
  • Ergebnisse am Studienende
  • Nach dem Schlachten bei Studienende wurden die Feten untersucht.
  • Von Färse 536 konnte kein Fetus gewonnen werden (Siehe Absatz: „Aborte nach Infektion"). Die folgenden Ergebnisse wurden bei der Autopsie der Feten festgehalten:
    Figure 00380001
  • Die Befunde lassen den Schluss zu, dass in der Gruppe 1 zwei Feten (Färse Nr. 598 und Färse Nr. 618) und in in Gruppe 2 ein Fetus (Färse Nr. 619) einige Wochen vor der Gewinnung starben und insofern als Aborte betrachtet werden können.
  • Durch Autopsieergebnisse modifizierte Abortbefunde
  • Nach den Autopsien war die Frage nicht geklärt, warum einige der Färsen keine Aborte hatten. Tote Feten sollen als Aborte aufgefasst werden, daher wurde das klinische Bild nach Studienende wie folgt modifiziert: Gruppe 1
    Tier Nr. Schlussfolgerungen
    526 BVD-Abort (Uterus mit Plazenta, post-mortem)
    598 BVD-Abort (Fetus, post-mortem)
    615 Klinischer BVD-Abort
    618 BVD-Abort (Fetus, post-mortem)
    626 An BVD verstorben
    Gruppe 2
    Tier Nr. Schlussfolgerungen
    469 Klinischer BVD-Abort
    565 Erwarteter BVD-Abort; kein lebensfähiger Fetus
    588 Normal
    608 Normal
    619 BVD-Abort (Fetus post-mortem)
  • Untersuchungen von Blutproben Leukozytenzählung
  • Das Zählen der weißen Blutkörperchen wurde am Tag 26 NI unterbrochen, da zu diesem Zeitpunkt alle Tiere negativ auf das Virus getestet wurden. Die Werte vom Tag 0 NI wurde als individuelle Referenzwerte herangezogen.
  • In Gruppe 2 fiel die Leukozytenzahl bis zum Ende der Beobachtungszeitraums (Tag 26 NI) nie auf unter 40% des Referenzwertes.
  • In Gruppe 1 hatte ein Tier (Färse Nr. 598) einen Tag lang eine Leukozytenzahl unterhalb von 40% des Referenzwertes.
  • Serologie
  • Keines der ausgewählten Tiere wies vor der Infektion spezifische Antikörper gegen BVDV auf. Nach der Infektion entwickelten alle überlebenden Färsen aus Gruppe 1 spezifische Antikörper gegen BVDV, die in allen Studientieren ab Woche 3 NI bis zum Ende der Beobachtungszeitraumes nachgewiesen wurden. In Gruppe 2 wurden ab Woche 4 NI in 4 von 5 Färsen spezifische Antikörper gegen BVDV nachgewiesen. Messbare Antikörperreaktionen dauerten in nur 3 Tieren bis zum Ende der Beobachtungsperiode an. Die Titer waren in Gruppe 2 niedriger als in Gruppe 1.
  • Virennachweis über Co-Kultivierung
  • Buffy coats
  • BVDV wurde in beiden Gruppen nachgewiesen. Die Dauer des Virennachweises ist unten zusammengefasst. Alle Proben wurden unmittelbar nach der Gewinnung co-kultiviert, d.h. ohne Einfrieren. Tier Nr. Tag (NI) des Virennachweises Gruppe 1
    615 5–12
    526 5–9
    626 5–12
    618 5–11, 14
    598 5–11, 13
    Gruppe 2
    565 7–9
    588 8
    608 6–9
    469 8
    619 5–11
  • Gewebeproben
  • Die Anwesenheit des BVD-Virus in der toten Färse und den Feten ist unten zusammengefasst: Färse: Tier Nr. BVDV in Gewebeproben Gruppe 1
    626 Vorhanden#
    Feten: Tier Nr. BVDV in Gewebeproben Gruppe 1
    615 Nicht vorhanden#
    526 NG
    626 Vorhanden#
    618 Nicht vorhanden
    598 Vorhanden
    Gruppe 2
    565 Vorhanden
    588 Nicht vorhanden
    608 Vorhanden
    469 Nicht vorhanden#
    619 Nicht vorhanden
    NG = Nicht getestet
  • Proben wurden unmittelbar nach der Gewinnung kultiviert (d.h. ohne Einfrieren), die mit # Markierten sind davon ausgenommen, da hiervon nur eingefrorene Proben vorlagen.
  • Zusammenfassung der auf BVD bezogenen klinischen und Labordaten Gruppe 1
    Figure 00410001
  • Gruppe 2
    Figure 00410002
  • Schlussfolgerung:
  • Die Studie wurde mit der Zielsetzung durchgeführt, die Sicherheit der XIKE-A und XIKE-B in trächtigen Tieren zu ermitteln. Zehn trächtige Färsen wurden aus einer auf BVDV negativ getesteten Herde gewählt. Zwei Gruppen mit jeweils 5 Färsen wurden in die Studie einschlossen: Eine Gruppe wurde mit XIKE-A-, die andere Gruppe mit XIKE-B-Virusstamm geimpft. Die Färsen befanden sich am Tag der Impfung zwischen Tag 60 und Tag 90 der Trächtigkeit. Die Färsen wurden während des Beobachtungszeitraums auf klinische Symptome einer BVDV-Infektion einschließlich Aborte überwacht. Blutproben wurden von den Tieren abgenommen für die Serologie, Antigennachweis und die Ermittlung der Leukozytenzahl. Der Versuch wurde 9 Wochen nach der Impfung beendet. Abort-freie Kühe wurden geschlachtet, der Uterus untersucht und entnommen. Fetale Organproben wurden bei der geplanten Autopsie entnommen und auf BVDV-Infektion hin untersucht.
  • Das Vorliegen einer fetalen Infektion war der primäre Studienendpunkt, der sich aus der Anzahl der BVDV-bezogenen Färsensterblichkeit, der Anzahl der BVDV-bezogenen Aborte, und der Anzahl der auf BVDV postitiv-getesteten Feten am Studienende zusammensetzte. Neben dem primären Studienendpunkt wurden klinische Symptome, die für eine BVDV-Infektion charakteristisch waren, die Virämie, und die Leukozytenzahl in Kühen wie auch die rektalen Temperaturen nach der Impfung ausgewertet.
  • Das XIKE-B Virus erwies sich als weniger pathogen als XIKE-A, nichtsdestoweniger traten in der XIKE-B-Gruppe BVD-bezogene Aborte und infizierte Feten ebenfalls auf. Daher kann aus den Ergebnissen geschlossen werden, dass die Deaktivierung der Erns RNase fetale Infektionen nicht unterdrückt.
  • Beispiel 2
  • BVDV XIKE-A NdN: Bewertung der Fetopathogenität in trächtigen Färsen
  • Vom Npro-Gen ist gezeigt worden, dass es für das Wachstum von CSFV in Gewebekulturen nicht essentiell ist (Tratschin et al., 1998). Wenn auch der Beweis für eine BVDV-Attenuierung als Folge einer Npro-Deletion noch aussteht, scheint eine Rolle dieses Proteins in der Interaktion zwischen Wirt und Virus durchaus denkbar, was durch Ergebnisse kürzlich durchgeführter Versuche mit CSFV untermauert wurde (Mayer et al., 2004; Rüggli et al., 2003). Wir wollten daher untersuchen, ob die Deletion des Hauptteils der Npro-kodierenden Sequenz ein Virus ergibt, das Feten in trächtigen Färsen nicht mehr infiziert. Das Npro-Gen wurde mit Ausnahme der vier 5'terminalen Codons aus dem full-length cDNA-Klon pKANE40A mit üblichen Methoden deletiert. Die so entstandene full-length Klonmutante wurde als Matrize für die in-vitro Transkription verwendet und die resultierende cRNA in MDBK-Zellen wie beschrieben transfiziert (Meyer et al., 2002). Das gewonnene Virus wurde in Gewebekultur amplifiziert und in dem unten weiter beschriebenen Tierversuch eingesetzt. BVDV XIKE-B wurde als Kontrolle eingesetzt, da die Plazentagängigkeit bereits nachwiesen wurde (BEISPIEL 1).
  • Studienziel(e)
  • Die Studie soll in trächtigen Tieren die Sicherheit eines attenuierten lebenden BVDV mit genomischer Deletion des größten Teils der Npro-kodierenden Region ermitteln.
  • Die eingesetzten Materialien und Methoden sind in Beispiel 1 beschrieben.
  • Aufbau der Studie
  • Acht trächtige Färsen wurden auf zwei Gruppen randomisiert und nach dem folgenden Schema behandelt und beobachtet:
    Figure 00430001
    Figure 00440001
  • Ergebnisse
  • Alle Färsen waren bei Beginn der Studie gesund und trächtig. Alle Tiere wurden vor dem Einschluss in die Studie negativ auf BVDV und BVDV-Antikörper getestet.
  • Herstellung und Kontrolle des zur Infektion eingesetzten Virus
  • Proben wurden während der Verdünnungsschritte genommen und am Herstellungstag getested, d.h. durch Co-Kultivierung auf einer geeigneten Gewebekultur ohne Einfrieren. Die Ergebnisse der Virustitration sind in der folgenden Tabelle gezeigt.
  • Figure 00440002
  • Klinische Symptome einer BVDV-Infektion
  • Die unten aufgeführte Tabelle enthält eine Zusammenfassung der Tiere, die während des Beobachtungszeitraums klinische Symptome aufwiesen.
  • Klinische Symptome und der Tag nach der Impfung (N1), an denen sie beobachtet wurden
    Figure 00450001
  • Es wurden in einigen Tieren aus beiden Gruppen ausschließlich leichte und vorübergehende Symptome beobachtet.
  • In Gruppe 1 hatte eine Färse am Tag 8 NI Appetitsverlust.
  • In Gruppe 2 wiesen zwei der drei Tiere klinische Symptome auf. Beide Färsen bekamen um den Tag 21 Husten, welches bei einigen der Tieren von Appetitsverlust begleitet war.
  • Rektale Temperaturen
  • Vor der Impfung der Tiere wurden keine auffällige Temperaturveränderungen festgestellt.
  • In der unten aufgeführten Tabelle sind die wenigen Fälle, bei denen nach der Impfung erhöhte Temperaturen gemessen wurden, zusammengefasst.
  • Figure 00450002
  • In jeder Gruppe hatte jeweils ein Tier leicht erhöhte Temperatur und jeweils ein Tier aus jeder Gruppe hatte Fieber. Fieber wurde am Tag 8 NI oder am Tag 9 NI festgestellt. Die Temperaturwerte fielen jeweils am folgenden Tag wieder in den Normbereich.
  • Leukozytenzählung
  • In alten Gruppen wurde zwischen dem Tag 3 NI und dem Tag 8 NI eine leichte Leukopenie festgestellt. Die Zahl der Tiere mit einem mindestens 40%igen Abfall der Leukozytenzahl waren folgende:
    Gruppe Anzahl der Tiere mit Leukopenie/Gesamtzahl
    1 3/5 (60%)
    2 1/3 (33%)
  • Serologie (BVDV-Antikörper)
  • In Übereinstimmung mit dem Studienprotokoll waren alle Färsen vor der Impfung negativ auf BVDV-Antikörper getestet worden. In Gruppe 1 (mit XIKE-A NdN geimpft) und in Gruppe 2 (mit XIKE-B geimpft), wurde eine vollständige Serokonversion erst bei Studienende (2 Monate nach der Impfung) festgestellt.
  • BVD-Virus-Isolation aus Buffy coats
  • Es wurde keine Virämie festgestellt BVD-Virus-Isolation aus fetalen Gewebeproben
    Figure 00460001
  • Schlussfolgerung
  • Die Npro-Deletion ergab eine beträchtliche Attenuierung des BVDV im Vergleich zu dem Ursprungsvirus XIKE-A, von dem eine hohe Pathogenität nachgewiesen. werden konnte (Meyer et al. 2002). Jedoch verhindert die Npro- Deletion an sich nicht die Übertragung einer von NY93-abgeleiteten Virus-rekombinante auf Feten nach der Impfung von trächtigen Kühen.
  • Beispiel 3
  • BVDV XIKE-B NdN: Bewertung der Fetopathogenität in trächtigen Färsen
  • Um das Potential der Kombination aus deaktivierter RNase und Npro-Deletion im Hinblick auf die Attenuierung des BVDV und die Übertragung auf Feten zu prüfen, wurden verschiedene BVDV-2 Mutanten mit Deletion innerhalb der Npro-kodierenden Region hergestellt, die auf dem infektiösen cDNA-Klon pKANE40B, der RNase-negativen Mutante von pKANE40A mit einer Deletion am Codon 349, basierten. Die so hergestellten Viren wurden untersucht mit Hinsicht auf die Anwesenheit der gewünschten Mutationen und der Abwesenheit von Sekundärstellenmutationen in Regionen, welche die eingeführten Änderungen flankieren, und ihre Wachstumseigenschaften in Gewebekultur. XIKE-B-NdN (V-pk88C), eine Variante, die eine Deletion der vollständigen Npro-kodierenden Region mit Ausnahme von den Codons 1 bis 4 und zusätzlich eine RNase-desaktivierende Deletion des Codons 349 aufwies, wurde für einen Tierversuch ausgewählt, da sie die gewünschten Mutationen mit brauchbaren Wachstumseigenschaften kombinierte. Das Studienziel war die Bewertung der Sicherheit eines attenuierten Lebend-BVDV-Isolats in trächtigen Tieren.
  • Fünf BVDV-freie trächtige Färsen wurden intranasal mit einer infektiösen Dosis mit 105 TCID50/Tier XIKE-B-NdN geimpft (Daten zur Rücktitrierung sind in Tabelle 3.1 aufgeführt). Klinische Daten wurden täglich erhoben. Blutproben wurden für die Leukozytenzählung, die Herstellung von Buffy coats und für die Serologie gesammelt. Nach Studienende wurde fetales Gewebe für die Virusisolation gesammelt.
  • Material und Methoden
  • Wie in Beispiel 1 aufgeführt.
  • Ergebnisse
  • Es wurden keine klinische Daten erhoben (Daten nicht aufgeführt). Die Leukozytenzahl blieb nahezu unverändert mit Ausnahme eines signifikanten Abfalls von etwa 40% unter dem Referenzwert (Tag 0) innerhalb eines einzigen Tages (Tag 6 NI) bei Färse Nr. 1015.
  • Auswertung der Buffy coat-Präparationen
  • Etwa 106 Leukozyten wurden im Doppel 5 Tage mit MDBK-Zellen in 24 Well-Gewebekulturplatten kultiviert. Die Proben unterliefen zwei Einfrier/Auftau-Zyklen. Frisch angesetzte 24 Well-Gewebekulturplatten wurden mit 100 ml-Aliquots aufgetauter Proben beimpft und mittels indirekter Immunfluoreszenzfärbung (mAb Code 4, gegen ein konserviertes Epitop des nicht-strukturellen Protein NS3 gerichtet) auf Viren getestet. Aus den Buffy coats der Tiere Nr. 921, Nr. 1013, Nr. 1015, Nr. 1055 und Nr. 1075 (Tabelle 3.2) konnten keine Viren isoliert werden, wohingegen positiv getestete Kontrolltiere die ordnungsgemäße Durchführung dieses Versuches belegten.
  • b) Post-mortale Untersuchung von fetalem Gewebe
  • Nach Studienende wurde die folgenden fetalen Gewebeproben zum Zwecke der Virusisolation gesammelt: Milz, Niere, Thymus, Brustbein, Cerebellum, Plazenta, Darm und Abdominalflüssigkeit. Um das Verfahren kurz zusammenzufassen, wurden Gewebesuspensionen im Mörser mit Hilfe von sterilem Meersand und eiskaltem PBS ohne Ca2+ und Mg2+ hergestellt. Die Mörser wurden mit 1 ml eiskaltem PBS ohne Ca2+ und Mg2+ ausgespült und die Suspensionen 10 min bei 2000 × g (4°C) zentrifugiert. Der Überstand durchlief zunächst einen 0,45 μm Einweg-Filterhalter, gefolgt von einem zweiten Filterdurchlauf (0,2 μm Porengröße). Die Virusisolation (400 μl fetale Gewebesuspension oder 100 ml fetale Abdominalflüssigkeit) wurde in doppelter Anordnung auf einer MDBK-Zellschicht in einer 24 Well- Gewebekulturplatte (37°C, 7% CO2) durchgeführt. Gewebeproben wurden täglich auf das Vorliegen einer Zytopathie oder bakterielle Kontamination untersucht. Nach einer Inkubationszeit von 5 Tagen wurden die Gewebekulturplatten zweimal eingefroren und aufgetaut. Auf die frisch angesetzten MDBK-Zellen wurden 100 μl Probe gegeben. Der Virennachweis erfolgte mittels indirekter Immunfluoreszenzfärbung (mAb Code 4). Aus den Gewebeproben oder den fetalen Abdominalflüssigkeiten konnte kein BVDV nachgewiesen werden (Tabelle 3.3).
  • c) Serologische Befunde
  • Die Titer für die Neutralisierung des Serums wurden vor der Impfung, 1 Monat nach der Impfung und am Studienende ermittelt. Seren von allen Tieren wurden in Dreierreihen auf neutralisierende Antikörper gegen NY93/C getestet und die Endpunkt-Verdünnung mittels indirekter Immunfluoreszenzfärbung abgelesen. Die Ergebnisse wurden als Endpunkt-Verdünnung angegeben, die etwa die Menge von 100 TCID50 neutralisierte und nach der Methode von Kaerber berechnet wurden. Für den Tag 0, und Woche 1 und Woche 2 nach der Infektion konnten keine genaue Daten erhoben werden, da die Seren in Verdünnungen bis zu 1:16 toxisch auf die MBDK-Zellen wirkten und bei höheren Verdünnungen keine Neutralisierungen gemessen werden konnten. Anfang der dritten Woche nach der Impfung entwickelten alle Tiere bis zum Versuchsende neutralisierende Antikörper gegen das homologe BVDV-2 Virus NY93/C (Tabelle 3.4 und 1).
  • d) Schlussfolgerungen
  • Die während der Tierstudie erhaltenen Daten zeigen deutlich, dass das BVDV XIKE-B-NdN ein stark attenuiertes Virus darstellt. Im Gegensatz zum Wildtyp-Virus oder den Einfachmutanten XIKE-B oder XIKE-A-NdN, die sich in trächtigen Färsen als stark fetengängig erwiesen hatten, erwies sich die Doppelmutante als nicht plazentagängig. BVDV XIKE-B-NdN wie auch ähnliche Doppelmutanten sind für den Einsatz in attenuierten Lebendvakzinen ausgezeichnet geeignet.
  • Studie Nr.: B01 BIVI020 und B01 BIVI022 Tabelle 3.1: Rücktitration der Viren
    Figure 00490001
  • Figure 00500001
  • Figure 00510001
  • Figure 00520001
  • Wirksamkeits- und Kreuzschutz-Studie
  • Beim Impfen mit den attenuierten Virusmutanten BVDV XIKE-B oder BDVD XIKE-B-NdN müssen zwei mögliche Probleme berücksichtigt werden. Das erstere betrifft einen möglichen Kreuzschutz zwischen BVDV-1 und BVDV-2. Zumindest verhinderte eine Impfung mit deaktiviertem BVDV-1 Impfstoff nicht die Übertragung von BVDV-2 auf die Feten von trächtigen Tieren. Da der Schutz gegen fetale Infektion das Hauptziel der anti-BVDV-Impfungen darstellt, kann man bei Impfstoffen dieser Art nicht von der Induktion einer umfassenden schützenden Immunität ausgehen. Es stellte sich daher die Frage, ob das Impfen mit attenuiertem BVDV-2 die Virenübertragung auf Feten verhindern kann. Zweitens kann sich aus den reduzierten Wachstumsraten des BVDV XIKE-B-NdN eine nur niedrige Schutzwirkung ergeben, die die transplazentale Infektion von Feten in trächtigen Färsen nicht unterbinden kann. Um diese Fragestellung zu klären, wurde eine Tierstudie durchgeführt. Die Tiere (2 Gruppen mit jeweils 10 Tiere) wurden entweder mit BVDV XIKE-B oder XIKE-B-NdN (Dosierungsziel: 1 ml Überstand mit 105 TCID50 Virus; die Ergebnisse der Rücktitration sind in Tabelle 3.5 aufgeführt) geimpft. In keinem der Tiere, mit Ausnahme eines Tieres aus der nichtgeimpften Gruppe, welches einen Tag lang mit leichtem Husten auffällig wurde, konnten nach der Impfung signifikante klinische Zeichen beobachtet werden. Rektaltemperaturen waren in allen Tieren, mit Ausnahme bei einem Tier aus der nichtgeimpften Gruppe, welches einen Tag lang 39,1°C aufwies, unter 39°C. Buffy coat-Proben wurden nach der Impfung hergestellt und wurden nach der oben beschriebenen Methode auf die Anwesenheit von Viren untersucht. Die Versuche zeigten, dass in nur 5 von 20 untersuchten Tieren zwischen 4 bis 8 Tagen nach der Infektion für 1 bis 2 Tage Viren im Blut nachgewiesen werden konnte (Tabelle 3.6).
  • Tabelle 3.5: Rücktitration der bei der Impfung verwendeten Viren
    Figure 00530001
  • Figure 00540001
  • Figure 00550001
  • Die Tiere wurden vier Wochen nach der Impfung besamt. Provokationsimpfungen wurden 60 Tage bis 90 Tage später durchgeführt entweder mit dem BVDV-1 Stamm (BVDV KE-9, heterologe Provokation, Tiere mit XIKE-B geimpft) oder mit dem heterologen BVDV-2 Stamm (BVDV KE-13, homologe Provokation, Tiere mit XIKE-B-NdN geimpft) (Zieldosierung: 105 TCID50 in 6 ml; Daten der Rücktitration sind in Tabelle 3.7 aufgeführt). Aus jeder Gruppe geimpfter Tiere wurden 5 trächtige Färsen nach dem Zufallsprinzip für die Provokationsimpfung ausgewählt. Tiere, die mit BVDV XIKE-B geimpft worden waren, erhielten eine Provokationsimpfung mit dem BVDV-1-Stamm KE-9, wohingegen mit BVDV XIKE-B/NdN geimpfte Färsen eine Provokationsimpfung mit dem BVDV-2 KE-13 erhielten. Zusätzlich wurden zwei nicht-geimpfte Tiere mit je einem der beiden Provokationsviren infiziert.
  • Figure 00560001
  • Die geimpften Tiere zeigten nach der Provokationsimpfung weder eine Virämie noch klinische Symptome. Die Provokationsimpfung wurde als aktiv bewertet, da alle nicht-geimpften Kontrolltiere BVDV-positiv getestet wurden (Tabelle 3.8). In der Kontrollgruppen wurden nur leichte Krankheitszeichen festgestellt. Die Leukozytenzahlen waren annähernd normal (Daten nicht gezeigt).
  • Figure 00570001
  • Figure 00580001
  • Serum-Neutralisationstiter wurden vor der Impfung, 1 Monat nach der Impfung, vor der Provokationsimpfung, 1 Monat nach der Provokationsimpfung und am Studienende bestimmt. Seren von allen Tieren wurden mittels Dreifachbestimmungen auf neutralisierende Antikörper gegen KE9 und NY93/C (1456Nase) untersucht und die Endpunkt-Verdünnung mittels indirekter Immunfluoreszenzfärbung dargestellt. Die Ergebnisse wurden als die Endpunkt-Verdünnung dargestellt, bei der etwa die 100-fache TCID50-Menge neutralisiert wurde und nach der Methode von Kaerber bestimmt wurde. Bei einigen der höheren Antikörpertiter erwies sich die eingesetzte Endpunkt-Verdünnung als nicht ausreichend hoch. Nur Tiere, die mit XIKE-B geimpft worden waren, entwickelten ab etwa dem Anfang der vierten Woche niedrige Antikörpertiter gegen KE9. Zum Zeitpunkt der Provokationsimpfung wiesen alle Tiere Antikörpertiter auf, die etwa vier Wochen nach der Provokationsimpfung beträchtlich zunahmen. Mit XIKE-B geimpfte Tiere wiesen höhere Antikörpertiter auf als Tiers, die mit XIKE-B-NdN geimpft worden waren. Alle Tiere entwickelten innerhalb von vier Wochen nach der Impfung in etwa vergleichbare Neutralisationstiter gegen Ny93/C, wobei geringfügig niedrigere Titer in XIKE-B-NdN-geimpften Tieren gemessen wurden. Nach der Provokationsimpfung wiesen alle Tiere hohe Titer auf. Die Ergebnisse des Serumneutralisationstest gegen KE9 (BVDV-1) sind in 2 dargestellt, und 3 zeigt die Ergebnisse des Serumneutralisationstests gegen NY93/C (BVDV-2).
  • Die Untersuchung der Gewebeproben, die nach Studienende von den Feten entnommen wurden, zeigte, dass das Material, welches von den geimpften Tieren entnommen wurde, negative Ergebnisse aufwies, wohingegen eine Übertragung in allen vier Kontrolltieren stattgefunden hatte (Tabelle 3.9). Daher ist offensichtlich, dass die etablierten BVDV-2 Mutanten sehr gut für den Einsatz als kreuzschützende Impfviren geeignet sind.
  • Figure 00600001
  • Figure 00610001
  • Schlussfolgerung
  • Die Provokationsimpfung war erfolgreich, da alle nicht geimpften Kontrolltiere eine BVDV-Virämie aufwiesen und die Feten aller nicht geimpften Kontrolltiere BVDV-positiv wurden.
  • Unter den vorliegenden Test- und Assaybedingungen gewährten beide Isolate einen vollständigen Schutz. Das Isolat XIKE-B mit dem einfachen genetischen Marken gewährte einen Kreuzschutz gegen BVDV-Typ 1-Provokation bezüglich BVD-Virämie und Übertragung auf Feten nach der Provokation. Das Isolat XIKE-B-NdN mit dem doppelten genetischen Marker gewährte einen vollständigen Schutz gegen einen heterologen BVDV-Typ 2-Provokationsstamm bezüglich BVD-Virämie und Übertragung auf Feten nach der Provokation.
    • 1. Isolat XIKE-B (Isolat vom Typ 2) wurde als kreuzprotektiv gegen eine BVDV Typ 1-Provokation bezüglich BVD-Virämie und Übertragung auf Feten nach der Provokation unter den bestehenden Test- und Assaybedingungen nachgewiesen (n=4).
    • 2. Isolat XIKE-B-NdN (Isolat vom Typ 2) wurde als voll protektiv gegen einen heterologen BVDV Typ 2-Provokationsstamm bezüglich BVD-Virämie und Übertragung auf Feten nach der Provokation unter den bestehenden Test- und Assaybedingungen nachgewiesen (n=5).
  • Beispiel 4
  • Weitere Untersuchungen von BVDV-2 Mutanten mit Npro-Deletionen Verschiedene Mutanten mit Deletionen in der Npro-kodierenden Region des Genoms wurden bereitgestellt. Am Anfang wurden nur echte Deletionen oder eine von einer Punktmutation begleitete Deletion eingeführt.
    • A: [Npro]1-[C-term];
    • B: [Npro]3-[C-term];
    • C: [Npro]4-[C-term];
    • D: [Npro]6-[C-term];
    • E: [Npro]4-[C-term*]
  • In den Formeln [Npro]x steht X für die Anzahl der Gruppen am aminoterminalen Ende des Npro, die in den mutierten Polyprotein-Arninosäuren verbleiben; [C-term] stellt das vollständige Polyprotein mit Ausnahme von Npro (welches am C-Protein anfängt und mit NS5B endet); [C-term*] unterscheidet sich vom [C-term] in einer Mutation in der Position 2 am C-Protein (N statt D).
  • Die Wachstumsratem der bereitgestellten Viren waren beträchtlich niedriger als bei Wildtyp-XIKE-A oder bei der RNase-negativen Mutante XIKE-B. Für diesen Befund gibt es zwei mögliche Erklärungen: (i) Je nach Virusstamm werden Sequenzen unterschiedlicher Länge aus der Npro-kodierenden Region für eine wirksame Einleitung der Translation benötigt (Meyers et al., 2001; Tautz et al., 1999) und (ii) die Fusion zusätzlicher Sequenzen am aminoterminalen Ende des Capsid-Proteins führt zur einer Funktionsstörung der Capsid-Proteine.
  • Um schneller wachsende Npro-Deletionsmutanten bereitzustellen, wurde ein zweiter Mutantensatz generiert mit entweder einem bovinen Ubiquitin-Gen oder einem Fragment der bovinen LC3-kodierenden Sequenz, das den Großteil des Npro-Gens ersetzt. Diese Konstrukte erlauben eine wirksame Translation und erzeugen somit ein Capsid-Protein mit dem fehlerfreien Aminoterminus. [Npro]22[PS]-[C-term] wobei PS Ubiquitin oder LC3 ist, und C-term das vollständige Polyprotein mit Ausnahme von Npro (welches am C-Protein anfängt und mit NS5B endet) darstellt.
  • Die Wachstumsraten dieser Mutanten sind ähnlicher denen, die für XIKE-A ermittelt wurden. Scheinbar wiesen die beiden RNase-positiven Viren V-pK87F und V-pK87G mit der allgemeinen Formel [Npro]22[PS]-[C-term] keine signifikante Wachstumsverzögerung auf, wohingegen das RNase-negative Gegenstück V-pK88G wiederum etwas gehemmt in der Vermehrung war, dies jedoch nicht in dem Ausmaß wie bei den vorbeschriebenen Mutanten.
  • Weitere Beispiele von Npro-Deletionsmutanten sind:
    MESDEGSK...
    MELFSSDEGSK...
    MELFSNESDEGSK...
    MELFSNELSDEGSK...
    MELFSNELLSDEGSK...
    MELFSNELLYSDEGSK...
    MELFSNELLYKSDEGSK...
    MELFSNELLYKTSDEGSK...
  • MELFSNELLYKT stellt die aminoterminale Sequenz des Npro des BVDV Isolats NewYork93/C dar.
  • Es ist auch möglich, Varianten dieser Sequenzen mit einer oder mehreren Mutationen zu verwenden. Insbesondere ist zu erwarten, dass die natürlich vorkommenden Varianten, wie sie bei anderen Pestiviren vorliegen, funktionell sind.
  • Daher kann die vollständige Liste der geprüften oder vorgeschlagenen Varianten mit den unterschiedlichen Resten am aminoterminalen Ende des Npro mittels Aminosäureaustausch durch gleichwertige Gruppen erweitert werden. Unten sind typische Beispiele der entsprechenden Sequenzen für mehrere Pestiviren aufgeführt, wobei die Menge der möglichen Varianten nicht auf diese Beispiele beschränkt sind.
    BVDV NewYork93/C: MELFSNELLYKT
    BVDV CP13: MELISNELLYKT
    BVDV SD1: MELITNELLYKT
    CSFV Brescia: MELNHFELLYKT
    BDV X818: MELANKFELLYKT
  • Daher können die Varianten zum Beispiel auch die folgenden beinhalten:
    MELI-[PS]0-[C-term];
    MELIS-[PS]0-[C-term];
    MELISN-[PS]0-[C-term];
    MELISNE-[PS]0-[C-term];
    MELISNEL-[PS]0-[C-term];
    MELISNELL-[PS]0-[C-term];
    MELISNELLY-[PS]0-[C-term];
    MELISNELLYK-[PS]0-[C-term];
    MELISNELLYKT-[PS]0-[C-term];
    MELIT-[PS]0-[C-term];
    MELITN-[PS]0-[C-term];
    MELITNE-[PS]0-[C-term];
    MELITNEL-[PS]0-[C-term];
    MELITNELL-[PS]0-[C-term];
    MELITNELLY-[PS]0-[C-term];
    MELITNELLYK-[PS]0-[C-term];
    MELITNELLYKT-[PS]0-[C-term];
  • Diese Formeln können auch [PS]1, enthalten, d.h. PS kann auch ein PS wie hier beschrieben darstellen.
  • Sequenzen, die dem Npro Protein zugeordnet sind, sind kursiv dargestellt. Aminosäureaustausche relativ zur Sequenz des BVDV NewYork93/C sind in Fettschrift dargestellt.
  • Weitere Beispiele können beispielsweise unter Benutzung der GenBank-Zugriffsnummern gefunden werden, die bei Becher et al., 2003, Virology 311, 96-104, angegeben sind, oder durch Sequenzdaten-Standardrecherchen.
  • Eine weitere Möglichkeit stellt die Verwendung eines Processing-Signals (PS) dar, welches zwischen der (verbleibenden) Npro-Sequenz und dem Aminoterminus des Capsid-Proteins eingeführt wird. Das PS führt zu einer Spaltung, welches ein funktionelles Capsid-Protein freisetzt. Die Konfiguration eines solches Konstrukts kann wie folgt ausgeführt sein: [Npro]22-PS[C-term]
  • PS: Processing-Signal. Dieses kann entweder Target einer Protease (z.B. Ubiquitin, nachstehend definierte LC3 oder eine Protease oder ein instabiles Peptid, das zum Processing an seinem eigenen Carboxyterminus führt, beispielsweise Intein (Chong et al. 1998 und dort aufgeführte Referenzen) oder 3C von Picornaviren oder 2A von Caridoviren oder Aphtoviren, p15 vom Chinaseuchenvirus oder der entsprechenden Protease von anderen Caliciviren (Proter 1993, und dort aufgeführte Referenzen; Meyers et al., 2000 und dort aufgeführte Referenzen) sein.
  • Bei der Verwendung von PS kann eine große Anzahl von Varianten erzielt werden, da das PS die Erzeugung eines fehlerfreien Aminoterminus beim Capsid-Protein C gewährleistet. Daher kann erwartet werden, dass bei der Verwendung eines PS-Konstrukts alle Deletionen oder Mutationen der Npro-Sequenz funktionsfähige Mutanten ergeben unter der Voraussetzung, dass das Leseraster nicht verschoben ist oder die Translation durch ein Stopcodon im Leseraster angehalten wird. Als Beispiel wurde eine funktionsfähige CSFV Npro-Mutante mit der nachstehenden Formel erzeugt: [Npro]29-PS[C-term]
  • Als besonders interessant können sich Npro-Mutanten erweisen, welche die Proteolyse von Proteinen blockieren können. Von Rürnenapf et al. (1998) ist die Identifizierung der Aktivzentrumsreste der Protease für CSFV Alfort Tübingen veröffentlicht worden. Die jeweiligen Aminosäuren (Glutaminsäure in Position 22, Histidin in Position 49 und Cystein in Position 69) waren bei anderen Pestiviren konserviert. Der Austausch einer beliebigen Aminosäure, mit Ausnahme von Serin oder Threonin, für das Cystein in Position 69 führt zum Erliegen der Protease-Aktivität. Ähnlich führt der Austausch von Glutaminsäure in Position 22 höchstwahrscheinlich zur Deaktivierung der Protease, es sei denn der Austausch erfolgte mit Asparaginsäure. In ähnlicher Weise werden die meisten, wenn auch nicht alle, Austausche in Position 49 eine inaktive Protease ergeben.
  • Referenzen
    • Baker, J.C. 1987. Bovine viral diarrhea virus: A Review. J. Am. Vet. Med.Assoc. 190: 1449-1458.
    • Becher, P., König, M., Paton, D.J., Thiel, H.J., 1995, Further characterization of border disease virus isolates: evidence for the presence of more than three species within the genus pesivirus. Virology 209 (1), 200-206.
    • Chong, S., Williams, K.S., Wotkowicz, C., and Xu, M.Q.1998. Modulation of Protein Splicing of the Saccharomyces cerevisiae Vacuolar Membrane ATPase Intein. J. Biol. Chem. 273: 10567-10577.
    • Donis, R.O., Corapi, W., and Dubovi, E.J. 1988. Neutralizing monoclonal antibodies to bovine viral diarrhea virus bind to the 56K to 58K glycoprotein. J. Gen. Virol. 69: 77-86.
    • Fuerst T.R. et al. 1986. Eukaryotic transient expression system based on recombinant vaccinia virus that synthesizes bacteriophage T7 RNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 8122-8126.
    • Heinz, F.X., Collett, M.S., Purcell., R.H., Cold, E.A., Howard, C.R., Houghton, M., Moormann, R.J.M., Rice, C.M., and Thiel, H.-J. 2000. Familiy Flaviviridae. pp. 859-878. In: Virus Taxonomy (van Regenmortel., H.H.V., Fauquet, C.M., and Bishop, D.H.L, Eds.). Academic Press, San Diego.
    • Hulst, M.M., Himes, G., Newbigin, E., Moormann, R.J.M. 1994. Glycoprotein E2 of classical swine fever virus: expression in insect cells and identification as a ribonuclease. Virology 200: 558-565.
    • Hulst, M.M., F.E. Panoto, A. Hooekmann, H.G.P. van Gennip., and Moormann, R.J.M. 1998. Inactivation of the RNase activity of glycoprotein Erns of classical swine fever virus results in a cytopathogenic virus. J. Virol. 72: 151-157.
    • Kit, M. and S. Kit. 1991. Sensitive glycoprotein gIII blocking ELISA to distinguish between pseudorabies (Aujeszky's disease) -infected and vaccinated pigs. Veterinary Microbiology 28:141-155.
    • Kunkel, T. A., J. D. Roberts, and R. A. Zakour. 1987. Rapid and efficient sitespecific mutagenesis without phenotypic selection. Methods Enzymol. 154:367-392.
    • König, Matthias, 1994, Virus der klassischen Schweinepest: Untersuchungen zur Pathogenese and zur Induktion einer protektiven Immunantwort. Dissertation, Tierärztliche Hochschule Hannover, Germany.
    • Lindenbach, B.D., and Rice, C. M. 2001. The pestiviruses. In Fields Virology, eds. Knipe, D.M., & Howley, P.M. (Lippincott-Raven, Philadelphia), pp. 991-1042. Mayer, D., Hofmann, M.A., and Tratschin, J.D. 2004. Attenuation of classical swine fever virus by deletion of the viral N(pro) gene. Vaccine. 22:317-328.
    • Meyers, G., Rümenapf, T. and Thiel, H.-J. 1989. Molecular cloning and nucleotide sequence of the genome of hog cholera virus. Virology 171: 555-567.
    • Meyers, G., Saalmüller, A., and Büttner, M. (1999). Mutations abrogating the RNase activity in glycoprotein e(rns) of the pestivirus classical swine fever virus lead to virus attenuation. J Virol 73: 10224-10235.
    • Meyers, G., Tautz, N., Becher, P., Thiel, H.-J., & Kümmerer, B.M. 1996b. Recovery of cytopathogenic and noncytopathogenic bovine viral diarrhea viruses from cDNA constructs. J. Virol., 70: 8606-8613.
    • Meyers, G., Thiel, H.-J., and Rümenapf, T. 1996a. Classical swine fever virus: Recovery of infectious viruses from cDNA constructs and generation of recombinant cytopathogenic swine fever virus. J. Virol. 67:7088-709526.
    • Meyers, G., Wirblich, C., Thiel. H.-J. and Thumfart, J.O. 2000. Rabbit hemorrhagic disease Virus: genome organization and polyprotein processing of a calicivirus studied after transient expression of cDNA constructs. Virology 276: 349-363.
    • Moennig, V. and Plagemann, J. 1992. The pestiviruses. Adv. Virus Res. 41: 53-91.
    • Paton, D.J., Lowings, J.P., Barnett, A.D. 1992. Epitope mapping of the gp53 envelope protein of bovine viral diarrhea virus. Virology 190: 763-772.
    • Pellerin, C. et. al. Identification of a new group of bovine viral diarrhea virus strains associated with severe outbreaks and high mortalities, Virology 203, 1994:260-268.
    • Porter, A.G. (1993). Picornavirus nonstructural proteins: emerging roles in virus replication and inhibition of host cell functions. J. Virol. 67, 6917-6921.
    • Rüggli, N., Tratschin, J.D., Schweizer, M., McCullough, K.C., Hofmann, M.A., Summerfield, A. 2003. Classical swine fever virus interferes with cellular antiviral defense: evidence for a novel function of N(pro). J. Virol. 77:7645-7654.
    • Rümenapf, T., Stark, R., Heimann, M., and Thiel, H.-J. 1998. N-terminal protease of pestiviruses: identification of putative catalytic residues by site. directed mutagenesis. J. Virol. 72: 2544-2547.
    • Rümenapf, T., Unger, G., Strauss, J.H., and Thiel, H.-J. 1993. Processing of the evelope glycoproteins of pestiviruses. J. Virol. 67: 3288-3294.
    • Schneider, R., G. Unger, R. Stark, E. Schneider-Scherzer, and H.-J. Thiel. 1993. Identification of a structural glycoprotein of an RNA virus as a ribonuclease. Science 261: 1169-1171.
    • Stark, R., Meyers, G., Rümenapf, T., and Thiel, H.-J. (1993): Processing of pestivirus polyprotein: Cleavage site between autoprotease and nucleocapsid protein of classical swine fever virus. J. Virol., 67, 7088-7095.
    • Thiel, H.-J., Plagemann, G.W., & Moennig, V. 1996. The pestiviruses. In Fields Virology, eds. Fields, B.N., Knipe, D.M., & Howley, P.M. (Lippincott-Raven, Philadelphia), pp.1059-1073.
    • Thiel, H.-J., Stark, R., Weiland, E., Rümenapf, T. & Meyers, G. 1991. Hog cholera virus: molecular composition of virions from a pestivirus. J. Virol. 65: 4705-4712.31.
    • Tratschin, J.-D., Moser, C., Ruggli, N., and Hofmann, M.A. 1998. Classical swine fever virus leader proteinase Npro is not required for viral replication in cell culture. J. Virol. 72, 7681-7684.
    • van Rijn, P.A., van Gennip, H.G., de Meijer, E.J., Moormann, R.J. 1993. Epitope mapping of envelope glycoprotein E1 of hog cholera virus strain Brescia. J. Gen. Virol. 74: 2053-2060.
    • Weiland, E., Thiel, H.-J., Hess, G., and Weiland, F. (1989). Development of monoclonal neutralizing antibodies against bovine viral diarrhea virus after pretreatment of mice with normal bovine cells and cyclophosphamide. J. Virol. Methods 24: 237-244.
    • Weiland, E., Stark, R., Haas, B., Rümenapf, T., Meyers, G, and Thiel, H.-J. (1990). Pestivirus glycoprotein which induces neutralizing antibodies forms part of a disulfide-linked heterodimer. J. Virology 64, 3563-3569.
    • Weiland, E., Ahl, R., Stark, R., Weiland, F. and Thiel, H.-J. (1992). A second envelope glycoprotein mediates neutralization of a pestivirus, hog cholera virus. J. Virology 66, 3677-3682.
    • Windisch, J.M., Schneider, R., Stark, R., Weiland, E., Meyers, G., and Thiel, H.-J. 1996. RNase of classical swine fever virus: biochemical characterization and inhibition by virus-neutralizing monoclonal antibodies. J. Virol. 70: 352-358.
    • Wiskerchen, M., Belzer, S.K., and Collett, M. S. 1991. Pestivirus gene expression: the first protein product of the bovine viral diarrhea virus large open reading frame, p20, possesses proteolytic activity J. Virol. 65:4508-4514.
  • Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims (32)

  1. Attenuiertes bovines Virusdiarrhoe-Virus (BVDV) mit mindestens einer Mutation in der kodierenden Sequenz für das Glycoprotein Erns und mindestens einer Mutation in der kodierenden Sequenz für Npro.
  2. BVDV nach Anspruch 1, wobei die Mutation in der kodierenden Sequenz für das Glycoprotein Erns zur Deaktivierung der von Erns ausgehenden RNase-Aktivität und/oder die Mutation in der kodierenden Sequenz für Npro zur Deaktivierung von Npro führt.
  3. BVDV nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Mutationen aus der Gruppe der Deletionen, Insertationsmutationen und/oder Substitutionsmutationen ausgewählt sind.
  4. BVDV nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Mutation(en) Deletionen sind.
  5. BVDV nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Mutation(en) in der kodierenden Sequenz für das Glycoprotein Erns in der kodierenden Nucleotidsequenz lokalisiert sind, die den Aminosäuren in Position 298 bis 310 und/oder Position 341 bis 360 entsprechen.
  6. BVDV nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Mutation in der kodierenden Sequenz für das Glycoprotein Erns eine Deletion oder eine Substitution des Histidins in Position 349 ist.
  7. BVDV nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Mutation(en) in der kodierenden Sequenz für das Glycoprotein Erns in der Nucleotidsequenz lokalisiert sind, die für die konservierte Erns-Sequenz SLHGIWPEKICTG und/oder LQRHEWNKHGWCNWFHIEPW kodiert.
  8. BVDV nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Mutation(en) in der kodierenden Sequenz für das Glycoprotein Erns in der Nucleotidsequenz lokalisiert sind, die für die konservierte Erns-Sequenz SLHGIWPEKIC und/oder RHEWNKHGWCNW kodiert.
  9. BVDV nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Mutation(en) in der kodierenden Sequenz für das Glycoprotein Erns zwei Mutationen sind, die in der Nucleotidsequenz lokalisiert sind, die für die konservierte Erns-Sequenz SLHGIWPEKIC und/oder RHEWNKHGWCNW kodiert.
  10. BVDV nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Mutation in der kodierenden Sequenz für das Glycoprotein Erns eine einzelne Mutation ist, die in der konservierten Erns-Sequenz SLHGIWPEKIC oder RHEWNKHGWCNW lokalisiert ist.
  11. BVDV nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Mutation(en) auf der kodierenden Sequenz für Npro ein kodiertes Polyprotein ergeben, das durch die folgende Formel charakterisiert ist: [Npro]x-[PS]y-[C-term] und worin: [Npro] den Npro-Teil des Polyproteins bezeichnet; [N-term] den verbleibenden unmodifizierten C-terminalen Teil des Polyproteins bezeichnet; M N-terminales Methionin bezeichnet; [Npro] den Npro-Teil des Polyproteins bezeichnet; [PS] ein Processing-Signal bezeichnet, ausgewählt aus der Gruppe von Ubiquitin, LC3, SUMO-1, NEDD8, GATE-16, GABA(A)RAP, Intein, Picornavirus 3C, Caridovirus 2A und p15 des Chinaseuchenvirus; [C-term] das vollständige BVDV-Polyprotein, mit Ausnahme von Npro, einschließlich des Capsid (C)-Proteins und irgendeinem anderen in dem BVDV-Polyprotein vorliegenden Protein, einschließlich dem carboxyterminalen NS5B, bezeichnet, und worin x 0-12 Aminosäuren ist, wenn y=0, oder 0-168 wenn y=1; y 0 oder 1 ist und 0= abwesend, 1= anwesend.
  12. BVDV nach Anspruch 11, wobei die Mutation(en) in der kodierenden Sequenz für Npro ein kodiertes Polyprotein ergeben, das durch die folgende Formel charakterisiert ist: [Npro]1-[PS]0-[C-term] und wobei die Definitionen wie in Anspruch 11 definiert sind.
  13. BVDV nach Anspruch 11, wobei die Mutation(en) in der kodierenden Sequenz für Npro ein kodiertes Polyprotein ergeben, das durch die folgende Formel charakterisiert ist: [Npro]3-[PS]0-[C-term] und wobei die Definitionen wie in Anspruch 11 definiert sind.
  14. BVDV nach Anspruch 11, wobei die Mutation(en) in der kodierenden Sequenz für Npro ein kodiertes Polyprotein ergeben, das durch die folgende Formel charakterisiert ist: [Npro]4-[PS]0-[C-term] und wobei die Definitionen wie in Anspruch 11 definiert sind.
  15. BVDV nach Anspruch 11, wobei die Mutation(en) in der kodierenden Sequenz für Npro ein kodiertes Polyprotein ergeben, das durch die folgende Formel charakterisiert ist: [Npro]6-[PS]0-[C-term] und wobei die Definitionen wie in Anspruch 11 definiert sind.
  16. BVDV nach Anspruch 11, wobei die Mutation(en) in der kodierenden Sequenz für Npro ein kodiertes Polyprotein ergeben, das durch die folgende Formel charakterisiert ist: [Npro]4-[PS]0-[C-term*] wobei in dem C-Protein die Aminosäure in Position 2 von D zu N geändert wurde ud wobei die Definitionen wie in Anspruch 11 definiert sind.
  17. BVDV nach Anspruch 11, wobei die Mutation(en) in der kodierenden Sequenz für Npro ein kodiertes Polyprotein ergeben, das durch die folgende Formel charakterisiert ist: [Npro]x-[PS]1-[C-term] und wobei die Definitionen wie in Anspruch 13 definiert sind und PS aus der Gruppe von Ubiquitin oder LC3 ausgewählt ist.
  18. BVDV nach Anspruch 11, wobei die Mutation(en) in der kodierenden Sequenz für Npro ein kodiertes Polyprotein ergeben, das durch eine Formel charakterisiert ist, welche aus der Gruppe ausgewählt ist: M-[PS]0-[C-term]; MEL-[PS]0-[C-term]; MELF-[PS]0-[C-term]; MELFS-[PS]0-[C-term]; MELFSN-[PS]0-[C-term]; MELFSNE-[PS]0-[C-term]; MELFSNEL-[PS]0-[C-term]; MELFSNELL-[PS]0-[C-term]; MELFSNELLY-[PS]0-[C-term]; MELFSNELLYK-[PS]0-[C-term]; MELFSNELLYKT-[PS]0-[C-term]; MELI-[PS]0-[C-term]; MELIS-[PS]0-[C-term]; MELISN-[PS]0-[C-term]; MELISNE-[PS]0-[C-term]; MELISNEL-[PS]0-[C-term]; MELISNELL-[PS]0-[C-term]; MELISNELLY-[PS]0-[C-term]; MELISNELLYK-[PS]0-[C-term]; MELISNELLYKT-[PS]0-[C-term]; MELIT-[PS]0-[C-term]; MELITN-[PS]0-[C-term]; MELITNE-[PS]0-[C-term]; MELITNEL-[PS]0-[C-term]; MELITNELL-[PS]0-[C-term]; MELITNELLY-[PS]0-[C-term]; MELITNELLYK-[PS]0-[C-term]; MELITNELLYKT-[PS]0-[C-term]; [Npro]x-[PS]0-MELF-[PS]0-[C-term*]; wobei in dem C-Protein die Aminosäure in Position 2 von D zu N geändert wurde, und [Npro]22-[PS]1-[C-term], worin PS Ubiquitin oder LC3 ist.
  19. BVDV nach Anspruch 18, wobei das [PS]0 durch -[PS]1 ersetzt ist und worin PS ausgewählt ist aus der Gruppe von Ubiquitin, LC3, SUMO-1, NEDD8, GATE-16, GABA(A)RAP, Intein, Picornavirus 3C, Caridovirus 2A und p15 des Chinaseuchenvirus.
  20. BVDV nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 19, wobei das BVDV aus der Gruppe BVDV-Typ 1 oder BVDV-Typ 2 ausgewählt ist.
  21. BVDV nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 20, wobei das BVDV der SEQ ID Nr. 8 oder einer funktionellen Variante davon entspricht.
  22. Zusammensetzung umfassend das BVDV nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 21 und eine Lösung.
  23. Zusammensetzung nach Anspruch 22, die in einem Tier eine Immunantwort induziert.
  24. Zusammensetzung nach Anspruch 22 oder 23, die eine Vakzine ist.
  25. Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 22 bis 24, wobei die Zusammensetzung ferner einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Exzipienten umfasst.
  26. Verwendung des BVDV nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 21 bei der Herstellung einer Vakzine für die Prophylaxe und Behandlung von BVDV-Infektionen.
  27. Nucleotidmolekül, das für ein BVDV nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 21 oder ein Fragment, eine funktionelle Variante, eine Variante aufgrund des degenerierten Nucleinsäurecodes, ein Fusionsmolekül oder ein chemisches Derivat davon kodiert.
  28. Nucleotidmolekül nach Anspruch 27, wobei das Nucleotidmolekül eine DNA ist.
  29. Nucleotidmolekül nach Anspruch 27, wobei das Nucleotidmolekül eine RNA ist.
  30. Verfahren zur Attenuierung von BVDV, das dadurch gekennzeichnet ist, dass mindestens eine Mutation in der kodierenden Sequenz für das Glycoprotein Erns und mindestens eine weitere Mutation in der kodierenden Sequenz für Npro in einem BVDV erzeugt wird.
  31. Verfahren nach Anspruch 30, welches die folgenden Schritte umfasst: a) ein Wildtyp-BVDV wird revers-transkribiert und eine cDNA erhalten; b) die cDNA wird kloniert; c) Mutationen, ausgewählt aus der Gruppe von Deletionen, Insertationsmutationen und/oder Substitutionsmutationen werden in die cDNA eingeführt, wobei die Mutationen in der kodierenden Sequenz lokalisiert sind, die für das Glycoprotein Erns und die Protease Npro kodieren, und d) die cDNA in ein Plasmid oder in ein DNA-Virus einschleust, das in der Lage ist, die Transkription der BVDV-cDNA zu RNA in-vitro oder bei Infektion geeigneter Zellen zu steuern.
  32. Verfahren zur Behandlung von BVDV-verursachten Erkrankungen, wobei ein BVDV nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 21 oder eine Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 22 bis 25, einem bedürftigen Tier in einer geeigneten, dem Fachmann bekannten Dosis verabreicht wird, und die Abnahme der Symptome einer BVDV-Infektion wie Virämie und Leukopenie und/oder Pyrexie und/oder Diarrhoe beobachtet wird.
DE102004025452A 2004-05-19 2004-05-19 Vakzine enthaltend BVDV Withdrawn DE102004025452A1 (de)

Priority Applications (43)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102004025452A DE102004025452A1 (de) 2004-05-19 2004-05-19 Vakzine enthaltend BVDV
DE602005012381T DE602005012381D1 (de) 2004-05-19 2005-05-18 Impfstoff der einen attenuierten pestivirus enthält
DK05741681.0T DK1751276T5 (da) 2004-05-19 2005-05-18 Vaccine omfattende en svækket pestivirus
MXPA06013298A MXPA06013298A (es) 2004-05-19 2005-05-18 Vacuna que comprende un pestivirus atenuado.
CA2561719A CA2561719C (en) 2004-05-19 2005-05-18 Vaccine comprising an attenuated pestivirus
AU2005243488A AU2005243488B2 (en) 2004-05-19 2005-05-18 Vaccine comprising an attenuated pestivirus
KR1020067026800A KR100908798B1 (ko) 2004-05-19 2005-05-18 약독화 페스티바이러스를 포함하는 백신
PT05741681T PT1751276E (pt) 2004-05-19 2005-05-18 Vacina compreendendo um pestivírus atenuado
NZ552088A NZ552088A (en) 2004-05-19 2005-05-18 Vaccine comprising an attenuated pestivirus
CN201310269097.1A CN103352030B (zh) 2004-05-19 2005-05-18 含有减毒瘟病毒的疫苗
ARP050102032A AR049176A1 (es) 2004-05-19 2005-05-18 Vacuna que comprende un pestivirus atenuado
RS20090106A RS50753B9 (sr) 2004-05-19 2005-05-18 Vakcina koja sadrži oslabljeni pestivirus
JP2007517077A JP5006782B2 (ja) 2004-05-19 2005-05-18 弱毒ペスチウイルスを含むワクチン
CN200580024345XA CN1989240B (zh) 2004-05-19 2005-05-18 含有减毒瘟病毒的疫苗
MEP-2009-56A ME01119B (me) 2004-05-19 2005-05-18 Vakcina koja sadrži oslabljeni pestivirus
SI200530619T SI1751276T1 (sl) 2004-05-19 2005-05-18 Cepivo, ki obsega oslabljen pestivirus
UY28905A UY28905A1 (es) 2004-05-19 2005-05-18 Pestivirus atenuados con al menos una mutación en las secuencias codificadoras de glicoproteína erns y de npro, preparación y composiciones
BRPI0510396-7A BRPI0510396B1 (pt) 2004-05-19 2005-05-18 Pestivírus atenuado e seu uso, composição, molécula de ácido nucléico e método para atenuar pestivírus
EP05741681.0A EP1751276B9 (de) 2004-05-19 2005-05-18 Impfstoff der einen attenuierten pestivirus enthält
PCT/EP2005/005377 WO2005111201A1 (en) 2004-05-19 2005-05-18 Vaccine comprising an attenuated pestivirus
ES05741681T ES2321210T3 (es) 2004-05-19 2005-05-18 Vacuna que comprende un pestivirus atenuado.
PL05741681T PL1751276T3 (pl) 2004-05-19 2005-05-18 Szczepionka zawierająca atenuowane pestiwirusy
AT05741681T ATE420949T1 (de) 2004-05-19 2005-05-18 Impfstoff der einen attenuierten pestivirus enthält
US11/132,686 US7572455B2 (en) 2004-05-19 2005-05-19 Vaccine comprising an attenuated pestivirus
CY20091100429T CY1109036T1 (el) 2004-05-19 2009-04-10 Εμβολιο περιλαμβανον εναν εξασθενημενο ιο πανωλης
US12/463,564 US20090226488A1 (en) 2004-05-19 2009-05-11 Vaccine comprising an attenuated pestivirus
JP2011247652A JP5562316B2 (ja) 2004-05-19 2011-11-11 弱毒ペスチウイルスを含むワクチン
US13/655,278 US20130039946A1 (en) 2004-05-19 2012-10-18 Vaccine comprising an attenuated pestivirus
NL300745C NL300745I1 (de) 2004-05-19 2015-06-16
NL300743C NL300743I2 (de) 2004-05-19 2015-06-16
NL300744C NL300744I1 (de) 2004-05-19 2015-06-16
BE2015C036C BE2015C036I2 (de) 2004-05-19 2015-06-17
BE2015C034C BE2015C034I2 (de) 2004-05-19 2015-06-17
BE2015C035C BE2015C035I2 (de) 2004-05-19 2015-06-17
CY2015023C CY2015023I2 (el) 2004-05-19 2015-06-19 Εμβολιο περιλαμβανον εναν εξασθενημενο ιο πανωλης
CY2015021C CY2015021I2 (el) 2004-05-19 2015-06-19 Εμβολιο περιλαμβανον εναν εξασθενημενο ιο πανωλης
HUS1500031 HUS1500031I1 (hu) 2004-05-19 2015-06-19 Legyengített pestivírust tartalmazó vakcina
HUS1500033C HUS1500033I1 (hu) 2004-05-19 2015-06-19 Legyengített pestivírust tartalmazó vakcina
LU92748C LU92748I2 (fr) 2004-05-19 2015-06-19 Virus de la diarrhée virale bovine atténué 2 (bvdv-2)
CY2015022C CY2015022I2 (el) 2004-05-19 2015-06-19 Εμβολιο περιλαμβανον εναν εξασθενημενο ιο πανωλης
LU92747C LU92747I2 (fr) 2004-05-19 2015-06-19 Virus de la diarrhée bovine atténué 1 (bvdv-1)
LU92749C LU92749I2 (fr) 2004-05-19 2015-06-19 Composition comprenant le virus de la diarrhée virale bovine atténué 1(bvdv-1) et le virus de la diarrhée virale bovine atténué 2 (bvdv-2)
ARP160101219A AR104448A2 (es) 2004-05-19 2016-04-28 Una composición que comprende un pestivirus atenuado de dvb

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102004025452A DE102004025452A1 (de) 2004-05-19 2004-05-19 Vakzine enthaltend BVDV

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE102004025452A1 true DE102004025452A1 (de) 2006-01-19

Family

ID=34967522

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE102004025452A Withdrawn DE102004025452A1 (de) 2004-05-19 2004-05-19 Vakzine enthaltend BVDV
DE602005012381T Active DE602005012381D1 (de) 2004-05-19 2005-05-18 Impfstoff der einen attenuierten pestivirus enthält

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE602005012381T Active DE602005012381D1 (de) 2004-05-19 2005-05-18 Impfstoff der einen attenuierten pestivirus enthält

Country Status (25)

Country Link
EP (1) EP1751276B9 (de)
JP (2) JP5006782B2 (de)
KR (1) KR100908798B1 (de)
CN (2) CN103352030B (de)
AR (2) AR049176A1 (de)
AT (1) ATE420949T1 (de)
AU (1) AU2005243488B2 (de)
BR (1) BRPI0510396B1 (de)
CA (1) CA2561719C (de)
CY (4) CY1109036T1 (de)
DE (2) DE102004025452A1 (de)
DK (1) DK1751276T5 (de)
ES (1) ES2321210T3 (de)
HU (2) HUS1500031I1 (de)
LU (3) LU92747I2 (de)
ME (1) ME01119B (de)
MX (1) MXPA06013298A (de)
NL (3) NL300745I1 (de)
NZ (1) NZ552088A (de)
PL (1) PL1751276T3 (de)
PT (1) PT1751276E (de)
RS (1) RS50753B9 (de)
SI (1) SI1751276T1 (de)
UY (1) UY28905A1 (de)
WO (1) WO2005111201A1 (de)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7179473B2 (en) 1998-06-05 2007-02-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Attenuated pestiviruses
US7135561B2 (en) 2001-09-06 2006-11-14 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Infectious bovine viral diarrhea virus clone
US20090068223A1 (en) * 2005-11-15 2009-03-12 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Combination vaccine comprising an attenuated bovine viral diarrhea virus
AR062917A1 (es) * 2006-09-22 2008-12-17 Intervet Int Bv Nuevo mutante de pestivirus para uso en una vacuna.
UY31437A1 (es) 2007-10-29 2009-05-29 Vacuna de mycoplasma bovis y métodos de uso de la misma
UY31930A (es) 2008-06-25 2010-01-29 Boheringer Ingelheim Pharma Kg Pestivirus atenuados recombinantes, en particular a csfv, bvdv o bdv atenuado recombinante
CN102202685A (zh) 2008-10-31 2011-09-28 贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司 包含来自牛枝原体的抗原的多种抗原在多价疫苗组合物中的用途
US8846054B2 (en) 2009-01-09 2014-09-30 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Method of treating pregnant cows and/or heifers
UY32570A (es) 2009-04-24 2010-11-30 Boehringer Ingelheim Vetmed Vacuna viva modificada de mycoplasma bovis mejorada
ES2606605T3 (es) 2010-09-21 2017-03-24 Intervet International B.V. Vacuna para el BVDV
JP6589159B2 (ja) * 2014-04-01 2019-10-16 共立製薬株式会社 新規ネコモルビリウイルス株、不活化ワクチン製剤、並びにネコモルビリウイルス感染症予防方法
WO2015177369A1 (en) * 2014-05-23 2015-11-26 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Recombinant classical swine fever virus (csfv) comprising substitution in the tav epitope of the e2 protein
CN105779499B (zh) * 2016-03-23 2019-11-19 江苏科技大学 重组杆状病毒和其应用及构建该重组杆状病毒的载体
CN107823639B (zh) * 2017-11-10 2020-10-02 齐鲁动物保健品有限公司 牛病毒性腹泻病毒灭活疫苗及其制备方法
CN108707190B (zh) * 2018-04-18 2021-07-13 中国科学院武汉病毒研究所 猪瘟病毒ns5b蛋白保真度突变体及其应用
CN114853912B (zh) * 2022-05-24 2023-06-13 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种牛病毒性腹泻病毒e2-e0融合蛋白、制备方法及应用
CN115960847B (zh) * 2023-01-11 2024-06-14 青岛大学 小分子依赖的内含肽自剪接系统在制备减毒活疫苗中的应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6168942B1 (en) * 1998-11-10 2001-01-02 Pfizer Inc. Attenuated forms of bovine viral diarrhea virus
EP1104676A1 (de) * 1999-11-30 2001-06-06 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Sichere abgeschwächte Rinderdiarrhöeviren zur Verwendung in trächtigen Kühen
CA2363493C (en) * 2000-11-22 2006-06-06 Xuemei Cao Attenuated forms of bovine viral diarrhea virus
DE10143813A1 (de) * 2001-09-06 2003-04-10 Boehringer Ingelheim Vetmed Infektiöser Rindervirusdiarrhoe-Virusklon

Also Published As

Publication number Publication date
CY2015021I2 (el) 2023-11-15
RS50753B (sr) 2010-08-31
NL300744I2 (de) 2016-01-26
CY2015023I1 (el) 2020-05-29
HUS1500033I1 (hu) 2015-07-28
CY2015022I2 (el) 2024-02-16
AU2005243488A1 (en) 2005-11-24
EP1751276B1 (de) 2009-01-14
CN1989240B (zh) 2013-07-31
SI1751276T1 (sl) 2009-06-30
NL300745I2 (de) 2016-01-26
LU92747I2 (fr) 2015-11-02
BRPI0510396A (pt) 2007-11-13
CY1109036T1 (el) 2014-07-02
CN103352030A (zh) 2013-10-16
KR20070012862A (ko) 2007-01-29
NL300743I1 (de) 2016-01-26
CY2015023I2 (el) 2024-02-16
MXPA06013298A (es) 2007-05-07
NL300745I1 (de) 2016-01-26
CY2015022I1 (el) 2020-05-29
AR104448A2 (es) 2017-07-19
AR049176A1 (es) 2006-07-05
KR100908798B1 (ko) 2009-07-22
ATE420949T1 (de) 2009-01-15
JP5006782B2 (ja) 2012-08-22
UY28905A1 (es) 2005-12-30
HUS1500031I1 (hu) 2019-11-28
PT1751276E (pt) 2009-02-24
CA2561719A1 (en) 2005-11-24
ES2321210T9 (es) 2020-11-04
AU2005243488B2 (en) 2011-07-07
JP2012061001A (ja) 2012-03-29
CA2561719C (en) 2015-01-27
BRPI0510396B1 (pt) 2020-08-18
DE602005012381D1 (de) 2009-03-05
CN103352030B (zh) 2018-08-10
EP1751276A1 (de) 2007-02-14
DK1751276T3 (da) 2009-05-18
JP2007537740A (ja) 2007-12-27
EP1751276B9 (de) 2020-05-27
RS50753B9 (sr) 2020-08-31
PL1751276T3 (pl) 2009-06-30
DK1751276T5 (da) 2020-07-20
CY2015021I1 (el) 2020-05-29
JP5562316B2 (ja) 2014-07-30
ES2321210T3 (es) 2009-06-03
WO2005111201A1 (en) 2005-11-24
ME01119B (me) 2013-03-20
LU92749I2 (fr) 2015-11-02
CN1989240A (zh) 2007-06-27
NL300743I2 (de) 2016-01-26
NZ552088A (en) 2009-10-30
NL300744I1 (de) 2016-01-26
LU92748I2 (fr) 2015-11-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1751276B1 (de) Impfstoff der einen attenuierten pestivirus enthält
AU2006341564B2 (en) Combination vaccine comprising an attenuated bovine viral diarrhea virus
US7572455B2 (en) Vaccine comprising an attenuated pestivirus
AU2009264206B2 (en) Attenuated pestivirus
Nettleton et al. Border disease
MEYERS et al. Patent 2561719 Summary
MEYERS et al. Patent 2627952 Summary
MX2008006162A (en) Combination vaccine comprising an attenuated bovine viral diarrhea virus

Legal Events

Date Code Title Description
R005 Application deemed withdrawn due to failure to request examination

Effective date: 20110519