KR100908798B1 - 약독화 페스티바이러스를 포함하는 백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 당단백질 E^rns의 암호화 서열에 하나 이상의 돌연변이가 존재하고 N^pro의 암호화 서열에 하나 이상의 또 다른 돌연변이가 존재하여, 바람직하게는 당단백질 E^rns에 존재하는 RNase 활성의 불활성화 및 N^pro에 존재하는 면역조절 활성(가설)의 불활성화가 복합 유도된 약독화 페스티바이러스, 특히 약독화 BVDV에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 BVDV와 같은 페스티바이러스의 약독화 방법, 상기 페스티바이러스, 특히 BVDV를 암호화하는 핵산, 상기 약독화 페스티바이러스, 특히 본 발명의 BVDV를 포함하는 조성물 및 백신에 관한 것이다.

페스티바이러스, BVDV, 소 바이러스성 설사병 바이러스, 약독화

Description

약독화 페스티바이러스를 포함하는 백신{Vaccine comprising an attenuated pestivirus}

본 발명은 동물 보건 분야, 구체적으로 소 바이러스성 설사병 바이러스(BVDV)와 같은 약독화 페스티바이러스에 관한 것이다.

페스티바이러스는 전세계적으로 많은 국가들에서 경제적으로 중요한 동물 질병의 원인체이다. 현재 공지된 바이러스 분리체는 플라비비리대(Flaviviridae) 과에서 함께 하나의 속을 구성하는 4가지 다른 종으로 분류되고 있다.

I/II 소 바이러스성 설사병 바이러스(BVDV) 타입 1(BVDV-1 및 타입-2(BVDV-2)는 소에 소 바이러스성 설사병(BVD)과 점막병(MD)을 일으킨다(Baker, 1987; Moennig and Plagemann, 1992; Thiel et al., 1996). BVDV가 2종으로 나뉘는 기준은 제한된 교차 중화성 항체 반응(Ridpath et al. 1994)으로부터 분명히 나타나는 게놈 서열 수준의 유의적인 차이이다(Heinz et al., 2000에 정리되어 있다)

III 통상적인 돼지 열병 바이러스(CSFV)는 종래 돼지 콜레라 바이러스로 불리던 것으로, 통상적인 돼지 열병(CSF) 또는 돼지 콜레라((HC)에 관여한다(Moennig and Plagemann, 1992; Thiel et al., 1996).

IV 경계병(Border disease) 바이러스(BDV)는 대체로 양에서 발견되고 경계병(BD)을 일으킨다. 새끼양이 BDV로 자궁내 감염되면, 허약하고 여러 이상들, 특히 가장 잘 알려진 "헤어리 쉐이커(hairy shaker)" 증후군을 나타내는 영구 감염된 새끼양이 태어날 수 있다(Moenning and Plagemann, 1992; Thiel et al., 1996).

페스티바이러스는 5' 캡과 3' 폴리(A) 서열이 결실되고 양성(+) 극성을 띤 일본쇄 RNA 게놈을 보유한 작은 외피 바이러스이다. 이러한 바이러스 게놈은 아미노산 약 4000개의 다단백질(polyprotein)을 암호화하여 세포 프로테아제 및 바이러스 프로테아제가 관여하는 해독 동시 및 해독 후 프로세싱을 통해 최종 절단 산물을 생성한다. 바이러스 단백질은 다단백질에 NH₂-N^pro-C-E^rns-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH의 순으로 배열되어 있다(Lindenbach and Rice, 2001). 단백질 C(코어 또는 캡시드 단백질) 및 당단백질 E^rns, E1 및 E2는 CSFV에서 입증된 바와 같이(Thiel et al., 1991), 페스티바이러스 비리온의 구조 성분이다. 이들은 BVDV에도 존재한다. E2는 항체 중화의 표적인 것으로 밝혀져 있고, 이보다는 드물게 E^rns도 표적으로 밝혀져 있다(Donis et al., 1998; Paton et al., 1992; van Rijn et al., 1993; Weiland et al, 1990, 1992). E^rns는 전형적인 막 앵커(anchor)가 없어서 감염된 세포에서 상당한 양으로 분비된다. 이 단백질은 RNase 활성이 있는 것으로 보고되었다(Hulst et al., 1994; Schneider et al., 1993; Windisch et al., 1996). 하지만, 바이러스 생활주기에서 이 효소 활성의 기능은 현재 알려지지 않았 다. 이 효소 활성은 페스티바이러스 E^rns와 다른 식물 및 진균류 기원의 공지된 RNase 사이에 보존성 아미노산 스트레치(stretch) 2개의 존재에 의해 좌우된다. 이러한 보존성 서열은 둘 다 히스티딘 잔기를 함유한다(Schneider et al., 1993). CSFV 백신 종의 E^rns 단백질에서 상기 각 잔기를 리신으로 교환한 결과 RNase 활성이 파괴되었다(Hulst et al., 1998). CSFV 백신 종의 게놈에 상기 돌연변이의 도입은 바이러스 생존력 또는 증식성에는 영향을 미치지 않았지만 세포 병원성 표현형을 나타내는 바이러스로 만들었다(Hulst et al., 1998). 이와 마찬가지로, 마이어스(Meyers) 등은 독성 CSFV 종 Alfort/Tubingen의 RNase 음성 변이체는 완전 생존성임을 보여주었다. 하지만, 이들 바이러스 돌연변이체는 각각 어떠한 세포 병원성 표현형도 나타내지 않았다(Meyers et al., 1999).

N^pro는 페스티바이러스 RNA에 존재하는 긴 개방 판독 프레임(open reading frame)에 의해 암호화되는 첫 단백질이다. N^pro는 프로테아제 활성이 있고 아마도 해독 중에 이미 초기 다단백질(Stark et al., 1993; Wiskerchen et al., 1991) 자체를 절단하는 비구조성 단백질이다. N^pro는 바이러스 복제(Tratschin et al., 1998)에 필수 요소가 아닌 시스테인 프로테아제(Rumenapf et al., 1998)이다. 최근, N^pro는 감염 숙주 내의 면역계를 조절한다는 가설을 세울 수 있을 만큼 세포의 항바이러스 방어를 다소 방해하는 것으로 밝혀졌다(Ruggli et al., 2003). 메이어 와 동료들은 CSFV 약독화 징후가 N^pro 유전자 결실의 결과라고 발표했다(Mayer et al., 2004).

현재, BVDV 감염의 예방 및 치료에 사용되는 BVDV 백신은 여전히 단점을 갖고 있다(Oirschot et al., 1999). 통상적인 BVDV-1에 대한 백신은 BVDV-2 감염에 대한 부분적인 보호 효과만을 제공하여, 백신접종된 어미는 독성 BVDV-2로 영구 감염된 송아지를 출산할 수 있다(Bolin et al., 1991, Ridpath et al., 1994). 이러한 문제는 아마도 바이러스 중화의 주요 항원인 당단백질 E2에서 가장 현저한, 타입 1과 타입 2 종 사이의 상당한 항원 다양성 때문인 것으로 생각된다(Tijssen et al., 1996). 타입 1 종에 대한 대부분의 모노클로날 항체는 타입 2 바이러스에 결합하지 못한다(Ridpath et al., 1994).

이종 발현 시스템에서 발현된 바이러스 단백질이나 약독화 바이러스 또는 사멸 바이러스를 포함하는 백신은 CSFV 및 BVDV에 대해 생산되고, 현재 사용되고 있다. 사멸 백신(불활성화된 전체 바이러스) 또는 서브유닛 백신(통상적으로 정제되거나 이종 발현된 바이러스 단백질)은 보강제(adjuvant)의 존재하에서도 완전한 방어 면역반응을 제공하는 효능 면에서 대부분 생 백신보다 떨어진다.

생 백신으로서 사용된 BVDV 약독화에 대한 구조적 기반은 알려진 바 없다. 이러한 백신은 약독화되었더라도 대부분 안전성 문제를 안고 있다. 백신 바이러스는 암소와 같은 임신한 동물의 태반을 통과하여 태아에게 임상 증상을 나타내게 하고(내거나) 영구 감염된 송아지를 유도할 수 있다. 따라서, 상기 약독화 생 백신은 임신한 암소를 포함한 사육 소들에게는 사용할 수 없다. 임신한 암소는 태아 보호 를 위해 백신접종된 소로부터 격리시켜야 하고, 백신접종도 받지 않아야 한다. 또한, 약독화 생 BVDV의 복귀돌연변이주는 동물에게 심각한 위험이 된다. 약독화가 통상적인 수회 계대접종을 통해 수득된 통상적으로 유도된 약독화 바이러스의 경우에도 분자 기원 및 약독화의 유전자적 안정성은 알려진 바 없으며, 독성인 야생형으로의 복귀도 예측할 수 없다.

페스티바이러스 감염의 예방 및 치료가 효과적이고 안전하면서 검출가능한 것이 중요하기 때문에, 면역 유도의 잠재력이 높을 뿐만 아니라 병원성 페스티바이러스, 예컨대 BVDV와 구별될 수 있는 약독화의 한정된 기반을 보유한 개량된 약독화 페스티바이러스, 예컨대 BVDV, 뿐만 아니라 이러한 약독화 페스티바이러스, 예컨대 BVDV를 포함하는 조성물 및 백신이 절실히 요구된다.

따라서, 본 발명의 근원적인 기술적 문제는 개량된 약독화 페스티바이러스, 바람직하게는 약독화 생백신으로 사용할 수 있는 약독화 BVDV를 제공하는 것이다. 이러한 개량된 약독화 페스티바이러스, 바람직하게는 BVDV는 구체적으로 (i) 스스로 태반을 통과하지 않아야 하고, (ii) 태반을 통한 바이러스 전파를 예방하고, 이에 따라 영구 감염된 숙주, 예컨대 BVDV 감염인 경우의 송아지의 출산이나 태아 낙태와 같은 임신 중의 문제를 예방하는 면역을 유도해야 한다.

도 1은 NY93/C(BVDV 타입 II)에 대한 혈청 중화반응을 도시한 것이다.

도 2는 KE9(BVDV 타입 I)에 대한 혈청 중화반응 분석을 도시한 것이다.

도 3은 NY93/C(BVDV 타입 II)에 대한 혈청 중화반응 분석을 도시한 것이다.

후속되는 모든 서열은 번호 매겨진 결실 영역을 점선으로 표시하고 있는 반면, 첨부된 서열 목록 중의 서열은 결실 영역 또는 아미노산 코돈 없이 연속하여 번호를 매겨서 나타냈다.

서열번호 1 XIKE-A-cDNA 서열

서열번호 2 XIKE-A-NdN-cDNA 서열

서열번호 3 XIKE-B-cDNA 서열

서열번호 4 XIKE-B-NdN-cDNA

서열번호 5 XIKE-A 아미노산 서열

서열번호 6 XIKE-A-NdN 아미노산 서열

서열번호 7 XIKE-B 아미노산 서열

서열번호 8 XIKE-B-NdN 아미노산 서열

서열번호 9 XIKE-C-NdN 아미노산 서열

서열번호 10 XIKE-C-NdN-cDNA 서열

서열번호 11 XIKE-C-cDNA 서열

서열번호 12 XIKE-C 아미노산 서열

발명의 개요

본 발명은 당단백질 E^rns의 암호화 서열에 적어도 하나의 돌연변이가 존재하고 N^pro의 암호화 서열에 적어도 다른 하나의 돌연변이가 존재하여, 바람직하게는 당단백질 E^rns에 존재하는 RNase 활성의 불활성화 및 N^pro에 존재하는 면역조절 활성(가설)의 불활성화가 복합적으로 유도된 약독화 페스티바이러스, 바람직하게는 약독화 BVDV에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 그러한 약독화가 전술한 바와 같은 약독화 페스티바이러스, 바람직하게는 약독화 BVDV를 생산하도록 페스티바이러스를 약독화하는 방법에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 상기 약독화된 페스티바이러스, 바람직하게는 약독화된 BVDV를 암호화하는 핵산 분자, 본 명세서에 게시된 바와 같은 약독화된 페스티바이러스, 바람직하게는 BVDV를 포함하는 조성물 및 백신에 관한 것이다.

상세한 설명에 사용된 용어의 정의:

본 발명의 구현에 앞서서, 본 발명 및 첨부되는 청구의 범위에 사용된 단수적 표현은 다른 특별한 언급이 없는 한 복수적 의미를 포함한다. 따라서, 예를 들어 "BVDV"란 표현은 그 BVDV의 복수도 포함하며, "세포"란 표현은 하나 또는 그 이상의 세포 및 당해 기술분야의 숙련가(이하, 당업자)에게 공지된 그 등가물을 의미한다. 본 명세서에 사용된 모든 기술적, 과학적 용어는 다른 언급이 없는 한 본 발명이 속하는 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미를 갖는 것이다. 본 명세서에 기술된 바와 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 검사에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법, 장치 및 재료는 다음에 설명되는 바와 같다. 본 명세서에 언급된 모든 공개 문헌들은 본 발명과 관련하여 사용되어도 좋은 공개 문헌들에 보고된 바와 같은 세포부, 벡터 및 방법론을 설명하고 게시하기 위하여 참고 인용한 것이다. 따라서, 종래 발명으로 인해 본 발명이 신규성을 부여할 자격이 없는 것임을 인정하는 것으로 간주되어서는 아니 된다.

본 명세서에 사용된 "페스티바이러스"란 용어는 플라비비리대 과에 속하는 페스티바이러스 속의 모든 구성원, 예컨대 BVDV, CSFV 및 BVD를 의미한다.

본 명세서에 사용된 "CSFV"란 용어는 플라비비리대 과에 속하는 페스티바이러스 속 중 통상적인 돼지 열병 바이러스(CSFV) 종에 속하는 모든 바이러스를 의미한다.

본 명세서에 사용되는 "BVDV"란 용어는 플라비비리대 과에 속하는 페스티바이러스 속의 소 바이러스성 설사병 바이러스(BVDV) 타입 1(BVDV-1) 및 BVDV 타입 2(BVDV-2) 종에 속하는 모든 바이러스를 의미한다(Heintz et al., 2000). 더욱 통상적인 BVDV 타입 1 종 및 더 최근에 식별된 BVDV 타입 2 종은 뉴클레오타이드 서열과 아미노산 서열에 다소 제한적이지만 독특한 차이를 나타낸다.

본 명세서에서 설명된 바와 같이 "N^pro"란 용어는 바이러스의 개방 판독 프레임에 의해 암호화된 제1 단백질을 의미하며, 합성된 다단백질의 나머지로부터 스스로 절단된다(Stark, et al., J.Virol. 67: 7088-7093(1993); Wiskerchen, et al., Virol. 65: 4508-4514(1991)). 이 용어는 상황에 따라서 암호화 뉴클레오타이드 서열의 돌연변이 후의 나머지 "N^pro" 아미노산을 의미하거나 또는 상기 단백질의 암호화 뉴클레오타이드 서열 자체를 의미하기도 한다. "N^pro에 존재하는 프로테아제 활성"은 상기 "N^pro"의 폴리펩타이드 절단 활성을 의미한다.

본 명세서에 사용된 "E^rns"는 페스티바이러스 비리온의 구조 성분을 나타내는 당단백질 E^rns를 의미한다(Thiel et al., 1991). E^rns는 전형적인 막 앵커가 없어서 감염된 세포로부터 상당량 분비되며, 이 단백질은 RNase 활성을 나타내는 것으로 보고되어 있다(Hulst et al., 1994; Schneider et al., 1993; Windisch et al., 1996). 당단백질 E0란 용어가 공개 문헌들에서 당단백질 E^rns와 동의어로 사용되기도 한다는 점에 주의한다. 이 용어는 상황에 따라 암호화 뉴클레오타이드 서열의 돌연변이 후의 돌연변이된 "E^rns" 단백질을 의미하거나 또는 그 단백질의 암호화 뉴클레오타이드 서열 자체를 의미하기도 한다. "당단백질 E^rns에 존재하는 RNase 활성"은 상기 당단백질의 RNA 절단 활성, 즉 RNA를 가수분해하는 당단백질 E^rns의 능력을 의미한다. "상기 당단백질에 존재하는 RNase 활성의 불활성화"란 용어는 상기 당단백질 E^rns의 미변형된 야생형과 비교했을 때 RNA를 가수분해하지 못하는 변형된 당단백질 E^rns의 무능력 또는 성능 감소를 의미한다.

약독화: 본 명세서에 사용된 "약독화 페스티바이러스 또는 BVDV 입자"는 본 명세서에 기술된 방법에 따라 약독화된 바이러스 입자가 약독화된 본 발명에 따른 약독화 페스티바이러스 또는 BVDV 입자의 독성과 야생형 페스티바이러스 또는 상기 약독화 페스티바이러스 또는 BVDV 입자가 유래된 BVDV 분리체의 독성 사이에 주요 임상 변수들, 예컨대 BVDV이 경우에 동일 투여량(바람직하게는 6x10⁶ TCID₅₀)으로 감염된 동물의 설사, 발열 및 사망률에 통계적으로 유의적인 차이가 있는 것을 의미한다. 즉, 약독화 BVDV 입자는 설사, 발열 및 사망을 유발하지 않아서 백신에 사용될 수 있다.

본 명세서에 사용된 E^rns의 불활성화는 문헌[Meyers et al., 1999]에 기술된 바와 같은 RNase 분석에 따라 미감염된 대조군 세포에서 측정된 수준보다 유의적으로 높지 않은 RNase 활성을 의미한다. "문헌[Meyers et al., 1999]에 기술된 바와 같은 RNase 분석에 따라 미감염된 대조군 세포에서 측정된 수준보다 유의적으로 높지 않은"이란, 예컨대 RNase 활성이 미감염된 대조군 세포에 비해 150% 미만인 것을 의미한다.

본 명세서에 사용된 N^pro의 불활성화는 N^pro의 가능한 면역조절 활성이 돌연변이에 의해 차단되거나 또는 상당히 감소된 것을 의미한다. 바람직한 양태에 따르면, 이러한 돌연변이는 N^pro의 간섭을 문헌[Ruggli et al.(2003)]에 기술된 바와 같은 감염 세포에 의한 인터페론 반응 유도에 의하여 차단하거나 또는 상당히 감소시킨다. 이러한 경우, N^pro의 불활성화는 세포가 정상적인 인터페론 반응을 야기하도록 허용할 것이다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 "프로세싱 시그널"은 페스티바이러스, 바람직하게는 BVDV의 C 단백질 중 기능성 N 말단이 확실히 생성되게 해주는 물질, 구체적으로 유비퀴틴, 미소관 결합 단백질의 경쇄 3(LC3; light chain 3 of microtubule-associated protein), 소형 유비퀴틴-관련 변형인자-1(SUMO-1; small ubiquitin-related modifier-1), 신경 전구세포에서 발현되는 발달적으로 하향 조절되는 단백질 8(NEDD8; neural precursor cell-expressed developmentally down-regulated protein 8), 16kDa의 골지-연관 ATPase 인핸서(GATE-16; Golgi-associated ATPase Enhancer of 16 kDa) 및 감마-아미노부티르산 수용체 A형 수용체 연관 단백질(GABA(A)RAP; gamma-aminobutyric acid receptor type A receptor associated protein)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 물질을 의미한다. 또한, 인테인, 피코나바이러스 3C, 카리도바이러스 2A 및 토끼 출혈병 바이러스의 p15로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 프로테아제도 본 명세서에 사용된 "프로세싱 시그널"을 의미한다. 상기 C 단백질의 기능성 N 말단을 확실히 생성되게 해주는 당업자에게 공지된 다른 임의의 유사 프로세싱 시그널도 상기 "프로세싱 시그널"이란 용어에 포함될 수 있다.

본 명세서에 사용된 "단백질 C" 또는 "C 단백질" 또는 "C-단백질"이란 용어는 페스티바이러스 비리온의 구조 성분을 의미한다(Thiel et al., 1991). "단백질 C"는 페스티바이러스의 캡시드 또는 코어 단백질이다. 이 용어는 상황에 따라서 암호화 뉴클레오타이드 서열의 돌연변이에 의해 하나 또는 여러개의 아미노산이 교환된 "단백질 C"를 의미할 수도 있다.

본 발명에 사용된 "단편"이란 용어는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드 분자의 임의의 서브유닛, 즉 임의의 서브세트를 의미한다. DNA인 경우, 상기 단편은 전장의 바이러스 게놈을 포함하는 DNA보다 짧은 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 뉴클레오타이드 분자의 "기능성 변이체"란 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 분자와 실질적으로 유사한 생물학적 활성(기능적 또는 구조적)을 보유하는 뉴클레오타이드 분자이다. 또한, "기능성 변이체"에는 "단편", "기능성 변이체", "축퇴성 핵산 코드에 기초한 변이체" 또는 "화학적 유도체"도 포함된다. 이러한 "기능성 변이체"는 예컨대 하나 또는 여러 개의 뉴클레오타이드 교환, 결실 또는 삽입을 보유할 수 있다. 이러한 기능성 변이체는 적어도 부분적으로 자신의 생물학적 활성, 예컨대 감염성 클론 또는 백신 종으로서의 기능을 보유하거나, 또는 심지어 개량된 생물학적 활성을 나타낸다. "실질적으로 유사한 생물학적 활성을 보유하는"이란 예컨대 여기에 제시된 페스티바이러스인 경우에, 상기 페스티바이러스가 본 명세서에 기술된 방식으로 약독화되어, 태반을 통과하는 능력을 상실하지만 백신접종 후 면역반응을 매개하는 약독화된 생 바이러스의 생산에 적합한 비병원성 바이러스가 되는 것을 의미한다.

"유전자 코드의 축퇴성에 기초한 변이체"는 특정 아미노산이 여러 다른 뉴클레오타이드 트리플렛(triplet)에 의해 암호화될 수 있다는 사실로부터 생긴 변이체이다. 이러한 변이체는 자신의 생물학적 활성을 적어도 부분적으로 보유하거나, 심지어 개량된 생물학적 활성을 나타내기도 한다.

두 분자가 뉴클레오타이드 서열이나 생물학적 활성이 실질적으로 유사하다면 한 분자는 다른 분자와 "실질적으로 유사한" 것이다. 즉, 두 분자가 유사한 활성을 보유한다면 두 분자는 뉴클레오타이드 서열이 동일하지 않는 한 본 명세서에 사용된 용어에 따라 변이체로 간주되며, 뉴클레오타이드 서열이 유사한 두 분자는 각각의 생물학적 활성이 동일하지 않아도 본 명세서에 사용된 용어에 따라 변이체로 간주되어야 한다.

본 명세서에 사용된 돌연변이는 본 발명에 따른 단백질/아미노산을 암호화하는 핵산 분자의 변형을 의미한다. 이러한 돌연변이는 치환(하나 또는 여러 뉴클레오타이드/염기쌍의 치환), 결실(하나 또는 여러 뉴클레오타이드/염기쌍의 제거), 및/또는 삽입(하나 또는 여러 뉴클레오타이드/염기쌍의 첨가)을 의미하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 본 명세서에 사용된 돌연변이는 단일 돌연변이 또는 여러 돌연변이일 수 있는 바, "돌연변이(들)"란 용어는 종종 단일 돌연변이 및 여러 돌연변이를 모두 의미한다. 이러한 돌연변이에는 점돌연변이(단일 뉴클레오타이드 변이) 또는 더 큰 돌연변이, 예컨대 암호화 핵산 분자의 일부가 결실, 치환되고(되거나) 추가 암호화 핵산이 삽입된 돌연변이가 포함되며, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 돌연변이는 암호화 서열의 변화로 인하여 변형된 폴리펩타이드의 발현을 일으킬 수도 있다. 이러한 변형된 폴리펩타이드는 이하의 본 발명의 상세한 설명에 제시된 바와 같은 것이 바람직하다.

본 명세서에 사용된 "백신"이란 용어는 동물의 면역학적 반응을 유도하는 적어도 하나의 면역학적 활성 성분 및 가능하다면(절대적인 것은 아니다) 상기 활성 성분의 면역학적 활성을 증강시키는 하나 이상의 추가 성분을 함유하는 약제학적 조성물을 의미한다. 백신은 또한 약제학적 조성물에 전형적인 추가 성분을 함유할 수 있다. 백신의 면역학적 활성 성분은 완전한 바이러스 입자를 본래 형태대로 또는 소위 변형된 생 백신(MLV)에서의 약독화된 입자로서 또는 소위 사멸 백신(KV)에서 적당한 방법에 따라 불활성화된 입자로서 포함할 수 있다. 다른 양태에 따르면, 백신의 면역학적 활성 성분은 상기 미생물의 적당한 인자(서브유닛 백신)를 포함할 수 있으며, 이 때 상기 인자들은 전체 입자 또는 이러한 입자를 함유한 증식 배양물을 파괴하고, 경우에 따라 정제 단계를 후속적으로 수행하여 원하는 구조를 수득하여 제조하거나, 또는 세균, 곤충, 포유동물 또는 다른 종을 기초로 한 적당한 시스템을 사용하여 적당한 조작을 포함하는 합성 방법을 수행하고, 경우에 따라 분리 및 정제 절차를 후속적으로 수행하여 제조하거나, 또는 백신을 필요로 하는 동물 중에 적당한 약제학적 조성물을 이용한 유전자 물질을 직접 투입하여 상기 합성 과정을 유도함으로써(폴리뉴클레오타이드 백신접종) 제공한다. 백신은 전술한 인자를 하나 또는 동시에 하나 이상을 함유할 수 있다. 본 명세서에서 의도하는 "백신"이란 용어는 항원 물질을 포함하는 수의용 백신이며, 페스티바이러스 감염, 바람직하게는 BVDV 감염에 의해 유발된 질병에 대한 특이적인 능동 면역을 유도하기 위한 목적으로 투여되는 백신이다. 본 명세서에 기술된 약독화 페스티바이러스, 구체적으로 약독화 BVDV는 함유된 면역원 및 때로는 항원적 관련성이 있는 미생물에 대한 모계 항체를 통해 수동적으로 전달될 수 있는 능동 면역을 부여한다. 본 발명의 백신은 전술한 백신으로서, 하나의 면역학적 활성 성분이 BVDV 또는 페스티바이러스 기원의 것이거나 또는 공지된 임의의 페스티바이러스 서열(센스 또는 안티센스)과 상동성이 70% 초과인 뉴클레오타이드 서열 유래인 백신을 의미한다.

"생백신"이란 용어는 살아 있는, 특히 살아 있는 바이러스 활성 성분을 함유하는 함유하는 백신을 의미한다.

면역 반응을 증강시키는 추가 성분은 백신에 첨가되는 알루미늄하이드록사이드, 광유 또는 여타 오일이나, 보조 분자와 같이 일반적으로 "보강제"로 불리는 성분이거나, 또는 인터페론, 인터류킨 또는 성장 인자와 같이(이에 국한되지 않는다) 상기 추가 성분에 의해 각각 유도된 후 신체에서 생성되는 성분이다.

"약제학적 조성물"은 당해 조성물이 투여된 유기체, 또는 이 유기체 내에 또는 이 유기체 상에 살아 있는 유기체의 생리학적, 예컨대 면역학적 기능을 조절할 수 있는 하나 또는 그 이상의 성분으로 본질적으로 구성된다. 이 용어는 항생제 또는 항기생충제 뿐만 아니라 가공 성형, 멸균성, 안정성, 경구, 비내, 정맥내, 근육내, 피하, 피내 또는 다른 적합한 경로 등의 장내 또는 비경구 경로를 통해 성분을 투여할 수 있는 가능성, 투여 후 내성, 조절 방출성 등과 같은(이에 국한되지 않는다) 다른 특정 목적을 달성하는데 일반적으로 사용되는 다른 성분을 포함하며, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 약제학적 조성물의 비제한적인 예로서, 오로지 증명하기 위한 목적의 약제학적 조성물은 다음과 같이 제조할 수 있다: 감염된 세포 배양물의 세포 배양 상청액을 안정화제(예, 스퍼미딘 및/또는 BSA(소 혈청 알부민))와 혼합하고 이 혼합물을 그 다음 동결건조하거나 다른 방법으로 탈수시킨다. 백신접종 하기 전에, 상기 혼합물을 수성 용액(예, 식염수, PBS(인산염 완충 식염수)) 또는 비수성 용액(예, 오일 에멀젼, 알루미늄계 보강제)에 재수화시킨다.

발명의 기재

상기 기술적 문제는 이하 상세한 설명과 청구의 범위에서 특징부로 나타낸 구체예들을 통해 해결된다.

놀랍게도, 페스티바이러스, 구체적으로 BVDV는 당단백질 E^rns의 암호화 서열 중의 적어도 하나의 돌연변이 및 N^pro의 암호화 서열 중의 적어도 다른 하나의 돌연변이, 바람직하게는 당단백질 E^rns에 존재하는 RNase 활성의 불활성화와 함께 N^pro에 존재하는 면역조절 활성의 불활성화를 유도하는 상기 돌연변이들의 도입을 통해 더욱 효과적으로 약독화될 수 있음을 발견했다. 면역조절 효과는 문헌[Ruggli et al.(2003)]에 예시된 방식에서 한 페스티바이러스의 표시된 기능에 대하여 표시되며, 이에 국한되는 것은 아니다.

본 발명에 따라 약독화된 페스티바이러스, 구체적으로 BVDV는 백신으로 유리하게 사용될 수 있다. 이러한 약독화 페스티바이러스, 특히 상기 약독화된 BVDV는 현재 고면역원성의 생 백신을 제공한다. 놀랍게도, 본 발명에 따른 페스티바이러스, 구체적으로 BVDV는 태반을 통과하지 않는 바, 임신 동물에 사용하여도 안전하다. 이에 대해서는 실시예 3에서 BVDV에 대하여 비제한적 방식으로 예시하고 있다.

더욱이, 약독화의 기초로서 일정한 돌연변이를 보유한 생 백신은 현행 백신 생산의 단점, 예컨대 병원성 종으로의 복귀 위험성을 피할 수 있게 한다. 이러한 약독화 돌연변이의 또 다른 장점은 이 돌연변이를 약독화 페스티바이러스, 특히 BVDV의 독특한 라벨로서 사용할 수 있게 하고 야생의 페스티바이러스, 특히 BVDV와 구별할 수 있게 하는 분자 고유성에 있다. 따라서, 한 관점에 따르면, 본 발명은 당단백질 E^rns의 암호화 서열 중의 적어도 하나의 돌연변이 및 N^pro의 암호화 서열 중의 적어도 다른 하나의 돌연변이를 보유한 약독화 페스티바이러스, 특히 약독화 BVDV를 제공한다. 바람직하게는, 그러한 약독화 페스티바이러스, 바람직하게는 그러한 약독화 BVDV에서 당단백질 E^rns의 암호화 서열에 존재하는 상기 돌연변이는 E^rns에 존재하는 RNase 활성의 불활성화를 유도하고(하거나) N^pro의 암호화 서열에 존재하는 상기 돌연변이는 상기 N^pro의 불활성화를 유도한다. 이러한 불활성화는 E^rns 암호화 서열 및 N^pro 암호화 서열에 당업자에게 공지된 임의의 돌연변이를 수행함으로써 유발될 수 있으며, 상기 돌연변이는 결실, 삽입 돌연변이 및/또는 치환 돌연변이와 같이 "용어 정의"편에 정의된 바와 같은 임의의 돌연변이이다. 특히, 야생형으로의 복귀 가능성이 결실시 가장 낮기 때문에, 상기 돌연변이는 결실 돌연변이인 것이 가장 바람직하다.

당단백질 E^rns 는 약 97kD의 이황화 결합된 동종이량체를 형성하고, 각 단량체는 문헌[Rumenapf et al.(1993)]에 기술된 바와 같은 CSFV 다단백질의 아미노산 268 내지 494에 해당하는 227개 아미노산으로 구성된다는 것이 밝혀져 있다. CSFV 알포트/튜빙겐(Alfort/Tubingen) 종의 게놈 서열은 GenBank/EMBL 데이터 라이브러리에서 수탁 번호 J04358로 입수할 수 있고; 또 BVDV 종 CP7의 아미노산 서열도 GenBank/EMBL 데이터 라이브러리(수탁 번호 U63479)에서 입수할 수 있으며, 이러한 BVDV CP7 다단백질에서 E^rns 단백질은 잔기 271 내지 497에 해당한다. 당단백질 E^rns 뿐만 아니라 일부 식물 및 진균류의 RNase 활성 단백질에서는 아미노산의 두 영역이 고도로 보존성이다(Schneider et al., 1993). 이러한 두 영역은 특히 RNase 효소 활성에 중요하다. 제1 영역은 위치 295 내지 307(BVDV 종 cp7에서는 298 내지 310)의 아미노산에 있는 영역으로 구성되고, 제2 영역은 문헌[Meyers et al., 1999]에서 CSFV 알포트 종에서 예시한 바와 같은 상기 바이러스 다단백질의 위치 338 내지 357(BVDV 종 cp7의 341 내지 360)에 있는 아미노산(아미노산 번호는 CSFV 종 알포트/튜빙겐(Meyers et al., 1989)의 공개된 추론 아미노산 서열에 따른 것이다)으로 구성된다. 앞서 언급한 RNase 활성에 특히 중요한 아미노산은 CSFV 알포트/튜빙겐 종에 대해서 정의된 바와 같은 정확한 위치에만 제한되는 것은 아니고, 그 아미노산들이 고도로 보존성이기 때문에 BVDV, BVD 및 페스티바이러스에서 발견되는 것과 같이 다른 종들의 그 위치에 존재하거나 그 위치에 상응하는 바람직한 아미노산을 단순히 예시 방식으로 나타내기 위해 사용된 것뿐이다. CSFV 알포트/튜빙겐 종이외의 다른 페스티바이러스에서 바람직한 아미노산 위치의 번호는 다를 수 있지만, 페스티바이러스 분자생물학 분야의 전문가라면 그 아미노산 서열의 고도의 보존성과 서열 중의 상기 모티프의 위치를 통해 상기 바람직한 아미노산을 쉽게 확인할 수 있을 것이다. 구체적인 비제한적 예 중 하나로서, CSFV 알포트/튜빙겐의 위치 346은 BVDV 종 cp7의 위치 349와 동일하다.

결과적으로, 본 발명은 바람직하게는 당단백질 E^rns의 암호화 서열에 존재하는 상기 돌연변이가 아미노산 위치 298 내지 310 및/또는 위치 341 내지 360에 상응하는 암호화 뉴클레오타이드 서열에 위치하는 본 발명에 따른 BVDV에 관한 것이다. 이러한 돌연변이는 다음과 같은 것이 바람직하다: 아미노산은 1문자 기호로 표시했고, 위치 번호 앞의 아미노산은 치환될 아미노산을 나타내고, 위치 번호 다음의 아미노산은 치환 아미노산을 나타내며, del은 결실을 나타낸다. 예컨대 H300L은 히스티딘 300이 류신으로 치환되었음을 의미한다:

당단백질 E^rns의 적당한 변형은 예컨대 단독 치환/결실: S298G, H300K, H300L, H300R, H300del, W303G, P304del, E305A, C308G, R343G, E345del, W346G, K348A, H349K, H349L, H349del, H349Q, H349SV(돌연변이 H349S 및 V 삽입), K348R, W351P, W351G, W351L, W351K, W351H; 이중 치환/결실: H300L/H349L, K348del/H349del, H349del/G350del, E345del/H349del, W303G/E305A, H300K/H349K, H300K/H349L 및 삼중 결실: L299del/H300del/G300del, K348del/H349del/G350del. 앞에 나열된 모든 돌연변이체의 번호들은 공개된 BVDV CP7의 아미노산 서열에 따른 것이다(제시된 번호에서 3을 빼면 CSFV 알포트/튜빙겐 아미노산 서열의 동등 잔기에 해당할 것이다). 앞에 나열된 모든 돌연변이체는 적어도 N^pro 영역의 돌연변이없이 각 CSFV 또는 BVDV 돌연변이체로서 검사되었다. 페스티바이러스 당단백질 E^rns의 적당한 돌연변이체는 예컨대 전문이 본원에 참고인용된 WO99/64604에 제시되어 있다. 하지만, 본 발명에 따르면, 이하에 상세히 게시되는 바와 같이 N^pro 영역에 적어도 하나의 다른 돌연변이가 존재해야 한다는 것을 명심해야 한다.

특히, 위치 346(CSFV) 또는 349(BVDV)에서 히스티딘 잔기의 결실이나 치환이 E^rns의 효과적인 불활성화를 유도하고, 이에 따라 특히 유용한 페스티바이러스 생 백신이 수득된다는 것이 발견되었다. 본 발명은 페스티바이러스가 생존성이고 E^rns RNase의 보존성 추정상의 활성 부위 잔기 중 하나를 나타내는 바이러스 다단백질의 위치 346(CSFV 알포트/튜빙겐의 공개 서열(Meyers et al., 1989)에 따라 번호 매긴 경우) 또는 상기 페스티바이러스가 BVDV인 경우에는 위치 349(BVDV CP7의 공개 서열(Meyers et al., 1996b)에 따라 번호 매긴 경우)의 히스티딘 잔기가 결실된 경우에 RNase 활성이 없는 E^rns 단백질을 암호화한다는 것을 입증한다. 따라서, 바람직하게는 본 발명은 당단백질 E^rns의 암호화 서열에 있는 돌연변이가 위치 349에 있는 히스티딘 잔기의 결실 또는 치환인, 본 발명에 따른 BVDV에 관한 것이다. 더욱 더 구체적으로, RNase의 추정상의 활성 부위는 보존성 E^rns 서열 SLHGIWPEKICTG 및/또는 LQRHEWNKHGWCNWFHIEPW로 표시된 부위이다(여기에 제시된 BVDV-2 New York'93 단백질의 서열은 예시용이며; 다른 페스티바이러스 서열에는 약간의 변화가 있을 수 있지만, 당해 기술분야의 전문가라면 모티프의 동일성을 분명하게 알 수 있을 것이다). 일 예로서, BVDV-1 CP7의 상응 아미노산 서열은 SLHGIWPEKICTG 및/또는 LQRHEWNKHGWCNWYNIEPW이며, CSFV 알포트/튜빙겐의 상응 아미노산 서열은 SLHGIWPEKICKG 및/또는 LQRHEWNKHGWCNWYNIDPW일 것이다. 즉, 바람직하게는, 본 발명은 또한 당단백질 E^rns의 암호화 서열에 존재하는 돌연변이(들)가 보존성 E^rns 서열 SLHGIWPEKICTG 및/또는 LQRHEWNKHGWCNWFHIEPW를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 위치하는 본 발명에 따른 BVDV에 관한 것이다. 이러한 서열들은 RNase의 추정상의 활성 부위를 나타내고 있다. 추정상의 E^rns 활성 부위의 서열 SLHGIWPEKIC 및 RHEWNKHGWCNW는 페스티바이러스들에 있어서 더욱 더 보존성 서열이다. 따라서, 바람직하게는, 본 발명은 또한 N^pro 단백질 및 당단백질 E^rns의 암호화 서열에 적어도 하나의 돌연변이를 보유하고, 당단백질 E^rns의 암호화 서열에 존재하는 상기 돌연변이(들)가 보존성 E^rns 서열 SLHGIWPEKIC 및/또는 RHEWNKHGWCNW를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 위치하는 것인 페스티바이러스, 특히 BVDV에 관한 것이다. 상기 돌연변이는 상기 서열 중 오로지 한 서열에 위치한 것이 바람직하다. 즉, 본 발명은 N^pro 단백질 및 당단백질 E^rns의 암호화 서열에 적어도 하나의 돌연변이를 보유하고, 당단백질 E^rns의 암호화 서열에 존재하는 상기 돌연변이(들)가 보존성 E^rns 서열 SLHGIWPEKIC 또는 RHEWNKHGWCNW를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 위치하는 것인 페스티바이러스, 특히 BVDV에 관한 것이다. 이러한 돌연변이는 2개의 다른 아미노산에 관한 돌연변이, 즉 이중 돌연변이인 것이 바람직하다. 즉, 이러한 돌연변이는 2개의 아미노산을 암호화하는 2개의 다른 트리플렛 중에 1 내지 3개의 뉴클레오타이드 돌연변이일 수 있다. 즉, 본 발명은 또한 N^pro 단백질 및 당단백질 E^rns의 암호화 서열에 적어도 하나의 돌연변이를 보유하고, 당단백질 E^rns의 암호화 서열에 존재하는 상기 돌연변이(들)가 보존성 E^rns 서열 SLHGIWPEKIC 및/또는 RHEWNKHGWCNW를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 위치하는 2개의 돌연변이인 페스티바이러스, 특히 BVDV에 관한 것이다. 이러한 돌연변이는 단독 아미노산에 관한 돌연변이인 것이 바람직하다. 즉, 이 돌연변이는 하나의 아미노산을 암호화하는 하나의 트리플렛 중에 있는 1 내지 3개의 뉴클레오타이드의 돌연변이일 수 있다. 또한, 본 발명은 N^pro 단백질 및 당단백질 E^rns의 암호화 서열에 적어도 하나의 돌연변이를 보유하고, 하나의 돌연변이가 보존성 E^rns 서열 SLHGIWPEKIC 및/또는 RHEWNKHGWCNW에 위치하는 것인 페스티바이러스, 특히 BVDV에 관한 것이다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 당단백질 E^rns의 암호화 서열 및 N^pro 단백질의 암호화 서열에 적어도 하나의 돌연변이를 보유하고, 이러한 돌연변이가 바람직하게는 당단백질 E^rns에 존재하는 RNase 활성 및 N^pro 에 존재하는 면역조절 활성을 불활성화시키는 약독화 페스티바이러스가 제공된다. N^pro의 불활성화는 이하에 상세히 설명되는 특정 형태, 즉 N^pro의 아미노산 0개 내지 전부가 존재하고; 유비퀴틴 또는 LC3 또는 프로세싱 시그널로서 작용하는 다른 서열(예, SUMO-1, NEDD8, GATE-16, GABA(A)RAP 또는 프로테아제(예, 인테인), 피코나바이러스 3C, 카리도바이러스 2A 또는 토끼 출혈병 바이러스 p15)가 존재하거나 존재하지 않는, 페스티바이러스, 특히 BVDV에 의해 달성된다. 프로세싱 시그널이 존재하는 경우에, 이 프로세싱 시그널의 암호화 서열은 N^pro 단백질(나머지 부분)의 C 말단 단부에 삽입되거나 근처에 삽입된다. 프로세싱 시그널이 존재하는 경우에만, N^pro를 암호화하는 임의의 수의 아미노산(=N^pro 아미노산)이 존재할 수 있다. 어떠한 프로세싱 시그널 서열도 삽입되지 않은 경우에는, N^pro의 최대 12개 아미노산, 바람직하게는 아미노 말단 아미노산이 존재할 수 있고, 나머지 아미노산은 결실되어야 한다. 더욱이, 앞에 게시한 바와 같은 E^rns 돌연변이(이 돌연변이 중 적어도 하나는 본 발명에 따른 페스티바이러스, 특히 BVDV에 존재해야 한다) 이외에, 상기 페스티바이러스, 구체적으로 BVDV의 나머지 서열은 변화되지 않은, 즉 돌연변이되지 않은 상태를 유지하거나, 또는 C 단백질의 N 말단 단부 근방에 돌연변이를 보유할 수도 있다. 이하에 더욱 구체적으로 다수의 양태를 예시한다.

즉, 본 발명은 N^pro 암호화 서열의 돌연변이가 다음과 같은 식으로 표시되는 암호화된 다단백질을 유도하는 본 발명에 따른 페스티바이러스, 특히 BVDV에 관한 것이다:

[N^pro]_x-[PS]_y-[C 말단]

이 식에서, [N^pro]는 상기 다단백질의 N^pro 부분을 의미하고, 여기서 x는 다단백질에 존재하는 N^pro의 아미노산 수를 의미한다;

[PS]는 유비퀴틴, LC3, SUMO-1, NEDD8, GATE-16 또는 GABA(A)RAP 또는 인테인, 피코나바이러스 3C, 카리도바이러스 2A, 또는 토끼 출혈병 바이러스의 p15와 같은 프로테아제, 또는 C 단백질의 기능성 N 말단을 확실히 생성시켜주는 당업자에게 공지된 임의의 프로세싱 시그널 중에서 선택되는 프로세싱 시그널을 의미한다. "Y"는 0일 수 있는데, 이는 프로세싱 시그널이 존재하지 않음을 의미하고(PS = 부재), "Y"는 1일 수 있는데, 이는 하나의 프로세싱 시그널이 존재하는 것을 의미한다(=PS 존재);

[C 말단]은 N^pro를 제외하고는, 캡시드(C) 단백질 및 페스티바이러스 다단백질, 특히 카복시말단 NS5B를 포함하는 BVDV 다단백질에 존재하는 임의의 다른 단백질을 포함하는 완전한 페스티바이러스, 특히 완전한 BVDV 다단백질을 의미한다. 바람직하게는, 상기 [C 말단] 중의 당단백질 E^rns는 당단백질 E^rns에 존재하는 RNase 활성이 불활성화될 정도로 돌연변이된 것이 좋다. "페스티바이러스 다단백질/BVDV 다단백질에 존재하는 임의의 다른 단백질"이란 표현은 당단백질 E^rns가 바람직하게는 본 명세서에 게시된 바와 같이(전술한 설명 참조) 당단백질 E^rns에 존재하는 RNase 활성이 불활성화될 정도로 돌연변이된 E^rns, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B 및 NS5A를 의미한다. 본 발명에 따른 페스티바이러스, 특히 BVDV는 D에서 N으로 변화된 위치 2번의 아미노산을 제외하고는 돌연변이되지 않은 C 단백질을 보유한 것이 바람직하다. 따라서, [C 말단^*]은 C 단백질의 2번 위치에 돌연변이(D 대신에 N)를 보유한 것을 제외하고는 [C 말단]과 동일한 것이다;

"y"가 0인 경우([PS]가 존재하지 않는 것을 의미한다), "x"는 0 내지 12(N^pro 특정 아미노산이 존재하지 않거나 또는 N^pro의 1 내지 12개 아미노산, 바람직하게는 N^pro의 N 말단의 1 내지 12개 아미노산이 존재하는 것을 의미한다)이며;

"y"가 1인 경우([PS]가 존재하는 것을 의미한다), "x"는 0 내지 168(N^pro 특정 아미노산이 존재하지 않거나 또는 N^pro의 1 내지 168개 아미노산, 바람직하게는 N^pro의 N 말단의 1 내지 168개 아미노산이 존재하는 것을 의미한다)이다.

더욱 바람직하게는, 본 발명은 N^pro 암호화 서열의 돌연변이가 하기 식을 특징으로 하는 암호화 다단백질을 유도하는, 본 발명에 따른 페스티바이러스, 특히 BVDV에 관한 것이다:

[N^pro]₁-[PS]₀-[C 말단]

여기서, 각 정의는 전술한 바와 같다.

이의 구체적인 예는 다음과 같은 것으로서, N 말단 메티오닌에 이어서 C 단백질 및 카복시말단 NS5B를 포함한 상기 다단백질에 존재하는 임의의 다른 단백질로 구성되는 것이다. 따라서, 가장 바람직하게는 본 발명은 N^pro의 암호화 서열에 존재하는 돌연변이(들)가 M[C 말단](여기서 각 정의는 전술한 바와 같다)으로 표시되는 암호화 다단백질을 유도하는 본 발명에 따른 페스티바이러스, 특히 BVDV에 관한 것이다.

더욱 바람직하게는, 본 발명은 N^pro 암호화 서열에 존재하는 돌연변이(들)가 [N^pro]₃-[PS]₀-[C 말단](여기서 각 정의는 전술한 바와 같다)으로 표시되는 암호화 다단백질을 유도하는, 본 발명에 따른 페스티바이러스, 특히 BVDV에 관한 것이다.

BVDV의 구체적인 예는 N 말단 메티오닌 다음에 N^pro 서열 EL 및 C 단백질, 그리고 다단백질에 존재하는, 카복시말단 NS5B를 포함하는 임의의 다른 단백질로 구성되는 것이다. 가장 바람직하게는, 본 발명은 N^pro 암호화 서열의 돌연변이(들)가 MEL-[C 말단](여기서, 각 정의는 전술한 바와 같다)으로 표시되는 암호화 다단백질을 유도하는 본 발명에 따른 BVDV에 관한 것이다.

더욱 바람직하게는, 본 발명은 N^pro 암호화 서열의 돌연변이(들)가 [N^pro]₄-[PS]₀-[C 말단](여기서, 각 정의는 전술한 바와 같다)으로 표시되는 암호화 다단백질을 유도하는 본 발명에 따른 BVDV에 관한 것이다.

BVDV의 구체적인 예는 다음과 같은 것으로서, 즉 N 말단 메티오닌 다음에 N^pro 서열 ELF와 C 단백질 및 상기 다단백질에 존재하는, 카복시말단 NS5B를 포함하는 임의의 다른 단백질로 구성되는 것이다. 따라서, 가장 바람직하게는 본 발명은 N^pro 암호화 서열의 돌연변이(들)가 MELF-[C 말단](여기서, 각 정의는 전술한 바와 같다)으로 표시되는 암호화 다단백질을 유도하는 본 발명에 따른 BVDV에 관한 것이다.

또한, 더욱 바람직하게는 본 발명은 N^pro 암호화 서열의 돌연변이(들)가 [N^pro]₆-[PS]₀-[C 말단](여기서 각 정의는 전술한 바와 같다)으로 표시되는 암호화 다단백질을 유도하는 본 발명에 따른 페스티바이러스, 특히 BVDV에 관한 것이다.

BVDV의 구체적인 예는 다음과 같은 것으로서, 즉 N 말단 메티오닌 다음에 N^pro 서열 ELFSN과 C 단백질 및 상기 다단백질에 존재하는, 카복시말단 NS5B를 포함하는 임의의 다른 단백질로 구성되는 것이다. 따라서, 가장 바람직하게는 본 발명은 N^pro 암호화 서열의 돌연변이(들)가 MELFSN-[C 말단](여기서, 각 정의는 전술한 바와 같다)으로 표시되는 암호화 다단백질을 유도하는 본 발명에 따른 BVDV에 관한 것이다.

또한, 더욱 바람직하게는 본 발명은 N^pro 암호화 서열의 돌연변이(들)가 [N^pro]₄-[PS]₀-[C 말단^*](여기서 각 정의는 전술한 바와 같으며, 단 C 단백질의 아미노말단이 변화되었다)으로 표시되는 암호화 다단백질을 유도하는 본 발명에 따른 페스티바이러스, 특히 BVDV에 관한 것이다.

BVDV의 구체적인 예는 다음과 같은 것으로서, 즉 N 말단 메티오닌 다음에 N^pro 서열 ELF이 오고, C 단백질 서열 중에서 위치 2번의 아미노산이 D에서 N으로 변화된 것이다. 따라서, 아미노말단 C 단백질 서열은 SDEGSK 대신에 SNEGSK인 것이다. 가장 바람직하게는 본 발명은 N^pro 암호화 서열의 돌연변이(들)가 MELF-[C 말단^*](여기서, C 단백질의 위치 2번의 아미노산은 D에서 N으로 변화되었고 각 정의는 전술한 바와 같다)으로 표시되는 암호화 다단백질을 유도하는 본 발명에 따른 BVDV에 관한 것이다.

또한, 더욱 바람직하게는 본 발명은 N^pro 암호화 서열의 돌연변이(들)가 [N^pro]_x-[PS]₁-[C 말단](여기서 각 정의는 전술한 바와 같고, PS는 앞서 게시된 임의의 PS, 바람직하게는 유비퀴틴 또는 LC3으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이다)으로 표시되는 암호화 다단백질을 유도하는 본 발명에 따른 페스티바이러스, 특히 BVDV에 관한 것이다.

BVDV의 구체적인 예는 다음과 같은 것으로서, 즉 N 말단 메티오닌 다음에 임의의 21개 또는 28개 N^pro 아미노산, 유비퀴틴 또는 LC3 및 C 단백질로 구성되는 것이다. 따라서, 가장 바람직하게는 본 발명은 N^pro 암호화 서열의 돌연변이(들)가 하기 식으로 표시되는 암호화 다단백질을 유도하는 본 발명에 따른 BVDV에 관한 것이다:

[N^pro]₂₂-[PS]₁-[C 말단](여기서, PS는 유비퀴틴 또는 LC3인 것이 바람직하다) 또는

[N^pro]₂₉-[PS]₁-[C 말단](여기서, PS는 유비퀴틴 또는 LC3인 것이 바람직하다).

유비퀴틴은 76개 아미노산으로 이루어진 공지된 고도의 보존성 세포 단백질이다. 다른 기능들보다, 유비퀴틴은 유비퀴틴과 접합 시 프로테아좀을 통해 분해되는 단백질을 표시할 수 있는 바 단백질 이화작용의 주요 기능인자이다. 카복시말단 글리신을 통해 다른 단백질과 접합 또는 융합된 유비퀴틴은 세포 유비퀴틴 특이적 프로테아제에 의해 절단될 수 있다. 즉, 유비퀴틴의 카복시말단과 단백질의 융합은 세포 내에서 발현될 때 그 융합 단백질의 일정한 단백분해성 절단으로 인해 각 성분으로 분해될 것이다.

LC3(미소관 결합 단백질의 경쇄 3)은 다양한 기능을 하는 125개 아미노산의 세포 단백질이다(소 LC3의 길이). 최근, 이 단백질의 자가포식현상에서의 기본적인 역할이 규명되었다. 이 과정동안, LC3은 카복시말단 절단에 의해 활성화된다. 이에 따라, 글리신으로 이루어진 새로운 카복시말단이 생성된다. LC3은 그 다음 카복시말단 글리신을 통해 자가포식 소포의 막에 존재하는 포스파티딜에탄올아민에 접합된다. 이 과정으로 인해, LC3의 카복시말단과 융합된 단백질은 일정한 위치에서 세포의 프로테아제에 의해 절단될 것이다.

더욱 바람직하게는, 본 발명은 N^pro 암호화 서열의 돌연변이(들)가 다음과 같은 식으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 식으로 표시되는 암호화 다단백질을 유도하는, 본 발명에 따른 페스티바이러스, 바람직하게는 BVDV에 관한 것이다:

[N^pro]₂-[PS]_y-[C 말단] 및 바람직하게는 ME-[PS]_y-[C 말단];

[N^pro]₅-[PS]_y-[C 말단] 및 바람직하게는 MELFS-[PS]_y-[C 말단];

[N^pro]₇-[PS]_y-[C 말단] 및 바람직하게는 MELFSNE-[PS]_y-[C 말단];

[N^pro]₈-[PS]_y-[C 말단] 및 바람직하게는 MELFSNEL-[PS]_y-[C 말단];

[N^pro]₉-[PS]_y-[C 말단] 및 바람직하게는 MELFSNELL-[PS]_y-[C 말단];

[N^pro]₁₀-[PS]_y-[C 말단] 및 바람직하게는 MELFSNELLY-[PS]_y-[C 말단];

[N^pro]₁₁-[PS]_y-[C 말단] 및 바람직하게는 MELFSNELLYK-[PS]_y-[C 말단]; 및

[N^pro]₁₂-[PS]_y-[C 말단] 및 바람직하게는 MELFSNELLYKT-[PS]_y-[C 말단]

(여기서, 상기 각 정의는 전술한 바와 같다). 이와 같이 게시된 양태는 BVDV에 관한 것이 바람직하다.

가장 바람직하게는 y가 0(PS가 존재하지 않는 것)인 것이다.

더욱 바람직하게는 상기에 기술한 본 발명에 따른 상기 BVDV가 BVDV 타입 1 BVDV인 것이다. 가장 바람직하게는, 상기에 기술한 본 발명에 따른 상기 BVDV가 BVDV 타입 2 BVDV인 것이다. BVDV-1 및 BVDV-2는 이들의 게놈 서열의 특징에 따라 분류된다(Heinz et al., 2000 및 여기에 인용된 문헌 참조). 본 명세서에 게시된 BVDV-1은 육종 소, 임신한 암소의 BVDV 타입 1 감염의 예방 및/또는 치료, 및 임신한 암소의 BVDV 타입 1 감염에 대한 태아 보호 유도에 유용한 조성물의 제조에 사용될 수 있다. 놀랍게도, 본 명세서에 게시된 BVDV-2는 육종 소의 BVDV 타입 1 감염의 예방 및/또는 치료에 유용한 조성물의 제조에 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명은 임신한 암소의 BVDV 타입 1 감염의 예방 및/또는 치료에 유용한 조성물의 제조에 사용되는 본 발명에 따른 BVDV 타입 2의 용도에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 BVDV 타입 2는 임신한 암소의 BVDV 타입 1 감염에 대한 태아 보호의 유도에 유용한 조성물의 제조에 사용될 수 있다. 또한, 놀랍게도, 본 명세서에 게시된 BVDV-1은 육종 소의 BVDV 타입 2 감염의 예방 및/또는 치료에 유용한 조성물의 제조에 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명은 임신한 암소의 BVDV 타입 2 감염의 예방 및/또는 치료에 유용한 조성물의 제조에 사용되는 본 발명에 따른 BVDV 타입 1의 용도에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 BVDV 타입 1은 임신한 암소의 BVDV 타입 2 감염에 대한 태아 보호의 유도에 유용한 조성물의 제조에 사용될 수 있다. 가장 바람직한 것은, 육종 소, 임신한 암소의 BVDV 타입 1 및/또는 타입 2 감염의 예방 및/또는 치료에 유용하고, 임신한 암소의 BVDV 타입 1 및/또는 타입 2 감염에 대한 태아 보호의 유도에 유용한 조성물의 제조에 함께 사용되는 BVDV 타입 1 및 타입 2의 용도이다.

가장 바람직하게는, 본 명세서에 게시된 바와 같이 돌연변이되어야 하는 본 발명에 따른 야생형 BVDV가 아미노산 서열번호 5(XIKE A로 표시됨)에 상응하거나 또는 이의 기능성 변이체인 것이다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 BVDV는 본 발명에 따른 N^pro 돌연변이를 보유하고, 아미노산 서열번호 6(XIKE-A-NdN으로 표시됨)에 상응하거나 이의 기능성 변이체인 것이다. 이러한 기능성 변이체는 본 명세서에 게시된 아미노산 서열과 적어도 65% 상동성인 것이 바람직하다. 아미노산 수준에서의 상동성은 매우 대략적이다: BVDV-1/-BVDV-1: 93%; BVDV-1/-BVDV-2: 84%; BVDV-2/-BVDV-2: 98%. 따라서, 더욱 바람직하게는 상기 기능성 변이체는 본 명세서에 게시된 아미노산과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 또는 90% 상동성이 있는 것이다. 더욱 바람직하게는, 그러한 기능성 변이체가 본 명세서에 게시된 아미노산 서열과 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 또는 98% 상동성이 있는 것이다. 가장 바람직하게는, 그러한 기능성 변이체가 본 명세서에 게시된 아미노산 서열과 적어도 99% 또는 99.9% 상동성이 있는 것이다.

가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 BVDV는 히스티딘 349를 암호화하는 코돈이 결실된 본 발명에 따른 E^rns 돌연변이를 보유하고 서열번호 7(XIKE-B라 한다)의 아미노산 서열에 상응하거나, 이의 기능성 변이체인 것이다. 가장 바람직하게는 본 발명에 따른 BVDV는 E^rns의 히스티딘 349를 암호화하는 코돈이 결실되고 코돈 1 내지 4를 제외한 전체 N^pro 암호화 영역도 결실되어 N^pro의 아미노산 MELF만이 남아 있는, 본 발명에 따른 E^rns 돌연변이 및 N^pro 돌연변이를 모두 보유한 것이다. 이러한 돌연변이체는 서열번호 8의 아미노산 서열(XIKE-B-NdN이라 한다) 또는 이의 기능성 변이체에 상응한다. 이러한 기능성 변이체는 본 명세서에 게시된 아미노산 서열과 적어도 65% 상동성인 것이 바람직하다. 더욱 바람직한 상기 기능성 변이체는 본 명세서에 게시된 아미노산 서열과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 또는 90% 상동성이 있는 것이다. 더욱 바람직하게는, 이러한 기능성 변이체가 본 명세서에 게시된 아미노산 서열과 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 또는 98% 상동성이 있는 것이다. 가장 바람직하게는, 그러한 기능성 변이체가 본 명세서에 게시된 아미노산 서열과 적어도 99% 또는 99.9% 상동성이 있는 것이다.

가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 BVDV는 히스티딘 300을 암호화하는 코돈이 류신을 암호화하는 코돈으로 치환된 본 발명에 따른 E^rns 돌연변이를 보유하고 서열번호 9(XIKE-C라 한다)의 아미노산 서열에 상응하거나, 이의 기능성 변이체인 것이다. 가장 바람직하게는 본 발명에 따른 BVDV는 히스티딘 300을 암호화하는 코돈이 류신을 암호화하는 코돈으로 치환되고 코돈 1 내지 4를 제외한 전체 N^pro 암호화 영역도 결실되어 N^pro의 아미노산 MELF만이 남아 있는, 본 발명에 따른 E^rns 돌연변이 및 N^pro 돌연변이를 모두 보유한 것이다. 이러한 돌연변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열(XIKE-C NdN이라 한다) 또는 이의 기능성 변이체에 상응한다. 이러한 기능성 변이체는 본 명세서에 게시된 아미노산 서열과 적어도 65% 상동성인 것이 바람직하다. 더욱 바람직한 상기 기능성 변이체는 본 명세서에 게시된 아미노산 서열과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 또는 90% 상동성이 있는 것이다. 더욱 바람직하게는, 그러한 기능성 변이체가 본 명세서에 게시된 아미노산 서열과 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 또는 98% 상동성이 있는 것이다. 가장 바람직하게는, 그러한 기능성 변이체가 본 명세서에 게시된 아미노산 서열과 적어도 99% 또는 99.9% 상동성이 있는 것이다.

본 명세서에 기술된 본 발명의 또 다른 중요한 양태는 본 발명에 따른 페스티바이러스, 특히 BVDV와 용액을 함유하는 조성물이다. 당업자라면, 이러한 조성물에 함유될 수 있는 추가 성분을 알고 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences(1990). 18th ed. Mack Publ., Easton 참조). 전문가는 공지된 주사용 생리적 허용성 멸균 용액을 사용하기도 한다. 비경구 주사 또는 주입을 위한 즉석 제조용 용액의 제조에는 식염수와 같은 등장성 수용액 또는 이에 상응하는 혈장 단백질 용액을 손쉽게 이용할 수 있다. 이러한 약제학적 조성물은 동결건조물이나 건조 제제로서 제공될 수 있고, 이것은 멸균 조건 하에 사용하기 직전에 공지의 주사용 용액으로 복원할 수 있다(예, 구성 성분들의 키트).

본 발명에 따른 조성물의 최종 제조물은 본 발명에 따른 페스티바이러스, 바람직하게는 BVDV를 멸균 생리적 허용성 용액과 혼합하여, 예컨대 주사용으로 제조한다. 상기 생리적 허용성 용액은 공지의 담체 물질 및/또는 첨가제(예, 혈청 알부민, 덱스트로스, 중아황산 나트륨, EDTA)로 보충될 수 있다. 이러한 용액은 생리적 허용성 용액, 예컨대 pH 7 내지 8 사이의 수용액을 주성분으로 할 수 있다. pH는 약학적 허용성 완충액으로 안정화시킬 수 있다. 또한, 상기 용액은 Tween 20, BSA( 소 혈청 알부민)와 같은 혈청 알부민, 아스코르브산 및/또는 스퍼미딘과 같은 계면활성제 등의 추가 안정화제를 함유하여도 좋다. 또한, 상기 조성물은 수산화알루미늄, 광유 또는 여타 오일과 같은 보강제, 또는 이러한 추가 성분에 의해 각각 유도된 후 신체에서 발생되거나 백신에 첨가되는 보조 분자, 예컨대 인터페론, 인터류킨 또는 성장 인자(이에 국한되지 않는다)를 함유할 수도 있다.

예를 들어, 본 발명에 따른 조성물에서 상기 페스티바이러스, 특히 BVDV는 다음과 같은 용액으로 용해될 수 있다:

페스티바이러스(바람직하게는 BVDV)	102 내지 108 TCID50
SGS*	25% v/v
세포 배양액	qsp 1회 투여량
*SGS	조성물/2ml
슈크로스	75mg
젤라틴	20mg
수산화칼륨	0.274mg
L-글루탐산	0.72mg
인산이수소칼륨	0.516mg
인산이칼륨	1.254mg
주사용 물	qsp 2ml

상기 조성물이 먼저 동결건조되거나 다른 방법으로 탈수되면, 그 다음 백신접종에 앞서 상기 조성물은 수성(예, 식염수, PBS(인산염 완충 식염수) 또는 비수성 용액(예, 오일 에멀젼(광유 또는 식물성/대사가능한 오일계/단독 또는 이중 에멀젼계), 알루미늄계, 카보머계 보강제)으로 재수화한다.

본 발명에 따른 조성물은 동물의 면역학적 반응을 유도하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직한 본 발명에 따른 조성물은 백신이다. 본 명세서에 제시된 바와 같은 백신은 본 발명에 따른 페스티바이러스, 특히 BVDV를 함유하며, 앞서("용어 정의" 편) 정의한 바와 같다.

본 발명에 따른 조성물은 추가로 약학적 허용성 담체 또는 부형제를 함유하는 것이 가장 바람직하다. 몇몇 담체 또는 부형제는 앞서 게시한 바와 같다. 조성물은 주사제 또는 주입제가 목표라면 등장액 제조용 물질, p-하이드록시벤조에이트와 같은 방부제, 에틸렌디아민테트라아세트산의 알칼리 염과 같은 안정화제를 함유할 수 있고, 가능하다면 에멀션화제 및/또는 분산제도 함유할 수도 있다.

본 발명에 따른 조성물은 피내, 기관내 또는 질내로 적용될 수 있다. 이러한 조성물은 근육내 또는 비내로 적용하는 것이 바람직할 수 있다. 동물 신체에 대해서는, 정맥내 또는 표적 조직으로 직접 주사를 통해 전술한 약제학적 조성물을 적용하는 것이 유리한 것으로 증명되었다. 전신 투여용인 경우에는 정맥내, 혈관내, 근육내, 비내, 동맥내, 복강내, 경구 또는 경막내 경로가 바람직하다. 국소 투여는 피하, 피내, 피부내, 심장내, 골수내, 폐내 또는 치료받는 조직(결합 조직, 뼈 조직, 근육 조직, 신경 조직, 상피 조직)내 또는 그 부근에 직접 투여로 실시할 수 있다. 필요한 치료 기간 및 효과에 따라서 본 발명에 따른 조성물은 수일, 수주 또는 수개월 동안 예컨대 1일 기준으로 1회 또는 수회, 간헐적으로 여러 투약량으로 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 페스티바이러스 감염, 특히 BVDV 감염의 예방 및 치료를 위한 백신 제조에 사용되는 본 발명에 따른 페스티바이러스, 특히 BVDV의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 중요한 부분은 본 발명에 따른 페스티바이러스, 특히 BVDV를 암호화하는 핵산을 함유하는 폴리뉴클레오타이드 분자, 이의 단편, 기능성 변이체, 축퇴성 핵산 코드를 기반으로 한 변이체, 융합 분자 또는 화학적 유도체이다. 상기 폴리뉴클레오타이드 분자는 DNA인 것이 바람직하다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드 분자는 RNA인 것이 바람직하다. 더욱 바람직한 양태에 따르면, 상기 폴리뉴클레오타이드 분자는 페스티바이러스, 특히 BVDV의 기능성 5' 및/또는 3' 비해독 영역의 뉴클레오타이드 서열도 함유한다.

N^pro의 암호화 서열에 적어도 하나의 돌연변이 및 당단백질 E^rns의 암호화 서열에 적어도 하나의 돌연변이를 보유하고, 이러한 돌연변이가 당단백질 E^rns에 존재하는 RNase 활성과 N^pro에 존재하는 면역조절 활성을 모두 불활성화시키는, 본 발명에 따라 약독화된 페스티바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 분자 생산의 기본이 되는 뉴클레오타이드 서열은 다수가 당업계에 공지되어 있다. 이러한 여러 군의 페스티바이러스의 야생형 핵산 서열의 예는 다음과 같다:

경계병 바이러스
BD31 종	NCBI GenBank 수탁번호 [U70263]
X818 종	NCBI GenBank 수탁번호 [AF037405]
소 바이러스성 설사병 바이러스 1
NADL 종	NCBI GenBank 수탁번호 [M31182]
Osloss 종	NCBI GenBank 수탁번호 [M96687]
SD-1 종	NCBI GenBank 수탁번호 [M96751]
CP7 종	NCBI GenBank 수탁번호 [U63479]
소 바이러스성 설사병 바이러스 2
890 종	NCBI GenBank 수탁번호 [U18059]
C413 종	NCBI GenBank 수탁번호 [AF002227]
통상적인 돼지 열병 바이러스
알포트/187 종	NCBI GenBank 수탁번호 [X87939]
알포트-튜빙겐 종	NCBI GenBank 수탁번호 [J04358]
브레시아 종	NCBI GenBank 수탁번호 [M31768]
C 종	NCBI GenBank 수탁번호 [Z46258]

N^pro 및 E^rns의 암호화 서열에 관한 본 발명에 따른 돌연변이/변형은 앞에서 상세히 설명한 바와 같다. 당업자는 이러한 정보를 갖고 본 발명에 따른 페스티바이러스를 암호화하는 임의의 폴리뉴클레오타이드/폴리핵산을 제조할 수 있을 것이다. 뿐만 아니라, 당업자는 본 발명에 따른 약독화 페스티바이러스도 제조할 수 있을 것이다. 폴리뉴클레오타이드 서열에 돌연변이를 도입시키고, 이와 같이 돌연변이된 폴리뉴클레오타이드를 클로닝 및 증폭시키는 분자적 방법은 예컨대 문헌[참조: Sambrook et al. 1989 또는 Ausubel et al., 1994]에 제시되어 있다.

가장 바람직하게는, 본 명세서에 게시된 바와 같이 돌연변이되어야 하는 본 발명에 따른 야생형 BVDV는 서열번호 1의 핵산 서열(XIKE A라 한다) 또는 이의 기능성 변이체에 의해 암호화된다. 또한, 가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 BVDV는 본 발명에 따른 N^pro 돌연변이를 보유하고 서열번호 2의 핵산 서열(XIKE-A-NdN 으로 표시함) 또는 이의 기능성 변이체에 의해 암호화된다. 이러한 기능성 변이체는 본 명세서에 게시된 핵산 서열과 적어도 65% 상동성인 것이 바람직하다. 핵산 수준에서의 상동성은 매우 대략적이다: BVDV-1/-BVDV-1: 80%; BVDV-1/-BVDV-2: 70%; BVDV-2/-BVDV-2: 96%. 따라서, 더욱 바람직하게는 상기 기능성 변이체는 본 명세서에 게시된 핵산과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 또는 90% 상동성이 있는 것이다. 더욱 바람직하게는, 그러한 기능성 변이체가 본 명세서에 게시된 핵산 서열과 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 또는 98% 상동성이 있는 것이다. 가장 바람직하게는, 그러한 기능성 변이체가 본 명세서에 게시된 핵산 서열과 적어도 99% 또는 99.9% 상동성이 있는 것이다.

가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 BVDV는 코돈 H349가 결실된 본 발명에 따른 E^rns 돌연변이를 보유하고 서열번호 7의 핵산 서열(XIKE-B라 표시함) 또는 이의 기능성 변이체에 의해 암호화된다. 가장 바람직하게는 본 발명에 따른 BVDV는 E^rns의 히스티딘 349를 암호화하는 코돈이 결실되고 코돈 1 내지 4를 제외한 전체 N^pro 암호화 영역도 결실되어 N^pro의 아미노산 MELF만이 남아 있는, 본 발명에 따른 E^rns 돌연변이 및 N^pro 돌연변이를 모두 보유한 것이다. 이러한 돌연변이체는 서열번호 8의 핵산 서열(XIKE-B-NdN이라 표시함) 또는 이의 기능성 변이체에 의해 암호화된다. 이러한 기능성 변이체는 본 명세서에 게시된 핵산 서열과 적어도 65% 상동성인 것이 바람직하다. 더욱 바람직한 상기 기능성 변이체는 본 명세서에 게시된 핵산 서열과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 또는 90% 상동성이 있는 것이다. 더욱 바람직하게는, 그러한 기능성 변이체가 본 명세서에 게시된 핵산 서열과 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 또는 98% 상동성이 있는 것이다. 가장 바람직하게는, 그러한 기능성 변이체가 본 명세서에 게시된 핵산 서열과 적어도 99% 또는 99.9% 상동성이 있는 것이다.

가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 BVDV는 코돈 "H300"이 류신 코돈으로 치환된 본 발명에 따른 E^rns 돌연변이를 보유하고 서열번호 11(XIKE-C라 한다)의 핵산 서열 또는 이의 기능성 변이체에 의해 암호화된다. 가장 바람직하게는 본 발명에 따른 BVDV는 히스티딘 300을 암호화하는 코돈이 류신을 암호화하는 코돈으로 치환되고 코돈 1 내지 4를 제외한 전체 N^pro 암호화 영역도 결실되어 N^pro의 아미노산 MELF만이 남아 있는, 본 발명에 따른 E^rns 돌연변이 및 N^pro 돌연변이를 모두 보유한 것이다. 이러한 돌연변이체는 서열번호 12의 핵산 서열(XIKE-C-NdN이라 표시함) 또는 이의 기능성 변이체에 의해 암호화된다. 이러한 기능성 변이체는 본 명세서에 게시된 핵산 서열과 적어도 65% 상동성인 것이 바람직하다. 더욱 바람직한 상기 기능성 변이체는 본 명세서에 게시된 핵산 서열과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 또는 90% 상동성이 있는 것이다. 더욱 바람직하게는, 그러한 기능성 변이체가 본 명세서에 게시된 핵산 서열과 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 또는 98% 상동성이 있는 것이다. 가장 바람직하게는, 그러한 기능성 변이체가 본 명세서에 게시된 핵산 서열과 적어도 99% 또는 99.9% 상동성이 있는 것이다.

본 발명의 또 다른 중요한 관점은 당단백질 E^rns 암호화 서열의 적어도 하나의 돌연변이와 N^pro 암호화 서열의 적어도 다른 하나의 돌연변이가 페스티바이러스 게놈에 생성된 것을 특징으로 하는 페스티바이러스의 약독화 방법이다. 바람직한 양태에 따르면, 상기 페스티바이러스는 BVDV이다.

더욱 바람직한 양태에 따르면, 상기 방법은

a) 야생형 페스티바이러스 뉴클레오타이드 서열을 cDNA로 역전사하는 단계;

b) 상기 cDNA를 클로닝하는 단계;

c) 결실, 삽입 돌연변이 및/또는 치환 돌연변이로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 당단백질 E^rns 및 프로테아제 N^pro를 암호화하는 암호화 서열에 위치한 돌연변이를 상기 cDNA 중에 도입시키는 단계; 및

d) 상기 cDNA를 페스티바이러스 cDNA를 시험관내에서 또는 적당한 세포에 감염 시 RNA로 전사 유도할 수 있는 플라스미드 또는 DNA 바이러스 중에 혼입시키는 단계를 포함한다.

본 발명에 따른 BVDV 약독화 방법과 관련하여, 바람직한 방법은

a) 야생형 BVDV 뉴클레오타이드 서열을 cDNA로 역전사하는 단계;

b) 상기 cDNA를 클로닝하는 단계;

c) 결실, 삽입 돌연변이 및/또는 치환 돌연변이로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 당단백질 E^rns 및 프로테아제 N^pro를 암호화하는 암호화 서열에 위치한 돌연변이를 상기 cDNA 중에 도입시키는 단계; 및

d) 상기 cDNA를, 시험관내에서 또는 적당한 세포에 감염 시 페스티바이러스 cDNA를 RNA로 전사 유도할 수 있는 플라스미드 또는 DNA 바이러스 중에 혼입시키는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 중요한 양태는 본 발명에 따른 페스티바이러스 또는 본 발명에 따른 조성물을, 페스티바이러스 원인 질병의 치료를 필요로 하는 동물에게 당업자에게 공지된 적당한 투여량으로 투여하고 상기 페스티바이러스 감염의 증후군의 감소를 모니터하는, 상기 페스티바이러스 원인 질병의 치료방법이다.

본 발명의 또 다른 중요한 양태는 본 발명에 따른 BVDV 또는 본 발명에 따른 조성물을, BVDV 원인 질병의 치료를 필요로 하는 동물에게 당업자에게 공지된 적당한 투여량으로 투여하고 바이러스혈증 및 백혈구감소증 및/또는 발열 및/또는 설사와 같은 BVDV 감염의 증후군을 감소시키는, 상기 BVDV 원인 질병의 치료방법이다.

이하 실시예는 본 발명을 더 상세히 설명하기 위한 것으로서, 본 명세서에 게시된 본 발명의 영역을 제한하는 것으로 간주되어서는 아니 된다.

실시예 1

BVDV XIKE-B: 임신한 암소의 태아병원성 평가

고병원성 BVDV 타입 2 분리체 New York'93/C의 RNase 음성 돌연변이체인 BVDV XIKE-B는 감염성 cDNA 클론 pKANE40B로부터 회수했고, 조직 배양 시 야생형계(wt계) 증식 특징을 나타냈다. 동물 실험을 통해 상기 바이러스 돌연변이체가 약독화 생백신 바이러스 개발의 유망한 후보가 될 정도로 상당히 약독화된 것을 발견했다(Meyer et al., 2002). 이러한 약독화 바이러스가 태반을 통과하여 태아를 감염시킬 수 있는지의 여부를 검사하기 위하여 임신한 암소를 XIKE-B로 감염시켰다. 대조군으로서, cDNA 클론 pKANE40A로부터 회수한 야생형 BVDV를 사용했다. XIKE-A 로 표시한 각 바이러스는 감염된 세포에서 활성 E^rns RNase를 발현한다. 본 연구의 목표는 임신한 동물에서 XIKE-A 및 XIKE-B의 안전성을 평가하기 위한 것이다.

실험 설계

임신한 암소 10마리를 BVDV 음성 소떼 중에서 선발했다. 본 실험에 다음과 같은 5마리 암소 그룹을 사용했다:

	수	접종	바이러스
그룹 1	5	콧구멍내 투여 1회, 각 콧구멍당 3ml	XIKE-A
그룹 2	5	콧구멍내 투여 1회, 각 콧구멍당 3ml	XIKE-B

접종 8일 전에 암소를 실험 시설로 이동시켰다. 실험 시설로 이동 후 임신 상태를 확인했다. 접종 일에 암소의 임신 기간은 60일과 90일 사이였다. 접종은 모든 동물마다 한 시점에서 실시했다.

관찰 기간 동안 유산을 비롯한 BVDV 감염의 임상 징후의 존재를 모니터했다. 혈청검사, 항원 검출을 위해 동물의 혈액 시료를 채취하고 백혈구 세포를 계수했다. 본 실험은 감염 후 9주째 종결했다. 유산하지 않은 암소를 도살하고 자궁을 검사하고 수집했다. 태아 기관 시료는 통상의 부검 중에 수집하고 BVDV 감염에 대해 조사했다.

태아 감염의 존재는 BVDV 관련 암소 사망 수, BVDV 관련 유산 수 및 실험 종결시 BVDV 양성 태아 수로 구성되는, 주요 평가 변수로 확인했다. 주요 변수외에, BVDV 감염의 특징적인 임상 징후, 바이러스혈증 및 항원투여 후 암소의 백혈구 세포 수 및 직장 온도를 검사했다.

동물

BVDV가 없는 농장에서 암소를 구입했다.

다음과 같은 사용 기준에 부합하는 동물만을 사용했다.

사용 기준

- BVD 항체가 없는 것; 각 개체는 수송 전과 실험 초기(동물 검사 시설에서)에 혈청 항체 테스트로 검사한다.

- BVDV가 없는 것; 각 개체의 혈장 및/또는 백혈구연층 제조물을 적당한 테스트로 검사한다.

- 신체 검사 시 판단되는 연구 초기에 임상적으로 건강한 것. 동물의 건강 검사를 현재 일반적으로 허용되는 수의 실험 방식에 따라 실시했다.

- 접종 전 신체 검사 시 임신이 확인된 것. 정액주입 기록으로 확인된 임신 기간이 접종 시점에 60일에서 90일 사이인 것.

시험 균주 A

설명:	XIKE A, 생 바이러스 BVDV 균주
조성물:	저 계대배양성 XIKE-A의 세포 배양 상청액을 함유하는 실험 물질
BVD 성분:	BVDV 타입 II 균주: XIKE-A
제공원:	그레고르 메이어스 박사, "Bundesforschungsanstlt fur Viruskrankheiten der Tiere"(BFAV), Paul-Ehrlich-Strasse 28, 72076, Tubingen, Germany
적용된 BVD 바이러스 투여량:	타입 1 균주: 105 TCID50/6ml(TCID = 조직 배양물 감염 투여량)
적용된 백신 용량:	콧구멍당 3ml
적용 경로:	비내
투약 형태의 제조:	접종물은 예비희석된 동결 형태로 드라이아이스 상의 50ml 바이엘에 넣고 접종전까지 -70℃에 보관했다. 그룹 1 암소에게 접종하기 직전에 접종물을 국소 온도가 37℃를 초과하지 않도록 하면서 해동시켰다. 유체 중에 얼음이 전혀 관찰되지 않으면 접종물을 부드럽게 교반하고 즉시 동물 접종에 사용했다.
미사용 접종물:	사용하지 않은 접종물의 부피를 측정하고 2개의 일정량으로 분할한 후 드라이아이스 또는 액체 질소 중에서 직접 동결한 후 재역가 측정용으로서 보관해두었다. 바이러스 및 오염된 플라스틱 또는 유리제품은 바이러스 불활성화를 위해 폐기하기 전에 적당한 용량의 8 내지 10% 포름알데하이드 용액 중에서 적어도 24시간 동안 실온에서 항온처리했다.

시험 균주 B

설명:	XIKE B, 생 바이러스 BVDV 균주
조성물:	저 계대배양성 XIKE-B의 세포 배양 상청액을 함유하는 실험 물질
BVD 성분:	BVDV 타입 II 균주: XIKE-B
제공원:	그레고르 메이어스 박사, "Bundesforschungsanstlt fur Viruskrankheiten der Tiere"(BFAV), Paul-Ehrlich-Strasse 28, 72076, Tubingen, Germany
적용된 BVD 바이러스 투여량:	타입 1 균주: 105 TCID50/6ml(TCID = 조직 배양물 감염 투여량)
적용된 백신 용량:	콧구멍당 3ml
적용 경로:	비내
투약 형태의 제조:	접종물은 예비희석된 동결 형태로 드라이아이스 상의 50ml 바이엘에 넣고 접종전까지 -70℃에 보관했다. 그룹 2 암소에게 접종하기 직전에 접종물을 국소 온도가 37℃를 초과하지 않도록 하면서 해동시켰다. 유체 중에 얼음이 전혀 관찰되지 않으면 접종물을 부드럽게 교반하고 즉시 동물 접종에 사용했다.
미사용 접종물:	사용하지 않은 접종물의 부피를 측정하고 2개의 일정량으로 분할한 후 드라이아이스 또는 액체 질소 중에서 직접 동결한 후 재역가 측정용으로서 보관해두었다. 바이러스 및 오염된 플라스틱 또는 유리제품은 바이러스 불활성화를 위해 폐기하기 전에 적당한 용량의 8 내지 10% 포름알데하이드 용액 중에서 적어도 24시간 동안 실온에서 항온처리했다.

임신 기간 조절

임신 기간은 접종 직전에 확인했다.

암소 접종

접종은 실험 0일째 실시했다.

각 콧구멍마다 시험 물질 3ml을 주사바늘 없는 주사기로 비내로 투여했다. 매번 새로운 멸균 주사기를 사용했다. 투여는 날숨을 통한 유체의 손실을 최소화하기 위하여 흡인 중에 투여를 실시했다.

접종 후 관찰

혈액 시료의 수집 및 검사

혈액을 표준 무균 절차(채혈 부위 소독)에 따라 수집했다. 각 동물마다 새로운 멸균 주사기와 주사바늘을 사용했다.

혈청 제조를 위한 혈액 수집

적어도 10ml 혈액을 접종 직전의 암소로부터, 그 다음 감염 후 매주, 그리고 연구 종결 시에 암소로부터 수집했다. 혈청은 사용 전까지 -20℃에 보관했다.

백혈구 계수 및 백혈구연층 제조물을 위한 혈액 수집

백혈구 계수를 위해, 혈액 3ml를 수집 후 즉시, EDTA(0.235mol/L) 0.06ml가 채워진 적당한 멸균 용기(Venoject, Terumo Europe N.V., Leuven, Belgium)로 옮겼다.

백혈구연층 제조물을 위해, 혈액 적어도 15ml를 수집 후 즉시, 혈액 시료 중에 혈액 1ml당 적어도 20IU 헤파린을 제공하기 위해 0.1ml 헤파린 용액(주사용 Na- 헤파린, 5000IU/ml lot. A7B163A 유효 기간: 11/2000: Gedeon Richter RT, Budapest, Hungary)이 미리 채워진 적당한 멸균 용기로 옮겼다. 그 다음, 내용물을 조심스럽게 혼합했다.

백혈구연층 제조 및 백혈구 계수를 위한 혈액은

·감염 후 0 내지 14일 동안 매일;

·15일부터 40일까지 또는 3회 연속 시료채취 시점마다 모든 동물에서 바이러스 분리가 음성일 때까지는 이틀에 한번씩, 암소로부터 수집했다.

혈청 제조

혈액을 실온에서 응고시키고 원심분리하여 분리했다. 각 혈청 시료를 각각 적어도 2ml씩 2개의 부분표본으로 분리했다. 부분표본 1세트는 ELISA를 통해 BVDV 특이 항체에 대해 분석했다. 나머지 혈청은 동결하여, 이후 사용할 때까지 -20℃에 보관해두었다.

백혈구 수

백혈구 수는 정확도가 0.1 x 10⁹/1,100/㎕인 쿨터 계수기 반자동 전자 장치(Diatron Minicell-16; Messtechnik GmbH, Wien, Austria)로 측정했다. 이 기구는 제조자의 권장에 따라 사용했다(보정 및 백혈구 계수).

백혈구연층의 제조

헤파린 혈액 시료는 가능한 즉시 실험실로 옮겼다. 표준 실험 절차 후 백혈구연층 제조 절차를 무균 상태(멸균 피펫, 취급, 클린 벤치 등) 하에서 수행했다.

수득한 백혈구연층은 소량(2ml)의 RPMI 1640에 재현탁시키고 0.5ml씩 2개의 부분표본으로 -70℃에서 동결시켰다. 나머지 1ml 백혈구연층은 증식허용 세포 배양물에서 공동 배양을 통해 혈액 세포 결합 BVDV 측정에 바로 사용했다.

BVD 혈청 항체 ELISA 테스트

각 혈청 시료는 적당한 인증받은 ELISA 테스트(Svanovir™ BVDV 항체 검사 Cat# 10-2200-10)를 사용하여 BVDV 항체의 존재에 대해 검사했다. 테스트는 인증 받은 것으로서 제조자의 권장에 따라 수행했다. 양성 시료는 BVDV 항체 역가를 측정하기 위하여 log₂ 스케일로 희석했다.

BVD 항원 분석

각 백혈구연층 시료의 BVDV 존재는 새로 제조한 백혈구연층과 감수성 세포 또는 세포주와 공동 배양하여 분석했다. 공동 배양하기 전에는 동결시키지 않았다.

혈장을 수집하고 각 시료를 Man-Gene에 제공했다.

임상 관찰

암소 관찰

동물의 임상 증후군 존재는 충분히 훈련받은 수의사가 접종 후 0 내지 42일 동안 매일 검사했다.

모든 임상 징후를 기록하고, 그 특징, 일관성/촉진, 병도(약, 중 또는 강) 위치 및 감염 부위 크기로 나타내었으며, 각 점수는 협정된 표준 정의에 따랐다. 호흡 징후(호흡, 호흡수; 콧물 또는 눈물; 결막염, 재채기, 기침 등) 및 설사에 특히 관심을 기울였다.

직장 온도

직장 온도는 각 암소마다 매일 같은 시간(바람직하게는 아침에)에 접종 5일전부터 감염 후 21일까지 측정했다.

매일 마다 직장 온도의 측정은 각 동물의 직장 온도가 적어도 연속 3일간 39℃ 이하일 때까지 계속했다.

임신 중단 측정

임신 확인 및 태아 유산 또는 흡수의 기미는 직장 조사로 수행했다. 훈련된 수의사가 접종 시, 접종 후 1개월 및 접종 후 2개월에 모든 동물을 대상으로 조사했다. 이 조사는 일반적으로 인정받은 수의적 실습 방식에 따라 수행했다.

암소의 임의의 유산 징후는 연구 종결(항원접종 후 8 내지 12주) 시까지 매일 조사했다.

연구 종결

본 연구는 암소를 도살하고 태아를 적출하여 종결했다. 태아 및 태아 물질을 암소 번호와 날짜/시간을 표시한 밀폐 수송 용기로 옮겼다. 이 용기를 선택한 부검실로 이동시켰다.

암소 부검은 실시하지 않았다. 부검은 태아에 대해서만 실시하고 그 결과를 기록하고 시료 패널을 이하에 기술된 바와 같이 수집했다.

해부 검사

실험 동물의 세부 부검은 각 사망 케이스마다 수행했다.

해부 검사는 숙련된 수의사가 실시했고, 그 결과를 적당한 데이터 시트에 기록했다. 추가 실험 테스트는 관찰된 임상 징후 및 병변에 따라 수행했다. 부검 결 과 미생물 인자에 의해 유발된 질병이라는 진단이 나오면, 그 진단을 그 미생물 인자에 특이적인 적당한 테스트로 검증했다.

각 조직 시료는 적어도 2개의 다른 표지된 용기에 수집하여, 액체 질소로 급속 동결시켰다. 시료는 필요할 때까지 -70℃에 보관했다.

유산된 태아 및 연구 종결

적어도 다음과 같은 조직 시료를 태아로부터 수집했다:

·복강 또는 흉부(존재하는 경우) 삼출물,

·창자간막 림프절,

·비장,

·흉선,

·소뇌,

·신장,

·흉골 유래 골수

·태반 유래 시료(이용가능한 경우).

사망하거나 도살된 암소

적어도 다음과 같은 조직 시료를 수집했다:

·백혈구연층용 혈액(이용가능한 경우),

·혈청용 혈액(이용가능한 경우),

·페이에르판,

·창자간막 림프절,

·비장,

·신장,

·태반 유래 시료를 포함한 자궁(이용가능한 경우).

시료 보관 및 수송

시료	보관
혈청	-20℃
백혈구연층	-70℃
바이러스	-70℃
암소 유래 조직	-70℃
태아 유래 조직	-70℃

시료는 후원자가 필요로 하는 경우 실험 분석을 위해 이송했다. 시료의 선택과 수송 시기는 연구 모니터 또는 프로젝트 매니저와 협의했다. 원칙주의로서 유산된 물질 유래의 시료 또는 신생 송아지 유래의 시료는 가능한 즉시 조사했다.

결과

사망률

암소 626번(그룹 1)은 PI(접종 후) 13일째 사망했다. 다음 표는 관찰된 임상 징후 및 부검 동안 나타난 병변을 정리한 것이다.

암소	살아 있는 동안의 관찰 결과	부검 시 소견 결과
626번	·7 DPI 이후 질병 징후 ·7 내지 12 DPI째 눈물, 콧물 ·8 내지 12 DPI 이후 식욕 감퇴 ·11 내지 12 DPI째 설사 ·9 내지 10DPI 및 12DPI째 호흡수 상승 ·9DPI째 기침 ·12 DPI째 비정상적 호흡	·탈수 ·장막 상의 출혈 ·페이에르판 충혈 ·폐부종

이러한 임상 소견 및 육안 병리학적 소견은 BVDV 유도 손상과 일치하는 바, 사망 원인이 BVDV 감염이라고 결론지을 수 있다.

감염 후 유산

각 그룹마다 암소 한 마리는 임상적 유산을 나타냈다. 암소 615번(그룹 1)은 PI 38일째 유산했고, 암소 469(그룹 2)는 PI 39일째 유산했다. 두 태아는 자가용해 징후를 나타냈고, 적어도 유산 3 내지 7일전에 사망한 것으로 추정되었다(약 32 내지 35 DPI).

그룹 1의 암소 526번은 종결 시 도살 검사에서 태아가 관찰되지 않았다. 자궁의 육안 병리학 검사 결과는 다음과 같다:

· 우측 자궁각이 약간 확장되었다.

· 자가용해가 진행되어 태반 잔류물이 내강에 남아 있었다.

암소 526번 자궁에 대한 소견 결과는 BVD 감염의 가능성이 가장 큰 "무증상" 유산과 일치했다.

암소의 임상적 관찰

임상적 관찰 데이터 및 그룹간 임상 징후의 지속 기간은 다음과 같다.

임상 징후 및 관찰된 때의 접종후 경과일(DPI)

그룹 1(XIKE-A)

그룹 2(XIKE-B)

XIKE-1A로 감염된 그룹 1 동물은 모두 광범위한 임상 징후를 나타냈다. 호흡 징후는 먼저 식욕 감퇴를 동반했고, 몇일 후 암소 526번을 제외한 나머지 암소는 설사를 일으켰다. 감염 후 암소 한 마리가 사망했고, 다른 한 마리는 유산했다(상기 참조). 이러한 징후들은 모두 독성 BVDV 균주 감염 후에 예상되는 증후군과 일치한다.

XIKE-B로 감염된 그룹 2 동물은 모두 임상 징후가 없었다. 이와 동시에, 암소 한 마리는 관찰 기간 동안 유사했다.

직장 온도

동물을 감염시키기 전에는 어떠한 비정상적 온도 변화가 검출되지 않았다.

그룹 2에서 0일부터 감염 후 21일까지 온도는 모두 생리적 범위 안에서 유지되었다.

그룹 1 동물은 PI 7일에서 11일 사이에 검출된 감염 후 직장 온도가 모두 상승된 것으로 관찰되었다.

연구 종결 시의 소견

연구 종결 시, 도살하여 태아를 조사했다.

암소 526번에서는 태아가 회수되지 않았다("감염 후 유산" 섹션 10.2 참조).

태아 부검 시 다음과 같은 소견이 관찰되었다:

동물 번호	소견	결론
그룹 1
598	복수, 전신 부종, 자가용해	적어도 2주전에 사망함
618	복수, 전신 부종, 자가용해	적어도 3주전에 사망함
그룹 2
565	복수, 전신 부종, 간 변성	태아가 생육하지 못한 것으로 간주됨
588	정상	-
608	정상, 신장주위 부종	-
619	전신 자가용해	3 내지 6주전에 사망함

이러한 소견들은 그룹 1 동물 2마리(암소 598번 및 618번)와 그룹 2 동물 1마리(암소 619번)가 적출 전 수주 전에 사망했고, 따라서 유산한 것으로 간주할 수 있음을 암시한다.

해부 소견에 의해 변조된 유산

해부 검사 후 일부 암소들의 유산하지 않은 이유는 분명하지 않았다. 사망한 태아는 유산으로 간주되어야 한다. 따라서, 연구 종결 후 임상 영상이 다음과 같이 변조되었다:

그룹 1

동물 번호	결론
526	BVD 유산(사후 태반이 있는 자궁)
598	BVD 유산(사후 태아)
615	임상적 BVD 유산
618	BVD 유산(사후 태아)
626	BVD로 인해 사망

그룹 2

동물 번호	결론
469	임상적 BVD 유산
565	BVD 유산 추정; 태아 비생육
588	정상
608	정상
619	BVD 유산(사후 태아)

혈액 시료 검사

백혈구 수

WBC 계수는 모든 동물에서 바이러스 분리가 음성이 된 PI 26일째 중단한다.

DPI 0은 비교용의 개체 기준값으로 간주한다.

그룹 2에서, 백혈구 수는 관찰 기간 말(DPI 26)까지 기준값 보다 40% 이상까지 내려가지는 않았다.

그룹 1에서, 한 동물(암소 598)은 WBC 수가 어느 날 기준값 보다 40% 이하였다.

혈청학

선택된 동물 중에서 감염 전 혈청 중에 BVDV 특이 항체를 보유한 동물은 없었다. 감염 후, 살아 있는 모든 그룹 1 암소는 BVDV 특이 항체를 발생시켜 PI 3주째부터 검출되었고, 모든 연구 동물에서 관찰 기간 말까지 지속되었다. 그룹 2에서는, 암소 5마리 중 4마리가 PI 4주째부터 BVDV 특이 항체를 보이기 시작했다. 측정가능한 항체 반응은 3마리 동물에서만 관찰 기간 말기까지 지속되었다. 역가는 그룹 1보다 그룹 2에서 낮았다.

공동 배양에 의한 바이러스 검출

백혈구연층

BVDV는 두 그룹에서 검출되었다. 바이러스 검출 기간은 다음과 같다. 모든 시료는 수집 후 즉시, 즉 동결 없이 공배양했다.

동물 번호	BVDV가 검출될 때의 DPI
그룹 1
615	5-12
526	5-9
626	5-12
618	5-11,14
598	5-11,13
그룹 2
565	7-9
588	8
608	6-9
469	8
619	5-11

조직 시료

사망한 암소 및 태아 중의 BVD 바이러스의 존재는 다음과 같다:

암소:

동물 번호	조직 시료 중의 BVDV
그룹 1
626	존재#

태아:

동물 번호	조직 시료 중의 BVDV
그룹 1
615	존재하지 않음#
526	NT
626	존재#
618	존재하지 않음
598	존재
그룹 2
565	존재
588	존재하지 않음
608	존재
469	존재하지 않음#
619	존재하지 않음
NT = 검사 안됨

시료는 수집 후 즉시(즉, 동결 없이) 공배양했다. 단 "#"표시된 동물은 동결 시료만을 이용할 수 있었다.

BVD 관련 임상 데이터 및 실험 데이터 정리

그룹 1

동물 번호	결론	BVD
526	BVD 유산(자궁에 사후 태반 보유)	NT(시료 찾지 못함)
598	BVD 유산(사후 태아)	+(태아)*
615	임상적 BVD 유산	-(태아)*
618	BVD 유산(사후 태아)	-(태아)*
626	BVD로 인해 사망	+(태아)/+(암소)
NT: 검사되지 않음

그룹 2

동물 번호	결론	BVD
469	임상적 BVD 유산	-(태아)*
565	BVD 유산 추정; 태아 비생육	+(태아)
588	정상	-(태아)
608	정상	+(태아)
619	BVD 유산(사후 태아)	-(태아)*
* 태아는 시료 채취 시에 자가용해되었다.

결론:

본 연구는 임신한 동물에서의 XIKE-A 및 XIKE-B의 안전성을 평가하기 위한 것이었다. 임신한 암소는 BVDV 음성 그룹중에서 선발했다. 2 그룹의 5마리 암소를 본 실험에 사용했다: 그룹 1에는 XIKE-A를 접종했고, 그룹 2에는 XIKE-B 바이러스 종을 접종했다. 접종일에 암소의 임신 기간은 60 내지 90일 사이였다.

암소의 관찰 기간 동안 유산을 비롯한 BVDV 감염의 임상 징후를 모니터했다. 혈청학, 항원 검출 검사를 위해 동물의 혈액 시료를 수집하고, 백혈구 세포를 계수했다. 본 실험은 감염 9주 후에 종결했다. 유산하지 않은 암소는 도살하고, 자궁을 검사하고 수집했다. 태아 기관 시료는 통상의 부검 중에 수집하고 BVDV 감염을 검사했다.

태아 감염의 존재는 BVDV 관련 암소 사망률 수, BVDV 관련 유산 수 및 종결 시 BVD 양성 태아 수로 구성된 주요 평가 변수였다. 주요 변수 외에도, BVDV 감염의 특징적인 임상 징후, 바이러스혈증 및 암소의 백혈구 세포 수 및 항원투여 후의 직장 온도를 평가했다.

XIKE-B 바이러스는 XIKE-A보다 병원성이 낮은 것으로 확인되었지만, XIKE-B 그룹에서도 역시 BVD 관련 유산 및 태아 감염이 관찰되었다. 따라서, E^rns RNase의 불활성화가 태아 감염을 차단하지 못한다고 결론지을 수 있다.

실시예 2

BVDV XIKE-A-NdN: 임신한 암소의 태아병원성 평가

N^pro 유전자는 조직 배양에서 CSFV의 증식에 비필수 요소인 것으로 밝혀져 있다(Tratschin et al., 1998). BVDV 약독화가 N^pro 결실의 결과라는 증거는 아직 없지만, 바이러스와 숙주 사이의 상호작용에서 상기 단백질이 역할을 할 것으로 추정 되며, 실제 최근 CSFV 실험에서 시사된 바 있다(Mayer et al., 2004; Ruggli et al., 2003). 이에 따라 본 발명자들은 N^pro 암호화 서열의 주요 부분의 결실이 임신한 암소의 태아를 더 이상 감염시키지 않는 바이러스를 유도하는지의 여부를 조사하기를 원했다. 이에, 5' 말단의 4개 코돈을 제외한 N^pro 유전자를 표준 절차에 따라 전장의 cDNA 클론 pKANE40A로부터 결실시켰다. 그 결과 수득되는 돌연변이 전장 클론은 시험관내 전사의 주형으로 사용했고, 그 결과 수득되는 cRNA로 문헌(Meyer et al., 2002)에 기술된 바와 같이 MDBK 세포를 형질감염시켰다. 회수된 바이러스를 조직 배양을 통해 증폭시킨 후 다음과 같은 동물 실험에 사용했다. BVDV XIKE-B는 앞에서 확인된 바와 같이 태반을 통과할 수 있는 바 대조군으로 사용했다(실시예1).

연구 목표/목적

본 연구의 목표는 게놈에서 N^pro 암호화 영역의 대부분이 결실된 생 약독화 BVDV가 임신한 동물에서 안전한지의 여부를 평가하기 위한 것이다.

사용된 재료 및 방법은 실시예 1에 기술된 바와 같다.

연구 설계

임신한 암소 8마리를 2 그룹으로 무작위로 나누었다. 이 암소들을 다음과 같은 스케줄에 따라 처리하고 관찰했다:

	그룹 1	그룹 2
N	5	3
처리	XIKE-A-NdN	XIKE-B/대조군
경로	근육내
백신접종 시기	임신 60 내지 90일 사이(연구 0일째)
백신접종 후 관찰(살아 있는 동안)	·임상 징후 ·0일, 14일, 28일, 42일 및 종결 시의 혈청 ·0일 및 그 후 14일간 매일의 WBC ·0일 및 그 후 14일간 매일의 백혈구연층
사후(60일)	·육안 병리상태 ·바이러스 분리용 기관 패널

연구 형태:	개방 조절식 임상 연구
실험 유닛:	각 동물
맹검법:	부분맹검. 맹검 및 처리 스케줄 개시에 대한 세부 절차는 알리지 않았다. 연구 위치에서의 관찰 수의사와 병리학자는 처리를 인식하지 못했다. 이들은 오로지 자신들의 임무에 관한 프로토콜 초본을 받았다. 백신접종은 연구자 또는 이의 수탁자에 의해서 수행되었다. 바이러스 분리용 시료는 모든 결과가 나올 때까지 연구자의 코드로 표시되었다.

결과

모든 암소는 건강했고 연구 개시 시 임신 상태였다. 모든 동물은 연구 개시 전에는 BVDV 및 BVDV 항체가 없는 것으로 확인되었다.

감염에 사용된 바이러스의 제조 및 대조 조사

시료는 희석 단계를 통해 수집하고, 적당한 조직 배양으로 공배양하여 제조일, 즉 동결없이 분석했다. 바이러스 역가의 결과는 다음과 같다.

시료 ID	바이러스 균주	희석/설명	Log10 역가/ml
VT1a	XIKE-A/NdN (S)	1:2(4℃)	4.4
VT1b		열지 않고 얼음상에서 #2a	4.0
VT1c		#2b 복귀	2.8
VT2a	XIKE-B	1:2.2(4℃)	2.3
VT2b		열지 않고 얼음상에서 #3a	2.8
VT2c		#3b 복귀	음성

BVDV 감염의 임상적 증상

이하 표는 관찰 기간 동안의 임상 징후를 나타낸 동물에 대하여 정리한 것이 다.

임상 징후 및 이 징후가 관찰될 때의 접종후 경과일(DPI)

그룹 1(XIKE-A NdN) 그룹 2(XIKE-B)

각 그룹의 일부 동물에서만 약한 일시적인 임상 징후가 관찰되었다. 그룹 1의 경우, 암소 5마리 중 1마리에서 PI 8일째 식욕 감퇴가 나타났다. 그룹 2의 경우, 암소 3마리 중 2마리에서 임상 징후가 나타났다. 즉, 암소 2마리는 PI 21일경에 기침을 했고, 이 중 1마리는 식욕 감퇴도 동반했다.

직장 온도

동물에게 접종하기 전에는 비정상적 온도 변화가 검출되지 않았다. 접종 후 측정된 온도 상승의 몇몇 증례는 다음 표에 정리한 바와 같다.

그룹	동물 ID	온도(℃)	PI 경과일
1	1583	39.9	8
	1621	39.0	5
2	1438	39.0	2
	1585	40.8	9

각 그룹의 동물 1마리에서 약간 상승된 온도가 관찰되었고, 또한 각 그룹의 동물 1마리는 열이 있었다. 열은 PI 8일 또는 9일째 검출되었다. 온도는 항상 다음 날 정상 수치로 돌아왔다.

백혈구 수

PI 3일 내지 8일 사이에 모든 그룹에서 약간의 백혈구감소증이 관찰되었다. 백혈구 세포 수가 40% 이상 감소한 동물 수는 다음과 같다:

그룹	백혈구감소증이 있는 동물 수/전체 수
1	3/5(60%)
2	1/3(33%)

혈청학(BVDV 항체)

연구 프로토콜에 따르면, 백신접종 전 모든 암소에는 BVDV 항체가 없었다. 그룹 1(XIKE-A NdN 접종) 및 그룹 2(XIKE-B 접종)에서는 연구 종결(접종 후 2개월 후) 시에만 완전한 혈청전환이 검출되었다.

백혈구연층으로부터의 BVD 바이러스 분리

바이러스혈증은 전혀 검출되지 않았다.

태아 조직 시료로부터의 BVD 바이러스 분리

	그룹 1	그룹 2
N	5	3
처리	XIKE-A-NdN	XIKE-B/대조군
경로	근육내	근육내
태아 전파가 검출된 태아 수	태아 5마리 중 4마리가 감염됨	태아 3마리 중 2마리가 감염됨
처리에 사용된 바이러스에 대한 결론은 태반을 통해 전파될 가능성이 있다는 점이다.	XIKE-A-NdN의 태아 전파 관찰	XIKE-B의 태아 전파 관찰

결론

N^pro 결실은 고병원성(Meyer et al., 2002)으로 확인된 모 바이러스 XIKE-A에 비해 상당히 약독화된 BVDV였다. 하지만, N^pro 결실만으로는 임신한 암소 접종 후 NY93계 바이러스 재조합체의 태아로의 전파가 차단되지 않았다.

실시예 3

BVDV XIKE-B-NdN: 임신한 암소의 태아병원성 평가

BVDV 약독화 및 태아 전파와 관련하여 RNase 불활성화 및 N^pro 결실의 조합의 가능성을 검사하기 위하여 N^pro 암호화 영역에 결실이 있는 여러 BVDV-2 돌연변이체를, 코돈 349가 결실된 pKANE40A의 RNase 음성 돌연변이체인 감염성 cDNA 클론 pKANE40B를 기반으로 제조했다. 회수된 바이러스를 목적한 돌연변이의 존재, 도입된 변화 인접 영역에 제2 부위 돌연변이의 부재 및 조직 배양에서의 증식 특징에 대하여 분석했다. 코돈 1 내지 4를 제외한 전체 N^pro 암호화 영역이 결실되고 뿐만 아니라 코돈 349의 RNase 불활성화 결실을 함유하는 변이체인 XIKE-B-NdN(V-pK88C)는 적당한 증식 특징과 목적한 돌연변이가 조합되어 있기 때문에 동물 실험에 사용했다. 본 연구의 목적은 임신한 동물에서의 생 약독화 BVDV 분리체의 안전성을 평가하는 것이다.

BVDV 음성의 임신한 암소 5마리에게 감염 용량의 10⁵ TCID50/동물 XIKE-B-NdN(역 역가 데이터는 표 3.1에 정리한 바와 같다)을 비내로 접종했다. 임상 데이터는 매일 기록했다. 백혈구 세포 계수, 백혈구연층 제조 및 혈청학 검사를 위해 혈액 시료를 수집했다. 연구 종결 후 바이러스 분리를 위해 태아 조직을 수집했다.

재료 및 방법

세부 내용은 실시예 1과 같다.

결과

임상 데이터는 관찰하지 않았다(데이터 미제시). 백혈구 수는 암소 1015에서 어느 날(p.i. 6일) 기준값보다 약 40% 정도 현저히 감소한 것을 제외하고는 사실상 변화가 없었다(데이터 미제시).

백혈구연층 제조물 분석:

약 10⁶ 백혈구를 24웰 조직 배양판에서 MDBK 세포와 2회 5일 동안 배양했다. 시료는 2회 동결 해동시켰다. 해동된 시료 100㎕ 부분표본을 새로 접종된 24웰 조직 배양판에 접종하고 간접 면역형광 염색법(비구조 단백질 NS3 중의 보존성 에피토프에 대하여 지향성인 mAb Code 4)으로 바이러스를 검사했다. 양성 대조군이 검사의 정확한 유도작용을 분명히 나타낸 반면, 동물 921번, 1013번, 1015번, 1055번 및 1075번의 백혈구연층 제조물에서는 BVDV가 전혀 분리되지 않았다(표 3.2).

b) 태아 조직의 해부 검사

연구 종결후, 바이러스 분리를 위해 다음과 같은 태아 조직을 수집했다: 비장, 신장, 흉선, 흉골, 소뇌, 태반, 소장 및 복수. 간략히 설명하면, 조직 현탁액은 Ca²⁺와 Mg²⁺가 없는 빙냉한 PBS 및 멸균 해사를 이용하여 모르타르에서 제조했다. 모르타르는 Ca²⁺와 Mg²⁺가 없는 빙냉 PBS 1ml로 세척하고, 현탁액은 2000xg(4℃)에서 10분 동안 원심분리했다. 상청액은 먼저 일회용 0.45㎛ 필터 홀더를 통해 통과시킨 후 그 다음 필터(0.2㎛ 세공 크기)를 통과시켰다. 바이러스 분리는 24웰 조직 배양판(37℃, 7% CO₂) 중의 MDBK 세포 단층 상에서 2회(태아 조직 현탁액 400㎕ 또는 태아 복수 100㎕) 수행했다. 조직 시료는 세포 병원성 효과 또는 세균 오염에 대해 매일 대조 조사하고, 5일간 항온배양한 후 평판을 2회 동결 및 해동시켰다. 시료 100㎕를 새로 접종된 MDBK 세포에 계대배양했다. 바이러스 검출은 간접 면역형광 염색법(mAb 코드 4)으로 수행했다. 조직 시료 또는 태아 복수에서는 어떠한 BVDV도 검출되지 않았다(표 3.3).

c) 혈청학적 소견

혈청 중화 역가는 접종 전, 접종 후 1개월 후 및 연구 종결 시에 측정했다. 모든 동물의 혈청은 NY93/C에 대한 중화성 항체에 대하여 3회 검사하고, 최종 희석물을 간접 면역형광 염색법으로 판독했다. 결과는 약 100 TCID₅₀을 중화시키고 케버(Kaerber)법으로 계산한 최종 희석률로서 나타냈다. 혈청은 최고 1:16의 희석률에서 MBDK 세포에 대해 독성이었고 이보다 높은 희석률에서는 중화 반응을 전혀 검출할 수 없었는 바, 감염 0일, 1주 및 2주 후에는 어떠한 명확한 데이터를 수득할 수 없었다. 백신접종 3주 후부터 모든 동물에서 실험 말까지 지속되는 상동성 BVDV-2 바이러스 NY'93/C에 대한 중화 항체가 형성되었다(표 3.4 및 도 1).

d) 결론

동물 연구에서 수득된 데이터를 보면, BVDV XIKE-B-NdN이 고도로 약독화된 바이러스임을 분명히 알 수 있다. 임신한 암소에서 높은 비율로 태아 전파를 나타 내는 야생형 바이러스 또는 단독 돌연변이체 XIKE-B 또는 XIKE-A-NdN과 대조적으로, 이중 돌연변이체는 태반을 통과하지 못했다. BVDV XIKE-B-NdN은 물론 이와 유사한 이중 돌연변이체는 생 약독화 백신에 사용하기에 매우 적합하다.

연구 번호: B01 BIVI020 및 B01 BIVI022

[표 3.1]

바이러스 역적정

시료 ID	바이러스 균주	희석	역가
1a	XIKE-B-NdN	농축 바이러스	105.44 TCID50/ml
1		1:4	104.86 TCID50/ml
6		감염 잔여물(#1)	104.27 TCID50/ml

[표 3.2]

[표 3.3]

[표 3.4]

⁽¹⁾ 1456 Nase(=NY93/C) 10^2.03 TCID₅₀/50㎕에 대한 SNT

⁽²⁾ 1456 Nase(=NY93/C) 10^1.57 TCID₅₀/50㎕에 대한 SNT

^* 최고 1:16 희석률에서 MBDK 세포에 대해 독성인 혈청 ⇒ 데이터 유효하지 않음

NA : 데이터 유효하지 않음.

NY93/C에 대한 혈청 중화 분석 결과는 도 1에 도시했다.

효능 및 교차방어 연구

약독화 바이러스 돌연변이체 BVDV XIKE-B 또는 BVDV XIKE-B-NdN을 이용한 백신접종과 관련하여 2가지 가능한 문제점에 직면해야 했다. 그 하나는 BVDV-1 및 BVDV-2 사이의 교차 방어에 대한 일반적인 문제다. 최소한 불활성화된 BVDV-1 백신을 이용한 백신접종은 임신한 동물의 태아로의 BVDV-2의 전파를 차단하지 못했다. 태아 감염에 대한 방어는 항BVDV 백신접종의 주요 목적인 바, 이러한 백신은 광범위하게 방어 면역을 유도하는 것이라 간주될 수 없다. 따라서, 생 약독화 BVDV-2의 백신접종은 태아로의 바이러스 전파를 차단할 수 있는지 여부가 의문시된다. 다른 하나는, BVDV XIKE-B-NdN의 증식률 감소가 임신한 암소의 태아로의 태반을 통과한 감염을 차단할 수 없을 정도로 단지 낮은 방어율을 제공할 뿐일 수 있다는 점이다. 이러한 문제를 해결하기 위해 동물 연구를 시작했다. 동물(각각 10마리씩 2 그룹)에게 BVDV XIKE-B 또는 XIKE-B-NdN(의도 투여량: 10⁵ TCID₅₀ 바이러스 상청액 1ml; 역적정은 표 3.5에 제시한 바와 같다)을 백신접종했다. 백신접종되지 않은 대조 그룹의 1마리가 어느 날 약한 기침을 하는 것을 제외하고는 백신접종 후 유의적인 임상 징후를 나타내는 동물은 없었다. 직장 온도 역시 백신접종되지 않은 대조 그룹 의 1마리가 어느 날 39.1℃인 것을 제외하고는 모두 39℃ 이하였다. 백신접종 후 제조된 백혈구연층 시료도 바이러스 존재에 대해 전술한 바와 같이 분석했다. 이 실험에서는 동물 20마리 중 5마리만이 감염 후 4 내지 8일 후에 1 또는 2일 동안 혈액에 바이러스를 함유한 것으로 관찰되었다(표 3.6).

[표 3.5]

[표 3.6]

면역형광 염색법: 코드 4

□ 시료 음성

+ 시료 양성

B 웰에 세균 오염

동물 번호 코드:

⁽¹⁾ BVDV XIKE-B(RNase 돌연변이체) 백신접종

⁽²⁾ BVDV XIKE-B-NdN(RNase 및 N^pro 이중 돌여변이체) 백신접종

백신접종 4주 후, 동물 수정을 실시했다. 항원투여 감염은 BVDV-1 균주(BVDV KE-9, 이종 항원투여, XIKE-B 백신접종된 동물) 또는 이종 BVDV-2 균주(BVDV KE-13, 동종 항원투여, XIKE-B-NdN 백신접종된 동물)(의도 투여량: 10⁵ TCID50 6ml, 역적정은 표 3.7에 정리한 바와 같다)를 사용하여 60일 내지 90일 후에 실시했다. 백신접종된 동물 각 그룹 중에서 5마리 임신한 암소를 항원투여 감염을 위해 무작위로 선발했다. BVDV XIKE-B 백신접종된 동물은 BVDV-1 균주 KE-9로 항원투여하고, BVDV XIKE-B/NdN 백신접종된 암소는 BVDV-2 KE-13으로 항원투여했다. 또한, 백신접종하지 않은 대조군 동물 2마리는 각 항원투여 바이러스로 감염시켰다.

연구 번호/Id: B01 BIVE020/BVDV Tu XIKE-B-NdN; 태아 방어 연구

[표 3.7]

시료 1: 접종물 스톡

시료 2: 안정화 후 접종물 스톡

시료 3: 과량의 접종물

^* KE9 2차 접종, 시료 2는 세포 사망으로 인해 해독이 불가능했다.

^** KE9, 시료 3은 세포 사망 또는 세균 오염으로 인해 해독이 불가능했다.

^*** KE13 1차 접종, 시료 3은 세균 오염으로 인해 해독이 불가능했다.

백신접종된 동물은 항원투여 감염 시 바이러스혈증 또는 임상 증후군을 나타내지 않았다. 항원투여는 백신접종되지 않은 대조군이 모두 BVDV 양성이었는 바 성공적이었다(표 3.8). 대조군에서는 약한 질병 징후만이 관찰되었다. 백혈구 세포 수는 거의 정상이었다(제시하지 않음).

[표 3.8]

면역형광 염색법: 코드 4

□ 시료 음성

+ 시료 양성

B 웰에 세균 오염

동물 번호 코드:

⁽¹⁾ BVDV XIKE-B(RNase 돌연변이체) 백신접종

⁽²⁾ BVDV XIKE-B-NdN(RNase 및 N^pro 이중 돌여변이체) 백신접종

⁽³⁾ 백신접종되지 않은 대조군

혈청 중화 역가는 접종 전, 접종 후 1개월 후, 항원투여 전, 항원투여 1개월 후 및 연구 종결 시에 측정했다. 모든 동물의 혈청은 KE9 및 NY93/C(1456Nase)에 대한 중화 항체에 대해 3회 시험하고, 최종 희석물을 간접 면역형광 염색법으로 판독했다. 결과는 약 100 TCID₅₀을 중화시키고 케버(Kaerber)법으로 계산된 최종 희석률로서 나타냈다. 더 높은 항체 역가 일부에서는 사용된 최종 희석률이 그다지 높지 않았다. KE9에 대하여 XIKE-B 백신접종된 동물은 유일하게 약 4주부터 낮은 항체 역가를 발생시켰다. 항원투여 시, 모든 동물은 항체 역가를 나타냈고, 항원투여 4주경부터 상당히 증가되었다. XIKE-B 백신접종된 동물은 XIKE-B-NdN 백신접종된 동물보다 높은 항체 역가를 나타냈다. 모든 동물은 백신접종 4주 후에 NY93/C에 대한 거의 동일한 중화 역가를 발생시켰고, XIKE-B-NdN 백신접종된 동물에서 최저 역가가 나타났다. 항원투여 후, 모든 동물은 높은 항체 역가를 나타냈다. 도 2는 KE9(BVDV-1)에 대한 혈청 중화 분석을 도시한 것이고, 도 3은 NY93/C(BVDV-2)에 대한 혈청 중화 분석을 도시한 것이다.

연구 종결 시 태아로부터 수득한 조직 시료의 분석 결과, 백신접종된 동물에서 수득된 시료는 음성 결과를 나타내는 반면 대조 동물 4마리에서 모두 전파가 발생된 것으로 확인되었다(표 3.9). 즉, 확립된 BVDV-2 돌연변이는 효율적인 교차 방어 백신 바이러스로서 매우 적합하다는 것이 분명하다.

[표 3.9]

NA = 유효하지 않음.

^* 암소 1218번의 자궁에서는 태아가 발견되지 않았다.

^** 자궁내막(조직 검사를 위해 수집함)

^*** BFA 튜빙겐으로 보내지 않은 시료

동물 번호 코드:

⁽¹⁾ BVDV XIKE-B(RNase 돌연변이체) 백신접종

⁽²⁾ BVDV XIKE-B-NdN(RNase 및 N^pro 이중 돌연변이체) 백신접종

⁽³⁾ 백신접종되지 않은 대조군

결론

항원투여는 백신접종되지 않은 대조군이 모두 BVDV 바이러스혈증이고 백신접종되지 않은 대조군의 태아가 모두 BVDV 양성이었는 바 성공적이었다.

두 분리체는 본 시험 및 분석 조건 하에서 완전한 방어를 부여했다. 단독 유전자 마커를 보유한 분리체 XIKE-B는 항원투여 후 BVD 바이러스혈증 및 태아로의 전파를 통해 타입 1 BVDV 항원투여에 대하여 교차방어하는 것을 알 수 있었다. 이중 유전자 마커를 보유한 분리체 XIKE-B-NdN은 항원투여 후 BVD 바이러스혈증 및 태아로의 전파를 통해 이종 타입 2 BVDV 항원투여에 대하여 완전히 방어할 수 있었다.

1. 분리체 XIKE-B(타입 2 분리체)는 본 시험 및 분석 조건 하에서 항원투여 후 BVD 바이러스혈증 및 태아로의 전파를 통해 타입 1 BVDV 항원투여에 대하여 교차 방어하는 것으로 나타났다(n=4).

2. 분리체 XIKE-B-NdN(타입 2 분리체)는 본 시험 및 분석 조건 하에서 항원투여 후 BVD 바이러스혈증 및 태아로의 전파를 통해 이종 타입 2 BVDV 항원투여에 대하여 완전히 방어했다(n=5).

실시예 4

N ^pro 돌연변이체의 구축

N^pro 결실된 BVDV-2 돌연변이체의 추가 분석. 게놈의 N^pro 암호화 영역이 결실된 다른 돌연변이체를 구축했다. 먼저, 순수 결실 또는 점 돌연변이를 수반한 결실을 도입시켰다.

A: [N^pro]₁-[C 말단];

B: [N^pro]₃-[C 말단];

C: [N^pro]₄-[C 말단];

D: [N^pro]₆-[C 말단];

E: [N^pro]₄-[C 말단^*]

상기 식에서, [N^pro]_x는 변이된 다단백질 아미노산에 남아 있는 N^pro의 아미노말단 잔기 수를 나타내고, [C 말단]은 N^pro를 제외한 완전한 다단백질이며(C 단백질 에서 시작해서 NS5B로 끝난다), [C 말단^*]은 [C 말단]과 동일하나 C 단백질의 2번 위치에 돌연변이(D 대신에 N)를 보유한 것이다.

회수된 바이러스의 증식률은 야생형 XIKE-A 또는 RNase 음성 돌연변이체 XIKE-B에 비해 상당히 낮았다. 이러한 현상에 대하여 2가지 설명이 가능하다: (1) 바이러스 균주에 따라 N^pro 암호화 영역 중 다양한 길이의 서열이 효과적인 해독 개시에 필수적이다(Myers et al., 2001; Tautz et al., 1999); (ii) 캡시드 단백질의 아미노말단과 추가 서열의 융합은 캡시드 단백질 기능을 방해한다.

N^pro 결실 돌연변이의 증식 속도를 높이기 위하여, N^pro 유전자의 대부분 대신에 소 LC3 암호화 서열의 단편 또는 소 유비퀴틴 유전자를 사용하여 제2 돌연변이 세트를 제조했다. 이들 작제물은 효과적인 해독을 허용하고 정확한 아미노 말단을 보유한 캡시드 단백질을 생성했다.

[N^pro]₂₂-[PS]-[C 말단]

(여기서, PS는 유비퀴틴 또는 LC3이고, C 말단은 N^pro을 제외한 전체 다단백질(C 단백질부터 NS5B까지)이다.

이러한 돌연변이체의 증식률은 XIKE-A와 매우 유사했다. 식 [N^pro]₂₂-[PS]-[C 말단]에 따른 두 RNase 양성 바이러스, V-pK87F 및 V-pK87G는 심지어 증식 지연을 전혀 나타내지 않는 것으로 보인 반면, Rnase 음성 상응체인 V-pK88G는 또 다시 앞 서 기술된 돌연변이보다는 적은 정도지만 전파가 다소 방해되었다.

N^pro 결실 돌연변이체의 또 다른 예는 다음과 같다:

ME SDEGSK...

MELFS SDEGSK...

MELFSNE SDEGSK...

MELFSNEL SDEGSK...

MELFSNELL SDEGSK...

MELFSNELLY SDEGSK...

MELFSNELLYK SDEGSK...

MELFSNELLYKT SDEGSK...

MELFSNELLYKT는 BVDV 분리체 New York93/C의 N^pro의 아미노말단 서열이다.

또한, 이 서열에 하나 또는 여러 돌연변이를 보유한 변이체를 사용할 수도 있다. 특히 다른 페스티바이러스에서 발견되듯이 자연 발생의 변이는 기능성인 것으로 예상된다. 따라서, N^pro의 아미노말단 단부의 여러 부분을 보유한 시험 또는 제안된 변이체의 전체 목록은 아미노산 교환이 있는 동등 세트까지도 포함할 수 있다. 다음은 여러 페스티바이러스들에 대한 각 서열의 전형적인 예를 제시한 것이지만 가능한 변이가 이들 예에만 국한되는 것은 아니다.

즉, 이러한 변이체에는 예컨대 다음과 같은 것이 포함될 수 있다:

이러한 식들은 또한 [PS]₁을 보유할 수 있다. 즉 PS는 전술한 PS 중 하나일 수 있다. N^pro 단백질에 속하는 서열은 이탤릭체로 표시했다. BVDV New York93/C의 서열과 관련한 아미노산 교환은 진하게 표시했다.

또 다른 예는 문헌[Becher et al., 2003]에 제시된 GenBakn 수탁 번호를 사용하거나 또는 표준 서열 데이터 검색을 통해 찾을 수 있다.

또한, (잔여) N^pro 서열과 캡시드 단백질의 아미노말단 사이에 삽입된 프로세 싱 시그널(PS)의 사용도 가능할 수 있다. PS는 기능성 캡시드 단백질을 생산하는 절단 부위를 유도한다. 이러한 작제물의 형태는 다음과 같을 수 있다:

[N^pro]₂₂-PS[C 말단]

PS: 프로세싱 시그널. 이것은 프로테아제의 표적이거나(예컨대, 유비퀴틴, 본 명세서에 명시된 바와 같은 LC3), 또는 자신의 카복시말단의 프로세싱을 유도하는 프로테아제 또는 불안정한 펩타이드, 예컨대 인테인(Chong et al., 1998 및 여기에 인용된 문헌) 또는 피코나바이러스의 3C, 카디오바이러스 또는 아프토바이러스의 2A, 토끼 출혈병 바이러스의 p15 또는 다른 칼리시바이러스의 상응 프로테아제(Proter 1993, 및 여기에 인용된 문헌; Meyers et al., 2000 및 여기에 인용된 문헌)의 표적일 수 있다.

PS를 사용하면 PS가 캡시드 단백질 C의 정확한 아미노 말단이 생성되게 해주는 바 다수의 다른 변이체가 가능하다. 즉, PS 작제물을 사용하면 N^pro 서열의 모든 종류의 결실 또는 돌연변이가 판독 프레임이 이동되지 않거나 프레임 종결 코돈에 의해 해독이 정지되지 않는 한 생육성 돌연변이체가 제공될 것으로 예상된다. 일 예로서, 다음 식에 따른 생육성 CSFV N^pro 결실 돌연변이체를 구축했다.

[N^pro]₂₉-PS[C 말단]

특히 흥미로운 것은 단백질의 단백분해 활성을 차단하는 N^pro 돌연변이이다. 루메나프 등(Rumenapf et al., 1998)은 CSFV 알포트 튜빙겐의 프로테아제의 활성 부위 잔기를 동정했다. 각 아미노산(위치 22의 글루탐산, 위치 49의 히스티딘 및 위치 69의 시스테인)은 다른 페스티바이러스에서도 보존성이었다. 즉, 위치 69에 시스테인 대신에 세린이나 트레오닌 등의 임의의 아미노산 교환은 프로테아제 활성을 파괴할 것이다. 이와 마찬가지로, 위치 22의 글루탐산의 변화도 새 아미노산이 아스파르트산이 아닌 한 프로테아제를 불활성화시킬 가능성이 크다. 또한, 위치 49에서의 대부분의 교환도 불활성 프로테아제를 유도할 것이다.

참조문헌

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Sequence: Mutated BVDV: XIKE- A-NdN <400> 2 gtatacgaga ttagctaaag aactcgtata tggattggac gtcaacaaat ttttaattgg 60 caacgtaggg aaccttcccc tcagcgaagg ccgaaaagag gctagccatg cccttagtag 120 gactagcaaa agtaggggac tagcggtagc agtgagttcg ttggatggcc gaacccctga 180 gtacagggga gtcgtcaatg gttcgacact ccattagtcg aggagtctcg agatgccatg 240 tggacgaggg catgcccacg gcacatctta acccatgcgg gggttgcatg ggtgaaagcg 300 ctattcgtgg cgttatggac acagcctgat agggtgtagc agagacctgc tattccgcta 360 gtaaaaactc tgctgtacat ggcacatgga gttgttttcc gatgaaggga gcaagggtgc 420 tacaagtaag aagcagccta agccagatag gatagaaaaa ggtaagatga aaatagcccc 480 aaaagagaca gaaaaagatt gcaaaaccag accccccgac gcgactatag tagtagaagg 540 ggttaagtac caggtgaaga aaaaaggaaa ggtaagggga aaaaatactc aagatgggtt 600 atatcacaac aagaataagc cccctgaatc aagaaaaaaa ttggaaaagg cactgctggc 660 ttgggccatc ttagcagcgg tcctgcttca gctggtaaca ggagagaata tcacccagtg 720 gaacttgatg gacaacggca ccgagggaat acagcaagcg atgttcctaa gaggggtgaa 780 caggagtcta catggaattt ggccagagaa aatttgcacc 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Lys Val Ile Thr Ile Ile Lys 1295 1300 1305 Ala Ser Thr Leu Ser Lys Asn Arg His Cys Ile Ile Cys Thr Ile 1310 1315 1320 Cys Glu Gly Lys Glu Trp Asn Gly Ala Asn Cys Pro Lys Cys Gly 1325 1330 1335 Arg Gln Gly Lys Pro Ile Thr Cys Gly Met Thr Leu Ala Asp Phe 1340 1345 1350 Glu Glu Lys His Tyr Lys Lys Ile Phe Ile Arg Glu Glu Ser Ser 1355 1360 1365 Cys Pro Val Pro Phe Asp Pro Ser Cys His Cys Asn Tyr Phe Arg 1370 1375 1380 His Asp Gly Pro Phe Arg Lys Glu Tyr Lys Gly Tyr Val Gln Tyr 1385 1390 1395 Thr Ala Arg Gly Gln Leu Phe Leu Arg Asn Leu Pro Ile Leu Ala 1400 1405 1410 Thr Lys Met Lys Leu Leu Met Val Gly Asn Leu Gly Ala Glu Ile 1415 1420 1425 Gly Asp Leu Glu His Leu Gly Trp Val Leu Arg Gly Pro Ala Val 1430 1435 1440 Cys Lys Lys Ile Thr Asn His Glu Lys Cys His Val Asn Ile Met 1445 1450 1455 Asp Lys Leu Thr Ala Phe Phe Gly Ile Met Pro Arg Gly Thr Thr 1460 1465 1470 Pro Arg Ala Pro Val Arg Phe Pro Thr Ala Leu Leu Lys Val Arg 1475 1480 1485 Arg Gly Leu Glu Thr Gly Trp Ala Tyr Thr His Gln Gly Gly Ile 1490 1495 1500 Ser Ser Val Asp His Val Thr Ala Gly Lys Asp Leu Leu Val Cys 1505 1510 1515 Asp Ser Met Gly Arg Thr Arg Val Val Cys His Ser Asn Asn Lys 1520 1525 1530 Met Thr Asp Glu Thr Glu Tyr Gly Ile Lys Thr Asp Ser Gly Cys 1535 1540 1545 Pro Glu Gly Ala Arg Cys Tyr Val Leu Asn Pro Glu Ala Val Asn 1550 1555 1560 Ile Ser Gly Thr Lys Gly Ala Met Val His Leu Gln Lys Thr Gly 1565 1570 1575 Gly Glu Phe Thr Cys Val Thr Ala Ser Gly Thr Pro Ala Phe Phe 1580 1585 1590 Asp Leu Lys Asn Leu Lys Gly Trp Ser Gly Leu Pro Ile Phe Glu 1595 1600 1605 Ala Ser Ser Gly Arg Val Val Gly Arg Val Lys Val Gly Lys Asn 1610 1615 1620 Glu Asp Ser Lys Pro Thr Lys Leu Met Ser Gly Ile Gln Thr Val 1625 1630 1635 Ser Lys Asn Gln Thr Asp Leu Ala Asp Ile Val Lys Lys Leu Thr 1640 1645 1650 Ser Met Asn Arg Gly Glu Phe Lys Gln Ile Thr Leu Ala Thr Gly 1655 1660 1665 Ala Gly Lys Thr Thr Glu Leu Pro Arg Ser Val Ile Glu Glu Ile 1670 1675 1680 Gly Arg His Lys Arg Val Leu Val Leu Ile Pro Leu Arg Ala Ala 1685 1690 1695 Ala Glu Ser Val Tyr Gln Tyr Met Arg Val Lys Tyr Pro Ser Ile 1700 1705 1710 Ser Phe Asn Leu Arg Ile Gly Asp Met Lys Glu Gly Asp Met Ala 1715 1720 1725 Thr Gly Ile Thr Tyr Ala Ser Tyr Gly Tyr Phe Cys Gln Leu Pro 1730 1735 1740 Gln Pro Lys Leu Arg Ala Ala Met Val Glu Tyr Ser Tyr Ile Phe 1745 1750 1755 Leu Asp Glu Tyr His Cys Ala Thr Pro Glu Gln Leu Ala Ile Ile 1760 1765 1770 Gly Lys Ile His Arg Phe Ala Glu Asn Leu Arg Val Val Ala Met 1775 1780 1785 Thr Ala Thr Pro Ala Gly Thr Val Thr Thr Thr Gly Gln Lys His 1790 1795 1800 Pro Ile Glu Glu Phe Ile Ala Pro Glu Val Met Lys Gly Glu Asp 1805 1810 1815 Leu Gly Ser Glu Tyr Leu Asp Ile Ala Gly Leu Lys Ile Pro Thr 1820 1825 1830 Glu Glu Met Lys Gly Asn Met Leu Val Phe Ala Pro Thr Arg Asn 1835 1840 1845 Met Ala Val Glu Thr Ala Lys Lys Leu Lys Ala Lys Gly Tyr Asn 1850 1855 1860 Ser Gly Tyr Tyr Tyr Ser Gly Glu Asn Pro Glu Asn Leu Arg Val 1865 1870 1875 Val Thr Ser Gln Ser Pro Tyr Val Val Val Ala Thr Asn Ala Ile 1880 1885 1890 Glu Ser Gly Val Thr Leu Pro Asp Leu Asp Thr Val Val Asp Thr 1895 1900 1905 Gly Leu Lys Cys Glu Lys Arg Val Arg Ile Ser Ser Lys Met Pro 1910 1915 1920 Phe Ile Val Thr Gly Leu Lys Arg Met Ala Val Thr Ile Gly Glu 1925 1930 1935 Gln Ala Gln Arg Arg Gly Arg Val Gly Arg Val Lys Pro Gly Arg 1940 1945 1950 Tyr Tyr Arg Ser Gln Glu Thr Ala Ser Gly Ser Lys Asp Tyr His 1955 1960 1965 Tyr Asp Leu Leu Gln Ala Gln Arg Tyr Gly Ile Glu Asp Gly Ile 1970 1975 1980 Asn Val Thr Lys Ser Phe Arg Glu Met Asn Tyr Asp Trp Ser Leu 1985 1990 1995 Tyr Glu Glu Asp Ser Leu Met Ile Thr Gln Leu Glu Val Leu Asn 2000 2005 2010 Asn Leu Leu Ile Ser Glu Asp Leu Pro Ala Ala Val Lys Asn Ile 2015 2020 2025 Met Ala Arg Thr Asp His Pro Glu Pro Ile Gln Leu Ala Tyr Asn 2030 2035 2040 Ser Tyr Glu Asn Gln Ile Pro Val Leu Phe Pro Lys Ile Lys Asn 2045 2050 2055 Gly Glu Val Thr Asp Ser Tyr Glu Asn Tyr Thr Tyr Leu Asn Ala 2060 2065 2070 Arg Lys Leu Gly Glu Asp Val Pro Ala Tyr Val Tyr Ala Thr Glu 2075 2080 2085 Asp Glu Asp Leu Ala Val Asp Leu Leu Gly Met Asp Trp Pro Asp 2090 2095 2100 Pro Gly Asn Gln Gln Val Val Glu Thr Gly Arg Ala Leu Lys Gln 2105 2110 2115 Val Thr Gly Leu Ser Thr Ala Glu Asn Ala Leu Leu Ile Ala Leu 2120 2125 2130 Phe Gly Tyr Val Gly Tyr Gln Thr Leu Ser Lys Arg His Ile Pro 2135 2140 2145 Met Ile Thr Asp Ile Tyr Thr Leu Glu Asp His Arg Leu Glu Asp 2150 2155 2160 Thr Thr His Leu Gln Phe Ala Pro Asn Ala Ile Arg Thr Asp Gly 2165 2170 2175 Lys Asp Ser Glu Leu Lys Glu Leu Ala Val Gly Asp Leu Asp Lys 2180 2185 2190 Tyr Val Asp Ala Leu Val Asp Tyr Ser Lys Gln Gly Met Lys Phe 2195 2200 2205 Ile Lys Val Gln Ala Glu Lys Val Arg Asp Ser Gln Ser Thr Lys 2210 2215 2220 Glu Gly Leu Gln Thr Ile Lys Glu Tyr Val Asp Lys Phe Ile Gln 2225 2230 2235 Ser Leu Thr Glu Asn Lys Glu Glu Ile Ile Arg Tyr Gly Leu Trp 2240 2245 2250 Gly Val His Thr Ala Leu Tyr Lys Ser Leu Ala Ala Arg Leu Gly 2255 2260 2265 His Glu Thr Ala Phe Ala Thr Leu Val Val Lys Trp Leu Ala Phe 2270 2275 2280 Gly Gly Glu Thr Val Ser Ala His Ile Lys Gln Val Ala Val Asp 2285 2290 2295 Leu Val Val Tyr Tyr Ile Ile Asn Lys Pro Ser Phe Pro Gly Asp 2300 2305 2310 Thr Glu Thr Gln Gln Glu Gly Arg Arg Phe Val Ala Ser Leu Phe 2315 2320 2325 Ile Ser Ala Leu Ala Thr Tyr Thr Tyr Lys Thr Trp Asn Tyr Asn 2330 2335 2340 Asn Leu Gln Arg Val Val Glu Pro Ala Leu Ala Tyr Leu Pro Tyr 2345 2350 2355 Ala Thr Ser Ala Leu Lys Leu Phe Thr Pro Thr Arg Leu Glu Ser 2360 2365 2370 Val Val Ile Leu Ser Ser Thr Ile Tyr Lys Thr Tyr Leu Ser Ile 2375 2380 2385 Arg Lys Gly Lys Ser Asp Gly Leu Leu Gly Thr Gly Ile Ser Ala 2390 2395 2400 Ala Met Glu Ile Leu Asn Gln Asn Pro Ile Ser Val Gly Ile Ser 2405 2410 2415 Val Met Leu Gly Val Gly Ala Ile Ala Ala His Asn Ala Ile Glu 2420 2425 2430 Ser Ser Glu Gln Lys Arg Thr Leu Leu Met Lys Val Phe Val Lys 2435 2440 2445 Asn Phe Leu Asp Gln Ala Ala Thr Asp Glu Leu Val Lys Glu Asn 2450 2455 2460 Pro Glu Lys Ile Ile Met Ala Leu Phe Glu Ala Val Gln Thr Ile 2465 2470 2475 Gly Asn Pro Leu Arg Leu Ile Tyr His Leu Tyr Gly Val Tyr Tyr 2480 2485 2490 Lys Gly Trp Glu Ala Lys Glu Leu Ala Glu Lys Thr Ala Gly Arg 2495 2500 2505 Asn Leu Phe Thr Leu Ile Met Phe Glu Ala Phe Glu Leu Leu Gly 2510 2515 2520 Met Asp Ser Glu Gly Lys Ile Arg Asn Leu Ser Gly Asn Tyr Ile 2525 2530 2535 Leu Asp Leu Ile Phe Asn Leu His Asn Lys Leu Asn Lys Gly Leu 2540 2545 2550 Lys Lys Leu Val Leu Gly Trp Ala Pro Ala Pro Leu Ser Cys Asp 2555 2560 2565 Trp Thr Pro Ser Asp Glu Arg Ile Ser Leu Pro His Asn Asn Tyr 2570 2575 2580 Leu Arg Val Glu Thr Arg Cys Pro Cys Gly Tyr Glu Met Lys Ala 2585 2590 2595 Ile Lys Asn Val Ala Gly Lys Leu Thr Lys Val Glu Glu Lys Gly 2600 2605 2610 Ser Phe Leu Cys Arg Asn Arg Leu Gly Arg Gly Pro Pro Asn Phe 2615 2620 2625 Lys Val Thr Lys Phe Tyr Asp Asp Asn Leu Ile Glu Val Lys Pro 2630 2635 2640 Val Ala Arg Leu Glu Gly Gln Val Asp Leu Tyr Tyr Lys Gly Val 2645 2650 2655 Thr Ala Lys Leu Asp Tyr Asn Asn Gly Lys Val Leu Leu Ala Thr 2660 2665 2670 Asn Lys Trp Glu Val Asp His Ala Phe Leu Thr Arg Leu Val Lys 2675 2680 2685 Lys His Thr Gly Ile Gly Phe Lys Gly Ala Tyr Leu Gly Asp Arg 2690 2695 2700 Pro Asp His Gln Asp Leu Val Asp Arg Asp Cys Ala Thr Ile Thr 2705 2710 2715 Lys Asn Ser Val Gln Phe Leu Lys Met Lys Lys Gly Cys Ala Phe 2720 2725 2730 Thr Tyr Asp Leu Thr Ile Ser Asn Leu Val Arg Leu Ile Glu Leu 2735 2740 2745 Val His Lys Asn Asn Leu Gln Glu Arg Glu Ile Pro Thr Val Thr 2750 2755 2760 Val Thr Thr Trp Leu Ala Tyr Ser Phe Val Asn Glu Asp Leu Gly 2765 2770 2775 Thr Ile Lys Pro Val Leu Gly Glu Lys Val Ile Pro Glu Pro Pro 2780 2785 2790 Glu Glu Leu Ser Leu Gln Pro Thr Val Arg Leu Val Thr Thr Glu 2795 2800 2805 Thr Ala Ile Thr Ile Thr Gly Glu Ala Glu Val Met Thr Thr Gly 2810 2815 2820 Ile Thr Pro Val Val Glu Met Lys Glu Glu Pro Gln Leu Asp His 2825 2830 2835 Gln Ser Thr Thr Leu Lys Val Gly Leu Lys Glu Gly Glu Tyr Pro 2840 2845 2850 Gly Pro Gly Val Asn Pro Asn His Leu Ala Glu Val Ile Asp Glu 2855 2860 2865 Lys Asp Asp Arg Pro Phe Val Leu Ile Ile Gly Asn Lys Gly Ser 2870 2875 2880 Thr Ser Asn Arg Ala Arg Thr Ala Lys Asn Ile Arg Leu Tyr Lys 2885 2890 2895 Gly Asn Asn Pro Arg Glu Ile Arg Asp Leu Met Ser Gln Gly Arg 2900 2905 2910 Ile Leu Thr Val Ala Leu Lys Glu Leu Asp Pro Glu Leu Lys Glu 2915 2920 2925 Leu Val Asp Tyr Lys Gly Thr Phe Leu Asn Arg Glu Ala Leu Glu 2930 2935 2940 Ala Leu Ser Leu Gly Lys Pro Ile Lys Arg Lys Thr Thr Thr Ala 2945 2950 2955 Met Ile Arg Arg Leu Ile Glu Pro Glu Val Glu Glu Glu Leu Pro 2960 2965 2970 Asp Trp Phe Gln Ala Glu Glu Pro Leu Phe Leu Glu Ala Lys Ile 2975 2980 2985 Gln Asn Asp Leu Tyr His Leu Ile Gly Ser Val Asp Ser Ile Lys 2990 2995 3000 Ser Lys Ala Lys Glu Leu Gly Ala Thr Asp Asn Thr Lys Ile Val 3005 3010 3015 Lys Glu Val Gly Ala Arg Thr Tyr Thr Met Lys Leu Ser Ser Trp 3020 3025 3030 Ser Thr Gln Val Thr Lys Lys Gln Met Ser Leu Ala Pro Leu Phe 3035 3040 3045 Glu Glu Leu Leu Leu Lys Cys Pro Pro Cys Ser Lys Ile Ser Lys 3050 3055 3060 Gly His Met Val Ser Ala Tyr Gln Leu Ala Gln Gly Asn Trp Glu 3065 3070 3075 Pro Leu Gly Cys Gly Val Tyr Met Gly Thr Ile Pro Ala Arg Arg 3080 3085 3090 Leu Lys Ile His Pro Tyr Glu Ala Tyr Leu Lys Leu Lys Glu Leu 3095 3100 3105 Val Glu Val Glu Ser Ser Arg Ala Thr Ala Lys Glu Ser Ile Ile 3110 3115 3120 Arg Glu His Asn Thr Trp Ile Leu Arg Lys Val Arg His Glu Gly 3125 3130 3135 Asn Leu Arg Thr Lys Ser Met Ile Asn Pro Gly Lys Ile Ser Asp 3140 3145 3150 Gln Leu Cys Arg Asp Gly His Lys Arg Asn Ile Tyr Asn Lys Ile 3155 3160 3165 Ile Gly Ser Thr Met Ala Ser Ala Gly Ile Arg Leu Glu Lys Leu 3170 3175 3180 Pro Val Val Arg Ala Gln Thr Asp Thr Thr Ser Phe His Gln Ala 3185 3190 3195 Ile Arg Glu Lys Ile Asp Lys Thr Glu Asn Lys Gln Thr Pro Glu 3200 3205 3210 Leu His Glu Glu Leu Met Lys Val Phe Asp Cys Leu Lys Ile Pro 3215 3220 3225 Glu Leu Lys Glu Ser Tyr Asp Glu Val Ser Trp Glu Gln Leu Glu 3230 3235 3240 Ala Gly Ile Asn Arg Lys Gly Ala Ala Gly Tyr Leu Glu Ser Lys 3245 3250 3255 Asn Ile Gly Glu Val Leu Asp Thr Glu Lys His Ile Val Glu Gln 3260 3265 3270 Leu Ile Lys Asp Leu Arg Lys Gly Lys Lys Ile Arg Tyr Tyr Glu 3275 3280 3285 Thr Ala Ile Pro Lys Asn Glu Lys Arg Asp Val Ser Asp Asp Trp 3290 3295 3300 Glu Ala Gly Glu Phe Val Asp Glu Lys Lys Pro Arg Val Ile Gln 3305 3310 3315 Tyr Pro Asp Ala Lys Val Arg Leu Ala Ile Thr Lys Val Met Tyr 3320 3325 3330 Lys Trp Val Lys Gln Lys Pro Val Val Ile Pro Gly Tyr Glu Gly 3335 3340 3345 Lys Thr Pro Leu Phe Asp Ile Phe Asn Lys Val Lys Lys Glu Trp 3350 3355 3360 Asp Ser Phe Gln Asp Pro Val Ala Val Ser Phe Asp Thr Lys Ala 3365 3370 3375 Trp Asp Thr Gln Val Thr Ser Arg Asp Leu Met Leu Ile Lys Asp 3380 3385 3390 Ile Gln Lys Tyr Tyr Phe Lys Arg Ser Ile His Lys Phe Leu Asp 3395 3400 3405 Thr Ile Thr Glu His Met Val Glu Val Pro Val Ile Thr Ala Asp 3410 3415 3420 Gly Glu Val Tyr Ile Arg Asn Gly Gln Arg Gly Ser Gly Gln Pro 3425 3430 3435 Asp Thr Ser Ala Gly Asn Ser Met Leu Asn Val Leu Thr Met Ile 3440 3445 3450 Tyr Ala Phe Cys Lys Ser Thr Gly Ile Pro Tyr Arg Gly Phe Ser 3455 3460 3465 Arg Val Ala Arg Ile His Val Cys Gly Asp Asp Gly Phe Leu Ile 3470 3475 3480 Thr Glu Arg Gly Leu Gly Leu Lys Phe Ser Glu Lys Gly Met Gln 3485 3490 3495 Ile Leu His Glu Ala Gly Lys Pro Gln Lys Ile Thr Glu Gly Asp 3500 3505 3510 Lys Met Lys Val Ala Tyr Arg Phe Glu Asp Ile Glu Phe Cys Ser 3515 3520 3525 His Thr Pro Val Pro Val Arg Trp Ala Asp Asn Thr Ser Ser Tyr 3530 3535 3540 Met Ala Gly Arg Ser Thr Ala Thr Ile Leu Ala Lys Met Ala Thr 3545 3550 3555 Arg Leu Asp Ser Ser Gly Glu Arg Gly Ser Thr Ala Tyr Glu Lys 3560 3565 3570 Ala Val Ala Phe Ser Phe Leu Leu Met Tyr Ser Trp Asn Pro Val 3575 3580 3585 Val Arg Arg Ile Cys Leu Leu Val Leu Ser Gln Phe Pro Glu Ile 3590 3595 3600 Ser Pro Ser Lys Asn Thr Ile Tyr Tyr Tyr Gln Gly Asp Pro Ile 3605 3610 3615 Ala Ala Tyr Arg Glu Val Ile Gly Lys Gln Leu Cys Glu Leu Lys 3620 3625 3630 Arg Thr Gly Phe Glu Lys Leu Ala Gly Leu Asn Leu Ser Met Thr 3635 3640 3645 Thr Leu Gly Ile Trp Thr Lys His Thr Ser Lys Arg Leu Ile Gln 3650 3655 3660 Ala Cys Val Glu Ile Gly Lys Arg Glu Gly Thr Trp Leu Val Asn 3665 3670 3675 Ala Asp Arg Leu Ile Ala Gly Lys Thr Gly Lys Phe Tyr Ile Pro 3680 3685 3690 Ser Thr Gly Val Thr Leu Leu Gly Lys His Tyr Glu Glu Ile Asn 3695 3700 3705 Leu Lys Gln Lys Ala Ala Gln Pro Pro Ile Glu Gly Val Asp Arg 3710 3715 3720 Tyr Lys Leu Gly Pro Ile Val Asn Val Ile Leu Arg Arg Leu Arg 3725 3730 3735 Val Met Leu Met Thr Val Ala Ser Gly Ser Trp 3740 3745

Claims (40)

1. 당단백질 E^rns에 존재하는 RNase 활성이 상기 당단백질의 하나 이상의 아미노산의 결실, 삽입 돌연변이 및 치환 돌연변이로 이루어진 그룹으로부터 선택된 돌연변이에 의해 불활성화되고, N^pro에 존재하는 N^pro 활성이 상기 N^pro의 하나 이상의 아미노산의 결실, 삽입 돌연변이 및 치환 돌연변이로 이루어진 그룹으로부터 선택된 돌연변이에 의해 불활성화된 약독화 페스티바이러스(pestivirus).
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, RNase 활성이 당단백질의 하나 이상의 아미노산의 결실에 의해 불활성화되고 N^pro 활성이 N^pro의 하나 이상의 아미노산의 결실에 의해 불활성화된 약독화 페스티바이러스.
4. 제1항에 있어서, 페스티바이러스가 소 바이러스성 설사병 바이러스(BVDV)인 약독화 페스티바이러스.
5. 제4항에 있어서, RNase 활성이 위치 298 내지 310 또는 위치 341 내지 360 또는 위치 298 내지 310과 위치 341 내지 360의 아미노산의 결실, 삽입 돌연변이 및 치환 돌연변이로 이루어진 그룹으로부터 선택된 돌연변이에 의해 불활성화된 약독화 페스티바이러스.
6. 제4항 또는 제5항에 있어서, RNase 활성이 위치 349의 히스티딘의 결실 또는 치환에 의해 불활성화된 약독화 페스티바이러스.
7. 제1항, 제4항 또는 제5항 중 어느 한 항에 있어서, RNase 활성이 보존성 E^rns 서열 SLHGIWPEKICTG, 보존성 E^rns 서열 LQRHEWNKHGWCNWFHIEPW 또는 이들 둘다에 위치하는 결실, 삽입 돌연변이 및 치환 돌연변이로 이루어진 그룹으로부터 선택된 돌연변이에 의해 불활성화된 약독화 페스티바이러스.
8. 제1항, 제4항 또는 제5항 중 어느 한 항에 있어서, RNase 활성이 보존성 E^rns 서열 SLHGIWPEKIC, 보존성 E^rns 서열 RHEWNKHGWCNW 또는 이들 둘다에 위치하는 결실, 삽입 돌연변이 및 치환 돌연변이로 이루어진 그룹으로부터 선택된 돌연변이에 의해 불활성화된 약독화 페스티바이러스.
9. 제1항, 제4항 또는 제5항 중 어느 한 항에 있어서, RNase 활성이 보존성 E^rns 서열 SLHGIWPEKIC, 보존성 E^rns 서열 RHEWNKHGWCNW 또는 이들 둘다에 위치하는 결실, 삽입 돌연변이 및 치환 돌연변이로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개의 돌연변이에 의해 불활성화된 약독화 페스티바이러스.
10. 제1항, 제4항 또는 제5항 중 어느 한 항에 있어서, RNase 활성이 보존성 E^rns 서열 SLHGIWPEKIC 또는 RHEWNKHGWCNW에 위치하는 결실, 삽입 돌연변이 및 치환 돌연변이로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나의 돌연변이에 의해 불활성화된 약독화 페스티바이러스.
11. 제1항에 있어서, N^pro 활성이 다음 식으로 표시되는 암호화된 다단백질을 유도하는 돌연변이에 의해 불활성화된 약독화 페스티바이러스:

    [N^pro]_x-[PS]_y-[C 말단]

    이 식에서, [N^pro]는 상기 다단백질의 N^pro 부분을 의미하고, 여기서 "x"는 다단백질에 존재하는 N^pro의 아미노산 수를 의미하며;

    [PS]는 유비퀴틴, 미소관 결합 단백질의 경쇄 3(LC3; light chain 3 of microtubule-associated protein), 소형 유비퀴틴-관련 변형인자-1(SUMO-1; small ubiquitin-related modifier-1), 신경 전구세포에서 발현되는 발달적으로 하향 조절되는 단백질 8(NEDD8; neural precursor cell-expressed developmentally down-regulated protein 8), 16kDa의 골지-연관 ATPase 인핸서(GATE-16; Golgi-associated ATPase Enhancer of 16 kDa), 감마-아미노부티르산 수용체 A형 수용체 연관 단백질(GABA(A)RAP; gamma-aminobutyric acid receptor type A receptor associated protein), 인테인, 피코나바이러스 3C, 카리도바이러스 2A, 또는 토끼 출혈병 바이러스의 p15로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 프로세싱 시그널을 의미하고;

    "Y"는 0일 수 있는데, 이는 프로세싱 시그널이 존재하지 않음을 의미하고, 또는 "Y"는 1일 수 있는데, 이는 하나의 프로세싱 시그널이 존재하는 것을 의미하며;

    [C 말단]은 N^pro를 제외한, 캡시드(C) 단백질 및 카복시말단 NS5B를 포함하는 상기 바이러스 다단백질에 존재하는 임의의 다른 단백질을 포함하는, 전체 바이러스 다단백질을 의미하고;

    "y"가 0인 경우, "x"는 0 내지 12(N^pro 특정 아미노산이 존재하지 않거나 N^pro의 1 내지 12개 아미노산이 존재하는 것을 의미한다)이고;

    "y"가 1인 경우, "x"는 0 내지 168(N^pro 특정 아미노산이 존재하지 않거나 N^pro의 1 내지 전체 168개 아미노산이 존재하는 것을 의미한다)이다.
12. 제11항에 있어서, N^pro 활성이 다음 식으로 표시되는 암호화된 다단백질을 유도하는 돌연변이에 의해 불활성화된 약독화 페스티바이러스:

    [N^pro]₁-[PS]₀-[C 말단]

    이 식에서, [N^pro], [PS] 및 [C 말단]에 대한 각 정의는 제11항에 정의된 바와 같다.
13. 제11항에 있어서, N^pro 활성이 다음 식으로 표시되는 암호화된 다단백질을 유도하는 돌연변이에 의해 불활성화된 약독화 페스티바이러스:

    [N^pro]₃-[PS]₀-[C 말단]

    이 식에서, [N^pro], [PS] 및 [C 말단]에 대한 각 정의는 제11항에 정의된 바와 같다.
14. 제11항에 있어서, N^pro 활성이 다음 식으로 표시되는 암호화된 다단백질을 유도하는 돌연변이에 의해 불활성화된 약독화 페스티바이러스:

    [N^pro]₄-[PS]₀-[C 말단]

    이 식에서, [N^pro], [PS] 및 [C 말단]에 대한 각 정의는 제11항에 정의된 바와 같다.
15. 제11항에 있어서, N^pro 활성이 다음 식으로 표시되는 암호화된 다단백질을 유도하는 돌연변이에 의해 불활성화된 약독화 페스티바이러스:

    [N^pro]₆-[PS]₀-[C 말단]

    이 식에서, [N^pro], [PS] 및 [C 말단]에 대한 각 정의는 제11항에 정의된 바와 같다.
16. 제11항에 있어서, N^pro 활성이 다음 식으로 표시되는 암호화된 다단백질을 유도하는 돌연변이에 의해 불활성화된 약독화 페스티바이러스:

    [N^pro]₄-[PS]₀-[C 말단^*]

    이 식에서, [C 말단^*]은 C 단백질에서 2번 위치의 아미노산이 D에서 N으로 교환된 [C 말단]이고, 이때 [C 말단]은 제11항에서 정의된 바와 같고,

    [N^pro]는 및 [PS]에 대한 각 정의는 제11항에 정의된 바와 같다.
17. 제11항에 있어서, N^pro 활성이 다음 식으로 표시되는 암호화된 다단백질을 유도하는 돌연변이에 의해 불활성화된 약독화 페스티바이러스:

    [N^pro]_x-[PS]₁-[C 말단]

    이 식에서, PS는 유비퀴틴 또는 LC3으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이고,

    [N^pro], [C 말단] 및 x에 대한 각 정의는 제11항에 정의된 바와 같다.
18. 제11항에 있어서, 바이러스가 BVDV이고, N^pro 활성이 다음 식으로 표시되는 암호화된 다단백질을 유도하는 돌연변이에 의해 불활성화된 약독화 페스티바이러스:

    M-[PS]₀-[C 말단];

    MEL-[PS]₀-[C 말단];

    MELF-[PS]₀-[C 말단];

    MELFS-[PS]₀-[C 말단];

    MELFSN-[PS]₀-[C 말단];

    MELFSNE-[PS]₀-[C 말단];

    MELFSNEL-[PS]₀-[C 말단];

    MELFSNELL-[PS]₀-[C 말단];

    MELFSNELLY-[PS]₀-[C 말단];

    MELFSNELLYK-[PS]₀-[C 말단];

    MELFSNELLYKT-[PS]₀-[C 말단];

    이 식들에서, [PS] 및 [C 말단]에 대한 각 정의는 제11항에 정의된 바와 같다.
19. 제11항에 있어서, 바이러스가 BVDV이고, N^pro 활성이 다음 식으로 표시되는 암호화된 다단백질을 유도하는 돌연변이에 의해 불활성화된 약독화 페스티바이러스:

    MELI-[PS]₀-[C 말단];

    MELIS-[PS]₀-[C 말단];

    MELISN-[PS]₀-[C 말단];

    MELISNE-[PS]₀-[C 말단];

    MELISNEL-[PS]₀-[C 말단];

    MELISNELL-[PS]₀-[C 말단];

    MELISNELLY-[PS]₀-[C 말단];

    MELISNELLYK-[PS]₀-[C 말단];

    MELISNELLYKT-[PS]₀-[C 말단];

    이 식들에서, [PS] 및 [C 말단]에 대한 각 정의는 제11항에 정의된 바와 같다.
20. 제11항에 있어서, 바이러스가 BVDV이고, N^pro 활성이 다음 식으로 표시되는 암호화된 다단백질을 유도하는 돌연변이에 의해 불활성화된 약독화 페스티바이러스:

    MELIT-[PS]₀-[C 말단];

    MELITN-[PS]₀-[C 말단];

    MELITNE-[PS]₀-[C 말단];

    MELITNEL-[PS]₀-[C 말단];

    MELITNELL-[PS]₀-[C 말단];

    MELITNELLY-[PS]₀-[C 말단];

    MELITNELLYK-[PS]₀-[C 말단];

    MELITNELLYKT-[PS]₀-[C 말단];

    이 식들에서, [PS] 및 [C 말단]에 대한 각 정의는 제11항에 정의된 바와 같다.
21. 제11항에 있어서, 바이러스가 BVDV이고, N^pro 활성이 다음 식으로 표시되는 암호화된 다단백질을 유도하는 돌연변이에 의해 불활성화된 약독화 페스티바이러스:

    [N^pro]_x-[PS]₀-MELF-[PS]₀-[C 말단^*]

    이 식에서, [C 말단^*]은 C 단백질의 2번 위치에 아미노산이 D에서 N으로 교환된 [C 말단]이고, 이때 [C 말단]은 제11항에서 정의된 바와 같고,

    [N^pro], [PS] 및 x에 대한 각 정의는 제11항에서 정의한 바와 같다.
22. 제11항에 있어서, N^pro 활성이 다음 식으로 표시되는 암호화된 다단백질을 유도하는 돌연변이에 의해 불활성화된 약독화 페스티바이러스:

    [N^pro]₂₂-[PS]₁-[C 말단]

    이 식에서, PS는 유비퀴틴 또는 LC3이고,

    [N^pro] 및 [C 말단]에 대한 각 정의는 제11항에서 정의한 바와 같다.
23. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, [PS]₀가 [PS]₁로 치환되고, 이러한 PS가 유비퀴틴, 미소관 결합 단백질의 경쇄 3(LC3; light chain 3 of microtubule-associated protein), 소형 유비퀴틴-관련 변형인자-1(SUMO-1; small ubiquitin-related modifier-1), 신경 전구세포에서 발현되는 발달적으로 하향 조절되는 단백질 8(NEDD8; neural precursor cell-expressed developmentally down-regulated protein 8), 16kDa의 골지-연관 ATPase 인핸서(GATE-16; Golgi-associated ATPase Enhancer of 16 kDa), 감마-아미노부티르산 수용체 A형 수용체 연관 단백질(GABA(A)RAP; gamma-aminobutyric acid receptor type A receptor associated protein), 인테인, 피코나바이러스 3C, 카리도바이러스 2A 및 토끼 출혈병 바이러스의 p15로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 약독화 페스티바이러스.
24. 제4항, 제5항 또는 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, BVDV 타입 1 또는 BVDV 타입 2로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 BVDV.
25. 제4항, 제5항 또는 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 8에 상응하는 BVDV.
26. 삭제
27. 삭제
28. 삭제
29. 삭제
30. 제1항, 제4항, 제5항 또는 제11항 내지 제22항 중 어느 한 항에 기재된 바이러스를 포함하는, 페스티바이러스 감염의 예방 및 치료용 백신 조성물.
31. 제30항에 있어서, 페스티바이러스가 소 바이러스성 설사병 바이러스(BVDV)인 백신 조성물.
32. 제4항, 제5항 또는 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 기재된 생 약독화 BVDV를 암호화하는 핵산을 함유하는 핵산 분자.
33. 제32항에 있어서, 뉴클레오타이드 분자가 DNA인 핵산 분자.
34. 제33항에 있어서, 뉴클레오타이드 분자가 RNA인 핵산 분자.
35. 당단백질 E^rns에 존재하는 RNase 활성을 상기 당단백질의 하나 이상의 아미노산의 결실, 삽입 돌연변이 및 치환 돌연변이로 이루어진 그룹으로부터 선택된 돌연변이에 의해 불활성화시키고, N^pro에 존재하는 N^pro 활성을 상기 N^pro의 하나 이상의 아미노산의 결실, 삽입 돌연변이 및 치환 돌연변이로 이루어진 그룹으로부터 선택된 돌연변이에 의해 불활성화시킴을 특징으로 하는, 페스티바이러스(pestivirus)의 약독화 방법.
36. 제35항에 있어서,

    a) 야생형 페스티바이러스 뉴클레오타이드 서열을 cDNA로 역전사하는 단계;

    b) 상기 cDNA를 클로닝하는 단계;

    c) 결실, 삽입 돌연변이, 치환 돌연변이 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 당단백질 E^rns 및 프로테아제 N^pro를 암호화하는 암호화 서열에 위치한 돌연변이를 상기 cDNA 중에 도입시키는 단계; 및

    d) 상기 cDNA를, 시험관내에서 또는 적당한 세포의 감염 시 페스티바이러스 cDNA를 RNA로 전사 유도할 수 있는 플라스미드 또는 DNA 바이러스 중에 혼입시키는 단계를 포함하는 약독화 방법.
37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 페스티바이러스가 BVDV인 약독화 방법.
38. 제4항, 제5항 또는 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 기재된 BVDV를, BVDV 원인 질병의 치료를 필요로 하는 사람을 제외한 동물에게 투여하고, 바이러스혈증, 백혈구감소증, 발열 및 설사로 이루어진 그룹으로부터 선택된 BVDV 감염 증상의 감소를 모니터함을 포함하는, 상기 BVDV 원인 질병의 치료방법.
39. 제30항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 추가로 포함하는 백신 조성물.
40. 제38항에 있어서, 상기 BVDV가 10² 내지 10⁸ TCID₅₀의 투여량으로 투여되는 방법.

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