BRPI0510396B1 - Pestivírus atenuado e seu uso, composição, molécula de ácido nucléico e método para atenuar pestivírus - Google Patents

Abstract

pestivírus atenuados, composições compreendendo os mesmos, seu uso, bem como molécula de ácido nucléico e métodos para atenuação de pestivírus. a presente invenção refere-se aos pestivírus atenuados, em particular ao bvdv atenuado, em que pelo menos uma mutação está na seqüência de codificação para glicoproteína erns e pelo menos outra mutação na seqüência de codificação para npro que preferivelmente leva à inativação combinada da atividade de rnase que reside na glicoproteína erns além da inativação da atividade imunomoduladora (sob hipótese) que reside na npro. a invenção também relaciona-se aos métodos para atenuar pestivírus como bvdv, ácidos nucléicos que codificam os ditos pestivírus, em particular bvdv, composições e vacinas compreendendo os pestivírus atenuados, em particular bvdv da invenção.

Description

Antecedentes da Invenção Campo Técnico

[0001] A presente invenção refere-se ao campo de saúde animal e em particular aos pestivírus atenuados como vírus de diarréia viral bovina (BVDV).

Informação Anterior

[0002] Pestivírus são agentes que causam doenças economicamente importantes de animais em muitos países no mundo. Presentemente, isolados de vírus conhecidos foram agrupados em quatro espécies diferentes que juntas formam um gênero dentro da família Fla- viviridae.

[0003] I / HVírus de diarréia viral bovina (BVDV) tipo 1 (BVDV-1) e tipo 2 (BVDV-2) causam diarréia viral bovina (BVD) e doença de mucosa (MD) em gado (Baker, 1987; Moennig e Plagemann, 1992; Thiel et al., 1996). A divisão de BVDV em 2 espécies é com base nas diferenças significativas no nível de sequências genômicas (resumidas em Heinz et al., 2000) que são também óbvias de reações de anticorpo de neutralização cruzada limitada (Ridpath et al. 1994).

[0004] IHVírus de febre suína clássica (CSFV), antigamente nome ada vírus de cólera de porco, é responsável por febre suína clássica (CSF) ou cólera de porco (HC) (Moennig e Plagemann, 1992; Thiel et al., 1996).

[0005] IWírus da doença de Border (BDV) é tipicamente encontrado em ovelha e causa doença de Border (BD). Após infecção intra-uterina de carneiros com BDV, carneiros persistentemente infetados podem ser ge-rados que são fracos e mostram anormalidades diferentes entre as quais a síndrome de 'sacudida de pêlo' é a melhor conhecida (Moennig e Pia-gemann, 1992; Thiel etal., 1996).

[0006] Pestivírus são virus com envelopes pequenos com urn ge- noma de RNA filamentado simples de polaridade positiva que carece de ambas as seqüências de 5'-cap e 3' poli(A). O genoma virai codifica para uma poliproteína de cerca de 4000 aminoácidos que dão origem aos produtos de clivagem finais através de processamento co- e pós- translacional que envolve proteases celulares e virais. As proteínas virais são dispostas na poliproteína na ordem NH2-Npro-C-Erns-E1-E2- p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH (Lindenbach e Rice, 2001). Proteína C (= proteína de núcleo ou capsídeo) e as glicoproteí- nas Erns, E1 e E2 representam componentes estruturais do virion de pestivírus como demonstrado para CSFV (Thiel et al., 1991). Isto é também verdadeiro para BVDV. E2 e em uma proporção menor Erns foram descobertas ser alvos para neutralização de anticorpos (Donis et al., 1988; Paton et al., 1992; van Rijn et al., 1993; Weiland et al., 1990, 1992). Erns carece de uma âncora de membrana típica e é segregada em quantidades consideráveis das células infetadas; esta proteína foi relatada exibir atividade de RNase (Hulst et al., 1994; Schneider et al., 1993; Windisch et al., 1996). A função desta atividade enzimática para o ciclo de vida virai é presentemente desconhecida. A atividade enzimática depende da presença de duas extensões de aminoácidos conservados entre as Erns de pestivírus e RNases conhecidas diferentes de origem vegetal e fúngica. Ambas estas seqüências conservadas contêm um resíduo de histidina (Schneider et al., 1993). Permuta de cada um destes resíduos contra lisina na proteína de Erns de uma cepa de vacina de CSFV resultou na destruição da atividade de RNase (Hulst et al., 1998). Introdução destas mutações no genoma da cepa de vacina de CSFV não influenciou a viabilidade virai ou as propriedades de crescimento mas levou a um vírus que exibe um fenó- tipo citopatogênico (Hulst et al., 1998). Similarmente, Meyers et al.mostrou que uma variante negativa de RNase da cepa de CSFV virulenta Alfort/Tübingen foi completamente viável. Porém, o respectivo mutante de vírus não mostrou nenhum fenótipo citopatogênico (Meyers et al., 1999).

[0007] Npro representa a primeira proteína codificada pela estrutura de leitura aberta longa no RNA de pestivírus. Npro representa uma proteína não-estrutural que tem atividade de protease e cliva por si só da poliproteína nascente (Stark et al., 1993; Wiskerchen et al., 1991) presumivelmente já durante a translação. Npro é uma cisteína protease (Rümenapf et al., 1998) que não é essencial para replicação do vírus (Tratschin et al., 1998). Recentemente, foi mostrado que Npro interfere de alguma maneira com a defesa antiviral celular de forma que pode ser levantada a hipótese dela modular o sistema imune dentro de um hospedeiro infetado (Rüggli et al., 2003). Mayer e co-colaboradores apresentaram indicações para uma atenuação de CSFV por causa de uma deleção do gene de Npro(Mayer et al., 2004).

[0008] As presentes vacinas de BVDV para a prevenção e tratamento de infecções de BVDV ainda têm inconvenientes (Oirschot et al. 1999). Vacinas contra o BVDV-1 clássico fornecem apenas proteção parcial de infecção por BVDV-2, e fêmeas vacinadas podem reproduzir bezerros que estão persistentemente infetados com BVDV-2 virulento (Bolin et al., 1991, Ridpath et al., 1994). Este problema provavelmente seja devido à grande diversidade antigênica entre cepas do tipo 1 e tipo 2 que são as mais pronunciadas na glicoproteína E2, o antígeno principal para neutralização do vírus (Tijssen et al., 1996). A maioria dos anticorpos monoclonais contra cepas do tipo 1 falha em ligar ao vírus do tipo 2 (Ridpath et al., 1994).

[0009] Vacinas compreendendo vírus atenuados ou mortos ou proteínas virais expressas em sistemas de expressão heteróloga foram geradas para CSFV e BVDV e são presentemente usadas. Vacinas mortas (vírus inteiro inativado) ou vacinas de subunidade (proteínas virais convencionalmente purificadas ou heterologamente expressas) são mais freqüentemente inferiores às vacinas vivas em sua eficácia para produzir uma resposta imune protetora total até mesmo na presença de adjuvantes.

[00010] A base estrutural da atenuação de BVDV usada como vacinas vivas não é conhecida. Estas vacinas, embora atenuadas, estão mais freqüentemente associadas aos problemas de segurança. Os vírus de vacina podem atravessar a placenta de animais em prenhez, por exemplo vacas, e levar a manifestações clínicas no feto e/ou à indução de bezerros persistentemente infetados. Portanto, elas não podem ser aplicadas em rebanhos de reprodução contendo vacas pre- nhas. Vacas prenhas têm que ser mantidas separadas do gado vacinado para proteger os fetos e não devem ser vacinadas. Além disso, reversores de BVDV de vida atenuada apresenta uma ameaça séria aos animais. Para vírus atenuados convencionalmente derivados em que a atenuação é alcançada através de passagem múltipla convencional, a origem molecular como também a estabilidade genética da atenuação permanece desconhecida e a reversão para o tipo selvagem virulento é imprevisível.

[00011] Por causa da importância de uma profilaxia e tratamento eficaz e seguro como também detectável de infecções pestivirais, há uma necessidade forte por pestivírus atenuados melhorados, como BVDV, com um potencial alto para indução de imunidade como também uma base definida de atenuação que pode também ser distinguida dos pestivírus patogênicos, como BVDV, como também composições e vacinas compreendendo os ditos pestivírus atenuados, como BVDV.

[00012] Portanto, o problema técnico subjacente à presente invenção é fornecer pestivírus atenuado melhorado, em referência um BVDV atenuado para o uso como vacinas vivas atenuadas. Tal pestivírus atenuado melhorado, preferivelmente BVDV, especialmente deve (i) não cruzar placenta por si só e (ii) induzir uma imunidade que impede a transmissão virai ao longo da placenta e assim impede os problemas de prenhez como aborto do feto ou nascimento de hospedeiro persistentemente infetado como bezerros no caso de infecção por BVDV.

Breve Descrição dos Desenhos

[00013] A figura 1 neutralização de soro contra NY93/C (BVDV tipo II)

[00014] A figura 2 ensaio de neutralização de soro contra KE9 (BVDV tipo I)

[00015] A figura 3 ensaio de neutralização de soro contra NY93/C (BVDV tipo II)

[00016] Todas as Seqüências subseqüentes são a apresentação das regiões deletadas indicadas com hífens (-), que são também numeradas, enquanto que as seqüências na listagem de seqüência anexada aqui são continuamente numeradas sem as regiões deletadas ou códons de aminoácido. SEQ ID NO: 1 seqüência de XIKE-A-cDNA SEQ ID NO: 2seqüência de XIKE-A-NdN-cDNA SEQ ID NO: 3seqüência de XIKE-B-cDNA SEQ ID NO: 4XIKE-B-NdN-cDNA SEQ ID NO: 5seqüência de aminoácido de XIKE-AA SEQ ID NO: 6seqüência de aminoácido de XIKE-A-NdN SEQ ID NO: 7seqüência de aminoácido XIKE-B SEQ ID NO: 8seqüência de aminoácido XIKE-B-NdN SEQ ID NO: 9seqüência de aminoácido XIKE-C-NdN SEQ ID NO: 10seqüência de XIKE-C-NdN-cDNA SEQ ID NO: 11 seqüência de XIKE-C-cDNA SEQ ID NO: 12seqüência de aminoácido XIKE-C

Breve Sumário da Invenção

[00017] A presente invenção refere-se aos pestivírus atenuados, preferivelmente para BVDV atenuado, em que pelo menos uma mutação está na seqüência de codificação para a glicoproteína Ems e pelo menos outra mutação na seqüência de codificação para Npro que preferivelmente levam à inativação combinada da atividade de RNase que reside na glicoproteína Erns além da inativação da atividade imunomo- duladora (sob hipótese) que reside em Npro. A invenção também refe- re-se aos métodos para atenuar pestivírus de modo que a atenuação resulte em um pestivírus atenuado, preferivelmente em um BVDV atenuado, como descrito acima. A presente invenção refere-se além disso às moléculas de ácidos nucléicos para codificar os ditos pestivírus atenuados, preferivelmente codificando BVDV atenuado, composições e vacinas compreendendo o pestivírus atenuado, preferivelmente BVDV como descrito aqui.

Descrição Detalhada da Invenção Definições dos Termos Usados na Descrição:

[00018] Antes das modalidades da presente invenção, deve ser observado que como aqui usado e nas reivindicações em anexo, as formas singulares "um", "uma", e "o/a" incluem referência plural a menos que o contexto dite claramente o contrário. Desse modo, por exemplo, referência a "um BVDV" inclui uma pluralidade de tal BVDV, referência à "célula" é uma referência a uma ou mais células e equivalentes destas conhecido a aqueles versados na técnica, e assim sucessivamente. A menos que do contrário definido, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm os mesmos significados como comumente entendido por alguém versado na técnica ao qual esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes a aqueles descritos aqui possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, os métodos, dispositivos e materiais preferidos são agora descritos. Todas as publicações mencionadas aqui são incorporadas aqui por referência para o propósito de descrever as linhagens celulares, vetores e metodologias como relatados nas publicações que poderiam ser usadas com relação à invenção. Nada aqui será interpretado como uma admissão que a invenção não é intitulada para antecipar tal descrição em virtude da invenção anterior.

[00019] O termo "pestivírus" como aqui usado refere-se a todos os membros do gênero Pestivírus, incluindo BVDV, CSFV e BDV, dentro da família Flaviviridae.

[00020] O termo "CSFV" como aqui usado refere-se a todos os vírus que pertencem às espécies de vírus de febre suína clássica (CSFV) no gênero Pestivírus dentro da família Flaviviridae.

[00021] O termo "BVDV" como aqui usado refere-se a todos os vírus que pertencem às espécies de vírus de diarréia viral bovina (BVDV) tipo 1 (BVDV-1) e BVDV tipo 2 (BVDV-2) no gênero Pestivírus dentro da família Flaviviridae (Heinz et al., 2000). As cepas de BVDV tipo 1 mais clássicas e as cepas de BVDV tipo 2 recentemente reconhecidas exibem algumas diferenças limitadas mas distintivas nas se- qüências de nucleotídeo e de aminoácido.

[00022] O termo "Npro" como entendido aqui diz respeito à primeira proteína codificada pela estrutura de leitura aberta virai e se cliva do resto da poliproteína sintetizada (Stark, et al., J. Virol. 67:7088-7093 (1993); Wiskerchen, et al., Virol. 65:4508-4514 (1991)). O dito termo, dependendo do contexto, pode também estar relacionado aos amino- ácidos "Npro" restantes após a mutação da seqüência de nucleotídeo de codificação ou à seqüência de nucleotídeo de codificação para a dita proteína em si. "Atividade de protease que reside em Npro" diz respeito à atividade de clivagem de polipeptídeo do dito "Npro".

[00023] "Erns" como aqui usado diz respeito à glicoproteína Erns que representa um componente estrutural do virion de pestivírus (Thiel et al., 1991). Erns carece de uma âncora de membrana típica e é segregada em quantidades consideráveis das células infetadas; esta proteína foi relatada exibir atividade de RNase (Hulst et al., 1994; Schneider et al., 1993; Windisch et al., 1996). Deveria ser observado que o termo glicoproteína EO é freqüentemente de forma sinônima usado para glicoproteína Erns nas publicações. O dito termo, dependendo do contexto, pode também estar relacionado à proteína de "Ems" mutada após a mutação da seqüência de nucleotídeo de codificação ou à seqüência de nucleotídeo de codificação para a dita proteína em si. "Atividade de RNase que reside na glicoproteína Erns" diz respeito à atividade de clivagem de RNA da dita glicoproteína, isto é a capacidade da glicoproteína Erns de hidrolisar RNA. O termo "inativação da atividade de RNase que reside na dita glicoproteína"refere-se à incapacidade ou capacidade reduzida de uma glicoproteína modificada Ems para hidrolisar RNA quando comparada ao tipo selvagem inalterado da dita glicoproteína Erns.

[00024] Atenuação: "Uma partícula de pestivírus ou de BVDV atenuadas" como aqui usado significa que há uma diferença estatisticamente significativa entre a virulência das partículas de pestivírus ou de BVDV atenuadas da presente invenção, em que as ditas partículas virais atenuadas são atenuadas por um método descrito aqui, e isolados de pestivírus do tipo selvagem ou de BVDV dos quais as ditas partículas de pestivírus ou BVDV atenuadas foram derivadas, pelos parâmetros clínicos predominantes, no caso de BVDV para diarréia, pire- xia e letalidade em animais infetados com a mesma dose, preferivelmente 6X1O6TCID5O- Desse modo, as ditas partículas de BVDV atenuadas não causam diarréia, pirexia e letalidade e desse modo podem ser usadas em uma vacina.

[00025] Inativação de Erns como aqui usado significa atividade de RNase não significativamente acima do nível medido para células de controle não-infectadas em um ensaio de RNase como descrito em Meyers et al., 1999. "Não significativamente acima do nível medido para células de controles não-infectadas em um ensaio de RNase como descrito em Meyers et al., 1999, significa por exemplo, que a atividade de RNase é menor que 150 % comparada às células de controle não-infectadas.

[00026] Inativação de Npro como aqui usado significa a prevenção ou redução considerável da atividade imunomoduladora provável de Npro através de mutação. Em uma modalidade preferida esta mutação impede ou consideravelmente reduz a interferência de Npro com a indução de uma resposta de interferona pelas células infetadas como descrito por Rüggli et al., (2003). Neste caso, a inativação de Npropermitiria a célula montar uma resposta de interferona normal.

[00027] "Sinal de processamento" como aqui usado diz respeito a uma substância que assegura a geração de um N-terminal funcional da proteína C do pestivírus, preferivelmente em particular de BVDV, uma substância selecionada do grupo de ubiquitina, LC3, SUMO-1, NEDD8, GATE-16 e GABA(A)RAP. Também proteases selecionadas do grupo de Inteína, picornavírus 3C, caridovírus 2A e p15 do vírus de doença hemorrágica de coelho são entendidas como "sinais de processamento" como aqui usado. Qualquer outro sinal de processamento similar conhecido à pessoa versada que assegura a geração de um N-terminal funcional da proteína C deve também ser compreendido no termo "sinal de processamento".

[00028] "Proteína C" ou "C proteína" ou "proteína-C" como aqui usado diz respeito a um componente estrutural do virion de pestivírus (Thiel et al., 1991). "Proteína C" é a proteína de capsídeo ou de núcleo dos pestivírus. O dito termo, dependendo do contexto, pode também estar relacionado à "Proteína C" com uma ou várias permutas de ami- noácidos resultantes da mutação da seqüência de nucleotídeo de codificação.

[00029] Um "fragmento" de acordo com a invenção é qualquer su- bunidade de uma molécula de polinucleotídeo de acordo com a invenção, isto é qualquer subconjunto. Para o DNA, o dito fragmento é caracterizado em que é mais curto que o DNA que abrange o genoma viral de comprimento total.

[00030] Uma "variante funcional" da molécula de nucleotídeo de acordo com a invenção é uma molécula de nucleotídeo que possui uma atividade biológica (funcional ou estrutural) que é substancialmente similar à molécula de nucleotídeo de acordo com a invenção. O termo "variante funcional" também inclui "um fragmento", "uma variante funcional", "variante com base no código de ácido nucléico degenerativo" ou "derivado químico". Uma tal "variante funcional" por exemplo pode carregar uma ou várias permutas, deleções ou inserções de nucleotídeo. A dita variante funcional pelo menos parcialmente retém sua atividade biológica, por exemplo funciona como um clone infeccioso ou uma cepa de vacina, ou até mesmo exibe atividade biológica melhorada. "Possui uma atividade biológica que é substancialmente similar" significa com respeito aos pestivírus fornecidos com ela, por exemplo, que o dito pestivírus é atenuado de uma maneira descrita aqui e resulta em um vírus não-patogênico adequado para a produção de vírus atenuado vivo, cuja perde capacidade de atravessar a placenta mas medeia uma resposta imune após a vacinação.

[00031] Uma "variante com base na natureza degenerativa do código genético" é uma variante que é o resultado do fato que um certo aminoácido pode ser codificado através de vários tripletos de nucleotídeo diferentes. A dita variante pelo menos parcialmente retém sua atividade biológica, ou até mesmo exibe atividade biológica melhorada.

[00032] Uma molécula é "substancialmente similar" a outra molécu- la se ambas as moléculas tiverem as seqüências de nucleotídeo ou atividade biológica substancialmente similar(es). Desse modo, contanto que duas moléculas possuam uma atividade similar, elas são consideradas variantes como aquele termo é aqui usado se a seqüência de nucleotídeo não for idêntica, e duas moléculas tendo uma seqüência de nucleotídeo similar são consideradas variantes como aquele termo é aqui usado até mesmo se sua atividade biológica não for idêntica.

[00033] Uma mutação, como aqui usado, diz respeito às modificações nas moléculas de ácido nucléico que codificam as proteínas / aminoácidos de acordo com a invenção. As ditas mutações dizem respeito, mas não são limitadas a substituições (substituição de um ou vários pares de nucleotídeos/base), deleções (remoção de um ou vários pares de nucleotídeos/base) e/ou inserções (adição de um ou vários pares de nucleotídeos/base). Como aqui usado, mutação pode ser uma única mutação ou várias mutações, portanto, freqüentemente o termo "mutação(ões)" é usado e diz respeito a uma única mutação e várias mutações. As ditas mutações incluem, mas não são limitadas a mutações de ponto (mutações de nucleotídeo simples) ou mutações maiores em que por exemplo partes das moléculas de ácido nucléico de codificação são deletadas, substituídas e/ou o ácido nucléico de codificação adicional é inserido. As ditas mutações podem resultar em um polipeptídeo expresso modificado devido à alteração na seqüência de codificação. Tais polipeptídeos modificados são desejados, como exposto na revelação da invenção como exposta abaixo.

[00034] O termo "vacina" como aqui usado refere-se a uma composição farmacêutica que compreende pelo menos um componente imu- nologicamente ativo que induz uma resposta imunológica em um animal e possivelmente mas não necessariamente um ou mais componentes adicionais que intensificam a atividade imunológica do dito componente ativo. Uma vacina pode compreender outros componentes adicionalmente típicos para as composições farmacêuticas. O componente imunologicamente ativo de uma vacina pode compreender partículas de vírus completas ou em sua forma original ou como partículas atenuadas em uma assim chamada vacina viva modificada (MLV) ou partículas inativadas por métodos apropriados em uma assim chamada vacina morta (KV). Em outra forma o componente imunologicamente ativo de uma vacina pode compreender elementos apropriados dos ditos organismos (vacinas de subunidade) por meio do qual estes elementos ou são gerados destruindo a partícula inteira ou as culturas de crescimento contendo tais partículas e opcionalmente etapas de purificação subseqüentes que rendem a(s) estrutura(s) desejada(s), ou através de processos sintéticos incluindo uma manipulação apropriada pelo uso de um sistema adequado com base, por exemplo, nas bactérias, insetos, espécies mamíferas ou outras mais procedimentos de isolamento e purificação subseqüentes opcionalmente, ou por indução dos ditos processos sintéticos no animal necessitando de uma vacina por incorporação direta de material genético usando as composições farmacêuticas adequadas (vacinação de poli- nucleotídeo). Uma vacina pode simultaneamente compreender um ou mais dos elementos descritos acima. O termo "vacina" como entendido aqui é uma vacina para uso veterinário compreendendo substâncias antigênicas e é administrada para o propósito de induzir uma imunidade específica e ativar contra uma doença provocada por uma infecção por pestivírus, preferivelmente por uma infecção por BVDV. O pestivírus atenuado, em particular o BVDV atenuado como descrito aqui, confere imunidade ativa que pode ser transferida passivamente por meio de anticorpos maternos contra os imunógenos que contém e às vezes também contra organismos antigenicamente relacionados. Uma vacina da invenção refere-se a uma vacina como definida acima, em que um componente imunologicamente ativo é um BVDV ou de origem pestiviral ou derivado de uma seqüência de nucleotídeo que é mais que 70 % homóloga a qualquer seqüência de pestivírus conhecida (sense ou antissense).

[00035] O termo "vacina viva" refere-se a uma vacina que compreende uma vida, em particular, um componente ativo viral vivo.

[00036] Componentes adicionais para intensificar a resposta imune são comumente constituintes referidos como "adjuvantes", como por exemplo hidróxido de alumínio, mineral ou outros óleos ou moléculas subordinadas adicionados à vacina ou gerados pelo corpo após a respectiva indução por tais componentes adicionais, como mas não restringidos a interferonas, interleucinas ou fatores de crescimento.

[00037] Uma "composição farmacêutica" essencialmente consiste em um ou mais ingredientes capazes de modificar as funções fisiológicas por exemplo imunológicas, do organismo que é administrado, ou de organismos que vivem dentro ou sobre o organismo. O termo inclui, mas não é restringido a, antibióticos ou antiparasitários, como também outros constituintes comumente usados para alcançar certos outros objetivos como, mas não limitados a, características de processamento, esterilidade, estabilidade, viabilidade para administrar a composição por meio de rotas enterais ou parenterais como rota adequada oral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutânea, intradérmica ou outra, tolerância após administração, propriedades de liberação controladas. Um exemplo não-limitativo de tal uma composição farmacêutica, somente dado para propósitos de demonstração, poderia ser preparado como segue: o sobrenadante de cultura de célula de uma cultura de célula infetada é misturado com um estabilizante (por exemplo espermidina e/ou BSA (albumina de soro bovino)) e a mistura é subseqüentemente liofilizada ou desidratada através de outros métodos. Antes da vacinação, a dita mistura é depois reidratada em aquoso (por exemplo solução salina, PBS (solução salina tamponada de fosfato)) ou soluções não-aquosas (por exemplo emulsão de óleo, adjuvante com base em alumínio).

Descrição da Invenção

[00038] A solução para o problema técnico acima é alcançada pela descrição e as modalidades caracterizadas nas reivindicações.

[00039] Foi surpreendentemente descoberto que pestivírus, em particular BVDV, podem ser atenuados mais eficazmente introduzindo pelo menos uma mutação na seqüência de codificação para glicoproteína Erns e pelo menos outra mutação na seqüência de codificação para Npro que preferivelmente leva à inativação combinada da atividade de RNase que reside na glicoproteína Erns além da inativação da atividade imunomoduladora que reside em Npro. Um efeito imunomodulador em um aspecto é indicado mas não limitado à função indicada para um pestivírus de uma maneira exemplar por Rüggli et al. (2003).

[00040] Um pestivírus, em particular BVDV atenuado de acordo com a presente invenção pode ser vantajosamente usado em vacinas. O dito pestivírus atenuado, em particular o dito BVDV atenuado, agora fornece vacinas vivas de imunogenicidade alta. Surpreendentemente, o pestivírus, em particular o BVDV de acordo com a invenção, são, além disso, seguros para o uso em animais em prenhez visto que eles não atravessam a placenta. Isto é exemplificado de uma maneira não- limitativa para BVDV no exemplo 3.

[00041] Além disso, vacinas vivas com mutações definidas como uma base para atenuação permitirá evitar as desvantagens da geração presente de vacinas, por exemplo o risco de reversão para uma cepa patogênica mor. Uma outra vantagem da ditas mutações atenuadas fica em sua singularidade molecular que permite as usar como marcações distintivas para um pestivírus atenuado, em particular BVDV e as distinguir dos pestivírus, em particular BVDV do campo. Portanto, em um aspecto a presente invenção fornece um pestivírus atenuado, em particular um BVDV atenuado tendo pelo menos uma mutação na seqüência de codificação para glicoproteína Erns e pelo menos outra mutação na seqüência de codificação para Npro. Preferi-velmente, em tal pestivírus atenuado, preferivelmente em tal BVDV atenuado a dita mutação na seqüência de codificação para glicoproteína Erns leva à inativação da atividade de RNase que reside em Erns e/ou a dita mutação na seqüência de codificação para Npro leva à inativação do dito Npro. A dita inativação pode acontecer por qualquer mutação conhecida à pessoa versada na técnica da seqüência de codificação de Erns e de Npro, em que as mutações são qualquer mutação como definida na seção de "definições", como deleções, mutações de inserção e/ou mutações de substituição. O mais preferivelmente, a(s) mutação(ões) é/são deleções, como a probabilidade para reversão para o tipo selvagem é a menor para deleções.

[00042] Foi mostrado que a glicoproteína Ems forma um homodíme- ro ligado a dissulfeto de cerca de 97 kD, em que cada monômero consiste em 227 aminoácidos que correspondem aos aminoácidos 268 a 494 da poliproteína de CSFV como descritos por Rümenapf et al. (1993). A seqüência de genoma da cepa de Alfort/Tübingen de CSFV está disponível na biblioteca de dados de GenBank/EMBL sob número de acesso J04358; alternativamente, a seqüência de aminoácido para a cepa de BVDV CP7 pode ser acessada na biblioteca de dados de GenBank/EMBL (número de acesso U63479); na poliproteína de CP7de BVDV, a proteína de Erns corresponde aos resíduos 271 a 497. Duas regiões de aminoácidos são altamente conservadas na glicoproteína Erns como também em alguma planta e proteínas RNase-ativas fúngicas (Schneider et al., 1993). Estas duas regiões são de importância particular para a atividade enzimática de RNase. A primeira região consiste na região nos aminoácidos na posição 295 a 307 (298 a 310 para cepa de BVDV cp7) e a segunda região consiste nos aminoáci- dos na posição 338 a 357 (341 a 360 para cepa de BVDV cp7) da dita poliproteina viral como exemplificado para a cepa de Alfort de CSFV em Meyers et al., 1999 (numeração de acordo com a seqüência de aminoácido deduzida publicada da cepa de Alfort/Tübingen de CSFV (Meyers et al., 1989). Os aminoácidos de importância particular para a atividade de RNase como mencionados acima não são de forma alguma limitados à posição exata como definida para a cepa de Alfort/Tübingen de CSFV, mas são simplesmente usados de uma maneira exemplar para apontar os aminoácidos preferidos estando naquela posição ou correspondendo àquela posição em outras cepas como encontradas em BVDV, BDV e pestivírus em geral uma vez que eles são altamente conservados. Para pestivírus diferente da cepa de Alfort/Tübingen de CSFV a numeração das posições dos aminoácidos preferidos pode ser diferente mas o versado na técnica da biologia molecular de pestivírus facilmente identificará estes aminoácidos preferidos pelo grau alto de conservação desta seqüência de aminoácido e a posição destes motivos no contexto de seqüência. Em um exemplo não-limitativo particular, a posição de Alfort/Tübingen de CSFV 346 é idêntica à posição 349 da cepa de BVDV cp7.

[00043] Como uma conseqüência, a presente invenção preferivelmente diz respeito a um BVDV de acordo com a invenção, em que a(s) dita(s) mutação(ões) na seqüência de codificação para glicoproteína Erns estão localizadas na seqüência de nucleotídeo de codificação que corresponde aos aminoácidos na posição 298 a 310 e/ou posição 341 a 360. Preferivelmente, tais mutações são (aminoácidos são dados nos símbolos de uma letra; o aminoácido antes do número de posição indica o aminoácido a ser substituído, o aminoácido após o número de posição o aminoácido substituinte (dei indica deleção): por exemplo, H300L quer dizer que a histidina 300 foi substituída por leucina:

[00044] Modificação adequada da glicoproteína Erns é por exemplo, as substituições/deleções simples: S298G, H300K, H300L, H300R, H300del, W303G, P304del, E305A, C308G, R343G, E345del, W346G, K348A, H349K, H349L, H349del, H349Q, H349SV (mutação H349S e inserção de V), K348R, W351P, W351G, W351L, W351K, W351H; as substituições/deleções duplas: H300L/H349L, K348del/H349del, H349del/G350del, E345del/ H349del, W303G/E305A, H300K/H349K, H300K/H349L e as deleções triplas: L299del/H300del/G300del, K348del/H349del/G350del. Numeração é de acordo com a seqüência de aminoácido publicada de BVDV CP7 para todos os mutantes listados acima (os números dados menos 3 corresponderiam aos resíduos equivalentes da seqüência de aminoácido de Alfort/Tübingen de CSFV). Todos os mutantes acima listados foram pelo menos testados como os respectivos mutantes CSFV ou BVDV sem mutações na região de Npro. Mutantes adequados da glicoproteína pestiviral Erns são fornecidos, por exemplo, por WO 99/64604 que é incorporado aqui em seu todo. Porém, deveria ser observado que de acordo com a presente invenção, pelo menos uma mutação adicional na região de Npro, como descrita em outro detalhe abaixo, deve estar presente.

[00045] Foi particularmente descoberto que a deleção ou substituição do resíduo de histidina na posição 346 (CSFV) ou 349 (BVDV) leva à inativação eficaz de Erns e portanto conduz às vacinas vivas pesti- virais particularmente úteis. A presente invenção demonstra que pestivírus são viáveis e codificam para uma proteína de Erns sem atividade de RNase quando o resíduo de histidina na posição 346 da poliproteína virai (numeração de acordo com a seqüência publicada de Alfort/Tübingen de CSFV (Meyers et al., 1989)), ou na posição 349 (numeração de acordo com a seqüência publicada de BVDV CP7 (Meyers et al., 1996b)) se o dito pestivírus for BVDV, que representa um dos resíduos dos sítios ativos putativos conservados da RNase de Erns, for deletado. Desse modo, preferivelmente, a invenção também diz respeito a um BVDV de acordo com a invenção, em que a dita mutação na seqüência de codificação para glicoproteína Erns é uma deleção ou substituição do resíduo de histidina na posição 349. Até mesmo mais especificamente, o sítio ativo putativo da RNase é representado pelas seqüências de Erns conservadas SLHGIWPEKICTG e/ou LQRHEWNKHGWCNWFHIEPW (seqüência da proteína de BVDV-2 New York'93 dada aqui de uma maneira exemplar; alterações secundárias podem ser encontradas possivelmente em outras seqüências de pestivírus mas a identidade do motivo sempre será óbvio para um versado na técnica. Como um exemplo, as seqüências de aminoácido correspondentes de BVDV-1 CP7 seriam SLHGIWPEKICTG e/ou LQRHEWNKHGWCNWYNIEPW e à de Alfort/Tübingen de CSFV SLHGIWPEKICKG e/ou LQRHEWNKHGWCNWYNIDPW). Desse modo, preferivelmente, a invenção também diz respeito a um BVDV de acordo com a invenção, em que a(s) dita(s) mutação(ões) na seqüência de codificação para a glicoproteína Erns fica(m) localizada(s) na seqüência de nucleotídeo que codifica para a seqüência de Erns conservada SLHGIWPEKICTG e/ou LQRHEWNKHGWCNWFHIEPW. Estas seqüências estão representando o sítio ativo putativo da RNase. As seqüências SLHGIWPEKIC e RHEWNKHGWCNW do sítio ativo putativo de Erns são conservadas até mesmo mais ao longo dos pestivírus. Desse modo, preferivelmente, a invenção também diz respeito a um pestivírus, em particular ao BVDV tendo pelo menos uma mutação na seqüência de codificação da proteína de Npro e da glicoproteína Erns, em que a(s) dita(s) mutação(ões) na seqüência de codificação para glicoproteína Erns está(ão) localizada(s) na seqüência de nucleotídeo que codifica para a seqüência de Erns conservada SLHGIWPEKIC e/ou RHEWNKHGWCNW. Preferivelmente, a mutação está localizada em apenas uma da ditas seqüências. Desse modo a invenção também diz respeito a um pestivírus, em particular ao BVDV tendo pelo menos uma mutação na seqüência de codificação da proteína de Npro e da glicoproteína Erns, em que a(s) dita(s) mutação(ões) na seqüência de codificação para a glicoproteína Erns está(ão) localizada(s) na seqüência de nucleotídeo que codifica para a seqüência de Erns conservada SLHGIWPEKIC ou RHEWNKHGWCNW. Preferivelmente, tais mutações concernem a dois aminoácidos diferentes, isto é são mutações duplas. Desse modo, as ditas mutações podem ser 1 a 3 mutações de nucleotídeo em dois tripletos diferentes que codificam dois aminoácidos. Desse modo, a invenção também diz respeito a um pestivírus, em particular ao BVDV tendo pelo menos uma mutação na seqüência de codificação da proteína de Npro e da glicoproteína Erns, em que a dita mutação(ões) na seqüência de codificação para glicoproteína Erns são duas mutações localizadas na seqüência de nucleotídeo que codifica para a seqüência de Erns conservada SLHGIWPEKIC e/ou RHEWNKHGWCNW. Preferivelmente, tais mutações concernem a um aminoácido simples. Desse modo, a dita mutação pode ser 1 a 3 mutações de nucleotídeo em um tripleto que codifica um aminoácido. Desse modo, a invenção também diz respeito a um pestivírus, em particular ao BVDV tendo pelo menos uma mutação na seqüência de codificação da proteína de Npro e da glicoproteína Erns, em que uma única mutação está localizada na seqüência de Erns conservada SLHGIWPEKIC ou RHEWNKHGWCNW.

[00046] Como mencionado acima, os pestivírus atenuados fornecidos pela presente invenção, tendo pelo menos uma mutação na seqüência de codificação da glicoproteína Erns e na seqüência de codificação da proteína de Npro, em que a dita mutação preferivelmente resulta na inativação da atividade de RNase que reside na glicoproteína Erns e da atividade imunomoduladora que reside em Npro. Inativação da Npro é alcançada em pestivírus, em particular BVDV da fórmula especificada descrita abaixo mais em detalhes, em que entre 0 e todos os aminoácidos de Npro estão presentes; ubiquitina ou LC3 ou outra seqüência servindo como sinal de processamento (por exemplo SUMO- 1, NEDD8, GATE-16, GABA(A)RAP, ou proteases como por exemplo Inteína, picornavírus 3C, caridovírus 2A, ou p15 do vírus de doença hemorrágica de coelho) está presente ou ausente. No caso de um sinal de processamento estar presente, a seqüência de codificação do sinal de processamento é inserida na ou perto da extremidade C- terminal da (parte restante da) proteína de Npro. Apenas no caso que um sinal de processamento estiver presente, qualquer número de aminoácidos que codificam para Npro (= aminoácidos de Npro) pode estar presente. No caso de nenhuma seqüência de sinal de processamento ser inserida, um máximo de 12 aminoácidos, preferivelmente aminoácidos amino-terminais, de Npro pode estar presente, os aminoácidos restantes têm que ser deletados. Além disso, diferente das mutações de Erns como descritas acima (pelo menos uma destas tem que estar presente no pestivírus, em particular em BVDV de acordo com a invenção), as seqüências restantes do pestivírus, em particular BVDV, podem permanecer inalteradas, isto é não são mutadas, ou podem também ter mutações perto da extremidade N-terminal da proteína C. Várias modalidades mais específicas como descritas abaixo exemplificam isso.

[00047] Desse modo, a invenção diz respeito a um pestivírus, em particular ao BVDV de acordo com a invenção, em que a(s) dita(s) mu- tação(ões) na seqüência de codificação para Npro conduz(em) a uma poliproteína codificada como caracterizada pela fórmula a seguir: [Npr°]x-[PS]y-[C-term] e em que: [Npro] diz respeito à porção de Npro da dita poliproteína, em que "x" representa o número de aminoácidos da Npro presentes na poliproteína; [PS] diz respeito a um sinal de processamento selecionado de: ubiquitina, LC3, SUMO-1, NEDD8, GATE-16 ou GABA(A)RAP ou proteases como por exemplo Inteína, picornavírus 3C, caridovírus 2A ou p15 do vírus de doença hemorrágica de coelho ou qualquer sinal de processamento conhecido à pessoa versada que assegura a geração de um N-terminal funcional da proteína C. "Y" pode ser = 0 que significa que nenhum sinal de processamento está presente (= PS está ausente), ou "Y" pode ser = 1 que significa que um sinal de processamento está presente (= PS presente).

[00048] [C-term] diz respeito ao pestivírus completo, em particular a poliproteína de BVDV completa com exceção de Npro, mas incluindo o capsídeo (C)-proteína e qualquer outra proteína presente na poliproteína de pestivírus, em particular na poliproteína de BVDV incluindo o NS5B carbóxi-terminal. Preferivelmente, a glicoproteína Erns no dito [C- term] é mutada, de modo que a atividade de RNase que reside na glicoproteína Erns é inativada. O termo "qualquer outra proteína presente na poliproteína de pestivírus / poliproteína de BVDV" diz respeito a Erns, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B e NS5A, em que a glicoproteína Erns é mutada, preferivelmente como descrita aqui (ver acima), de modo que a atividade de RNase que reside na glicoproteína Erns é inativada. Preferivelmente, o pestivírus, em particular o BVDV de acordo com a invenção tem uma proteína C que não é mutada com exceção do aminoácido na posição 2 que é alterado de D para N. Portanto, [C- term*] é igual a [C-term] mas com uma mutação na posição 2 da proteína C (N em vez de D); se "y" for = 0 (significa nenhum [PS] presente) então "x" é 0 a 12, (significa nenhum Npro aminoácido específico ou 1 a 12 aminoácidos de Npro, preferivelmente do término N de Npro, estão presentes); se "y" for = 1 (significa [PS] está presente) então "x" é 0 a 168; (significa nenhum Npro aminoácido específico ou 1 a todos 168 aminoácidos de Npro, preferivelmente do término N de Npro, estão presentes).

[00049] Também mais preferivelmente, a invenção diz respeito a um pestivírus, em particular ao BVDV de acordo com a invenção, em que a(s) dita(s) mutação(ões) na seqüência de codificação para Npro conduz(em) a uma poliproteína codificada como caracterizada pela fórmula a seguir: [Npra]i-[PS]o-[C-term] e em que as definições são como definidas acima.

[00050] Um exemplo específico destes é descrito abaixo, em que a metionina N-terminal é seguida pela proteína C e qualquer outra proteína presente na poliproteína incluindo o NS5B carbóxi-terminal. Con- seqüentemente, o mais preferivelmente, a invenção diz respeito a um pestivírus, em particular BVDV de acordo com a invenção, em que a(s) dita(s) mutação(ões) na seqüência de codificação para Npro con- duz(em) a uma poliproteína codificada como caracterizada pela fórmula a seguir: M[C-term]. e em que as definições são como definidas acima.

[00051] Também mais preferivelmente, a invenção diz respeito a um pestivírus, em particular ao BVDV de acordo com a invenção, em que a(s) dita(s) mutação(ões) na seqüência de codificação para Npro conduz(em) a uma poliproteína codificada como caracterizada pela fórmula a seguir: [Npro]3-[PS]o-[term] e em que as definições são como definidas acima.

[00052] Um exemplo específico de BVDV é descrito abaixo, em que a metionina N-terminal é seguida pela seqüência de Npro EL e a proteína C e qualquer outra proteína presente na poliproteína incluindo o NS5B carbóxi-terminal. Conseqüentemente, o mais preferivelmente, a invenção diz respeito a um BVDV de acordo com a invenção, em que a(s) dita(s) mutação(ões) na seqüência de codificação para Npro conduzam) a uma poliproteína codificada como caracterizada pela fórmula a seguir: MEL-[C-term] e em que as definições são como definidas acima.

[00053] Também mais preferivelmente, a invenção diz respeito a um pestivírus, em particular ao BVDV de acordo com a invenção, em que a(s) dita(s) mutação(ões) na seqüência de codificação para Npro conduz(em) a uma poliproteína codificada como caracterizada pela fórmula a seguir: [Npro]4-[PS]o-[term] e em que as definições são como definidas acima.

[00054] Um exemplo específico de BVDV é descrito abaixo, em que a metionina N-terminal é seguida pela seqüência de Npro ELF e a proteína C e qualquer outra proteína presente na poliproteína incluindo o NS5B carbóxi-terminal. Conseqüentemente, o mais preferivelmente, a invenção diz respeito a um BVDV de acordo com a invenção, em que a(s) dita(s) mutação(ões) na seqüência de codificação para Npro conduzam) a uma poliproteína codificada como caracterizada pela fórmula a seguir: MELF-[C-term]. e em que as definições são como definidas acima.

[00055] Também mais preferivelmente, a invenção diz respeito a pestivírus, em particular para BVDV de acordo com a invenção, em que a(s) dita(s) mutação(ões) na seqüência de codificação para Npro conduz(em) a uma poliproteína codificada como caracterizada pela fórmula a seguir: [Npro]6-[PS]o-[C-term] e em que as definições são como definidas acima.

[00056] Um exemplo específico de BVDV é descrito abaixo, em que a metionina N-terminal é seguida pela seqüência de Npro ELFSN e a proteína C e qualquer outra proteína presente na poliproteína incluindo o NS5B carbóxi-terminal. Conseqüentemente, o mais preferivelmente, a invenção diz respeito a um BVDV de acordo com a invenção, em que a(s) dita(s) mutação(ões) na seqüência de codificação para Npro conduz(em) a uma poliproteína codificada como caracterizada pela fórmula a seguir: MELFSN-[C-term]. e em que as definições são como definidas acima.

[00057] Também mais preferivelmente, a invenção diz respeito a um pestivírus, em particular ao BVDV de acordo com a invenção, em que a(s) dita(s) mutação(ões) na seqüência de codificação para Npro conduz(em) a uma poliproteína codificada como caracterizada pela fórmula a seguir: [Npro]4-[PS]o-[C-term*] e em que as definições são como definidas acima com exceção do fato que a parte amino-terminal da proteína C é alterada.

[00058] Um exemplo específico de BVDV é descrito abaixo, em que a metionina N-terminal é seguida pela seqüência de Npro ELF e na seqüência de proteína C, o aminoácido na posição 2 é alterado de D para N. Portanto, a seqüência de proteína C amino-terminal é SNE- GSK... em vez de SDEGSK. Conseqüentemente, o mais preferivelmente, a invenção diz respeito a um BVDV de acordo com a invenção, em que a(s) dita(s) mutação(ões) na seqüência de codificação para Npro conduz(em) a uma poliproteína codificada como caracterizada pela fórmula a seguir: MELF-[C-term*], em que na proteína C o aminoácido na posição 2 é alterado de D para N, e em que as definições são como definidas acima.

[00059] Também mais preferivelmente, a invenção diz respeito a um pestivírus, em particular BVDV de acordo com a invenção, em que a(s) dita(s) mutação(ões) na seqüência de codificação para Npro conduzam) a uma poliproteína codificada como caracterizada pela fórmula a seguir: [NPr°]x-[PS]i-[C-term], em que as definições são como definidas acima, e em que PS é qualquer um do PS descrito acima, preferivelmente selecionado do grupo de ubiquitina ou LC3.

[00060] Um exemplo específico de BVDV é descrito abaixo, em que a metionina N-terminal é seguida por quaisquer 21 ou 28 aminoácidos de Npro, ubiquitina ou LC3 e a proteína C. Conseqüentemente o mais preferivelmente, a invenção diz respeito a um BVDV de acordo com a invenção, em que a(s) dita(s) mutação(ões) na seqüência de codificação para Npro conduz(em) a uma poliproteína codificada como caracterizada pela fórmula a seguir: [Npro]22-[PS]i-[C-term], em que preferivelmente, PS é ubiquitina ou LC3 ou [Npro]29-[PS]i-[C-term], em que preferivelmente, PS é ubiquitina ou LC3.

[00061] Ubiquitina é uma proteína celular altamente conservada bem conhecida de 76 aminoácidos. Entre outras funções, ubiquitina é um representante fundamental no catabolismo de proteína uma vez que a conjugação com ubiquitina pode marcar uma proteína para degradação por meio do proteasoma. Ubiquitina conjugada ou fundida com outras proteínas por meio do glicina carbóxi-terminal pode ser separada por clivagem através de proteases celulares ubiquitina- específicas. Desse modo, a fusão de uma proteína com o término car- bóxi de ubiquitina usualmente resultará em divagem proteolítica defi- nida da proteína de fusão em seus componentes quando expressos dentro de uma célula.

[00062] LC3 (cadeia leve 3 de proteínas associadas ao microtúbulo) representa uma proteína celular de 125 aminoácidos servindo uma va-riedade de funções (comprimento dado para LC3 bovino). Recentemente, um papel fundamental da proteína em autofagia foi definido. Durante este processo, LC3 é ativado através de divagem carbóxi- terminal. Assim, um término carbóxi novo é gerado que consiste em glicina. LC3 é depois conjugado por meio da glicina carbóxi-terminal com fosfatidiletanolamina presente nas membranas das vesículas au- tofágicas. Por causa deste processo, uma proteína fundida com o término carbóxi de LC3 será separada por clivagem por uma protease celular em uma posição definida.

[00063] Também mais preferivelmente, a invenção diz respeito a um pestivírus, preferivelmente para BVDV de acordo com a invenção, em que a(s) dita(s) mutação(ões) na seqüência de codificação para Npro conduz(em) a uma poliproteína codificada como caracterizada pela fórmula a seguir selecionada do grupo de: [Npro]2-[PS]y-[C-term] e preferivelmente ME-[PS]y-[C-term]; [Npro]5-[PS]y-[C-term] e preferivelmente MELFS-[PS]y[C-term]; [Npra]7-[PS]y-[C-term] e preferivelmente MELFSNE-[PS]y-[C-term]; [Npra]8-[PS]y-[C-term] e preferivelmente MELFSNEL-[PS]y-[C-term]; [Npra]9-[PS]y-[C-term] e preferivelmente MELFSNELL-[PS]y-[C-term]; [Npra]io-[PS]y-[C-term] e preferivelmente MELFSNELLY-[PS]y-[C-term]; [Npra]ii-[PS]y[C-term] e preferivelmente MELFSNELLYK-[PS]y-[C- term]; e [Npro]i2-[PS]y-[C-term] e preferivelmente MELFSNELLYKT-[PS]y-[C- term] e em que as definições são como definidas acima. As mo-dalidades preferivelmente descritas referem-se ao BVDV.

[00064] O mais preferivelmente, y é 0 (nenhum PS presente).

[00065] Também mais preferivelmente, o dito BVDV de acordo com a invenção como acima descrito é um BVDV de BVDV tipo 1. O mais preferivelmente, dito BVDV de acordo com a invenção como supra descrito é um BVDV de BVDV tipo 2. BVDV-1 e BVDV-2 são diferenciados de acordo com as características de suas seqüências genômicas (Heinz et al., 2000 e referências nela). BVDV-1 como descrito aqui pode ser usado na fabricação de uma composição para o uso na prevenção e/ou tratamento de infecções de BVDV tipo 1 em gados de procriação, em vacas prenhas e na indução de proteção fetal contra infecção por BVDV tipo 1 em vacas prenhas. Surpreendentemente, um BVDV-2 como descrito aqui pode ser usado na fabricação de uma composição para o uso na prevenção e/ou tratamento de infecções de BVDV tipo 1 em gados de procriação. Em particular, a invenção diz respeito ao uso de um BVDV tipo 2 de acordo com a invenção na fabricação de uma composição para o uso na prevenção e/ou tratamento de infecções de BVDV tipo 1 em vacas prenhas. Preferivelmente, o BVDV tipo 2 de acordo com a invenção pode ser usado na fabricação de uma composição para o uso na indução de proteção fetal contra infecções de BVDV tipo 1 em vacas prenhas. Surpreendentemente também, um BVDV-1 como descrito aqui pode ser usado na fabricação de uma composição para o uso na prevenção e/ou tratamento de infecções de BVDV tipo 2 em gados de procriação. Em particular, a invenção diz respeito ao uso de um BVDV tipo 1 de acordo com a invenção na fabricação de uma composição para o uso na prevenção e/ou tratamento de infecções de BVDV tipo 2 em vacas prenhas. Preferivelmente, o BVDV tipo 1 de acordo com a invenção pode ser usado na fabricação de uma composição para o uso na indução de proteção fetal contra infecções de BVDV tipo 2 em vacas prenhas. O mais preferido é o uso de BVDV tipo 1 e tipo 2 em combinação para a fabricação de uma composição para o uso na prevenção e/ou tratamento de infecções de BVDV tipo 1 e ou tipo 2 em gados de procriação, em vacas prenhas e na indução de proteção fetal contra infecções de BVDV tipo 1 e/ou tipo 2 em vacas prenhas.

[00066] O mais preferivelmente, o BVDV do tipo selvagem de acordo com a invenção que é para ser mutado, como descrito aqui, corresponde à seqüência de aminoácido SEQ ID N° 5 (denominada XIKE A) ou é uma variante funcional desta. O mais preferivelmente também, o BVDV de acordo com a invenção tem uma mutação de Npro de acordo com a invenção e corresponde à seqüência de aminoácido SEQ ID N° 6 (denominada XIKE-A-NdN) ou é uma variante funcional desta. Preferivelmente, uma tal variante funcional é pelo menos 65 % homóloga à seqüência de aminoácido descrita aqui. No nível de aminoácido, ho- mologias são muito rudemente: BVDV-1/-BVDV-1: 93 %; BVDV-1/- BVDV-2: 84 %; BVDV-2/-BVDV-2: 98 %. Portanto, mais preferível, uma tal variante funcional é pelo menos 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 % ou 90 % homóloga à seqüência de aminoácido descrita aqui. Mais preferivelmente também, tal variante funcional é pelo menos 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % ou 98 % homóloga à seqüência de aminoácido descrita aqui. O mais preferivelmente, tal variante funcional é pelo menos 99 % ou 99,9 % homóloga à seqüência de aminoácido descrita aqui.

[00067] O mais preferivelmente também, o BVDV de acordo com a invenção tem uma mutação de Erns de acordo com a invenção que tem uma deleção do códon que codifica para histidina 349, e corresponde à seqüência de aminoácido SEQ ID N° 7 (denominada XIKE-B) ou é uma variante funcional desta. O mais preferivelmente também, o BVDV de acordo com a invenção tem uma mutação de Erns e uma mutação de Npro de acordo com a invenção, em que o códon que codifica para histidina 349 de Ernsé deletado e também a região de codificação de Nprocompleta é deletada, com exceção dos codons 1 a 4, desse modo aminoácidos MELF de Npropermanecem. O dito mutante corresponde à seqüência de aminoácido SEQ ID N° 8 (denominada XIKE-B- NdN) ou é uma variante funcional desta. Preferivelmente, uma tal variante funcional é pelo menos 65 % homóloga à seqüência de aminoácido descrita aqui. Mais preferível, uma tal variante funcional é pelo menos 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 % ou 90 % homóloga à seqüência de aminoácido descrita aqui. Mais preferivelmente também, tal variante funcional é pelo menos 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % ou 98 % homóloga à seqüência de aminoácido descrita aqui. O mais preferivelmente, tal variante funcional é pelo menos 99 % ou 99,9 % homóloga à seqüência de aminoácido descrita aqui.

[00068] O mais preferivelmente também, o BVDV de acordo com a invenção tem uma mutação de Erns de acordo com a invenção que tem uma substituição do códon que codifica para histidina 300 pelo códon que codifica para leucina e corresponde à seqüência de aminoácido SEQ ID N° 9 (denominada XIKE-C) ou é uma variante funcional desta. O mais preferivelmente também, o BVDV de acordo com a invenção tem uma mutação de Erns e uma mutação de Npro de acordo com a invenção, em que o códon que codifica para histidina 300 é substituído pelo códon que codifica para leucina e também a região de codificação de Npro completa é deletada, com exceção dos códons 1 a 4, desse modo aminoácidos MELF de Npro permanecem. O dito mutante corresponde à seqüência de aminoácido SEQ ID N° 10 (denominada XIKE-C NdN) ou é uma variante funcional desta. Preferivelmente, uma tal variante funcional é pelo menos 65 % homóloga à seqüência de aminoácido descrita aqui. Mais preferível, uma tal variante funcional é pelo menos 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 % ou 90 % homóloga à seqüência de aminoácido descrita aqui. Mais preferi-velmente também, tal variante funcional é pelo menos 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % ou 98 % homóloga à seqüência de aminoácido descrita aqui. O mais preferivelmente, tal variante funcional é pelo menos 99 % ou 99,9 % homóloga à seqüência de aminoácido descrita aqui.

[00069] Outra modalidade importante da invenção descrita aqui é uma composição que compreende um pestivírus, em particular um BVDV de acordo com a invenção e uma solução. A pessoa versada sabe dos componentes adicionais que podem ser compreendidos na dita composição (ver também as Remington's Pharmaceutical Sciences (1990). 18a ed. Mack Publ., Easton). O versado pode usar soluções estéreis fisiologicamente aceitáveis, injetáveis, conhecidas. Para preparar uma solução pronta-para-usar para injeção ou infusão parenteral, soluções isotônicas aquosas, como por exemplo soluções salinas ou soluções de proteína de plasma correspondentes, estão facilmente disponíveis. As composições farmacêuticas podem estar presentes como liofilizados ou preparações secas que podem ser reconstituídas diretamente com uma solução injetável conhecida antes do uso sob condições estéreis por exemplo como um kit de partes.

[00070] A preparação final das composições da presente invenção é preparada para, por exemplo injeção, misturando o dito pestivírus, pre-ferivelmente BVDV de acordo com a invenção com uma solução fisiolo-gicamente estéril aceitável que pode ser suplementada com substâncias veículos ou/e aditivos conhecidos (por exemplo albumina de soro, dextrose, bissulfito de sódio, EDTA). A dita solução pode ser com base em um solvente fisiologicamente aceitável, por exemplo uma solução aquosa entre pH 7 e 8. O pH pode ser estabilizado por um tampão far- maceuticamente aceitável. A solução pode também conter agentes es- tabilizantes também como um detergente como Tween 20, albumina de soro como BSA (albumina de soro bovino), ácido ascórbico e/ou es- permidina. A composição pode também compreender adjuvantes, por exemplo hidróxido de alumínio, mineral ou outros óleos ou moléculas auxiliares adicionadas à vacina ou geradas pelo corpo após respectiva indução por tais componentes adicionais, como mas não restringidos a interferonas, interleucinas ou fatores de crescimento.

[00071] Por exemplo, em uma composição de acordo com a invenção, o pestivírus, em particular BVDV pode ser solucionado em: Pestivírus (preferivelmente BVDV)102-108 TCID50 SGS*25 % v/v Meio de cultura de célulaqsp 1 dose *SGS:Composição por 2 ml Sacarose75 mg Gelatina20 mg Hidróxido de potássio0,274 mg Ácido L-glutâmico0,72 mg Fosfato de diidrogênio de potássio0,516 mg Fosfato de dipotássio1,254 mg Água para injeçãoqsp 2 ml

[00072] Se a composição for primeiro liofilizada ou desidratada através de outros métodos, então, antes da vacinação, a dita composição é re-hidratada em soluções aquosas (por exemplo solução salina, PBS (solução salina tamponada de fosfato)) ou não-aquosas (por exemplo emulsão de óleo (adjuvante com base em óleo mineral ou óleo vegetal/metabolizável / com base em emulsão simples ou dupla), com base em alumínio, carbômero).

[00073] Preferivelmente, a composição de acordo com a invenção induz uma resposta imunológica em um animal. Mais preferido, a composição de acordo com a invenção é uma vacina. Uma vacina como entendido aqui compreende um pestivírus, em particular BVDV de acordo com a invenção e é acima definida (seção "definições").

[00074] O mais preferido, a composição de acordo com a invenção também compreende um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Vários veículos ou excipientes são descritos acima. A composição pode compreender, se visado em injeções ou infusão, substâncias para preparar soluções isotônicas, conservantes como p- hidroxibenzoatos, estabilizantes, como sais de alquila de ácido etilen- diamintetracético, possivelmente também contendo emulsificantes e / ou dispersantes.

[00075] A composição de acordo com a invenção pode ser aplicada intradérmica, intratraqueana ou intravaginalmente. A composição pre-ferivelmente pode ser aplicada intramuscular ou intranasalmente. Em um corpo de animal, pode provar-se vantajosa em aplicar as composições farmacêuticas como descritas acima por meio de uma injeção intravenosa ou direta nos tecidos alvo. Para aplicação sistêmica, rotas intravenosas, intravasculares, intramusculares, intranasais, intraarteri- ais, intraversadoneais, orais ou intratecais são preferidas. Uma aplicação mais local pode ser realizada subcutânea, intradérmica, intracutâ- nea, intracardíaca, intralobal, intramedular, intrapulmonarmente ou diretamente no ou próximo do tecido a ser tratado (tecido conetivo, osso, músculo, nervo, epitelial). Dependendo da duração desejada e da eficácia do tratamento, as composições de acordo com a invenção podem ser administradas uma vez ou várias vezes, também com intermitência, por exemplo diariamente durante vários dias, semanas ou meses e em dosagens diferentes.

[00076] A invenção também diz respeito ao uso de um pestivírus, em particular BVDV de acordo com a invenção na fabricação de uma vacina para a profilaxia e tratamento de infecções pestiviral, em parti-cular de infecções de BVDV.

[00077] Outra parte importante da invenção é uma molécula de poli- nucleotídeo compreendendo o ácido nucléico que codifica para um pes-tivírus, em particular para um BVDV de acordo com a invenção, ou um fragmento, variante funcional, variante com base no código de ácido nucléico degenerativo, molécula de fusão ou um derivado químico deste. Preferivelmente, a dita molécula de polinucleotídeo é DNA. Também preferivelmente, a dita molécula de polinucleotídeo é RNA. Em uma modalidade mais preferida, a dita molécula de polinucleotídeo também compreende a seqüência de nucleotídeo de uma região funcional não- transladada de 5' e/ou 3' de um pestivírus, em particular de BVDV.

[00078] Há várias seqüências de nucleotídeo conhecidas na técnica que representa a base para a produção de uma molécula de polinucleotídeo que codifica para um pestivírus atenuado de acordo com a presente invenção, tendo pelo menos uma mutação na seqüência de codificação de Npro e pelo menos uma na seqüência de codificação de glicoproteína Erns, em que as ditas mutações resultam em uma inativação combinada da atividade de RNase que reside na glicoproteína Erns e na inativação da atividade imunomoduladora que reside em Npro. Exemplos de seqüências de ácido nucléico das seqüências do tipo selvagem de vários membros de pestivírus são listadas abaixo: VÍRUS DA DOENÇA DE BORDER Cepa BD31 N° de Acesso no GenBank do NCBI [U70263] Cepa X818 N° de Acesso no GenBank do NCBI [AF037405] VÍRUS DA DIARRÉIA VIRAL BOVINA 1 Cepa NADL N° de Acesso no GenBank do NCBI [M31182] Cepa Osloss N° de Acesso no GenBank do NCBI [M96687] Cepa SD-1 N° de Acesso no GenBank do NCBI [M96751] Cepa CP7 N° de Acesso no GenBank do NCBI [U63479] VÍRUS DA DIARRÉIA VIRAL BOVINA 2 Cepa 890 N° de Acesso no GenBank do NCBI [U18059] Cepa C413 N° de Acesso no GenBank do NCBI [AF002227] VÍRUS DA FEBRE SUÍNA CLÁSSICA Cepa Alfort/187 N° de Acesso no GenBank do NCBI [X87939] Cepa Alfort-Tübingen N° de Acesso no GenBank do NCBI [J04358] Cepa Brescia N° de Acesso no GenBank do NCBI [M31768] Cepa da Cepa de C N° de Acesso no GenBank do NCBI [Z46258]

[00079] Mutações/modificações de acordo com a invenção relativas à seqüência de codificação de Npro e Erns são descritas acima mais em detalhes. Tendo esta informação, uma pessoa versada na técnica é capaz de realizar a fabricação de qualquer polinucleotídeo/ácido poli- nucléico que codifica para um pestivírus de acordo com a presente invenção. Além disso, esta pessoa é capaz de manufaturar um pestivírus atenuado de acordo com a invenção. Método molecular para introduzir uma mutação em uma seqüência de polinucleotídeo, clonagem e amplificação do dito polinucleotídeo mutado é por exemplo fornecido por Sambrook et 1989 ou Ausubel et al. 1994.

[00080] O mais preferivelmente, o BVDV do tipo selvagem de acordo com a invenção que é para ser mutado como descrito aqui é codificado pela seqüência de ácido nucléico SEQ ID N° 1 (denominada XI- KE A) ou uma variante funcional desta. O mais preferivelmente também, o BVDV de acordo com a invenção tem uma mutação de Npro de acordo com a invenção e é codificado pela seqüência de ácido nucléico SEQ ID N° 2 (denominada XIKE-A-NdN) ou uma variante funcional desta. Preferivelmente, uma tal variante funcional é pelo menos 65 % homóloga à seqüência de ácido nucléico descrita aqui. No nível de ácido nucléico, homologias são muito rudes: BVDV-1/-BVDV-1: 80 %; BVDV-1/-BVDV-2: 70 %; BVDV-2/-BVDV-2: 96 %. Portanto, mais preferível, uma tal variante funcional é pelo menos 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 % ou 90 % homóloga à seqüência de ácido nucléico descrita aqui. Mais preferivelmente também, tal variante funcional é pelo menos 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % ou 98 % homóloga à seqüência de ácido nucléico descrita aqui. O mais preferivelmente, tal variante funcional é pelo menos 99 % ou 99,9 % homóloga à seqüência de ácido nucléico descrita aqui.

[00081] O mais preferivelmente também, o BVDV de acordo com a invenção tem uma mutação de Erns de acordo com a invenção que tem uma deleção de códon H349 e é codificado pela seqüência de ácido nucléico SEQ ID N° 7 (denominada XIKE-B) ou por uma variante funcional desta. O mais preferivelmente também, o BVDV de acordo com a invenção tem uma mutação de Erns e uma mutação de Npro de acordo com a invenção, em que o códon que codifica para histidina 349 de Ems é deletado e também a região de codificação de Npro completa é deleta- da, com exceção dos códons 1 a 4, desse modo aminoácidos MELF de Npro permanecem. O dito mutante é codificado pela seqüência de ácido nucléico SEQ ID N° 8 (denominada XIKE-B-NdN) ou por uma variante funcional desta. Preferivelmente, uma tal variante funcional é pelo menos 65 % homóloga à seqüência de ácido nucléico descrita aqui. Mais preferível, uma tal variante funcional é pelo menos 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 % ou 90 % homóloga à seqüência de ácido nucléico descrita aqui. Mais preferivelmente também, tal variante funcional é pelo menos 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % ou 98 % homóloga à seqüência de ácido nucléico descrita aqui. O mais preferivelmente, tal variante funcional é pelo menos 99 % ou 99,9 % homóloga à seqüência de ácido nucléico descrita aqui.

[00082] O mais preferivelmente também, o BVDV de acordo com a invenção tem uma mutação de Ems de acordo com a invenção que é uma substituição de códon "H300" por um códon de leucina, e é codificado pela seqüência de ácido nucléico SEQ ID N° 11 (denominada XI- KE-C) ou uma variante funcional desta. O mais preferivelmente também, o BVDV de acordo com a invenção tem uma mutação de Erns e uma mutação de Npro de acordo com a invenção, em que o códon que codifica para histidina 300 é substituído pelo códon que codifica para leucina e também a região de codificação de Npro completa é deletada, com exceção dos códons 1 a 4, desse modo aminoácidos MELF de Npro permanecem. O dito mutante é codificado pela seqüência de ácido nucléico SEQ ID N° 12 (denominada XIKE-C-NdN) ou por uma variante funcional desta. Preferivelmente, uma tal variante funcional é pelo menos 65 % homóloga à seqüência de ácido nucléico descrita aqui. Mais preferível, uma tal variante funcional é pelo menos 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 % ou 90 % homóloga à seqüência de ácido nucléico descrita aqui. Mais preferivelmente também, tal variante funcional é pelo menos 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % ou 98 % homóloga à seqüência de ácido nucléico descrita aqui. O mais preferivelmente, tal variante funcional é pelo menos 99 % ou 99,9 % homóloga à seqüência de ácido nucléico descrita aqui.

[00083] Outro aspecto importante da invenção é um método para atenuar um pestivírus, caracterizado em que pelo menos uma mutação na seqüência de codificação para glicoproteína Erns e pelo menos outra mutação na seqüência de codificação para Npro são geradas em um genoma de pestivírus. De acordo com uma modalidade preferida, o dito pestivírus é BVDV.

[00084] De acordo com uma modalidade mais preferida, o dito método compreende as etapas: a)transcrição reversa de uma seqüência de nucleotídeo de pestivírus do tipo selvagem em um cDNA; b)clonar o dito cDNA; c)introduzir mutações selecionadas do grupo de deleções, mutações de inserção e/ou mutações de substituição no dito cDNA, em que as ditas mutações estão localizadas na seqüência de codificação que codifica a glicoproteína Erns e a protease Npro, d)incorporar o cDNA em um plasmídeo ou em um vírus de DNA capaz de direcionar a transcrição de cDNA de pestivírus em RNA in vitro ou sob infecção das células adequadas.

[00085] Com relação ao método por atenuar um BVDV de acordo com a invenção, os ditos métodos preferidos compreendem as etapas: a)transcrição reversa de uma seqüência de nucleotídeo de BVDV do tipo selvagem em um cDNA; b)clonar o dito cDNA; c)introduzir mutações selecionadas do grupo de deleções, mutações de inserção e/ou mutações de substituição no dito cDNA, em que as ditas mutações estão localizadas na seqüência de codificação que codifica a glicoproteína Erns e a protease Npro, d)incorporar o cDNA em um plasmídeo ou em um vírus de DNA capaz de direcionar a transcrição de cDNA de pestivírus em RNA in vitro ou sob infecção de células adequadas.

[00086] Ainda outra modalidade importante da invenção é um método de tratamento de doença causada por um pestivírus, em que um pestivírus de acordo com a invenção ou uma composição de acordo com a invenção, em que o dito pestivírus ou a dita composição é administrada a um animal em necessidade deste em uma dose adequada como conhecida à pessoa versada e a redução dos sintomas da dita infecção por pestivírus.

[00087] Ainda outra modalidade importante da invenção é um método de tratamento de doença causada por BVDV, em que um BVDV de acordo com a invenção ou uma composição de acordo com a invenção, em que o dito BVDV ou a dita composição é administrada a um animal em necessidade deste em uma dose adequada como conhecida à pessoa versada e a redução dos sintomas de infecção por BVDV como viremia e leucopenia e/ou pirexia e/ou diarréia é monitorada.

Exemplos

[00088] Os exemplos a seguir servem para também ilustrar a presente invenção; mas os mesmos não deveriam ser interpretados como limitando o escopo da invenção descrita aqui. Exemplo 1 XIKE-B de BVDV: Avaliação de Fotopatogenicidade em Novilhas Prenhas

[00089] XIKE-B DE BVDV, um mutante negativo de RNase do isolado de BVDV do tipo 2 de altamente patogênico NewYork'93/C foi restabelecido do clone de cDNA infeccioso pKANE40B e mostrou características de crescimento parecidas com o tipo selvagem (parecidas com wt) em cultura de tecido. Em experimentos em animais, o vírus mutante foi observado estar consideravelmente atenuado de forma que isto representou um candidato promissor para o desenvolvimento de uma vacina viva de vírus atenuado (Meyer et al., 2002). Para testar se este vírus atenuado ainda pode cruzar a placenta e infetar o feto, novilhas prenhas foram infetadas com XIKE-B. Como um controle BVDV do tipo selvagem foi restabelecido de cDNA, clone pKANE40A foi usado. O respectivo vírus nomeado XIKE-A expressa uma RNase de Erns ativa na célula infetada. O estudo visou avaliar a segurança de XIKE-A e XIKE-B em animais em prenhez.

Projeto Experimental

[00090] Dez novilhas prenhas foram selecionadas de um rebanho negativo de BVDV. Os grupos a seguir de 5 novilhas foram incluídos na experimentação:

[00091] As novilhas foram deslocadas para as instalações experimentais 8 dias antes das inoculações. Estado de prenhez foi confirmado após transporte para a instalação experimental. As novilhas estavam entre 60 e 90 dias de gestação no dia da inoculação. Inocula-ção aconteceu em um certo ponto de tempo para todos os animais.

[00092] As novilhas foram monitoradas para a presença de sinais clínicos de infecção por BVDV incluindo abortos durante o período de observação. Amostras de sangue foram colhidas dos animais para se- rologia, detecção de antígeno e as células sangüíneas brancas foram contadas. O experimento foi terminado 9 semanas após infecção. Vacas não-abortadas foram abatidas, o útero examinado e colhido. Amostras de órgão fetais foram colhidas durante necropsia rotineira e examinadas para infecção por BVDV.

[00093] A presença de infecção fetal foi o parâmetro de avaliação principal, composto do número de mortalidade de vaca relacionada ao BVDV, o número de abortos relacionados ao BVDV e o número de fetos positivos em BVDV na terminação. Além do parâmetro principal, característica de sinais clínicos para infecção por BVDV, viremia e contagens de células sangüíneas brancas em vacas e temperatura retal após desafio foram avaliados.

Animais

[00094] As novilhas foram compradas de uma fazenda livre de BVDV.

[00095] Apenas animais que conheceram os critérios de inclusão a seguir foram usados. Critérios de Inclusão - Livre de anticorpos de BVD; cada indivíduo será testado no teste de anticorpo de soro antes do transporte e na iniciação do estudo (na instalação de teste dos animais). - Livre de BVDV; preparação plasma e/ou revestimento tamponante de cada indivíduo será testado por um teste adequado. - Clinicamente saudável na iniciação do estudo julgado em exame físico. O exame de saúde dos animais foi realizado de acordo com a prática veterinária corrente, em geral aceita. - Prenhez confirmada por exame físico antes da inoculação. Prenhez estava entre 60 - 90 dias na hora da inoculação, provado por registros de inseminação. Cepa de Teste A

Cepa de Teste B

Controle de Prenhez

[00096] Prenhez foi imediatamente confirmada antes da inoculação.

Inoculação das Novilhas

[00097] A inoculação é Dia 0 do experimento.

[00098] Em cada narina, 3 ml do material de teste foram administrados intranasalmente por seringa sem agulha. Cada vez uma seringa estéril nova foi tomada. Administração foi executada durante a fase de aspiração para minimizar a perda de fluido por meio da expiração do material.

observações Pós-lnoculacão Coletânea e Exame das Amostras de Sangue

[00099] Sangue foi colhido seguindo os procedimentos assépticos padrões (desinfetando o sítio da hemorragia). Uma seringa estéril nova e agulha foram usadas para cada animal.

Coletânea de Sangue para Preparar o Soro

[000100] Pelo menos 10 ml de sangue foram colhidos imediatamente das novilhas antes da inoculação, depois semanalmente após infecção e na terminação do estudo. Soro foi armazenado a -20° C até requerido.

Coletânea de Sangue para Contagens de Leucócitos e Preparações de Revestimento Tamponante

[000101] Para contagens de leucócitos, 3 ml de sangue foram transferidos imediatamente após a coletânea para vasos estéreis adequados (Venoject, Terumo Europa N. V., Leuven, Bélgica), pré-enchidos com 0,06 ml de EDTA (0,235 MOL/L).

[000102] Para preparações de revestimento tamponante, pelo menos 15 ml de sangue foram transferidos imediatamente após a coletânea para vasos estéreis adequados, pré-enchidos com 0,1 ml de solução de Heparina (heparina de Na para inj., 5 000 IU/ml lote: A7B163A. Data de expedição: 11/2000: Gedeon Richter RT, Budapeste, Hungria) rendendo pelo menos 20 IU de Heparina por ml de sangue na amostra de sangue. O conteúdo foi depois disso cuidadosamente misturado.

[000103] Para preparação de revestimentos tamponante e contagem de leucócitos, sangue foi colhido das novilhas • diariamente, entre o Dia 0 e Dia 14 após infecção; • a cada segundo dia, entre o Dia 15 e Dia 40, ou até que todos os animais estivessem negativos para isolamento do vírus para três pontos de tempo de amostragem sucessivos.

Preparação do Soro

[000104] Sangue foi deixada coagular-se em temperatura ambiente, e separado através de centrifugação. Cada amostra de soro foi dividida em duas alíquotas de pelo menos 2 ml cada. Um grupo de alíquotas foi ensaiado para anticorpos específicos de BVDV por ELISA. O resto dos soros foi congelado e armazenado a -20° C até requerido.

Contagens de Leucócitos

[000105] Contagens de leucócitos foram determinadas com um dispositivo eletrônico semi-automatizado de contador de coulter (Diatron Mini- cell-16, Messtechnik GmbH, Wien, Áustria) com uma precisão reivindicada de 0,1 x 109 /1.100 / pl. O instrumento foi usado (calibração e conta- gens de leucócitos) de acordo com as recomendações do fabricante. Preparação dos Revestimentos Tamponantes

[000106] As amostras de sangue de heparina foram transportadas o mais cedo possível para o laboratório. Procedimento de preparação do revestimento tamponante, seguindo um procedimento de laboratório padrão, foi executado sob condições assépticas (pipetas estéreis, ma-nipulação, banca limpa etc.).

[000107] Os revestimentos tamponantes obtidos foram re-suspensos em um volume pequeno (2 ml) de RPMI 1640 e congelados a -70° C em duas alíquotas de 0,5 ml. Os revestimentos tamponantes residuais de 1 ml foram imediatamente usados para determinação de BVDV associado à célula sangüínea através de co-cultivo em uma cultura de célula permissiva.

Teste de ELISA de Anticorpo de Soro de BVD

[000108] Cada amostra de soro foi testada para a presença de anticorpos de BVDV usando um teste de ELISA adequado e válido (teste de anticorpo de BVDV Svanovir™ Cat número 10-2200-10). Teste foi validado e executado de acordo com as recomendações do fabricante. As amostras positivas foram diluídas de acordo com a escala de Iog2 para determinar titulações de anticorpo de BVDV.

Ensaio(s) de Antíqeno de BVD

[000109] Cada amostra de revestimento tamponante foi ensaiada para a presença de BVDV através de co-cultivo dos revestimentos tamponantes recentemente preparados com células suscetíveis ou uma linhagem de célula. Nenhuma congelação foi permitido antes do co-cultivo.

[000110] Plasma foi colhido e fornecido para Man-Gene de cada amostra.

Observações Clínicas Observação das Novilhas

[000111] Animais foram examinados diariamente do Dia 0-42 pós inoculação para a presença de sintomas clínicos por um veterinário suficientemente treinado.

[000112] Todos sinais clínicos foram registrados e descritos por sua natureza, consistência/toque, severidade (moderada, média ou severa), localização, tamanho da área afetada, e eles serão registrados de acordo com as definições concordantes e padrões. Foi prestada atenção especial aos sinais respiratórios (respiração, sua taxa; descarga nasal ou ocular; conjuntivite, espirro, tosse, etc.) e diarréia.

Temperaturas Retais

[000113] As temperaturas retais foram medidas diariamente em cada novilha, na mesma hora do dia (preferivelmente pela manhã) de 5 dias antes da inoculação até 21 dias pós infecção.

[000114] Medição diária da temperatura retal foi continuada até que cada animal tivesse temperaturas retais abaixo ou iguais a 39° C por pelo menos 3 dias sucessivos.

Detecção de Prenhez Interrompida

[000115] Prenhez foi confirmada e suspeita por aborto ou ressorção do feto foi estabelecida através de exame retal. Um veterinário treinado examinou todos os animais na inoculação, 1 e 2 meses pós- inoculação. O exame foi realizado de acordo com a prática veterinária em geral aceita.

[000116] As novilhas foram examinadas diariamente por qualquer sinal de aborto até terminação do estudo (8-12 semanas pós- desafio).

Terminação do Estudo

[000117] O estudo foi terminado abatendo as novilhas e extraindo os fetos. Os fetos foram transferidos e o material fetal em recipientes de transporte fechados marcado com o número da vaca e a data/hora. Os recipientes foram transportados para um quarto de necropsia selecionado.

[000118] Necropsia das novilhas não foi requerida. Necropsia será executada em fetos, as descobertas registradas e um painel de amostras colhido como descrito abaixo.

Autópsia

[000119] Uma necropsia detalhada dos animais experimentais foi feita em cada caso de morte.

[000120] Autópsias foram realizadas por um cirurgião veterinário ex-periente e os dados foram registrados em folhas de dados apropriadas. Testes de laboratório foram também executados de acordo com os sinais clínicos e as lesões observadas. Se a diagnose da necropsia referiu a uma doença causada por agente microbiano aquela diagnose foi verificada por um teste apropriado, específico para o agente.

[000121] Cada amostra de tecido foi colhida em pelo menos 2 recipientes separados, marcados e congelados rapidamente em nitrogênio líquido. As amostras foram armazenadas a -70° C até requerido.

Fetos Abortados e Terminação do Estudo

[000122] Pelo menos as amostras de tecido a seguir foram colhidas dos fetos: • exsudato da cavidade versadoneal ou tórax, se presente, • linfonodos mesentéricos, • baço, • timo, • cerebelo, • rim, • medula óssea do esterno, • amostra da placenta, se disponível. Novilhas Mortas ou Sacrificadas Pelo menos as amostras de tecido a seguir foram colhidas: • sangue para revestimento tamponante, se disponível, • sangue para soro, se disponível, • emplastos de Peyer, • linfonodos mesentéricos, • baço, • rim, • útero, incluindo uma amostra da placenta, se disponível. Armazenamento e Transporte das Amostras

[000123] As amostras foram enviadas para análise de laboratório como requerido pelo patrocinador. A escolha das amostras e a temporização do transporte foram de acordo com o monitor de estudo ou o gerenciador do projeto. Como um questão de princípio geral, as amostras vindo do material abortado ou de bezerros recém-nascidos foram investigadas o mais cedo possível.

Resultados Mortalidade

[000124] Novilha N° 626 (grupo 1) morreu no Dia 13 Pl (pós inoculação). A tabela a seguir resume os sinais clínicos observados e lesões descritas durante a necropsia:

[000125] Estas descobertas clínicas e patológicas macroscópicas são consistentes com as lesões induzidas por BVDV, portanto pode ser concluído que a razão de morte foi a infecção por BVDV.

Abortos Após Infecção

[000126] Uma novilha teve aborto clínico em cada grupo. Novilha N° 615 (grupo 1) abortou no Dia 38 PI, Novilha N° 469 (grupo 2) abortou no Dia 39 PI. Ambos os fetos mostraram os sinais de autólise, e eles foram estimados morrer pelo menos 3-7 dias antes do aborto (por volta de 32 - 35 DPI).

[000127] No Grupo 1, nenhum feto foi encontrado na Novilha N° 526 durante o exame de matança na terminação. Patologia macroscópica do útero revelou o seguinte: • o corno uterino direito foi aumentado ligeiramente, • os restos da placenta com autólise progressiva foram retidos no lúmen.

[000128] As descobertas no útero da Novilha N° 526 são consistentes com um aborto "silencioso", o mais provavelmente devido à infecção por BVD.

Observação Clínica das Novilhas

[000129] Um sumário dos dados de observação clínica e duração de sinais clínicos nos grupos é apresentado abaixo.

[000130] Sinais Clínicos e os Dias Pós Inoculação (DPI) quando eles foram Observadas Grupo 1 (XIKE-A)

* Novilha N° 626 morreu no Dia 13 PI GRUPO 2 (XIKE-B)

[000131] Todos os animais do Grupo 1 infetados com XIKE-A exibiram um espectro vasto de sinais clínicos. Sinais respiratórios apareceram acompanhados por perda de apetite primeiro, e alguns dias as novilhas posteriores desenvolveram diarréia com a exceção da Novilha N° 526. Uma novilha morreu e uma outra abortou (ver antes) após infecção. Todos estes sinais são consistentes com os sintomas esperados após infecção com uma cepa de BVDV virulenta.

[000132] Todos os animais do Grupo 2 infetados com XIKE-B estavam livres de sinais clínicos. Ao mesmo tempo, uma novilha teve aborto durante o período de observação.

TEMPERATURAS RETAIS

[000133] Nenhuma alteração de temperatura anormal foi detectada antes da infecção dos animais. No Grupo 2, todos os valores de temperatura permaneceram dentro da faixa fisiológica do Dia 0 ao Dia 21 após infecção. Todos os animais do Grupo 1 mostraram temperatura retal elevada após infecção que foi detectada entre os Dias 7-11 PI. Descobertas na Terminação do Estudo

[000134] Na terminação do estudo, os fetos foram examinados no abatimento. Nenhum feto foi restabelecido da Novilha N° 526 (ver se-ção 10.2 "Abortos após Infecção").

[000135] As descobertas a seguir foram observadas na necropsia dos fetos:

[000136] As descobertas sugerem que 2 animais do Grupo 1 (Novilhas N° 598 e N° 618) e um animal do Grupo 2 (Novilha N° 619) morreram várias semanas antes da extração, e assim eles podem ser considerados abortos.

Abortos Modificados por Descobertas Pós-Mortes

[000137] Após a autópsia não estava claro por que algumas das novilhas não tinham tido aborto. Fetos mortos deveriam ser considerados como abortos, portanto o quadro clínico foi modificado após a terminação do estudo como segue: Grupo 1

Grupo 2

Exame das Amostras de Sangue Contagem de Leucócitos

[000138] Contagem de WBC foi interrompida no Dia 26 Pl, como todos os animais ficaram negativos para isolamento do vírus para este ponto de tempo.

[000139] Valores de 0 DPI foram considerados como linha base individual para comparação. No Grupo 2, as contagens de leucócitos nunca foram a 40 % ou mais abaixo do valor de linha base até o término do período de observação (26 DPI).

[000140] No Grupo 1, um animal (Novilha N° 598) teve contagem de WBC abaixo da linha base de 40 % durante um dia.

Serologia

[000141] Nenhum dos animais selecionados teve anticorpo BVDV- específico em seus soros antes da infecção.

[000142] Após infecção, todas as novilhas sobreviventes do Grupo 1 desenvolveram anticorpos BVDV-específicos detectados de 3 semanas Pl e duraram até o término do período de observação em todos os animais de estudo. No Grupo 2, 4 fora 5 novilhas tiveram anticorpos BVDV-específicos detectados de 4 semanas Pl. Resposta de anticorpo mensurável durou apenas em 3 animais até o término do período de observação. Titulações foram inferiores no Grupo 2 que no Grupo 1.

Detecção de Vírus Através de Co-Cultivo Revestimentos Tamponantes

[000143] BVDV foi detectado em ambos os grupos. A duração de detecção do vírus é resumida abaixo. Todas as amostras foram co-cultivadas imediatamente após a coletânea, i. e. sem congelação.

AMOSTRAS DE TECIDO

[000144] A presença do virus de BVD na novilha morta e nos fetos está resumida abaixo: Novilha:

Fetos:

NT = não testado

[000145] As amostras foram co-cultivadas imediatamente após coletânea (i. e. sem congelação), exceto as marcadas com "número", das quais apenas amostras congeladas estavam disponíveis. Sumário de Dados Clínicos e de Laboratório Relacionados a BVD Grupo 1

NT: não testado Grupo 2

* Fetos eram autolisados na hora da amostragem

CONCLUSÃO:

[000146] O estudo visou avaliar a segurança de XIKE-A e XIKE-B em animais em prenhez. Dez novilhas prenhas foram selecionadas de um rebanho negativo de BVDV. Dois grupos de 5 novilhas foram incluídos na experimentação: um foi inoculado com XIKE-A o outro com cepa de vírus de XIKE-B. Novilhas estavam entre dias 60 e 90 de gestação no dia da inoculação.

[000147] As novilhas foram monitoradas para a presença de sinais clínicos de infecção por BVDV incluindo abortos durante o período de observação. As amostras de sangue foram colhidas dos animais para serologia, detecção de antígeno e células sangüíneas brancas foram contadas. O experimento foi terminado 9 semanas após infecção. As vacas não-abortadas foram abatidas, o útero examinado e colhido. As amostras de órgãos fetais foram colhidas durante necropsia rotineira e examinadas para infecção por BVDV.

[000148] A presença de infecção fetal era o parâmetro de avaliação principal, composto do número de mortalidade de vaca relacionada ao BVDV, o número de abortos relacionados ao BVDV e o número de fetos positivos de BVD na terminação. Além do parâmetro principal, a característica de sinais clínicos para infecção por BVDV, viremia e contagem de células sangüíneas brancas em vacas e a temperatura retal após desafio foram avaliados.

[000149] O vírus de XIKE-B provou ser menos patogênico que XIKE- A, não obstante aborto relacionado a BVD e infecção do feto foram observados no grupo de XIKE-B, também. Portanto, pode ser concluído que a inativação da RNase de Erns não impede infecção fetal. EXEMPLO 2 XIKE-A DE BVDV-NDN: AVALIAÇÃO DA FETOPATOGENICIDADE EM NOVILHAS PRENHAS

[000150] O gene de Npro foi mostrado ser não-essencial para o crescimento de CSFV em cultura de tecido (Tratschin et al., 1998). Embora uma prova para atenuação de BVDV por causa da deleção de Npro ainda esteja faltando, um papel desta proteína na interação entre vírus e hospedeiro parecia ser possível e foi indicado de fato através dos recentes experimentos para CSFV (Mayer et al., 2004; Rüggli et al., 2003). Quisemos investigar, portanto, se a deleção da parte principal da seqüência de codificação de Npro leva a um vírus que já não infeta o feto em novilhas prenhas. O gene de Npro com exceção dos 4 códons terminais de 5' foi deletado do clone de cDNA de comprimento total pKANE40A de acordo com os procedimentos padrão. O clone de comprimento total mutante resultante foi usado como modelo para transcrição in vitro e o cRNA resultante foi transfeccionado para células de MDBK como descrito (Meyer et al., 2002). O vírus restabelecido foi amplificado em cultura de tecido e depois usado no experimento animal descrito abaixo. XIKE-B de BVDV serviu como um controle uma vez que ele foi mostrado antes dele ser capaz de atravessar a placenta (EXEMPLO 1).

OBJETIVO(S)/PROPÓSITO DO ESTUDO

[000151] O estudo visa avaliar a segurança de um BVDV atenuado vivo com uma deleção genômica da maioria da região de codificação de Npro em animais em prenhez.

[000152] Material e Métodos aplicados são descritos no Exemplo 1 PROJETO DE ESTUDO

[000153] Oito novilhas prenhas foram atribuídas ao acaso a dois grupos. Elas foram tratadas e observadas de acordo com a programa ção a seguir:

RESULTADOS

[000154] Todas as novilhas estavam saudáveis e prenhas no começo do estudo. Todos os animais provaram estar livre de BVDV e anticorpos de BVDV antes da iniciação do.

PREPARAÇÃO E CONTROLE DO VÍRUS USADO PARA A INFECÇÃO

[000155] Amostras foram colhidas ao longo das etapas de diluição e ensaiadas no dia da preparação, isto é sem congelação através de co- cultivo em cultura de tecido adequada. Os resultados da titulação de vírus estão mostrados na tabela a seguir.

SINTOMAS CLÍNICOS DE INFECÇÃO POR BVDV

[000156] A tabela abaixo dá um sumário a cerca dos animais que tiveram sinais clínicos durante o período de observação.

[000157] Sinais clínicos e os dias pós inoculação (DPI) quando eles foram observados

[000158] Apenas sinais clínicos moderados e transientes foram observados em alguns dos animais em cada grupo.

[000159] No Grupo 1, uma entre as 5 novilhas tive perda de apetite no dia 8 Pl. No Grupo 2, dois entre 3 animais tiveram sinais clínicos. Ambas as novilhas experimentaram tosse por volta do dia 21 Pl que foi acompanhada com perda de apetite em um dos animais.

TEMPERATURAS RETAIS

[000160] Nenhuma alteração de temperatura anormal foi detectada antes da inoculação dos animais. Os poucos casos de temperaturas elevadas medidas após a inoculação estão resumidos na tabela abaixo.

[000161] Um animal teve temperatura ligeiramente elevada em cada grupo, e também um animal teve febre em cada grupo. Febre foi detectada no dia 8 ou 9 Pl. Os valores de temperatura sempre voltaram no dia seguinte para o valor normal.

CONTAGENS DE LEUCÓCITOS

[000162] Alguma leucopenia foi observada em todos os grupos entre os dias 3-8 Pl. O número de animais com pelo menos 40 % de redução na contagem de célula sangüínea branca era o seguinte:

SEROLOGIA (ANTICORPOS DE BVDV)

[000163] Conforme o protocolo do estudo, todas as novilhas estavam livres de anticorpos de BVDV antes da vacinação. No Grupo 1 (inoculado com XIKE-A NdN) e Grupo 2 (inoculado com XIKE-B), sorocon- versão completa foi detectada apenas na terminação do estudo (2 meses após inoculação). ISOLAMENTO DE VÍRUS DE BVD DOS REVESTIMENTOS TAMPO- NANTES Nenhuma viremia foi detectada ISOLAMENTO DE VÍRUS DE BVD DAS AMOSTRAS DE TECIDO FETAL

CONCLUSÃO

[000164] A deleção de Npro resultou em uma atenuação considerável do BVDV em comparação ao vírus parental XIKE-A que foi mostrado ser altamente patogênico (Meyer et al., 2002). Porém, a deleção de Npro sozinha não está impedindo a transmissão de um vírus com base em NY93 recombinante para o feto após a inoculação de vacas prenhas. EXEMPLO 3 XIKE-B-NDN DE BVDV: AVALIAÇÃO DA FOTOPATOGE NIC IDADE EM NOVILHA PRENHAS

[000165] Para ser capaz de testar o potencial de uma combinação de inativação de RNase e deleção de Npro com respeito à atenuação de BVDV e transmissão fetal, mutantes de BVDV-2 diferentes com dele- ções dentro da região de codificação de Npro foram estabelecidos com base no clone de cDNA infeccioso pKANE40B, o mutante negativo de RNase pKANE40A com uma deleção de códon 349. Os vírus restabelecidos foram analisados com respeito à presença das mutações desejadas, à ausência das mutações no segundo sítio nas regiões flanqueando as alterações introduzidas e suas características de crescimento em cultura de tecido. XIKE-B-NdN (V-pK88C), uma variante contendo uma deleção da região de codificação de Npro completa com exceção dos códons 1 a 4 além da RNase inativando a deleção do códon 349 foi escolhida para um experimento em animais uma vez que combinou com as mutações desejadas com características de crescimento acei- táveis. A meta do estudo foi avaliar a segurança de um isolado de BVDV atenuado vivo em animais em prenhez.

[000166] Cinco novilhas BVDV-negativas prenhas foram inoculadas intranasalmente com uma dose infecciosa de 105 TCID50/animal XI- KE-B-NdN (dados de retitulação estão descritos na Tabela 3.1). Dados clínicos foram registrados diariamente. As amostras de sangue foram colhidas para contagem de células sangüíneas brancas, para preparação do revestimento tamponante e serologia. Após terminação do estudo, os tecidos fetais foram colhidos para isolamento do vírus.

MATERIAL E MÉTODOS:

[000167] Como detalhado para o exemplo 1: RESULTADOS

[000168] Nenhum dado clínico foi observado (dados não mostrados). Contagens de leucócitos permaneceram virtualmente inalteradas com exceção de uma diminuição significativa em aprox. 40 % abaixo do valor de linha base (dia 0) na novilha no -1015 em um único dia (dia 6 p.i.) (dados não mostrados).

ANÁLISE DE PREPARAÇÕES DE REVESTIMENTO TAMPONANTE:

[000169] Aproximadamente 106leucócitos foram cultivados em duplicatas com células de MDBK em placas de cultura de tecido de 24 cavidades durante 5 dias. As amostras foram congeladas-descongeladas duas vezes. Alíquotas de cem microlitros das amostras descongeladas foram inoculadas sobre as placas de cultura de tecido 24 cavidades recentemente semeadas e testadas para vírus por mancha por imunofluo- rescência indireta (mAb Código 4, direcionado contra um epítopo conservado na proteína não-estrutural NS3). Nenhum BVDV poderia ser isolado das preparações de revestimento tamponante dos animais número 921, 1013, 1015, 1055 e 1075 (Tabela 3.2) enquanto que os controles positivos claramente mostraram a condução correta do teste.

B) AUTÓPSIA DOS TECIDOS FETAIS

[000170] Após terminação do estudo os tecidos fetais a seguir foram colhidos para isolamento do vírus: baço, rim, timo, esterno, cerebelo, pla-centa, intestino e fluido abdominal. Brevemente, suspensões de tecido foram feitas em um morteiro usando areia do mar estéril e PBS esfriado em gelo sem Ca2+ e Mg2+. Os morteiros foram enxaguados com 1 ml de PBS esfriado em gelo sem Ca2+ e Mg2+ e as suspensões foram centrifugados por 10 min. a 2000 x g (4o C). O sobrenadante foi passado primeiro através de um retentor de filtro descartável de 0,45 pm, seguido por uma segunda passagem de filtro (tamanho de poro de 0,2 pm). Isolamento do vírus foi realizado em duplicatas (400 pl de suspensão de tecido fetal ou 100 pl de fluido abdominal fetal) em uma monocamada de células de MDBK em uma placa de cultura de tecido de 24 cavidades (37° C, 7 % de CO2). Amostras de tecido foram controladas diariamente para efeitos citopáticos ou contaminação bacteriana, e após um tempo de incubação de 5 dias, as placas foram congeladas e descongeladas duas vezes. 100 pl de amostras foram passados nas células de MDBK recentemente semeadas. Vírus foi detectado por mancha por imunofluo- rescência indireta (mAb Código 4). Nenhum BVDV poderia ser detectado nas amostras de tecido ou fluido abdominal fetal (Tabela 3.3).

C) DESCOBERTAS SEROLÓGICAS

[000171] Titulações de neutralização de soro foram determinadas antes da inoculação, 1 mês pós-inoculação e na terminação do estudo. Soros de todos os animais foram testados em triplicata para neutralizar os anticorpos contra NY93/C, e a diluição de ponto terminal foi lida por mancha por imunofluorescência indireta. Resultados foram expressados como a diluição de ponto terminal, que neutralizou aproximadamente 100 TCID50 e calculado pelo método de Kaerber. Nenhum dado definido poderia ser obtido durante o dia 0, e 1 e 2 semanas pós infecção visto que os soros eram tóxico às células de MBDK em diluições até 1:16 e nenhuma neutralização poderia ser detectada em diluições mais altas. Iniciando com a pós vacinação da terceira semana, todos os animais desenvolveram anticorpos de neutralização contra o vírus de BVDV-2 homólogo NY'93/C durando até o término do experimento (Tabela 3.4 e figura 1).

D) CONCLUSÕES

[000172] Os dados obtidos durante o estudo em animais claramente mostram que XIKE-B de BVDV-NdN representa um vírus altamente atenuado. Em contraste com o vírus do tipo selvagem ou os mutantes simples XIKE-B ou XIKE-A-NdN que mostram transmissão fetal em no-vilhas prenhas em taxas altas o mutante duplo não atravessou a placenta. XIKE-B de BVDV-NdN como também mutantes duplo similares são extremamente adequados para o uso em um vacina viva atenuada. ESTUDO N°: B01 BIVI020 E B01 BIVI022 TABELA 3.1: RETITULAÇÃO DOS VÍRUS

TABELA 3.2 (1a parte) DETECÇÃO DE VIREMIA

TABELA 3.2 (2a parte)

- amostra negative TABELA 3.3 (1a parte) ANÁLISE DAS AMOSTRAS DE TECIDO DE FETO PARA A PRESENÇA DE BVDV

TABELA 3.3 (2a parte)

NC = Não colhido -= amostra negative TABELA 3.4: B01 BIVI022 / XIKE-B DE BVDV-NDN; ESTUDO DE PROTEÇÃO FETAL (1a parte) ENSAIO DE NEUTRALIZAÇÃO DE SORO

TABELA 3.4: B01 BIVI022 / XIKE-B DE BVDV-NDN; ESTUDO DE PROTEÇÃO FETAL (2a parte)

(1)SNT contra 1456 Nase (= NY93/C) 102 03 TCID50 / 50 pl (2)SNT contra 1456 Nase (= NY93/C) 10157 TCID50 / 50 pl * Soro tóxico para células de MBDK em diluições até 1:16 ■=> nenhum dado disponível NAdados não disponíveis

[000173] O Soro Ensaio de Neutralização contra NY93/C é ilustrado na figura 1.

EFICÁCIA E ESTUDO DE PROTEÇÃO CRUZADA

[000174] Dois possíveis problemas têm que ser enfrentados com respeito à vacinação com mutantes de vírus atenuados XIKE-B de BVDV ou XIKE-B de BVDV-NdN. Primeiro, há um problema geral relativo à proteção transversal entre BVDV-1 e BVDV-2. Pelo menos vacinação com vacinas de BVDV-1 inativado não impediu a transmissão de BVDV-2 para o feto em animais em prenhez. Considerando que a proteção contra infecção fetal representa a meta principal de vacinação anti-BVDV, tais vacinas não podem ser consideradas para induzir uma imunidade protetora em uma faixa vasta. A questão foi, portanto, se vacinação com BVDV-2 atenuado vivo pode impedir transmissão de vírus para o feto. Segundo, as taxas de crescimento reduzidas de XI- KE-B de BVDV-NdN poderiam resultar em apenas um baixo nível de proteção incapaz de impedir infecção transplacental do feto em novilhas prenhas. Para focalizar estes problemas, foi iniciado um estudo animal. Os animais (2 grupos de 10 animais cada) ou foi vacinado com XIKE-B de BVDV ou XIKE-B-NdN (dosagem intencionada: 1 ml de so- brenadante com 105 TCID50 de vírus; retitulação é mostrada na Tab. 3.5). Nenhum dos animais mostrou sinais clínicos significativos após a vacinação com exceção de um animal do grupo de controle não- vacinado com tosse moderada durante um dia. Valores da temperatura retal foram abaixo de 39° C com exceção de um animal do grupo de controle não-vacinado que teve 39,1° C durante um dia. Amostras de revestimento tamponante preparadas após a vacinação foram analisadas pela presença de vírus como descrito acima. Os experimentos mostraram que apenas 5 dos 20 animais continham vírus no sangue durante 1 ou 2 dias a 4 a 8 dias pós infecção (Tab. 3.6). TABELA 3.5: RETITULAÇÃO DE VÍRUS USADO PARA A VACINAÇÃO

ESTUDO N° / Id.: B01 BIVI020 / BVDV Tü XIKE-B/XIKE-B-NdN; ES TUDO DE PROTEÇÃO FETAL TABELA 3.6: INOCULAÇÃO COM CÉLULA SANGUÍNEA BRANCA (REVESTIMENTO TAMPONANTE) PREPARAÇÕES COLHIDAS APÓS A VACINAÇÃO 1a parte

2a parte

1a parte

2a parte

Mancha por imunofluorescência: Código 4 0amostra negativa +amostra positiva Bcontaminação bacteriana na cavidade Código de números dos animais: (1) vacinação com XIKE-B de BVDV (mutante de RNase) (2) vacinação com XIKE-B de BVDV-NdN (mutante duplo de RNase e NPro)

[000175] Quatro semanas após a vacinação, inseminação dos animais foi realizada. Infecções de desafio foram executadas depois de 60 a 90 dias usando ou uma cepa de BVDV-1 (BVDV KE-9, desafio heterólogo, animais vacinados com XIKE-B) ou uma cepa de BVDV-2 heteróloga (BVDV KE-13, desafio homólogo, animais vacinados com XIKE-B-NdN) (dosagem intencionada: 105 TCID50 em 6 ml; retitulação é mostrada na Tab. 3.7). De cada grupo de animais vacinados 5 novilhas prenhas foram fortuitamente selecionadas para a infecção de desafio. Os animais vacinados foram desafiados com XIKE-B de BVDV com a cepa de KE-p de BVDV-1, enquanto que as novilhas vacinadas com XIKE-B de BVDV/NdN foram desafiadas com KE-13 de BVDV-2. Além disso, 2 animais de controle não-vacinados foram infetados com cada um dos vírus de desafio. ESTUDO N° / Id.: B01 BIVI020 / BVDV Tü XIKE-B-NdN; ESTUDO DE PROTEÇÃO FETAL TABELA 3.7: RETITULAÇÃO DE VÍRUS DE DESAFIO

Amostra 1: matéria-prima do inóculo Amostra 2: matéria-prima do inóculo retornado do estável Amostra 3: inóculo em excesso 1 Segunda inoculação de KE9, amostra 2 não foi interpretá- vel por causa de morte celular. 2 * KE9, amostra 3 não foi interpretável por causa de morte celular ou contaminação bacteriana. 3 ** Primeira inoculação de KE13, amostra 3 não foi interpre-tável por causa de contaminação bacteriana.

[000176] Os animais vacinados não mostraram viremia ou sintomas clínicos na infecção de desafio. O desafio teve êxito como todos os controles não-vacinados controles eram BVDV positivo (Tab. 3.8). Apenas sinais moderados da doença foram observados nos grupos de controle. As contagens de células sangüíneas brancas foram quase normais (não mostradas). ESTUDO N° / Id.: B01 BIVI020 / BVDV Tü XIKE-B/XIKE-B-NdN; ES-TUDO DE PROTEÇÃO FETAL TABELA 3.8: INOCULAÇÃO COM CÉLULA SANGÜÍNEA BRANCA (REVESTIMENTO TAMPONANTE) PREPARAÇÕES COLHIDAS APÓS O DESAFIO 1a parte

2a parte

1a parte

2a parte

Mancha por imunofluorescência: Código 4 0amostra negativa +amostra positiva Bcontaminação bacteriana na cavidade Código de números dos animais: (1)vacinação com XIKE-B de BVDV (mutante de RNase) (2)vacinação com XIKE-B de BVDV-NdN (mutante duplo de RNase e NPro) (3)controles não-vaci nados

[000177] Titulações de neutralização de soro foram determinadas antes da inoculação, 1 mês pós-inoculação, antes do desafio, 1 mês após desafio e a terminação do estudo. Soros de todos os animais foram testados em triplicata para neutralizar os anticorpos contra KE9 e NY93/C (1456Nase), e a diluição de ponto terminal foi lida mancha por imunofluorescência indireta. Os resultados foram expressos como a diluição de ponto terminal que neutralizou aproximadamente 100 TCID50 e calculados pelo método de Kaerber. Em algumas das titula-ções de anticorpo mais altas, a diluição de ponto terminal usada não foi bastante alta. Contra KE9, apenas animais vacinados com XIKE-B desenvolveram baixas titulações de anticorpo iniciando cerca da semana 4. No desafio, todos os animais tiveram titulações de anticorpo que aumentaram consideravelmente iniciando por volta da semana 4 pós desafio. Animais vacinados com XIKE-B tiveram titulações de anticorpo mais altas depois que os vacinados com XIKE-B-NdN. Todos os animais desenvolveram cerca da mesma titulação de neutralização contra NY93/C quatro semanas pós vacinação, com titulações marginalmente inferiores em animais vacinados com XIKE-B-NdN. Após desafio, todos os animais tiveram titulações de anticorpo altas, figura 2 mostram o ensaio de neutralização de soro contra KE9 (BVDV-1) e figura 3 mostra o ensaio de neutralização de soro contra NY93/C (BVDV-2).

[000178] Análise das amostras de tecido obtidas após terminação do estudo dos fetos revelou que o material obtido dos animais vacinados deram resultados negativos enquanto que a transmissão tinha ocorrido em todos os 4 animais de controle (Tabela 3.9). Desse modo, está claro que os mutantes de BVDV-2 estabelecidos são bem adequados como eficientes versus vírus de vacina protetora. ESTUDO N° / Id.: B01 BIVI020 / BVDV Tü XIKE-B/XIKE-B-NdN; ES TUDO DE PROTEÇÃO FETAL TABELA 3.9: ANÁLISE DAS AMOSTRAS DE TECIDO DE FETO PA RA A PRESENÇA DE BVDV 1a parte

2a parte

1a parte

2aparte

NA = não disponível 1 Nenhum feto foi encontrado no útero da novilha número 1218 2 * Endométrio (também colhido para histologia) 3 ** Amostra não foi enviada para BFA Tübingen Código de números dos animais: (^vacinação com XIKE-B de BVDV (mutante de RNase) (2)vacinação com XIKE-B de BVDV-NdN (mutante duplo de RNase e Npro) (3)controles não-vaci nados

CONCLUSÃO

[000179] O desafio teve êxito como todos os controles não- vacinados eram virêmicos de BVDV e fetos de todos controles não- vacinados eram BVDV positivo.

[000180] Ambos isolados deram proteção total sob as condições de teste e de ensaio presentes. Isolado XIKE-B, com o marcador genético simples foi mostrado proteger cruzado contra desafio de BVDV do tipo 1 em termos de viremia de BVD e transmissão para o feto após desafio. Isolado XIKE-B-NdN com o marcador genético duplo pôde proteger completamente contra uma cepa de desafio de BVDV do tipo 2 heteró- logo em termos de viremia de BVD e transmissão para o feto após o desafio. 1. Isolado XIKE-B (isolado do tipo 2) foi mostrado proteger cruzado contra desafio de BVDV do tipo 1 em termos de viremia de BVD e transmissão para o feto após o desafio sob as condições de teste e ensaio presentes (n=4). 2. Isolado de XIKE-B-NdN (isolado do tipo 2) completamente protegeu contra uma cepa de desafio de BVDV do tipo 2 heteróloga em termos de viremia de BVD e transmissão para o feto após o desafio sob as condições de teste e ensaio presentes (n=5).

EXEMPLO 4 ESTABELECIMENTO DE MUTANTES DE NPro

[000181] Outras análises de mutantes de BVDV-2 com deleções de Npro. Mutantes diferentes com deleções na região de codificação de Npro do genoma foram estabelecidos. Inicialmente, apenas verdadeiras deleções ou uma deleção acompanhada por uma mutação de ponto foram introduzidas. A:[NPro]i-[C-term]; B:[Npro]3-[C-term]; C:[Npro]4-[C-term]; D:[Npro]6-[C-term]; E:[Npro]4-[C-term*];

[000182] Nas fórmulas [Npro]xrepresenta o número de resíduos do término amino de Npro, que é deixado nos aminoácidos de poliproteína mutada, [C-term] é a poliproteína completa com exceção de Npro(inici-ando com a proteína C e terminando com NS5B) e [C-term*] é igual a [C-term] mas com uma mutação na posição 2 da proteína C (N em vez de D).

[000183] As taxas de crescimento dos vírus restabelecidos foram consideravelmente inferiores que os de XIKE-A do tipo selvagem ou a XIKE-B de mutante negativo de RNase. Há duas possíveis explanações para esta descoberta: (i) dependendo da cepa de vírus, as seqüências de comprimento variável da região de codificação de Npro são necessárias para iniciação de translação eficiente (Myers et al., 2001; Tautz et al., 1999) e (ii) a fusão das seqüências adicionais no término amino da proteína de capsídeo interfere com a função da proteína de capsídeo.

[000184] Para obter melhor crescimento dos mutantes de deleção de Npro, um segundo conjunto de mutantes foi gerado com um gene de ubiquitina bovina ou um fragmento da seqüência de codificação de LC3 bovina que substitui a parte principal do gene de Npro. Estes cons- tructos permitem translação eficiente e geram uma proteína de capsídeo com o término amino correto. [Npro]22-[PS]-[C-term] em que PS é ubiquitina ou LC3, C-term é a poliproteína completa com exceção de Npro (iniciando com a proteína C e terminando com NS5B).

[000185] As taxas de crescimento destes mutantes foram mais similares ao que foi determinado para XIKE-A. Parecia até mesmo que o dois vírus positivos de RNase de acordo com a fórmula [Npro]22-[PS]- [C-term] nomeados V-pK87F e V-pK87G não mostraram nenhum re-tardamento de crescimento significativo, enquanto que a contraparte negativa de RNase V-pK88G foi uma vez impedida um pouco na pro-pagação mas a uma proporção menor que os mutantes antigamente descritos.

[000186] Outros exemplos de mutantes de deleção de Npro podem ser: MESDEGSK... MELFSSDEGSK... MELFSNESDEGSK... MELFSNELSDEGSK... MELFSNELLSDEGSK... MELFSNELLYSDEGSK... MELFSNELLYKSDEGSK... MELFSNELLYKTSDEGSK... MELFSNELLYKT representa a seqüência amino-terminal de Npro do isolado de BVDV NewYork93/C.

[000187] Pode também ser possível usar variantes desta seqüência com uma ou várias mutações. Especialmente as variações de ocorrência natural como encontradas em outros pestivírus podem ser esperadas ser funcionais. Portanto, a lista completa das variantes testadas ou propostas com as partes diferentes da extremidade amino- terminal de Npro pode ser aumentada pelos conjuntos de equivalentes com permutas de aminoácido. Abaixo, exemplos típicos das respectivas seqüências são dados para vários pestivírus mas as possíveis variações não são limitadas a estes exemplos. BVDV NewYork93/C :/WE/_FSWE/_/_YKT BVDV CPU: MELISNELLYKT BVDV SD1 :MELITNELLYKT CSFV Brescia: MELNHFELLYKT BDV XM3:MELNKFELLYKT Desse modo, estas variantes por exemplo podem incluir: ME/_/S-[PS]o-[C-term]; /WE/_/S/V-[PS]o-[C-term]; /WE/_/SA/E-[PS]o-[C-term]; ME/_/SA/E/_-[PS]o-[C-term]; /WE/_/SA/E/_/_-[PS]o-[C-term]; /WE/_/SA/E/_/_Y-[PS]o-[C-term]; MELISNELLYK-[PS]0-[C-iem]-, MELISNELLYKT-[PS]o-[C-iem]', ME/_/T-[PS]o-[C-term]; /WE/_/TA/-[PS]o-[C-term]; /WE/_/TA/E-[PS]o-[C-term]; /WE/_/TA/E/_-[PS]o-[C-term]; MELITNELL-[PS]o-[C-tem]-, MELITNELLY-[PS]o-[C-tem]-, MELITNELLYK-[PS]o-[C-tem]-, MELITNELLYKT-[PS]o-[C-tem]-,

[000188] Estas fórmulas podem também ter [PS]i, isto é PS pode também ser um do PS como descrito aqui.

[000189] Seqüências que pertencem à proteína de Npro estão em itálicos. Trocas de aminoácido com respeito à seqüência de BVDV NewYork93/C está em negrito.

[000190] Outros exemplos podem ser encontrados por exemplo usando os GenBank acesso números cedidos Becher et al., 2003, Virology 311, 96-104) ou através de pesquisas de dados de seqüência padrão.

[000191] Uma possibilidade também poderia ser o uso de um sinal de processamento (PS) inseriu entre o (residual) seqüência de Npro e o término amino da proteína de capsídeo. O PS leva a uma divagem que gera uma proteína de capsídeo funcional. A configuração de tais constructos poderia ser como segue: [Npro]22-PS[C-term]

[000192] PS: Sinal de processamento. Pode ser um alvo para uma protease (por exemplo ubiquitina, LC3 como definida aqui ou uma pro-tease ou um peptídeo instável que levam a processar em seu próprio término carbóxi como por exemplo inteína (Chong et al. 1998 e refe-rências nele) ou 3C de picornavírus, 2A de cardiovírus ou aftovírus, p15 do vírus de doença hemorrágica de coelho ou a protease correspondente de outros calicivírus (Proter 1993, e referências nele; Meyers et al., 2000 e referências nele).

[000193] Quando usar um PS, um número grande de variantes diferentes é possível uma vez que o PS assegura a geração do término amino correto da proteína C de capsídeo. Desse modo, quando usar um constructo de PS, todos os tipos de deleções ou mutações da seqüência de Npro são esperados resultar em mutantes viáveis contanto que a estrutura de leitura não seja deslocada ou translação parada por um códon de parada dentro da estrutura. Como um exemplo, se estabelece um mutante de deleção de Npro de CSFV viável de acordo com a fórmula [Npro]29-PS[C-term]

[000194] Especialmente interessante poderia ser as mutações de Npro que bloqueiam a atividade proteolítica da proteína. Rümenapf et al. (1998) publicou a identificação dos resíduos de sítio ativo da protease por CSFV Alfort Tübingen. Os respectivos aminoácidos (ácido glutâmico na posição 22, histidina na posição 49 e cisteína na posição 69) são conservados para outros pestivírus. Desse modo, permutas de qualquer aminoácido esperado para serina ou treonina para a cisteína na posição 69 resultará em destruição da atividade de protease. Similarmente, alterando o ácido glutâmico na posição 22 mais provavelmente resultará em inativação da protease a menos que o aminoácido novo seja ácido aspártico. Similarmente a maioria se não todas as permutas na posição 49 conduzirão a uma protease inativa.

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Claims (11)

1. Pestivírus atenuado, caracterizado pelo fato de que tem pelo menos uma mutação na sequência de codificação para glicopro-teína Erns e pelo menos outra mutação na sequência de codificação para NPro, em que a referida mutação na sequência de codificação para glicoproteína Erns leva à inativação da atividade de RNase que reside em Erns e a referida mutação na sequência de codificação para NPro leva à inativação da referida Npro, em que a referida mutação na sequência de codificação da glicoproteína Erns é uma deleção ou substituição de histidina na posição 349, em que a proteína Npro foi deletada, exceto os quatro pri-meiros aminoácidos (MELF) resultantes da inativação da referida pro-teína Npro, e em que o referido pestivírus é um mutante do vírus da diar-réia virai bovina (BVDV) tipo 2 correspondente à sequência da SEQ ID NO: 8.

2. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o vírus, como definido na reivindicação 1, e uma solução.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 2, caracteri-zada pelo fato de que induz uma resposta imunológica em um animal.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, ca-racterizada pelo fato de é uma vacina.

5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 2 a 4, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

6. Uso de um vírus, como definido na reivindicação 1, ca-racterizado pelo fato de que é para a fabricação de uma vacina para a profilaxia e tratamento de uma infecção por pestivírus.

7. Uso de um vírus, como definido na reivindicação 1, ca- racterizado pelo fato de que é para a fabricação de uma vacina para a profilaxia e tratamento de uma infecção por BVDV.

8. Molécula de ácido nucléico, caracterizada pelo fato de que compreende o ácido nucléico correspondendo à SEQ ID NO: 4.

9. Método para atenuar pestivírus, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma mutação na sequência de codificação para glicoproteína Erns e pelo menos outra mutação na sequência de codifi-cação para Npro são geradas em um pestivírus.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas a seguir: a) transcrição reversa de uma sequência de nucleotídeo de pestivírus do tipo selvagem em um cDNA; b) clonagem do referido cDNA; c) introdução das mutações selecionadas dentre o grupo de deleções, mutações de inserção e/ou mutações de substituição no re-ferido cDNA, em que as referidas mutações estão localizadas na se-quência de codificação que codifica a glicoproteína Erns e a protease Npro, d) incorporação do cDNA em um plasmídeo ou em um vírus de DNA capaz de direcionar a transcrição de cDNA de pestivírus em RNA in vitroou sob infecção das células adequadas.

11. Método, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, carac-terizado pelo fato de que o referido pestivírus é BVDV.

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