CN106795484A

CN106795484A - 用于在产生岩藻糖基化低聚糖时使用的α(1，2)岩藻糖基转移酶变种

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Publication number: CN106795484A
Application number: CN201580028020.2A
Authority: CN
Inventors: J·M·麦科伊; M·I·海特曼; M·梅里吉
Original assignee: Gerry Too LLC
Current assignee: Gerry Too LLC
Priority date: 2014-05-15
Filing date: 2015-05-14
Publication date: 2017-05-31
Anticipated expiration: 2035-05-14
Also published as: EP3083938A4; JP2022173457A; MX2016014807A; NZ722185A; JP2017515455A; CN106795484B; CA2945661A1; US11046984B2; SG10202010599TA; SG11201609366TA; US20220056497A1; EP4293033A3; EP4293033A2; KR20170035835A; AU2015259088A1; EP3083938B1; WO2015175801A9; AU2015259088A2; EP3083938A1; WO2015175801A1

Abstract

本发明提供了用于设计大肠杆菌或者其他产生岩藻糖基化低聚糖的宿主生产细菌的组合物和方法，及其在预防或者治疗感染中的应用。

Description

用于在产生岩藻糖基化低聚糖时使用的α(1，2)岩藻糖基转移酶变种

技术领域

本发明提供了用于产生纯化的低聚糖的组合物和方法，尤其是某些通常在人类乳汁中发现的岩藻糖基化的低聚糖。

技术背景

人类乳汁中包含多种多样的种类丰富的中性和酸性低聚糖。已经在人体中确认超过130种不同的复合低聚糖，并且他们的结构多样性和分布量是人类独有的。虽然这些分子可能不能直接作为营养被婴儿利用，然而当建立健康的内脂生物微环境时、在预防疾病时和在建立免疫功能时，他们就能起到关键的作用。在这里所描述的发明之前，廉价地产生人类乳汁低聚糖(HMOS)的能力是存在问题的。例如，由于立体-特异性问题、前体有效性问题、产物不纯的问题和高成本问题，他们通过化学合成的生产受到了限制。因此，对廉价的生产大量人类乳汁低聚糖(HMOS)的新方法存在迫切需要。

发明内容

本发明的特征在于一种有效的并且经济的方法，用于产生岩藻糖基化的低聚糖。使用分离的核酸完成这种岩藻糖基化的低聚糖的产生，所述分离的核酸包括编码利用乳糖的α(1，2)岩藻糖基转移酶基因产物(例如，多肽或者蛋白质)的序列，这可操作的与一种或者一种以上异源的控制序列有关，所述控制序列指导重组岩藻糖基转移酶基因产物在宿主产生细菌，例如，大肠杆菌(E.coli)中的产生。

本发明公开的内容提供了一种新型的α(1，2)岩藻糖基转移酶(在这里也叫做α(1，2)FTs)，其可以利用乳糖并催化L-岩藻糖从GDP-岩藻糖供体底物传递到接受体底物中，并以α-1，2-键合。在一种优选的实施方案中，所述接受体底物是低聚糖。这里所确定并描述的α(1，2)岩藻糖基转移酶可以有效用于在宿主细菌中表达，用于产生人类乳汁低聚糖(HMOS)，例如岩藻糖基化的低聚糖。通过这里所描述的方法产生的示范性的岩藻糖基化的低聚糖包括2’-岩藻糖基乳糖(2’FL)、乳糖二岩藻四糖(LDFT)、乳-N-岩藻五糖I(LNF I)、或者乳-N-二岩藻六糖I(LDFH I)。这里所公开的“α(1，2)岩藻糖转移酶”包括α(1，2)岩藻糖基转移酶的氨基酸序列和编码所述α(1，2)岩藻糖基转移酶的核酸序列，以及显示α(1，2)岩藻糖基转移酶活性的变体及其片段。本发明还包括一种核酸构建物，所述核酸构建物包括一种分离的核酸，该分离的核酸编码接受乳糖的α(1，2)岩藻糖基转移酶，所述核酸选择性的与一种或者一种以上异源控制序列可操作的连接，指挥宿主细菌产生菌株中产生所述酶。

这里所描述的乳糖接受性α(1，2)岩藻糖基转移酶的氨基酸序列与螺杆菌幽门26695α-(1，2)岩藻糖基转移酶(futC或者SEQ IDNO：1)的氨基酸序列相比具有至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的同源性。优选的，这里所描述的乳糖-接受性α(1，2)岩藻糖基转移酶与螺杆菌幽门FutC或者SEQ IDNO：1具有至少22％的同源性。

在另一个方面，这里所描述的的乳糖-接受性α(1，2)岩藻糖基转移酶的氨基酸序列与普通拟杆菌α(1，2)岩藻糖基转移酶(FutN或者SEQ ID NO：3)的氨基酸序列相比具有至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的一致性。优选的，这里所描述的乳糖-接受性α(1，2)岩藻糖基转移酶与普通拟杆菌FutN或者SEQ ID NO：3具有至少25％的同源性。

做为选择，外源的α(1，2)岩藻糖基转移酶优选的包括与这里所公开的新型α(1，2)岩藻糖基转移酶至少具有至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的同源性的氨基酸序列，例如，如表1中所描述的氨基酸序列。

示范性的α(1，2)岩藻糖基转移酶包括，但是不局限于，产黑色普雷沃菌FutO、鲍氏梭状芽孢杆菌FutP、鲍式梭状芽孢杆菌+13FutP、毛螺菌科sp.FutQ、甲烷微菌属(methanosphaerula palustris)FutR、坦纳(Tannerella)菌属FutS、粪拟杆菌FutU、丁酸弧菌属FutV、普雷沃菌FutW、乔氏拟杆菌(Parabacteroides johnsonii)FutX、肠道疣微菌(Akkermansia muciniphilia)FutY、肠道沙门氏菌FutZ、拟杆菌属菌FutZA。例如，所述α(1，2)岩藻糖基转移酶包括一种氨基酸序列，所述氨基酸序列包括以下任意一个序列：产黑色普雷沃菌FutO(SEQ ID NO：10)、鲍氏梭状芽孢杆菌FutP(SEQ ID No：11)、鲍式梭状芽孢杆菌+13FutP(SEQ ID NO：292)、毛螺科菌FutQ(SEQ ID NO：12)、甲烷微菌属(methanosphaerula palustris)FutR(SEQ ID NO：13)Tannerella菌属FutS(SEQ ID NO：14)、粪拟杆菌FutU(SEQ ID NO：15)、丁酸弧菌属FutV(SEQ ID NO：16)、普雷沃菌FutW(SEQID NO：17)、乔氏拟杆菌(Parabacteroides johnsonii)FutX(SEQ ID NO：18)、肠道疣微菌(Akkermansia muciniphilia)FutY(SEQ ID NO：19)、肠道沙门氏菌FutZ(SEQ ID NO：20)、和拟杆菌属菌FutZA(SEQ ID NO：21)、或者功能性变体或其片段。其他示范性的α(1，2)岩藻糖基转移酶包括表1中列出的任意一种酶、或者功能性变体或其片段。

本发明的特征在于一种方法，所述方法通过提供表达至少一个外源的乳糖-利用性α(1，2)岩藻糖基转移酶的细菌，用于在细菌中产生岩藻糖基化的低聚糖。所述外源的乳糖利用性α(1，2)岩藻糖基转移酶的氨基酸序列优选与螺杆菌幽门FutC具有至少22％的同源性，或者与普通拟杆菌FutN具有至少25％的同源性。在一个方面，所述细菌也表达一种或者一种以上外源的乳糖-利用性α(1，3)岩藻糖基转移酶和/或一种或者一种以上外源的乳糖-利用性α(1，4)岩藻糖基转移酶。产生细菌中表达的岩藻糖基转移酶的组合取决于需要的岩藻糖基化低聚糖产物。这里所公开的方法进一步地包括从细菌或者所述细菌的培养上清液中取回岩藻糖基化的低聚糖。

适当的(1，3)岩藻糖基转移酶的实施例包括，但是不局限于，幽门螺杆菌26695futA基因(GenBank登记号码HV532291(GI：365791177)，通过引证在此全部并入本文)、螺杆菌Hh0072、幽门螺旋杆菌11639FucT、和幽门螺旋杆菌UA948FucTa(例如，GenBank登记号码AF194963(GI：28436396)，通过引证在此全部并入本文)(Rasko，D.A.，Wang，G.，Palcic，M.M.&Taylor，D.E.J Biol Chem 275，4988-4994(2000))。适当的α(1，4)岩藻糖基转移酶包括，但是不局限于，幽门螺杆菌UA948FucTa(具有缓和的接受体特异性并且能够产生α(1，3)-和α(1，4)-岩藻糖基键)。唯一具有(1，4)岩藻糖基转移酶活性的酶的实施例是来自幽门螺杆菌菌株DMS6709(例如，GenBank登记号码AY450598.1(GI：40646733)，通过引证在此全部并入本文)的FucT III酶所产生的(S.Rabbani，V.Miksa，B.Wipf，B.Ernst，Glycobiology 15，1076-83(2005)。

本发明的特征还在于一种核酸构建物或者一种载体，其包括编码至少一个α(1，2)岩藻糖基转移酶或者其变体或者片段的核酸，如这里所描述的。所述载体可以进一步地包括一种或者一种以上调节元素，例如，异源启动子。“异源”指的是来源于不同菌株的控制序列和蛋白质-编码序列。所述调节元素可以与一种基因可操作的连接，所述基因编码一种蛋白质、一种基因构建物，所述基因构建物编码融合蛋白质基因或者一系列与操纵子连接的基因，从而表达所述融合蛋白质。在依旧另一个方面，本发明包括一种分离的重组细胞，例如，包含上述核酸分子或者载体的细菌细胞。所述核酸选择性地整合到所述基因组的细菌寄主中。在一些实施方案中，所述核酸构建物还进一步地包括一种或者一种以上α(1，3)岩藻糖基转移酶和/或α(1，4)岩藻糖基转移酶。做为选择，所述α(1，2)岩藻糖基转移酶也显示出α(1，3)岩藻糖基转移酶活性和/或α(1，4)岩藻糖基转移酶活性。

在这里所描述的生产方法中使用的细菌是进行了基因设计的，能够增加岩藻糖基化低聚糖产物的效力和产率。例如，宿主产生的细菌的特点在于具有降低的β-半乳糖苷酶活性水平，缺少柯拉酸合成途径、ATP-依赖型细胞内蛋白酶失活、lacA失活或其结合。在一个实施方案中，所述细菌的特点在于具有降低的β-半乳糖苷酶活性水平、缺少柯拉酸合成途径、ATP-依赖型细胞内蛋白酶失活和lacA失活。

如这里所使用的基因、基因编码产物(例如，多肽)或者途径的“失活”或者“失活作用”指的是降低或者消除基因、基因产物或者途径的表达(例如，转录或者翻译)、蛋白质水平(即，翻译、降解速度)或者酶活性。在途径失活的情况下，优选的，在途径中的一个酶或者多肽在显示出减少的或者可以忽略的活性。例如，在途径中的酶被改变、删除或者突变，从而该途径的产物以相对于野生型细菌或者完整途径相比更低的水平产生产物。做为选择，所述途径的产物不产生。通过删除或者突变所述基因或者基因的调节元素使基因失活，从而所述基因不在被转录或者翻译。通过删除或者突变编码基因产物或者多肽突变的编码基因，破坏其活性，可以实现多肽的失活。失活突变包括一个或者一个以上的核酸的核苷酸或者氨基酸序列的氨基酸的加入、删除或者取代，从而导致所述基因或者多肽的表达或者活性降低或者消除。在其他实施方案中，通过向多肽的N-末端或者C-末端加入外源序列(即，tags)从而使多肽的活性被减少或者消除(即，通过空间位阻)实现多肽的失活。

适用于这里所描述的生产系统的宿主细菌显示出增强的或者增加的乳糖和/或GDP-岩藻糖细胞质文库或者细胞内文库。例如，所述细菌是大肠杆菌和内源性的大肠杆菌代谢途径，并且所述基因以多种方式被操作，与野生型大肠杆菌中发现的水平相比，产生增加的乳糖和/或GDP-岩藻糖细胞质浓度。优选的，细菌积聚增加的细胞内乳糖文库和增加的细胞内GDP-岩藻糖文库。例如，所述细菌包含至少10％、20％、50％、或者2X、5X、10X或者更多水平的细胞内乳糖和/或细胞内鸟苷二磷酸-岩藻糖，与相应的不含有这里所描述的遗传修饰的野生型细菌相比。

与野生型细菌相比，通过处理基因和涉及乳糖引入、输出和分解代谢的途径来增加宿主细菌中细胞内乳糖浓度。尤其是，这里所描述的是增加进行基因工程设计的大肠杆菌中细胞内乳糖水平的方法，通过同时删除内源性的(半乳糖苷酶基因(lacZ)和乳糖操纵子阻遏基因(lacI)产生人乳低聚糖。在构建这些删除期间，所述lacIq启动子被放置在乳糖渗透酶基因lacY的直接上游(与乳糖渗透酶基因lacY相连)，那就是说，lacIq启动子序列直接位于编码lacY基因的序列的起始端上游或与之接近，从而所述lacY基因被lacIq启动子进行翻译调节。被修饰的菌株维持了其从培养基中(通过LacY)运输乳糖的能力，但是删除了负责乳糖分解代谢的野生型lacZ染色体拷贝(编码β-半乳糖苷酶)基因。因此，当在外源乳糖存在时，培养修饰的菌株，产生细胞内乳糖库。

另一个增加大肠杆菌内乳糖细胞浓度的方法包括使lacA基因失活。lacA的失活突变、无效突变或者删除能够防止细胞内乙酰乳糖的形成，这不但能够从随后的提纯过程中除掉这些作为污染物的分子，还能够消除大肠杆菌从其细胞质中过度输出乳糖的能力(Danchin A.Cells need safety valves.Bioessays 2009，Jul；31(7)：769-73.)，因此极大的促进了大肠杆菌细胞内乳糖池有目的的处理。

本发明还提供了通过操作有机物内源性柯拉酸生物合成途径来增加细菌内GDP-岩藻糖细胞内水平的方法。该增加是通过对内源性大肠杆菌基因进行多种遗传修饰实现的，所述遗传修饰的基因直接包括在柯拉酸前体生物合成中，或者包括在柯拉酸合成调节子的全面控制中。尤其优选的是使在鸟苷二磷酸-岩藻糖(供体底物)产生之后和柯拉酸产生之间，对柯拉酸合成途径发挥作用的基因或者编码多肽失活。示范性的柯拉酸合成基因包括，但是不局限于：wcaJ基因，(例如，GenBank登记号码(氨基酸)BAA15900(GI：1736749)，通过引证在此全部并入本文)、wcaA基因(例如，GenBank登记号码(氨基酸)BAA15912.1(GI：1736762)，通过引证在此全部并入本文)、wcaC基因(例如，GenBank登记号码(氨基酸)BAE76574.1(GI：85675203)，通过引证在此全部并入本文)、wcaE基因(例如，GenBank登记号码(氨基酸)BAE76572.1(GI：85675201)，通过引证在此全部并入本文)、wcaI基因(例如，GenBank登记号码(氨基酸)BAA15906.1(GI：1736756)，通过引证在此全部并入本文)、wcaL基因(例如，GenBank登记号码(氨基酸)BAA15898.1(GI：1736747)，通过引证在此全部并入本文)、wcaB基因(例如，GenBank登记号码(氨基酸)BAA15911.1(GI：1736761)，通过引证在此全部并入本文)、wcaF基因(例如，GenBank登记号码(氨基酸)BAA15910.1(GI：1736760)，通过引证在此全部并入本文)、wzxE基因(例如，GenBank登记号码(氨基酸)BAE77506.1(GI：85676256)、通过引证在此全部并入本文)、wzxC基因，(例如，GenBank登记号码(氨基酸)BAA15899(GI：1736748)，通过引证在此全部并入本文)、wcaD基因，(例如，GenBank登记号码(氨基酸)BAE76573(GI：85675202)，通过引证在此全部并入本文)、wza基因(例如，GenBank登记号码(氨基酸)BAE76576(GI：85675205)，通过引证在此全部并入本文)、wzb基因(例如，GenBank登记号码(氨基酸)BAE76575(GI：85675204)，通过引证在此全部并入本文)、和wzc基因(例如，GenBank登记号码(氨基酸)BAA15913(GI：1736763)，通过引证在此全部并入本文)。

优选的，通过使wcaJ(编码尿苷二磷酸-葡萄糖脂质载体转移酶)基因失活对宿主细菌，例如大肠杆菌，进行基因设计，产生一种人类乳汁低聚糖。可以通过删除基因、无效突变、或者使wcaJ基因发生失活突变来实现wcaJ基因的失活，从而与野生型大肠杆菌相比，编码的wcaJ的活性被减少或者消除。在wcaJ无效的背景下，鸟苷二磷酸-岩藻糖在大肠杆菌细胞质中聚集。

在柯拉酸合成途径中，正调节蛋白质RcsA(例如，GenBank登记号码M58003(GI：1103316)，通过引证在此全部并入本文)的过表达导致细胞内鸟苷二磷酸-岩藻糖水平的增加。另一种柯拉酸生物合成的正调节蛋白(即，RcsB，例如，GenBank登记号码E04821(GI：2173017)，通过引证在此全部并入本文)的过表达也被用于，或者代替RcsA的过表达，或者作为RcsA过表达的补充，用于增加细胞内鸟苷二磷酸-岩藻糖水平。

做为选择，对大肠杆菌lon基因(例如，GenBank登记号码L20572(GI：304907)，通过引证在此全部并入本文)引入一种突变之后，柯拉酸生物合成被增加。Lon是一种腺苷酸-5′-三磷酸盐(ATP)-依赖性的细胞内蛋白酶，负责降解RcsA，如上所述，作为大肠杆菌中柯拉酸生物合成的阳性翻译调节蛋白。在lon无效的背景下，RcsA是稳定的，RcsA水平增加，在大肠杆菌中负责鸟苷二磷酸-岩藻糖合成的基因被上调节，并且细胞内鸟苷二磷酸-岩藻糖浓度增加。适用于这里所描述的方法中的在lon中发生的突变包括无效突变或者能够破坏lon表达或功能的插入作用。

细菌中还存在功能性的乳糖渗透酶基因。所述乳糖渗透酶基因是内源性的乳糖渗透酶基因或者外源的乳糖渗透酶基因。例如，所述乳糖渗透酶基因包括大肠杆菌lacY基因(例如，GenBank登记号码V00295(GI：41897)，通过引证在此全部并入本文)。许多细菌天生具有将乳糖从生长培养基中运输到细胞中的能力，通过使用转运蛋白，所述转运蛋白或者是大肠杆菌乳糖渗透酶的同族体(例如，如在地衣芽孢杆菌中发现的)，或者是运输蛋白，所述运输蛋白时普遍存在的PTS糖运输蛋白家族中的一员(例如，在干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌中发现的)。对于天然不存在将细胞外乳糖运输到细胞质中能力的细菌，通过在重组DNA构建物中提供外源性乳糖运输蛋白基因(例如，大肠杆菌lacY)，并且或者提供在质粒表达载体上，或者当做外源基因整合到宿主染色体中来赋与其这种能力。

如这里所描述的，在一些实施方案中，所述宿主细菌优选的具有降低水平的β-半乳糖苷酶活性。在以删除内源性β-半乳糖苷酶基因为特征的实施方案中，将外源性β-半乳糖苷酶基因引入细菌。例如，表达外源性β-半乳糖苷酶基因的质粒被引入到细菌中或者再结合或者整合到所述宿主基因组中。例如，所述外源β-半乳糖苷酶基因被引入到在宿主细菌中失活的基因中，例如Lon基因。

这种外源的β-半乳糖苷酶基因是一种功能性的β-半乳糖苷酶基因，其特征在于与不进行任何基因操作的野生型细菌中的β-半乳糖苷酶活性相比具有减少的或者降低水平的β-半乳糖苷酶活性。示范性的β-半乳糖苷酶基因包括大肠杆菌lacZ和β-半乳糖苷酶基因，来自任何许多其他有机体(例如，乳酸克鲁维酵母的lac4基因(例如，GenBank登记号码M84410(GI：173304)，通过引证在此全部并入本文)，所述基因能够催化β-半乳糖苷水解成单糖。野生型大肠杆菌中的β-半乳糖苷酶活性水平是，例如，6,000单位。因此，本发明工程设计的宿主基因所包括的减少的β-半乳糖苷酶活性水平包括小于6,000单位，小于5,000单位，小于4,000单位，小于3,000单位，小于2,000单位，小于单位，小于900单位，小于800单位，小于700单位，小于600单位，小于500单位，小于400单位，小于300单位，小于200单位，小于100单位，或者小于50单位。降低的β-半乳糖苷酶功能水平包括β-半乳糖苷酶活性水平在0.05和1,000单位之间、在0.05和750单位之间、在0.05和500单位之间、在0.05和400单位之间、在0.05和300单位之间、在0.05和200单位之间、在0.05和100单位之间、在0.05和50单位之间、在0.05和10单位之间、在0.05和5单位之间、在0.05和4单位之间、在0.05和3单位之间、或者在0.05和2单位之间的β-半乳糖苷酶活性。对于单位的定义和用于确定β-半乳糖苷酶活性的实验参见Miller JH，Laboratory CSH.Experiments in moleculargenetics.Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor，NY；1972；(通过引证在此全部并入本文)。这些低水平的细胞质的β-半乳糖苷酶活性不足以显著的减少细胞内乳糖库。所述低水平的β-半乳糖苷酶活性对于容易的除去发酵末端不需要的乳糖是很有用的。

选择性地，所述细菌具有失活的thyA基因。优选的，thyA基因在所述宿主细菌中的突变导致能够运输thyA的质粒作为一种可选择的标记基因被保留。示范性的选择性可选择的标记物包括抗菌素耐药性基因，例如BLA(β-内酰胺酶)，或者proBA基因(补充proAB宿主菌株脯氨酸营养缺陷型)或者purA(补充purA宿主菌株脯氨酸营养缺陷型)。

在一个方面，所述大肠杆菌细菌包括基因型ΔampC：：P_trp ^BcI，Δ(lacI-lacZ)：：FRT，P_lacIqlacY⁺，ΔwcaJ：：FRT，thyA：：Tn10，Δlon：(npt3，lacZ⁺)，ΔlacA，以及包括任何一个这里所描述的外源α(1，2)岩藻糖转移酶。

在乳糖存在的情况下培养包括这些特征的细菌。有时候，所述方法进一步地包括在色氨酸存在并且胸腺嘧啶不存在的情况下培养所述细菌。从细菌(即，细胞溶解产物)或者细菌培养上清液中回收岩藻糖基化的低聚糖。

本发明提供了一种纯化的岩藻糖基化低聚糖，通过这里所描述的方法产生的。纯化岩藻糖基化的低聚糖用于治疗性或者营养性产物，或者细菌直接在这些产物中应用。通过工程细菌产生的岩藻糖基化的低聚糖是2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)或者乳糖二岩藻四糖(LDFT)。新的α-1，2-岩藻糖转移酶还可以有效用于合成大分子量的含有α1，2岩藻糖基序(例如，乳-N-岩藻五糖I(LNF I)和乳-N-二岩藻六糖I(LDFH I))的HMOS。例如，为了产生乳糖二岩藻四糖(LDFT)，对宿主细菌进行工程设计使之表达外源α(1，2)岩藻糖转移酶，能够具有α(1，3)岩藻糖转移酶活性或者外源α(1，2)岩藻糖转移酶和外源α(1，3)岩藻糖转移酶。为了产生乳-N-岩藻五糖I(LNF I)和乳-N-二岩藻六糖I(LDFH I)，对宿主细菌进行工程设计使之表达具有α(1，3)岩藻糖转移酶活性和/或α(1，4)岩藻糖转移酶活性的外源α-(1，2)岩藻糖转移酶、或者外源α(1，2)岩藻糖转移酶、外源α(1，3)岩藻糖转移酶和外源α(1，4)岩藻糖转移酶。

本发明还包括通过这里所描述的方法产生的纯化的岩藻糖基化低聚糖。在工艺末端获得的纯化的低聚糖(2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL))是一种白色的、轻微灰白色的透明甜粉末。例如，本发明的工程细菌，细菌培养上清液或者细菌细胞溶解产物包括通过这里所描述的方法产生的2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)、乳糖二岩藻四糖(LDFT)、乳-N-岩藻五糖I(LNF I)或者乳-N-二岩藻六糖I(LDFH I)，但是在从所述细胞、培养上清液或者溶解产物中纯化岩藻糖基化低聚糖产物之前基本上不包括其他岩藻糖基化的低聚糖。作为一般物质，在含有2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)的细胞、细胞溶解产物或者培养物、或者上清液中，本方法产生的岩藻糖基化低聚糖包含可忽略数量的3-岩藻糖基乳糖(3-FL)，例如，小于1％水平的2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)或者0.5％水平的2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)。而且，通过这里所描述的方法产生的岩藻糖基化低聚糖也具有最小量的污染乳糖，所述污染乳糖通常与岩藻糖基化低聚糖一起被纯化，比如2′-岩藻糖基乳糖(2′FL)。在工程宿主细菌中存在较低水平的β-半乳糖苷酶活性，导致污染乳糖变少。

纯化的低聚糖，例如，2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)、乳糖二岩藻四糖(LDFT)、乳-N-岩藻五糖I(LNF I)或者乳-N-二岩藻六糖I(LDFH I)是按重量计算占理想低聚糖含量的至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，98％，99％，或者100％(重量/重量)。纯度可以通过任何已知的方法来评价，例如，薄层色层分析法或者其他本领域已知的色谱技术。本发明包括一种纯化由如上所述基因工程细菌产生的岩藻糖基化低聚糖的方法，该方法包括在细菌的细菌细胞溶解产物或者细菌细胞培养上清液中将需要的岩藻糖基化低聚糖(例如，2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL))从污染物中分离出来。

纯化所述低聚糖并用于多种产物，得到供人及动物消费的产物，例如，作为伙伴的动物(狗，猫)以及家畜(牛、马、绵羊、公山羊或者猪科动物，及家禽)。例如：，一种药物组合物包括纯化的2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)和一种药学上可接受的适合于口服的赋形剂。在细菌宿主中产生大量2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)，例如，包括外源α(1，2)岩藻糖转移酶基因的大肠杆菌细菌。

通过培养如上所述细菌来进行产生一种药物组合物的方法，所述药物组合物包括人类乳汁低聚糖(HMOS)，纯化通过所述细菌产生的HMOS，并将此HMOS与一种赋形剂或者载体结合，产生一种适合于口服的食物补充剂。这些组合物可以有效用于预防或者治疗幼儿和成人的肠道和/或呼吸道疾病的方法中。因此，所述组合物被施用给患有或者有风险发展成这种疾病的主体中。

本发明还提供了识别α(1，2)岩藻糖转移酶基因的方法，所述基因能够在宿主细菌中合成岩藻糖基化的低聚糖，例如，在大肠杆菌中的2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)。识别新型乳糖-利用性α(1，2)岩藻糖转移酶的方法包括以下步骤：

1)计算性检索序列数据库从而定义宽范围的任意已知的、乳糖-利用性α(1，2)岩藻糖转移酶的单一序列同族体。

2)使用来自步骤(1)的目录，衍生已知检索曲线，该检索曲线包含公共序列和/或目录所列成员均包含的结构基序；

3)检索序列数据库，使用来自步骤(2)的基于公共序列或者机构基序的衍生的检索曲线进行查询，确定候选序列，其中，与参考乳糖-利用性α(1，2)岩藻糖转移酶具有同源性的序列具有预先确定的百分比阈值；

4)编辑候选有机体列表，所述有机体的特点在于表达天然存在状态的α(1，2)岩藻糖-聚糖；

5)筛选来源于候选有机体的候选序列，产生候选乳糖-利用性酶列表；

6)在宿主有机物中表达候选乳糖-利用性酶；和

7)检验乳糖-利用性α(1，2)岩藻糖转移酶活性，其中，在所述有机体中检测到要求的岩藻糖基化低聚糖产物说明该候选序列包括新型的乳糖-利用性α(1，2)岩藻糖转移酶。在另一个实施方案中，从超过一个具有已知α(1，2)岩藻糖转移酶活性的酶的氨基酸序列的多个校准序列中产生检索曲线。然后，数据库检索可以被设计成改善并重复检索与多重序列校准查询具有显著序列相似性的新型的α(1，2)岩藻糖转移酶。

本发明提供了治疗、预防或者减少主体感染风险的方法，包括对所述主体给药一种组合物，所述组合物包括纯化的重组人类乳汁低聚糖，其中所述HMOS结合病原体并且其中，所述主体感染所述病原体或者由感染此病原体的风险。在一个方面，所述感染是由诺沃克类病毒或者空肠弯曲菌造成的。所述主体优选是需要这种治疗的哺乳动物。所述哺乳动物是，例如，任何哺乳动物，例如，人、灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、母牛，马或者猪。在一种优选的实施方案中，所述哺乳动物是人类。例如，所述组合物可以被配制成动物饲料(例如压成丸，碾碎，捣碎)或者动物饲料补充物用于陪伴类动物，例如狗或者猫，以及，通过消耗食物生长的家畜或者动物，例如，牛、羊、猪、小鸡和山羊。优选的，所述纯化的HMOS被配制成一种粉末(例如，婴儿配制食品粉末或者成人营养增补剂粉末，这些均可以在消费前与液态或者水或者果汁相混合)或者被配制成片剂、胶囊剂或者浆料形式，或者作为一种成分被整合到乳制品中，例如，奶、奶油、乳酪、酸奶酪或者山羊乳酪中，或者作为一种饮料成分，或者与包含或微生物培养物的制剂化合作为益生菌，或者在生物前制剂中用于增加有益微生物的生长，或者在体外或者在体内。

本发明的多聚核苷酸、多肽和低聚糖是纯化的和/或分离的。纯化的用于定义一种灭菌程度，这种灭菌程度可以安全的对人类主体给药，例如，不具有传染性或者毒剂。具体地说，如这里所使用的，“分离的”或者“纯化的"核苷酸分子、多聚核苷酸、多肽、蛋白质或者低聚糖是指在通过重组技术产生时基本上不含有其他细胞物质或者培养基的物质，或者是指通过化学合成的化学前体物或者其他化学试剂。例如，纯化的HMOS组合物按重量计算(干重)占所关心化合物的至少60％。优选的，所述制剂按重量计算占所关心化合物的至少75％，更优选的占至少90％，并且最优选的，占至少99％。可以通过任何适当的标准方法来测量纯度，例如，通过柱形色谱法、薄层色层分析法、或者高效液相色谱(HPLC)分析。例如，“纯化的蛋白质”指的是已经从其天然相关的其他蛋白质、脂质和核酸中分离出来的蛋白质。优选的，所述蛋白质构成所述纯化制剂干重的至少10、20、50、70、80、90、95、99-100％。

同样，“基本上纯的”是指从其天然伴随的成分中分离出来的低聚糖。通常，当低聚糖按重量计算不含有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或者乃至至少99％的蛋白质和其天然伴随存在的有机分子时，这种低聚糖是基本上纯的。

“分离的核酸”指的是一种核酸，这种核酸不含有其天然存在的基因组中的侧链基因，所述天然存在的基因组存在于本发明DNA所衍生的有机体中。该术语包括，例如，(a)一种DNA，这种DNA属于天然存在的基因组DNA分子的一部分，但是这部分DNA不是天然存在有机体基因组分子的侧链核苷酸序列；(b)一种核苷酸，这种核苷酸与一种载体整合或者以某种方式整合入原核生物或者真核生物基因组DNA中，从而使所得到的分子不与任意天然存在的载体或者基因组DNA相一致；(c)一种分离的分子，例如互补DNA、基因组片段、通过聚合酶链式反应(PCR)产生的片段、或者限制性片断；和(d)一种重组核苷酸序列，这种重组核苷酸序列是杂合基因的一部分，即，一种基因编码的融合蛋白。根据本发明的分离的核苷酸分子进一步包括合成产生的分子，以及任意具有改变的化学主链和/或具有修饰的主链的核苷酸。

“异源启动子”是指与基因或者核酸序列天然可操作连接的启动子所不同的启动子。

术语“过表达”或者“过表达作用”指的是在一种位置上，通过遗传上改变细胞，从而与野生型细胞在相同的情况下相比，表达更多的因子。相似的，如果未被改变的细胞并不能表达其经过遗传改变所需要产生的因子，则术语“表达”(与“过表达”相区别)用于表示野生型细胞在进行遗传操作之前根本不表达所述因子。

如这里所使用的术语“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”指的是对患有不利病况、异常或者疾病并具有临床症状的个体给药一种试剂或者制剂，从而起到减少症状严重性和/或出现率，消除所述症状和/或其起因，和/或促进改善或者补救损伤的作用。术语“预防”和“防止”指的是通过向对某种不利病况、异常或者疾病敏感但是无临床症状的个体给药一种试剂或者组合物，从而防止症状出现和/或其诱因。

术语制剂或者制剂组分的“有效量”和“治疗有效量”指的是所述制剂或其组分无毒但是足以提供理想的效果所需的数量。

过渡术语"包括(comprising)"与"包含(including)"、"含有(containing)"或者"具有...的特征"是同义词，都属于包括性的或者开放式定义，不排除其他未列出的成分或者方法步骤。相反，术语“由...组成”不包括任何在权利要求中没有特别指出的成分、步骤或者组分。术语“基本上由...组成”将权利要求的范围限制在指定的材料或者步骤，“以及那些本质上不影响要求保护的发明的本质和新颖特性的材料或者步骤”。

用于表达乳糖-接受性岩藻糖转移酶基因的宿主有机体通常是肠细菌大肠杆菌K12(E.coli)。大肠杆菌K-12不被认为是人或者动物的病原体也不被认为是产毒的。大肠杆菌K-12是一种细菌的标准生产菌株，并且特点在于由于其移植于结肠并产生感染的能力很差，因此是安全的(参见，例如epa.gov/oppt/biotech/pubs/fra/fra004.htm)。然而，多种细菌种类可以被用于低聚糖生物合成方法，例如，(成团泛菌)、弗氏柠檬细菌、柠檬泛菌、胡萝卜软腐病果胶杆菌或者黄单胞菌。还可以使用杆菌类的细菌，包括枯草杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、嗜热杆菌、侧孢芽胞杆菌、巨大芽孢杆菌、霉菌样杆菌、短小芽胞杆菌、迟缓芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌和环状杆菌。同样，使用本发明所述方法可以对乳杆菌属和乳球菌属进行修饰，包括但是不局限于嗜酸乳杆菌、唾液乳杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌、戴耳布吕克氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、保加利亚乳杆菌、卷曲乳杆菌、加氏乳杆菌、干酪乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、詹氏乳杆菌和乳酸乳球菌。嗜热生物链球菌和费氏丙酸杆菌(Propinibacterium freudenreichii)也属于适合于这里所描述的发明的细菌种类。同样作为本发明一部分的是菌株，进行这里所描述的修饰，来源于肠道球菌种类(例如，屎肠球菌和嗜热生物肠道球菌)、双歧杆菌属(例如，牛角椒双歧杆菌、婴儿双岐杆菌和两岐双岐杆菌)、芽孢乳杆菌属、Micromomospora spp.、小球菌属、红球菌属和假单胞菌属(例如，荧光假单胞菌和绿脓杆菌)。在乳糖存在的情况下培养具有这里所描述的特征的细菌，并且检查来自细菌本身或者来自细菌培养上清液中的岩藻糖基化的低聚糖。纯化岩藻糖基化的低聚糖用于治疗性或者营养性产物，或者细菌直接在这些产物中应用。合适的生产宿主细菌菌株是与来源细菌菌株不同的菌株，所述来源细菌菌株中可以识别出编码岩藻糖转移酶的核酸序列。

从下面关于本发明优选的实施方案的表述中，以及从权利要求书中，本发明的其他特点和优势将变得显而易见。除非另有定义，这里使用的所有科技用语与本发明所属领域普通技术人员通常的理解具有相同的含义。虽然与这里描述的方法和材料相似的任何方法和材料都可以被用于实施或者检测本发明，但是下面描述的是适当的方法和材料。这里应用的所有公开的外国专利和专利申请在此通过引证全部并入本文。Genbank和NCBI指明的登记号码也通过引证在此全部并入本文。这里引用的其他出版的参考文献、文件、原稿和科学文献通过引证在此全部并入本文。如果出现矛盾，以本发明说明书包括定义为准。此外，这里所述的材料、方法和实施例只起到说明作用，并不作为限制。

附图简要说明

图1是示意图，显示了在人类乳汁中发现的主要中性岩藻糖-低聚糖的合成途径。

图2是一种示意图，显示了代谢途径和将其引入到大肠杆菌(E.coli)中工程2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)合成法中的变化。具体地说，所述乳糖合成途径和所述鸟苷二磷酸-岩藻糖合成途径被显示了。在所述鸟苷二磷酸-岩藻糖合成途径中：manA＝磷酸甘露糖异构酶(PMI)、manB＝磷酸甘露糖变位酶(PMM)、，manC＝甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶(鸟苷酸)、gmd＝鸟苷二磷酸-甘露糖-4，6-脱水酶、fcl＝鸟苷二磷酸-岩藻糖合酶(GFS)、和ΔwcaJ＝突变的尿苷二磷酸-葡萄糖脂质载体转移酶。

图3A和图3B显示了4种之前已知的乳糖-利用性α(1，2)-岩藻糖转移酶蛋白质序列的序列同一性和多重序列校准。图3A是一种表，显示了4种已知的乳糖-利用性α(1，2)-岩藻糖转移酶之间的序列一致性：螺杆菌幽门futC(SEQ ID NO：1)、H.mustelae FutL(SEQ IDNO：2)、普通拟杆菌futN(SEQ ID NO：3)和大肠杆菌0126wbgL SEQ ID NO：4)。图3B显示了4种已知的乳糖-利用性α(1，2)-岩藻糖转移酶之间的多重序列校准在四种酶的校准之间，卵型突出区域显示了尤其高的序列保守性。.

图4显示了12个确定的α(1，2)-岩藻糖转移酶变种的序列校准，通过之前已知的乳糖-利用性α(1，2)-岩藻糖转移酶蛋白质序列所确定的。4种已知的乳糖-利用性α(1，2)-岩藻糖转移酶被框起来并且包括：螺杆菌幽门futC(SEQ ID NO：1)、H.mustelae FutL(SEQ IDNO：2)、普通拟杆菌futN(SEQ ID NO：3)和大肠杆菌0126wbgL SEQ ID NO：4)。12种确定的α(1，2)-岩藻糖转移酶如下：产黑素普雷沃菌FutO(SEQ ID NO：10)、梭状芽孢杆菌(Clostridium bolteae)+13FutP(SEQ ID NO：292)、毛螺菌科FutQ(SEQ ID NO：12)、甲烷微菌属(Methanosphaerula palustris)FutR(SEQ ID NO：13)、坦纳菌属(tannerella sp.)FutS(SEQ ID NO：14)、粪拟杆菌FutU(SEQ ID NO：15)、丁酸弧菌属FutV(SEQ ID NO：16)、普雷沃菌属FutW(SEQ ID NO：17)、乔治普氏菌(parabacteroides johnsonii)FutX(SEQ IDNO：18)、肠道疣微菌(Akkermansia muciniphilia)FutY(SEQ ID NO：19)、肠道沙门氏菌FutZ(SEQ ID NO：20)、拟杆菌FutZA(SEQ ID NO：21)。适合于梭状芽孢杆菌(Clostridiumbolteae)FutP的序列(在N-末端不含有13个额外的氨基酸)(SEQ ID NO：11)也显示在校准中。

图5A和图5B是两幅凝胶照片，显示了12种新型α(1，2)-岩藻糖转移酶中每种变种的结构。图5A显示了后-吉布森组装PCR。图5B显示了凝胶纯化的RI/Xho1变体片段。

图6A和图6B是两张显示岩藻糖基化的低聚糖产物薄层色谱的照片，所述岩藻糖基化的低聚糖产物是在大肠杆菌培养物中使用α(1，2)-岩藻糖转移酶变种制备的。图6A显示了来自2毫升培养上清液中的岩藻糖基化的低聚糖产物。图6B显示了来自0.2OD₆₀₀细胞当量的全细胞加热提取物的岩藻糖基化低聚糖产物。

图7是一张图表显示了宿主细菌生长曲线，所述宿主细菌表达包含α(1，2)-岩藻糖转移酶基因WbgL、FutN、FutO、FutQ、和FutX的质粒，该表达发生在乳糖存在的情况下将色氨酸引入培养基中之后(即，lac+trp)。

图8是一张SDS-PAGE凝胶照片显示了宿主细菌产生的蛋白质，所述宿主细菌在引入后表达包含α(1，2)-岩藻糖转移酶基因WbgL、FutN、FutO、FutQ、和FutX的质粒。

图9A和图9B是两张薄层色谱照片，显示了引入后7小时或者24小时之后，在表达选择性α(1，2)-岩藻糖转移酶变种WbgL、FutN、FutO、FutQ和FutX的大肠杆菌培养物中产生的岩藻糖基化低聚糖产物。图9A显示了来自2毫升培养上清液中的岩藻糖基化的低聚糖产物。图9B显示了来自0.2OD600细胞当量的全细胞加热提取物的岩藻糖基化低聚糖产物。

图10A和图10B是两张薄层色谱的照片，显示了在表达FutN的大肠杆菌进行两个不同的1.5L发酵轮之后的岩藻糖基化低聚糖产物：图10A)36B和图10B)37A。36B的培养产率是33克/升而37A的产率是36.3克/升。

图11是携带普通拟杆菌FutN基因的pG217质粒测绘图。

图12是示意图显示了LacIq启动子、功能性lacY基因的插入和lacA的删除。

图13是示意图，显示了使用FRT重组删除内源性wcaJ基因。

图14是大肠杆菌W3110染色体的示意图，显示了插入携带卡那霉素抗性基因的DNA片段(来源于转座子Tn5)和野生型LacZ插入lon基因。

具体实施方式

虽然一些研究证明人类乳汁聚糖可以用作抗菌剂防粘剂，但是产生足够量的这种质量适合于人体使用的试剂困难重重并且造价昂贵，这限制了其大规模实验并本公众认可。需要一种适当的方法以合理的成本产生足够量的合适的聚糖。在这里所描述的发明之前，已经进行了一些努力使用明显不同的合成方法进行聚糖合成。一些化学途径可以合成低聚糖(Flowers，H.M.Methods Enzymol 50，93-121(1978)；Seeberger，P.H.Chem Commun(Camb)1115-1121(2003))，但是进行这些反应的反应物十分昂贵并且可能有毒(Koeller，K.M.&Wong，C.H.Chem Rev 100，4465-4494(2000))。工程有机体表达的酶(Albermann，C.，Piepersberg，W.&Wehmeier，U.F.Carbohydr Res 334，97-103(2001)；Bettler，E.，Samain，E.，Chazalet，V.，Bosso，C.，et al.Glycoconj J 16，205-212(1999)；Johnson，K.F.Glycoconj J 16，141-146(1999)；Palcic，M.M.Curr Opin Biotechnol 10，616-624(1999)；Wymer，N.&Toone，E.J.Curr Opin Chem Biol 4，110-119(2000))提供了一种精确并有效的合成方法(Palcic，M.M.Curr Opin Biotechnol 10，616-624(1999))；Crout，D.H.&Vic，G.Curr Opin Chem Biol 2，98-111(1998))，但是反应物的高成本，尤其是糖核苷酸的高成本限制其低价的大规模公共生产。对微生物进行遗传工程设计表达糖基转移酶，所述糖基转移酶是从细菌先天核苷酸糖文库中合成低聚糖多必须的(Endo，T.，Koizumi，S.，Tabata，K.，Kakita，S.&Ozaki，A.Carbohydr Res330，439-443(2001)；Endo，T.，Koizumi，S.，Tabata，K.&Ozaki，A.Appl Microbiol Biotechnol 53，257-261(2000)；Endo，T.&Koizumi，S.Curr Opin StructBiol 10，536-541(2000)；Endo，T.，Koizumi，S.，Tabata，K.，Kakita，S.&Ozaki，A.Carbohydr Res 316，179-183(1999)；Koizumi，S.，Endo，T.，Tabata，K.&Ozaki，A.Nat Biotechnol 16，847-850(1998))。然而，这里所描述的发明之前，有持续增长的需要来确定并定性额外的糖基转移酶，所述额外的糖基转移酶可以有效用于在代谢工程细菌宿主中合成HMOS。

人类乳汁聚糖

人类乳汁包含各种各样种类丰富的中性和酸性低聚糖(Kunz，C.，Rudloff，S.，Baier，W.，Klein，N.，and Strobel，S.(2000).Annu Rev Nutr 20，699-722；Bode，L.(2006).J Nutr 136，2127-130)。已经在人类乳汁重识别出超过130种不同的复合物低聚糖，并且他们的结构多样性和丰富程度是人类所特有的。虽然这些分子可能不能直接被婴幼儿用作营养，但是他们仍然在建立健康的内脏微生态环境中起到至关重要的作用(Marcobal，A.，Barboza，M.，Froehlich，J.W.，Block，D.E.，et al.J Agric Food Chem 58，5334-5340(2010))，在预防疾病中起到至关重要的作用(Newburg，D.S.，Ruiz-Palacios，G.M.&Morrow，A.L.Annu Rev Nutr 25，37-58(2005))并且在建立免疫功能时起到至关重要的作用(Newburg，D.S.&Walker，W.A.Pediatr Res 61，2-8(2007))。尽管几百万年来与人类乳汁低聚糖(HMOS)的接触使病原体已经具有更多的方法来阻遏HMOS预防靶细胞吸附和抑制感染的能力。但利用HMOS作为病原体粘附抑制剂还是可以解决目前迅速发展的抗菌素耐药性危机。通过生物合成产生的人类乳汁低聚糖代表解决社会最棘手问题的一类新型治疗剂的先导化合物。

用于有效的、工业规模合成HMOS的一个选择性策略是细菌的代谢工程设计。该方法包括构建能够过表达异源糖基转移酶的微生物菌株，将前体糖通过膜运输引入细菌细胞液中，并具有增加的再生核苷酸糖库用于生物合成前体(Dumon，C.，Samain，E.，and Priem，B.(2004).Biotechnol Prog20，412-19；Ruffing，A.，and Chen，R.R.(2006).Microb CellFact 5，25)。这一方法的关键方面是选择在微生物宿主中过表达的异源糖基转移酶。糖基转移酶的选择可以显著的影响所需合成的低聚糖的最终产量，已知根据动力学、底物特异性、对供体和受体分子亲合性、稳定性和溶解性不同，酶可以发生很大变化。一些来源于不同细菌种类的糖基转移酶已经被确定并根据其催化HMOS在大肠杆菌宿主菌株中生物合成的能力来定性(Dumon，C.，Bosso，C.，Utille，J.P.，Heyraud，A.，and Samain，E.(2006).Chembiochem 7，359-365；Dumon，C.，Samain，E.，and Priem，B.(2004).Biotechnol Prog20，412-19；Li，M.，Liu，X.W.，Shao，J.，Shen，J.，Jia，Q.，Yi，W.，Song，J.K.，Woodward，R.，Chow，C.S.，and Wang，P.G.(2008).Biochemistry 47，378-387)。识别其他具有更快动力学、更好核苷酸糖供体和/或受体分子亲合性、或者更好细菌宿主内稳定性的糖基转移酶可以显著的改善治疗有效性HMOS的产率。在这里所描述的发明之前，化学合成HMOS是可能的，但是由于立体结构-特异性问题、前体有效性、产物纯度和高成本的问题受到一定局限(Flowers，H.M.Methods Enzymol 50，93-121(1978)；Seeberger，P.H.Chem Commun(Camb)1115-1121(2003)；Koeller，K.M.&Wong，C.H.Chem Rev 100，4465-4494(2000))。本发明克服了上述所有缺点，通过提供新的策略来经济的制造大量的人类乳汁低聚糖(HMOS)，用于食物增补剂。优势包括有效的表达酶、岩藻糖基化低聚糖产物(2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)、乳糖二岩藻四糖(LDFT)、乳-N-岩藻五糖I(LNF I)，和乳-N-二岩藻六糖I(LDFH I))改善的稳定性和/或溶解性和对宿主有机体减少的毒性。本发明特点在于新型的α(1，2)-岩藻糖转移酶，适合在生产菌株中表达，与目前在本领域中使用的α(1，2)-岩藻糖转移酶相比，本发明菌株具有增加的效率和岩藻糖基化人类乳汁低聚糖(HMOS)产率。

如下面所详细描述的，大肠杆菌(或者其他细菌)被设计成产生商业上可行水平的选择的岩藻糖基化低聚糖(即，2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)、乳糖二岩藻四糖(LDFT)、LDHF I或者乳-N-岩藻五糖I(LNF I))。例如，在细菌发酵过程中产量>5克/升。在其他实施方案中，所述岩藻糖基化低聚糖产物，比如2′-岩藻糖基乳糖(2′-FL)，乳糖二岩藻四糖(LDFT)，LDHFI，和乳-N-岩藻五糖I(LNF I)的产率大于10克/升，大于15克/升，大于20克/升，大于25克/升，大于30克/升，大于35克/升，大于40克/升，大于45克/升，大于50克/升，大于55克/升，大于60克/升，大于65克/升，大于70克/升，或者大于75克/升。

人类乳汁聚糖在传染性疾病中的作用

人类乳汁聚糖包括未结合的低聚糖及其糖基结合物，在保护并发展幼儿胃肠道(GI)区域方面发挥重要作用。中性的岩藻糖基化低聚糖包括2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)，能够保护幼儿不感染一些重要的病原体。在各种哺乳动物中发现的乳汁低聚糖区别很大，并且人类乳汁中的组合物是独特的(Hamosh M.，2001Pediatr Clin North Am，48：69-86；Newburg D.S.，2001 Adv Exp Med Biol，501：3-10)。而且，人类乳汁中聚糖水平在哺乳过程中是变化的，并且在个体之间也有很大区别(Morrow A.L.et al.，2004JPediatr，145：297-303；Chaturvedi P et al.，2001Glycobiology，11：365-372)。已经识别出大约200种不同的人类乳汁低聚糖，并且简单的抗原决定簇的组合引起这些多样性(Newburg D.S.，1999Curr_Med Chem，6：117-127；Ninonuevo M.et al.，2006J Agric Food Chem，54：7471-74801)。

人类乳汁低聚糖由5种单糖组成：右旋葡萄糖(Glc)、D-半乳糖(Gal)、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)、L-岩藻糖(Fuc)和唾液酸(N-乙酰基神经氨酸，Neu5Ac，NANA)。人类乳汁低聚糖通常根据其化学结构被分成两个组：中性化合物，包含与乳糖(Galβ 1-4Glc)核心相连的右旋葡萄糖(Glc)、D-半乳糖(Gal)、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和L-岩藻糖(Fuc)；和酸性化合物，包括相同的糖和通常相同的核心结构，加NANA(Charlwood J.et al.，1999Anal_Biochem，273：261-277；Martín-Sosa et al.，2003J Dairy Sci，86：52-59；ParkkinenJ.and Finne J.，1987Methods Enzymol，138：289-300；Shen Z.et al.，2001J ChromatogrA，921：315-321)。

大约70-80％的人类乳汁中的低聚糖是岩藻糖基化的，并且其合成途径被认为是按照图1所示的方式进行。较小比例的低聚糖是唾液酸化的或者既是岩藻糖基化又是唾液酸化的，但是其合成途径并不是完全定义的。对酸性(唾液酸化的)低聚糖的了解部分的受到测量这些化合物的方法的限制。用分析中性和酸性低聚糖的敏感的、可再生的方法已经被设计。人类乳汁低聚糖是可以通过幼儿肠道的低聚糖，非常有效，不易消化(Chaturvedi，P.，Warren，C.D.，Buescher，C.R.，Pickering，L.K.&Newburg，D.S.Adv Exp Med Biol 501，315-323(2001))。

人类乳汁聚糖抑制肠道病原体与其受体结合

人类乳汁聚糖与肠道病原体细胞受体具有结构同源性因此可以起到假目标受体的作用。例如，病原菌株弯曲杆菌属特异性结合包含H-2的聚糖，即，2′-岩藻糖-N-乙酰氨基乳糖或者2′-岩藻糖基乳糖(2′FL)；2′-FL及其他包含H-2抗原决定簇的聚糖抑制弯曲杆菌属的结合性和传染性。同样，包含2-连接的岩藻糖部分的人类乳汁低聚糖可以在体内有力的抑制一些致泻性大肠杆菌病原体。一些主要的人嵌杯样病毒，特别是诺如病毒也与2-连接的岩藻糖基化聚糖结合，并且该结合可以被人类乳汁2-连接的岩藻糖基化聚糖所抑制。在墨西哥一群以母乳喂养的孩子中，具有高水平2-连接的岩藻糖低聚糖的人类乳汁的消耗与降低的诺如病毒、弯曲杆菌属细菌、大肠杆菌-相关腹泻ST和所有原因造成的中度-到-重度腹泻的风险有关(Newburg D.S.et al.，2004Glycobiology，14：253-263；NewburgD.S.et al.，1998Lancet，351：1160-1164)。一些病原体使用唾液酸化的聚糖作为其宿主受体，例如流行性感冒(Couceiro，J.N.，Paulson，J.C.&Baum，L.G.Virus Res 29，155-165(1993))、副流感(Amonsen，M.，Smith，D.F.，Cummings，R.D.&Air，G.M.J Virol 81，8341-8345(2007)，和轮状病毒(Kuhlenschmidt，T.B.，Hanafin，W.P.，Gelberg，H.B.&Kuhlenschmidt，M.S.Adv Exp Med Biol 473，309-317(1999))。所述sialyl-Lewis X抗原决定簇被幽门螺杆菌(Mahdavi，J.，Sondén，B.，Hurtig，M.，Olfat，F.O.，et al.Science297，573-578(2002))、绿脓杆菌(Scharfman，A.，Delmotte，P.，Beau，J.，Lamblin，G.，etal.Glycoconj J17，735-740(2000))、和一些诺如病毒菌株(Rydell，G.E.，Nilsson，J.，Rodriguez-Diaz，J.，-Clouet，N.，et al.Glycobiology 19，309-320(2009))所使用。

新型α(1，2)岩藻糖转移酶的识别

本发明提供了一种新型α(1，2)-岩藻糖转移酶。本发明还提供了一种核酸构建物(即，一种质粒或者载体)，其携带新型α(1，2)-岩藻糖转移酶的核酸序列，用于在宿主细菌中表达所述新型α(1，2)-岩藻糖转移酶。本发明还提供了用于产生岩藻糖基化的低聚糖的方法，这里所描述的，通过在适当的宿主生产细菌中表达新型α(1，2)-岩藻糖转移酶产生岩藻糖基化低聚糖。

不是所有的α(1，2)岩藻糖转移酶都可以利用乳糖作为受体底物。受体底物包括，例如，碳水化合物、低聚糖、蛋白质或者糖基蛋白质、脂质或者糖脂，例如，N-乙酰氨基葡萄糖、N-乙酰氨基乳糖、半乳糖、岩藻糖、唾液酸、葡萄糖、乳糖、或者其任何结合。本发明优选的α(1，2)岩藻糖转移酶利用鸟苷二磷酸-岩藻糖作为供体，乳糖是所述供体的受体。

之前已经进行了一种用于确定新型α(1，2)岩藻糖转移酶的方法(如PCT/US2013/051777中所述，通过引证在此全部并入本文)，所述新型α(1，2)岩藻糖转移酶能够利用乳糖作为受体，并且所述方法使用以下步骤：1)进行计算性检索序列数据库从而定义宽范围的任意已知的、乳糖-利用性α(1，2)岩藻糖转移酶的单一序列同族体；2)使用来自步骤(1)的目录，衍生已知检索曲线，该检索曲线包含公共序列和/或目录所列成员均包含的结构基序，例如通过使用计算机程序，例如MEME(基序启发的多EM，在http：//meme.sdsc.edu/meme/cgi-bin/meme.cgi处获得)或者PSI-BLAST(位点特异迭代BLAST，可以从ncbi.nlm.nih.gov/blast处获得，从cnx.org/content/m11040/latest/处获得额外的信息)；3)检索序列数据库(例如，使用计算机程序，例如PSI-BLAST或者MAST(基序校准检索工具，可以从http：//meme.sdsc.edu/meme/cgi-bin/mast.cgi处获得))，使用这里衍生的检索曲线进行查询，确定“候选序列”，其中，所述候选序列与原始乳糖-利用性α(1，2)岩藻糖转移酶的简单序列同源性是40％或更小；4)筛选科技文献并扩大“候选有机体”列表，所述有机体的特点在于已知能够表达α(1，2)岩藻糖-聚糖；5)只筛选这些来源于“候选有机体”的“候选序列”，产生“候选乳糖-利用性酶”列表；和6)表达“候选乳糖-利用性酶”并检验乳糖-利用性α(1，2)岩藻糖转移酶活性。

序列分析工具的MEME程序组(meme.sdsc.edu/meme/cgi-bin/meme.cgi)可以用作PSI-BLAST的替代。使用程序“MEME”发现序列基序。因此这些基序能够通过使用程序“MAST”来检索序列数据库。BLAST和PSI-BLAST检索算法是其他已知的替换方法。

为了识别其他新型的α(1，2)岩藻糖转移酶，使用是指预先确定的乳糖-利用性α(1，2)岩藻糖转移酶蛋白质序列产生多重序列校准查询：螺杆菌幽门futC(SEQ ID NO：1)、H.mustelae FutL(SEQ ID NO：2)、普通拟杆菌futN(SEQ ID NO：3)和大肠杆菌0126wbgLSEQ ID NO：4)。这些序列校准和序列一致性百分比显示在图3中。进行迭代的PSI-BLAST，使用FASTA-型多重序列对准进行查询，并且在NCBI BLAST+版本2.2.29的本地拷贝上运行NCBI PSI-BLAST程序。起始位置-PSI-BLAST产生特异性划线基质文件(.pssm)，然后使用该程序调整迭代同源性检索运行数值。重复这一过程产生更大组的候选物，并且每次运行的结果用于进一步改善所述基质。

这种PSI-BLAST检索产生最初2515个采样数。其中787个采样数与FutC具有大于22％的序列一致性。396个采样数的氨基酸长度大于275。对采样进行补充分析，包括根据对FutC的一致性百分比分类，用BLAST将序列与现存的α(1，2)-岩藻糖转移酶库存量(已知的α(1，2)-岩藻糖转移酶)，并手动注释采样序列，确定来源于细菌的、天然存在于胃肠道的序列。通过这种筛选识别出的新型α(1，2)岩藻糖转移酶的注释列表显示在表1中。表1提供了发现候选酶的细菌种类、GenBank登记号码、GI标识号码、氨基酸序列和与FutC的序列同一性％。

在识别的采样中，12种新型α(1，2)-岩藻糖转移酶被进一步分析其功能性生产力：产黑素普雷沃菌FutO、梭状芽孢杆菌(Clostridium bolteae)+13FutP、毛螺菌科FutQ、甲烷微菌属(Methanosphaerula palustris)FutR、坦纳菌属(tannerella sp.)FutS、粪拟杆菌FutU、丁酸弧菌属FutV、普雷沃菌属FutW、乔治普氏菌(parabacteroides johnsonii)FutX、肠道疣微菌(Akkermansia muciniphilia)FutY、肠道沙门氏菌FutZ、拟杆菌FutZA。对于梭状芽孢杆菌(Clostridium bolteae)FutP，注释代表错误引发甲硫氨酸密码子。因此，本发明包括在注释FutP的N-末端具有额外13个氨基酸的FutP(衍生自天然上游DNA序列的非框架设计)，在这里命名为梭状芽孢杆菌(Clostridium bolteae)+13FutP。下面表2显示了12种被识别的新型α(1，2)-岩藻糖转移酶和4种预先识别的α(1，2)-岩藻糖转移酶之间的序列一致性。

表2.序列一致性

根据α(1，2)岩藻糖转移酶的氨基酸序列(即，在表1中)，本领域普通技术人员使用本领域已知的标准方法可以容易的设计变种并构建变种。例如，所述变种包括核蛋白体的结合位点，并且进行了密码子优化从而在宿主细菌生产菌株(即，大肠杆菌)中表达，并具有常见的6-齿限制酶切位点或者存在于所述宿主菌株中的内源性限制酶识别的位点(即，EcoK限制酶切位点)，移除从而使大肠杆菌宿主菌株中的克隆和表达变简单。在一种优选的实施方案中，所述变种用下列结构构建：EcoRI位点-T7g10RBS-α(1，2)FT变种-XhoI位点。表3显示了12种α(1，2)岩藻糖转移酶的样品变种的核酸序列(起始甲硫氨酸ATG密码子是粗字体)。

表3. 12种新型α(1，2)-岩藻糖转移酶变种的核酸序列

在这里所描述的任意方法中，所述α(1，2)-岩藻糖转移酶基因或者基因产物可能是变体或者其功能性的片段。这里所公开的基因或者基因产物的变体与这里所描述的核酸或者氨基酸序列具有50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或者99％的序列一致性。

这里公开的变体还包括这里所描述的基因或者基因产物的同族体、直系同源物或者旁系同源物，与这里特指的基因或者基因产物维持相同的生物功能。这些变体可以与在这里描述的方法中使用的基因互换使用。这些变体说明同源性或者一致性百分比，比如50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或者99％一致的保守区域对于生物功能是重要的，尤其是在功能性区域，例如，催化结构域。

在涉及两个或者更多个核酸或者多肽序列的上下文中，术语“一致性％”指的是两个或者更多个序列或者子序列是相同的或者具有指定百分比的氨基酸残基或者核苷酸是相同的，当比较并排列进行最大一致性时，当使用下列序列比较运算或者目测检查的方法来测量时。例如，一致性％相对于序列编码区域的长度被比较或者具体片段或者其功能性区域的长度。

对于序列对比，一般一个序列用作参考序列，针对此序列比较检测序列。当使用序列比较运算时，向电脑中输入检测序列和参考序列，必要时，指定子序列坐标，并且指定序列运算程序参数。然后，根据指定的程序参数，序列比较运算计算检测序列相对于参考序列的序列一致性百分比。

使用检索运算(例如BLAST和PSI-BLAST)确定一致性百分比(Altschul et al.，1990，J Mol Biol 215：3，403-410；Altschul et al.，1997，Nucleic Acids Res 25：17，3389-402).对于PSI-BLAST检索，使用下列示范性参数：(1)期望阈值是10；(2)Gap成本是Existence：11和Extension：1；(3)使用的基质是BLOSUM62；(4)对于低复杂性区域的过滤是“on”。

通过突变可以向这里所描述的任意基因或者基因产物的核酸序列或者氨基酸序列中引入变化，导致编码蛋白质或者酶的氨基酸序列发生改变，但不改变所的蛋白质或者酶的功能性能力。例如，可以对这里公开的所有序列中的任意序列进行核苷酸取代作用，从而导致在“非必需”氨基酸残基处发生氨基酸取代作用。“非必需”氨基酸残基是在序列某一位置的残基，此位置的残基相对于多肽的野生型序列发生改变时不会改变多肽的生物活性，而“必需”的氨基酸残基是指维持生物活性所必须的位置处的残基。例如，在蛋白质家族成员之间保守的氨基酸残基不可能发生突变。然而其他氨基酸残基(例如，在蛋白质家族成员之间保守性较低的氨基酸残基)可能不是其活性必需的，因此可以发生变化。因此，本发明的另一方面有关于编码这里所公开的蛋白质或者酶，所述蛋白质或者酶与这里公开的氨基酸序列相比包含氨基酸残基的改变，但是被改变的氨基酸残基对维持其活性(即，岩藻糖转移酶活性)是非必需的。

与这里所描述的任何基因相比，能够编码基本上维持功能性能力的蛋白质的分离的核酸分子可以通过引入一种或者一种以上核苷酸取代作用、填加或者删除相应的核苷酸序列来产生，从而向编码的蛋白质中引入一种或者一种以上氨基酸取代作用、填加或者删除。

通过标准技术可以向核酸序列中引入突变，从而改变编码的氨基酸序列，所述突变例如定点诱变和PCR-调节的致突变作用。优选的，保守性氨基酸取代发生在一种或者一种以上预知的非必需氨基酸残基上。“保守性氨基酸取代作用"是将氨基酸残基替换为具有类似侧链的氨基酸残基。本领域中以及定义了具有相似侧链的氨基酸残基族。某些氨基酸具有侧链，含有一个以上可分类的特征。这些族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如、赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如、天冬氨酸、谷氨酸)、带有不带电的极性侧链的氨基酸(例如、甘氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸、胞嘧啶)、具有非极性侧链的氨基酸(例如、丙氨酸、缬氨酸、白氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯基丙氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、色氨酸)、具有β-侧链的氨基酸(例如、苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如、酪氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在给定多肽上的预知的非必需氨基酸残基被来自相同侧链族的另一个氨基酸残基所取代。做为选择，在另一个实施方案中，在所有或者部分给定的编码序列中随机引入突变，例如，通过饱和致突变作用，则所得的突变株可以被筛选是否具有给定的多肽生物活性，从而确定维持活性的突变株。相反的，本发明还提供了具有能够提高或者增加内源性生物活性突变的变体。在所述核酸序列致突变作用之后，通过本领域已知的任意重组技术表达编码的蛋白质并测定所述蛋白质的活性。这里所公开的变体给定生物活性的增加、减少或者消除可以容易的被本发明所属领域普通技术人员，通过测定调节低聚糖修饰、合成或者降解作用能力来调节(通过检测产物)。

本发明还提供了这里所描述的基因或者基因产物的功能性片段。对于这些序列来说，片段和在这里所提供的其他物质被定义为全部的一部分，小于全部。而且，片段的尺寸可以是多聚核苷酸或者多肽序列内单个核苷酸或者氨基酸到比全部多聚核苷酸或者多肽序列较少的核苷酸或者氨基酸。最后，片段的定义是完整多聚核苷酸或者多肽序列的任意部分，即上面极端定义的中间部分。

例如，这里所公开的蛋白质或者酶的片段或者被这里所公开的基因所编码的蛋白质或者酶的片段可以是10到20个氨基酸、10到30个氨基酸、10到40个氨基酸、10到50个氨基酸、10到60个氨基酸、10到70个氨基酸、10到80个氨基酸、10到90个氨基酸、10到100个氨基酸、50到100个氨基酸、75到125个氨基酸、100到150个氨基酸、150到200个氨基酸、200到250个氨基酸、250到300个氨基酸、300到350个氨基酸、350到400个氨基酸、400到450个氨基酸，或者450到500个氨基酸。本发明所包括的片段包括维持其功能性片段的片段。因而，所述片段优选的保持催化结构域，所述催化结构域对于功能活性是必须的或者是重要的。使用这里的序列信息可以产生或者确定片段，并且所述片段可以使用本领域已知的标准方法来检测器功能活性。例如，通过本领域已知的任意重组技术表达编码的蛋白质并测定所述蛋白质的活性。通过测量合成或者修饰底物低聚糖的能力来测定所述片段的生物功能，或者相反的，通过测量分解代谢低聚糖底物的能力来测量所述片段的生物功能。

在本发明上下文中，如这里所使用的“功能等价物”指的是与野生型岩藻糖转移酶相比能够显示出基本上相似的活性的基因或者所得编码的蛋白质变体或其片段。具体地说，岩藻糖转移酶活性指的是能够将岩藻糖通过α-(1，2)-键传递到受体底物中。如这里所使用的，“基本上相似的活性”指的是其活性程度在野生型岩藻糖转移酶活性程度的5％、10％、20％、30％、40％或者50％以内。

为了检测乳糖-利用性岩藻糖基转移酶活性，在表达候选酶(或变体)的宿主有机体中评价岩藻糖基化的低聚糖(即，2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL))的产生，并且其包含细胞质的鸟苷二磷酸-岩藻糖和乳糖库。岩藻糖基化低聚糖的产生说明候选酶-编码序列起到了乳糖-利用性α(1，2)岩藻糖转移酶的作用。

工程设计的大肠杆菌从而产生人类乳汁低聚糖2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)

这里所描述的是基因筛选方法，所述方法用于确认新型的α(1，2)岩藻糖转移酶(α(1，2)FTs)，用于在代谢工程设计的大肠杆菌中合成岩藻糖-连接的低聚糖。尤其感兴趣的是能够合成人类乳汁低聚糖(HMOS)2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)的α(1，2)FTs。2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)是一种人类乳汁中最大量存在的岩藻糖基化低聚糖，并且这种低聚糖保护新生儿不受细菌性病原体例如空肠弯曲菌导致的传染性腹泻感染(Ruiz-Palacios，G.M.，etal.(2003).J Biol Chem 278，14112-120；Morrow，A.L.et al.(2004).J Pediatr 145，297-303；Newburg，D.S.et al.(2004).Glycobiology 14，253-263)。其他所关心的α(1，2)FTs是能够合成人类乳汁低聚糖(HMOS)乳糖二岩藻四糖(LDFT)、乳-N-岩藻五糖I(LNFI)或者乳-N-二岩藻六糖I(LDFH I)的FTs。

人类乳汁中岩藻糖低聚糖的合成途径在图1中表示出来。在结构上讲，2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)由岩藻糖分子与乳糖的半乳糖部分通过α(1，2)键连接(Fucα1-2Galβ1-4Glc)。来自螺杆菌幽门菌株26695的α(1，2)FT也叫做FutC，已经被用于催化2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)在代谢工程性大肠杆菌中合成(Drouillard，S.et al.(2006).Angew Chem IntEd Engl 45，1778-780)。

使用标准分子生物技术将候选α(1，2)FT(即，变种)克隆进入表达质粒中。该质粒利用强有力的左侧启动子噬菌体λ(叫做PL)直接表达候选基因(Sanger，F.et al.(1982).JMol Biol 162，729-773)。所述启动子是可控制的，例如，trp-cI构建物被稳定的整合到大肠杆菌宿主基因组(在ampC位点)中，并且通过向生长培养基中加入色氨酸进行控制。使用对温度敏感的cI阻断剂逐步诱导完成蛋白质表达。已经描述了另一个类似控制策略(与温度无关的表达系统)(Mieschendahl et al.，1986，Bio/Technology 4：802-808)。该质粒还携带大肠杆菌rcsA基因从而上调鸟苷二磷酸-岩藻糖合成，这是岩藻糖-连接的低聚糖合成的一种至关重要的前体。另外，所述质粒携带一种β-内酰胺酶(bla)基因和一种天然的thyA(胸苷酸合酶)基因，其中，所述β-内酰胺酶(bla)基因用于通过氨苄青霉素选择(为了方便起见在实验室中)将所述质粒维持在宿主菌株中，所述天然thyA(胸苷酸合酶)基因是thyA-宿主中的替换性选择方法。替代性可选择的标记物包括proBA基因，来弥补脯氨酸营养缺陷型(Stein et al.，(1984)，J Bacteriol 158：2，696-700(1984)或者purA，来弥补腺嘌呤营养缺陷型(S.A.Wolfe，J.M.Smith，J Biol Chem 263，19147-53(1988))。为了用作质粒可选择的标记物，这些基因中的每个都首先在宿主细胞染色体中失活，然后在质粒上提供基因的野生型拷贝。做为选择，所述质粒上可以使用耐药性基因，例如β-内酰胺酶(该基因已经在如上所述的表达质粒上表达，从而允许用氨苄青霉素选择)。氨苄青霉素选择是本领域内已知的，在标准实验手册中已经被描述了，例如在Maniatis et al.，(1982)Molecularcloning，a laboratory manual(分子克隆，实验室手册).Cold Spring HarborLaboratory(冷泉港实验室)，Cold Spring(冷泉)，NY.中的描述。

下面提供了这种表达质粒的核酸序列pEC2-(T7)FutX-rcsA-thyA(pG401)。带下划线的序列代表了FutX变种，使用标准重组DNA技术，其可以容易的被任意一种这里所描述的新型α(1，2)FT所代替。

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IDNO：287)

表达构建物被转入宿主菌株，有效用于产生2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)。生物合成的2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)要求增加的乳糖和鸟苷二磷酸-岩藻糖细胞文库的产生(图2)。野生型大肠杆菌K12原养型菌株W3110被选作亲本背景，检验候选物催化2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)产生的能力(Bachmann，B.J.(1972).Bacteriol Rev 36，525-557).使用的具体W3110衍生物预先通过引入(在ampC位点)色氨酸-可诱导的PtrpBcI+阻断剂暗盒进行修饰，产生大肠杆菌菌株，被称为GI724(LaVallie，E.R.et al.(2000).Methods Enzymol 326，322-340)。GI724的其他特征包括lacIq和lacPL8启动子突变。在用低水平外源色氨酸诱导之后，大肠杆菌GI724能够经济的生产来自噬菌体λPL启动子处的重组蛋白质(LaVallie，E.R.et al.(1993).Biotechnology(N Y)11，187-193；Mieschendahl，et al.(1986).Bio/Technology 4，802-08)。对这些菌株进行其他的遗传改变，从而促进2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)的生物合成。通过一些使用染色体的λ红色重组(Court，D.L.et al.(2002).Annu RevGenet 36，361-388)和一般化的P1噬菌体传导在菌株GI724中实现这一目的。

首先，通过同时删除内源性的β-半乳糖苷酶基因(lacZ)和乳糖操纵子阻遏基因(lacI)来设计大肠杆菌宿主菌株积聚细胞内乳糖的能力。在构建这些删除期间，lacIq启动子直接放置在乳糖渗透酶基因lacY的上游。这种修饰的菌株维持其从培养基运输乳糖的能力(通过LacY)，但是删除了负责乳糖分解的lacZ(β-半乳糖苷酶)基因野生型拷贝。因此，当在外源乳糖存在时，培养修饰的菌株，产生细胞内乳糖库。图12显示了P_lacIqlacY⁺染色体构建物示意图。

下面显示了P_lacIqlacY⁺染色体构建物的基因组DNA序列(SEQ ID NO：288)：

CACCATCGAATGGCGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGAGAGTCAAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTAAGGAGGATATTCATATGTACTATTTAAAAAACACAAACTTTTGGATGTTCGGTTTATTCTTTTTCTTTTACTTTTTTATCATGGGAGCCTACTTCCCGTTTTTCCCGATTTGGCTACATGACATCAACCATATCAGCAAAAGTGATACGGGTATTATTTTTGCCGCTATTTCTCTGTTCTCGCTATTATTCCAACCGCTGTTTGGTCTGCTTTCTGACAAACTCGGGCTGCGCAAATACCTGCTGTGGATTATTACCGGCATGTTAGTGATGTTTGCGCCGTTCTTTATTTTTATCTTCGGGCCACTGTTACAATACAACATTTTAGTAGGATCGATTGTTGGTGGTATTTATCTAGGCTTTTGTTTTAACGCCGGTGCGCCAGCAGTAGAGGCATTTATTGAGAAAGTCAGCCGTCGCAGTAATTTCGAATTTGGTCGCGCGCGGATGTTTGGCTGTGTTGGCTGGGCGCTGTGTGCCTCGATTGTCGGCATCATGTTCACCATCAATAATCAGTTTGTTTTCTGGCTGGGCTCTGGCTGTGCACTCATCCTCGCCGTTTTACTCTTTTTCGCCAAAACGGATGCGCCCTCTTCTGCCACGGTTGCCAATGCGGTAGGTGCCAACCATTCGGCATTTAGCCTTAAGCTGGCACTGGAACTGTTCAGACAGCCAAAACTGTGGTTTTTGTCACTGTATGTTATTGGCGTTTCCTGCACCTACGATGTTTTTGACCAACAGTTTGCTAATTTCTTTACTTCGTTCTTTGCTACCGGTGAACAGGGTACGCGGGTATTTGGCTACGTAACGACAATGGGCGAATTACTTAACGCCTCGATTATGTTCTTTGCGCCACTGATCATTAATCGCATCGGTGGGAAAAACGCCCTGCTGCTGGCTGGCACTATTATGTCTGTACGTATTATTGGCTCATCGTTCGCCACCTCAGCGCTGGAAGTGGTTATTCTGAAAACGCTGCATATGTTTGAAGTACCGTTCCTGCTGGTGGGCTGCTTTAAATATATTACCAGCCAGTTTGAAGTGCGTTTTTCAGCGACGATTTATCTGGTCTGTTTCTGCTTCTTTAAGCAACTGGCGATGATTTTTATGTCTGTACTGGCGGGCAATATGTATGAAAGCATCGGTTTCCAGGGCGCTTATCTGGTGCTGGGTCTGGTGGCGCTGGGCTTCACCTTAATTTCCGTGTTCACGCTTAGCGGCCCCGGCCCGCTTTCCCTGCTGCGTCGTCAGGTGAATGAAGTCGCTTAAGCAATCAATGTCGGATGCGGCGCGAGCGCCTTATCCGACCAACATATCATAACGGAGTGATCGCATTGTAAATTATAAAAATTGCCTGATACGCTGCGCTTATCAGGCCTACAAGTTCAGCGATCTACATTAGCCGCATCCGGCATGAACAAAGCGCAGGAACAAGCGTCGCA

第二，通过删除wcaJ基因(编码尿苷二磷酸-葡萄糖脂质载体转移酶)删除宿主大肠杆菌菌株合成柯拉酸(一种细胞外荚膜多糖)的能力(Stevenson，G.et al.(1996).JBacteriol 178，4885-893)。在wcaJ无效的背景下，鸟苷二磷酸-岩藻糖在大肠杆菌细胞质中聚集。(Dumon，C.et al.(2001).Glycoconj J 18，465-474)。图13显示了wcaJ染色体删除的示意图。

大肠杆菌携带ΔwcaJ：：FRT突变的染色体区域的序列显示如下(SEQ ID NO：289)：

GTTCGGTTATATCAATGTCAAAAACCTCACGCCGCTCAAGCTGGTGATCAACTCCGGGAACGGCGCAGCGGGTCCGGTGGTGGACGCCATTGAAGCCCGCTTTAAAGCCCTCGGCGCGCCCGTGGAATTAATCAAAGTGCACAACACGCCGGACGGCAATTTCCCCAACGGTATTCCTAACCCACTACTGCCGGAATGCCGCGACGACACCCGCAATGCGGTCATCAAACACGGCGCGGATATGGGCATTGCTTTTGATGGCGATTTTGACCGCTGTTTCCTGTTTGACGAAAAAGGGCAGTTTATTGAGGGCTACTACATTGTCGGCCTGTTGGCAGAAGCATTCCTCGAAAAAAATCCCGGCGCGAAGATCATCCACGATCCACGTCTCTCCTGGAACACCGTTGATGTGGTGACTGCCGCAGGTGGCACGCCGGTAATGTCGAAAACCGGACACGCCTTTATTAAAGAACGTATGCGCAAGGAAGACGCCATCTATGGTGGCGAAATGAGCGCCCACCATTACTTCCGTGATTTCGCTTACTGCGACAGCGGCATGATCCCGTGGCTGCTGGTCGCCGAACTGGTGTGCCTGAAAGATAAAACGCTGGGCGAACTGGTACGCGACCGGATGGCGGCGTTTCCGGCAAGCGGTGAGATCAACAGCAAACTGGCGCAACCCGTTGAGGCGATTAACCGCGTGGAACAGCATTTTAGCCGTGAGGCGCTGGCGGTGGATCGCACCGATGGCATCAGCATGACCTTTGCCGACTGGCGCTTTAACCTGCGCACCTCCAATACCGAACCGGTGGTGCGCCTGAATGTGGAATCGCGCGGTGATGTGCCGCTGATGGAAGCGCGAACGCGAACTCTGCTGACGTTGCTGAACGAGTAATGTCGGATCTTCCCTTACCCCACTGCGGGTAAGGGGCTAATAACAGGAACAACGATGATTCCGGGGATCCGTCGACCTGCAGTTCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCGAAGCAGCTCCAGCCTACAGTTAACAAAGCGGCATATTGATATGAGCTTACGTGAAAAAACCATCAGCGGCGCGAAGTGGTCGGCGATTGCCACGGTGATCATCATCGGCCTCGGGCTGGTGCAGATGACCGTGCTGGCGCGGATTATCGACAACCACCAGTTCGGCCTGCTTACCGTGTCGCTGGTGATTATCGCGCTGGCAGATACGCTTTCTGACTTCGGTATCGCTAACTCGATTATTCAGCGAAAAGAAATCAGTCACCTTGAACTCACCACGTTGTACTGGCTGAACGTCGGGCTGGGGATCGTGGTGTGCGTGGCGGTGTTTTTGTTGAGTGATCTCATCGGCGACGTGCTGAATAACCCGGACCTGGCACCGTTGATTAAAACATTATCGCTGGCGTTTGTGGTAATCCCCCACGGGCAACAGTTCCGCGCGTTGATGCAAAAAGAGCTGGAGTTCAACAAAATCGGCATGATCGAAACCAGCGCGGTGCTGGCGGGCTTCACTTGTACGGTGGTTAGCGCCCATTTCTGGCCGCTGGCGATGACCGCGATCCTCGGTTATCTGGTCAATAGTGCGGTGAGAACGCTGCTGTTTGGCTACTTTGGCCGCAAAATTTATCGCCCCGGTCTGCATTTCTCGCTGGCGTCGGTGGCACCGAACTTACGCTTTGGTGCCTGGCTGACGGCGGACAGCATCATCAACTATCTCAATACCAACCTTTCAACGCTCGTGCTGGCGCGTATTCTCGGCGCGGGCGTGGCAGGGGGATACAACCTGGCGTACAACGTGGCCGTTGTGCCACCGATGAAGCTGAACCCAATCATCACCCGCGTGTTGTTTCCGGCATTCGCCAAAATTCAGGACGATACCGAAAAGCTGCGTGTTAACTTCTACAAGCTGCTGTCGGTAGTGGGGATTATCAACTTTCCGGCGCTGCTCGGGCTAATGGTGGTGTCGAATAACTTTGTACCGCTGGTCTTTGGTGAGAAGTGGAACAGCATTATTCCGGTGCTGCAATTGCTGTGTGTGGTGGGTCTGCTGCGCTCCG

第三，通过向lon基因中引入无效突变来增加细胞质鸟苷二磷酸-岩藻糖库的数量。Lon是一种腺苷酸-5′-三磷酸盐(ATP)-依赖性的细胞内蛋白酶，负责降解RcsA，它是大肠杆菌中柯拉酸生物合成的阳性翻译调节蛋白。(Gottesman，S.&Stout，V.Mol Microbiol5，1599-1606(1991)).在lon无效的背景下，RcsA是稳定的，RcsA水平增加，在大肠杆菌中负责鸟苷二磷酸-岩藻糖合成的基因被上调节，并且细胞内鸟苷二磷酸-岩藻糖浓度增加。所述lon基因几乎全部被删除并且被插入的功能性、野生型但是启动子更少的大肠杆菌lacZ⁺基因(Δlon：：(kan，lacZ⁺)所取代。λ红色重组法用来进行所述构建。图14显示了插入lon位点的kan，lacZ⁺的示意图。

下面表示了插入大肠杆菌中lon区域lacZ+周围的基因组DNA序列(SEQ ID NO：290)：

GTGGATGGAAGAGGTGGAAAAAGTGGTTATGGAGGAGTGGGTAATTGATGGTGAAAGGAAAGGGTTGGTGATTTATGGGAAGGGGGAAGGGGAAGAGGGATGTGGTGAATAATTAAGGATTGGGATAGAATTAGTTAAGGAAAAAGGGGGGATTTTATGTGGGGTTTAATTTTTGGTGTATTGTGGGGGTTGAATGTGGGGGAAAGATGGGGATATAGTGAGGTAGATGTTAATAGATGGGGTGAAGGAGAGTGGTGTGATGTGATTAGGTGGGGGAAATTAAAGTAAGAGAGAGGTGTATGATTGGGGGGATGGGTGGAGGTGGAGTTGGAAGTTGGTATTGTGTAGAAAGTATAGGAAGTTGAGAGGGGTTTTGAAGGTGAGGGTGGGGGAAGGAGTGAGGGGGGAAGGGGTGGTAAAGGAAGGGGAAGAGGTAGAAAGGGAGTGGGGAGAAAGGGTGGTGAGGGGGGATGAATGTGAGGTAGTGGGGTATGTGGAGAAGGGAAAAGGGAAGGGGAAAGAGAAAGGAGGTAGGTTGGAGTGGGGTTAGATGGGGATAGGTAGAGTGGGGGGTTTTATGGAGAGGAAGGGAAGGGGAATTGGGAGGTGGGGGGGGGTGTGGTAAGGTTGGGAAGGGGTGGAAAGTAAAGTGGATGGGTTTGTTGGGGGGAAGGATGTGATGGGGGAGGGGATGAAGATGTGATGAAGAGAGAGGATGAGGATGGTTTGGGATGATTGAAGAAGATGGATTGGAGGGAGGTTGTGGGGGGGGTTGGGTGGAGAGGGTATTGGGGTATGAGTGGGGAGAAGAGAGAATGGGGTGGTGTGATGGGGGGGTGTTGGGGGTGTGAGGGGAGGGGGGGGGGGTTGTTTTTGTGAAGAGGGAGGTGTGGGGTGGGGTGAATGAAGTGGAGGAGGAGGGAGGGGGGGTATGGTGGGTGGGGAGGAGGGGGGTTGGTTGGGGAGGTGTGGTGGAGGTTGTGAGTGAAGGGGGAAGGGAGTGGGTGGTATTGGGGGAAGTGGGGGGGGAGGATGTGGTGTGATGTGAGGTTGGTGGTGGGGAGAAAGTATGGATGATGGGTGATGGAATGGGGGGGGTGGATAGGGTTGATGGGGGTAGGTGGGGATTGGAGGAGGAAGGGAAAGATGGGATGGAGGGAGGAGGTAGTGGGATGGAAGGGGGTGTTGTGGATGAGGATGATGTGGAGGAAGAGGATGAGGGGGTGGGGGGAGGGGAAGTGTTGGGGAGGGTGAAGGGGGGATGGGGGAGGGGGAGGATGTGGTGGTGAGGGATGGGGATGGGTGGTTGGGGAATATGATGGTGGAAAATGGGGGGTTTTGTGGATTGATGGAGTGTGGGGGGGTGGGTGTGGGGGAGGGGTATGAGGAGATAGGGTTGGGTAGGGGTGATATTGGTGAAGAGGTTGGGGGGGAATGGGGTGAGGGGTTGGTGGTGGTTTAGGGTATGGGGGGTGGGGATTGGGAGGGGATGGGGTTGTATGGGGTTGTTGAGGAGTTGTTGTAATAAGGGGATGTTGAAGTTGGTATTGGGAAGTTGGTATTGTGTAGAAAGTATAGGAAGTTGGAAGGAGGTGGAGGGTAGATAAAGGGGGGGGTTATTTTTGAGAGGAGAGGAAGTGGTAATGGTAGGGAGGGGGGGTGAGGTGGAATTGGGGGGATAGTGAGGGGGTGGAGGAGTGGTGGGGAGGAATGGGGATATGGAAAGGGTGGATATTGAGGGATGTGGGTTGTTGGGGGTGGAGGAGATGGGGATGGGTGGTTTGGATGAGTTGGTGTTGAGTGTAGGGGGTGATGTTGAAGTGGAAGTGGGGGGGGGAGTGGTGTGGGGGATAATTGAATTGGGGGGTGGGGGAGGGGAGAGGGTTTTGGGTGGGGAAGAGGTAGGGGGTATAGATGTTGAGAATGGGAGATGGGAGGGGTGAAAAGAGGGGGGAGTAAGGGGGTGGGGATAGTTTTGTTGGGGGGGTAATGGGAGGGAGTTTAGGGGGTGTGGTAGGTGGGGGAGGTGGGAGTTGAGGGGAATGGGGGGGGGATGGGGTGTATGGGTGGGGAGTTGAAGATGAAGGGTAATGGGGATTTGAGGAGTAGGATGAATGGGGTAGGTTTTGGGGGTGATAAATAAGGTTTTGGGGTGATGGTGGGAGGGGTGAGGGGTGGTAATGAGGAGGGGATGAGGAAGTGTATGTGGGGTGGAGTGGAAGAAGGGTGGTTGGGGGTGGTAATGGGGGGGGGGGTTGGAGGGTTGGAGGGAGGGGTTAGGGTGAATGGGGGTGGGTTGAGTTAGGGGAATGTGGTTATGGAGGGGTGGAGGGGTGAAGTGATGGGGGAGGGGGGTGAGGAGTTGTTTTTTATGGGGAATGGAGATGTGTGAAAGAAAGGGTGAGTGGGGGTTAAATTGGGAAGGGTTATTAGGGAGGTGGATGGAAAAATGGATTTGGGTGGTGGTGAGATGGGGGATGGGGTGGGAGGGGGGGGGGAGGGTGAGAGTGAGGTTTTGGGGGAGAGGGGAGTGGTGGGAGGGGGTGATGTGGGGGGGTTGTGAGGATGGGGTGGGGTTGGGTTGGAGTAGGGGTAGTGTGAGGGAGAGTTGGGGGGGGGTGTGGGGGTGGGGTAGTTGAGGGAGTTGAATGAAGTGTTTAGGTTGTGGAGGGAGATGGAGAGGGAGTTGAGGGGTTGGGAGGGGGTTAGGATGGAGGGGGAGGATGGAGTGGAGGAGGTGGTTATGGGTATGAGGGAAGAGGTATTGGGTGGTGAGTTGGATGGTTTGGGGGGATAAAGGGAAGTGGAAAAAGTGGTGGTGGTGTTTTGGTTGGGTGAGGGGTGGATGGGGGGTGGGGTGGGGAAAGAGGAGAGGGTTGATAGAGAAGTGGGGATGGTTGGGGGTATGGGGAAAATGAGGGGGGTAAGGGGAGGAGGGGTTGGGGTTTTGATGATATTTAATGAGGGAGTGATGGAGGGAGTGGGAGAGGAAGGGGGGGTGTAAAGGGGGATAGTGAGGAAAGGGGTGGGAGTATTTAGGGAAAGGGGGAAGAGTGTTAGGGATGGGGTGGGGGTATTGGGAAAGGATGAGGGGGGGGGTGTGTGGAGGTAGGGAAAGGGATTTTTTGATGGAGGATTTGGGGAGAGGGGGGAAGGGGTGGTGTTGATGGAGGGGGGGGTAGATGGGGGAAATAATATGGGTGGGGGTGGTGTGGGGTGGGGGGGGTTGATAGTGGAGGGGGGGGGAAGGATGGAGAGATTTGATGGAGGGATAGAGGGGGTGGTGATTAGGGGGGTGGGGTGATTGATTGGGGAGGGAGGAGATGATGAGAGTGGGGTGATTAGGATGGGGGTGGAGGATTGGGGTTAGGGGTTGGGTGATGGGGGGTAGGGAGGGGGGATGATGGGTGAGAGGATTGATTGGGAGGATGGGGTGGGTTTGAATATTGGGTTGATGGAGGAGATAGAGGGGGTAGGGGTGGGAGAGGGTGTAGGAGAGGGGATGGTTGGGATAATGGGAAGAGGGGAGGGGGTTAAAGTTGTTGTGGTTGATGAGGAGGATATGGTGGAGGATGGTGTGGTGATGGATGAGGTGAGGATGGAGAGGATGATGGTGGTGAGGGTTAAGGGGTGGAATGAGGAAGGGGTTGGGGTTGAGGAGGAGGAGAGGATTTTGAATGGGGAGGTGGGGGAAAGGGAGATGGGAGGGTTGTGGTTGAATGAGGGTGGGGTGGGGGGTGTGGAGTTGAAGGAGGGGAGGATAGAGATTGGGGATTTGGGGGGTGGAGAGTTTGGGGTTTTGGAGGTTGAGAGGTAGTGTGAGGGGATGGGGATAAGGAGGAGGGTGATGGATAATTTGAGGGGGGAAAGGGGGGGTGGGGGTGGGGAGGTGGGTTTGAGGGTGGGATAAAGAAAGTGTTAGGGGTAGGTAGTGAGGGAAGTGGGGGGAGATGTGAAGTTGAGGGTGGAGTAGAGGGGGGGTGAAATGATGATTAAAGGGAGTGGGAAGATGGAAATGGGTGATTTGTGTAGTGGGTTTATGGAGGAAGGAGAGGTGAGGGAAAATGGGGGTGATGGGGGAGATATGGTGATGTTGGAGATAAGTGGGGTGAGTGGAGGGGAGGAGGATGAGGGGGAGGGGGTTTTGTGGGGGGGGTAAAAATGGGGTGAGGTGAAATTGAGAGGGGAAAGGAGTGTGGTGGGGGTAAGGGAGGGAGGGGGGGTTGGAGGAGAGATGAAAGGGGGAGTTAAGGGGATGAAAAATAATTGGGGTGTGGGGTTGGTGTAGGGAGGTTTGATGAAGATTAAATGTGAGGGAGTAAGAAGGGGTGGGATTGTGGGTGGGAAGAAAGGGGGGATTGAGGGTAATGGGATAGGTGAGGTTGGTGTAGATGGGGGGATGGTAAGGGTGGATGTGGGAGTTTGAGGGGAGGAGGAGAGTATGGGGGTGAGGAAGATGGGAGGGAGGGAGGTTTGGGGGAGGGGTTGTGGTGGGGGAAAGGAGGGAAAGGGGGATTGGGGATTGAGGGTGGGGAAGTGTTGGGAAGGGGGATGGGTGGGGGGGTGTTGGGTATTAGGGGAGGTGGGGAAAGGGGGATGTGGTGGAAGGGGATTAAGTTGGGTAAGGGGAGGGTTTTGGGAGTGAGGAGGTTGTAAAAGGAGGGGGAGTGAATGGGTAATGATGGTGATAGTAGGTTTGGTGAGGTTGTGAGTGGAAAATAGTGAGGTGGGGGAAAATGGAGTAATAAAAAGAGGGGTGGGAGGGTAATTGGGGGTTGGGAGGGTTTTTTTGTGTGGGTAAGTTAGATGGGGGATGGGGGTTGGGGTTATTAAGGGGTGTTGTAAGGGGATGGGTGGGGTGATATAAGTGGTGGGGGTTGGTAGGTTGAAGGATTGAAGTGGGATATAAATTATAAAGAGGAAGAGAAGAGTGAATAAATGTGAATTGATGGAGAAGATTGGTGGAGGGGGTGATATGTGTAAAGGTGGGGGTGGGGGTGGGTTAGATGGTATTATTGGTTGGGTAAGTGAATGTGTGAAAGAAGG

第四，一种thyA(胸苷酸合酶)突变通过P1转导被引入菌株中。当不存在外源胸腺嘧啶时，thyA菌株不能制造DNA并死亡。通过在多拷贝质粒上提供野生型thyA基因可以弥补这一缺陷(Belfort，M.，Maley，G.F.，and Maley，F.(1983).Proc Natl Acad Sci U S A80，1858-861)。这里使用的互补作用是维持质粒的方法。

另一种对增加游离乳糖细胞质库(由此2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)的最后产量被增加)很有效的修饰是整合lacA突变。LacA是一种乳糖乙酰转移酶，只有当高水平的乳糖聚积在所述大肠杆菌细胞质中时才有活性。高细胞内渗透性(例如，由高细胞内乳糖池引起的)可以抑制细菌繁殖，并且大肠杆菌进化出一种适合于保护其自身免受细胞内部由乳糖引起的渗透性的机制，该机制通过用LacA使更多的细胞内乳糖“绑上”乙酰基，并且积极地从细胞中排出所述乙酰-乳糖(Danchin，A.Bioessays 31，769-773(2009))。在被设计产生2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)或者其他人类乳汁低聚糖的大肠杆菌中产生乙酰-乳糖是不受欢迎的，因为这会减少总回收率。而且，副产品乙酰-乳糖会使低聚糖提纯方案变得复杂。lacA突变的整合能够解决这些问题。次-最佳产生岩藻糖基化的低聚糖的方法存在于缺少柯拉酸途径和lon蛋白酶中的一个或者两个突变的菌株中。在不包含lacA突变的菌株中会发生乳糖向一种副产品(乙酰-乳糖)的转化。上面提供了lacA删除的示意图和相应的基因组序列(SEQ ID NO：288)。

该菌株用于检测不同的α(1，2)FT候选物，并整合上述所有遗传修饰和具有下列基因型：

ΔampC：：P_trp ^BcI，Δ(lacI-lacZ)：：FRT，P_lacIqlacY⁺，ΔwcaJ：：FRT，thyA：：Tn10，Δlon：(npt3，lacZ⁺)，ΔlacA

分析了藏匿不同的α(1，2)FT候选表达质粒的大肠杆菌菌株。菌株在选择性培养基(缺少胸腺嘧啶)中生长到早期指数生长期。然后加入乳糖直至最终浓度为0.5％，并且加入色氨酸(200μ M)来诱导每个候选α(1，2)FT从PL启动子处表达。在诱导期末端(大约24小时)，每个菌株等于OD600单位并收获培养物上清液。制备并通过薄层色层分析法(TLC)分析溶解产物检测是否存在2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)。

图11显示了质粒pG217的地图，其携带普通拟杆菌FutN。质粒pG217的序列如下所示(SEQ ID NO：291)：

TCTAGAATTCTAAAAATTGATTGAATGTATGCAAATAAATGCATACACCATAGGTGTGGTTTAATTTGATGCCCTTTTTCAGGGCTGGAATGTGTAAGAGCGGGGTTATTTATGCTGTTGTTTTTTTGTTACTCGGGAAGGGCTTTACCTCTTCCGCATAAACGCTTCCATCAGCGTTTATAGTTAAAAAAATCTTTCGGAACTGGTTTTGCGCTTACCCCAACCAACAGGGGATTTGCTGCTTTCCATTGAGCCTGTTTCTCTGCGCGACGTTCGCGGCGGCGTGTTTGTGCATCCATCTGGATTCTCCTGTCAGTTAGCTTTGGTGGTGTGTGGCAGTTGTAGTCCTGAACGAAAACCCCCCGCGATTGGCACATTGGCAGCTAATCCGGAATCGCACTTACGGCCAATGCTTCGTTTCGTATCACACACCCCAAAGCCTTCTGCTTTGAATGCTGCCCTTCTTCAGGGCTTAATTTTTAAGAGCGTCACCTTCATGGTGGTCAGTGCGTCCTGCTGATGTGCTCAGTATCACCGCCAGTGGTATTTATGTCAACACCGCCAGAGATAATTTATCACCGCAGATGGTTATCTGTATGTTTTTTATATGAATTTATTTTTTGCAGGGGGGCATTGTTTGGTAGGTGAGAGATCAATTCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCTCCTCAACCTGTATATTCGTAAACCACGCCCAATGGGAGCTGTCTCAGGTTTGTTCCTGATTGGTTACGGCGCGTTTCGCATCATTGTTGAGTTTTTCCGCCAGCCCGACGCGCAGTTTACCGGTGCCTGGGTGCAGTACATCAGCATGGGGCAAATTCTTTCCATCCCGATGATTGTCGCGGGTGTGATCATGATGGTCTGGGCATATCGTCGCAGCCCACAGCAACACGTTTCCTGAGGAACCATGAAACAGTATTTAGAACTGATGCAAAAAGTGCTCGACGAAGGCACACAGAAAAACGACCGTACCGGAACCGGAACGCTTTCCATTTTTGGTCATCAGATGCGTTTTAACCTGCAAGATGGATTCCCGCTGGTGACAACTAAACGTTGCCACCTGCGTTCCATCATCCATGAACTGCTGTGGTTTCTGCAGGGCGACACTAACATTGCTTATCTACACGAAAACAATGTCACCATCTGGGACGAATGGGCCGATGAAAACGGCGACCTCGGGCCAGTGTATGGTAAACAGTGGCGCGCCTGGCCAACGCCAGATGGTCGTCATATTGACCAGATCACTACGGTACTGAACCAGCTGAAAAACGACCCGGATTCGCGCCGCATTATTGTTTCAGCGTGGAACGTAGGCGAACTGGATAAAATGGCGCTGGCACCGTGCCATGCATTCTTCCAGTTCTATGTGGCAGACGGCAAACTCTCTTGCCAGCTTTATCAGCGCTCCTGTGACGTCTTCCTCGGCCTGCCGTTCAACATTGCCAGCTACGCGTTATTGGTGCATATGATGGCGCAGCAGTGCGATCTGGAAGTGGGTGATTTTGTCTGGACCGGTGGCGACACGCATCTGTACAGCAACCATATGGATCAAACTCATCTGCAATTAAGCCGCGAACCGCGTCCGCTGCCGAAGTTGATTATCAAACGTAAACCCGAATCCATCTTCGACTACCGTTTCGAAGACTTTGAGATTGAAGGCTACGATCCGCATCCGGGCATTAAAGCGCCGGTGGCTATCTAATTACGAAACATCCTGCCAGAGCCGACGCCAGTGTGCGTCGGTTTTTTTACCCTCCGTTAAATTCTTCGAGACGCCTTCCCGAAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTTCTTTAATGAAGCAGGGCATCAGGACGGTATCTTTGTGGAGAAAGCAGAGTAATCTTATTCAGCCTGACTGGTGGGAAACCACCAGTCAGAATGTGTTAGCGCATGTTGACAAAAATACCATTAGTCACATTATCCGTCAGTCGGACGACATGGTAGATAACCTGTTTATTATGCGTTTTGATCTTACGTTTAATATTACCTTTATGCGATGAAACGGTCTTGGCTTTGATATTCATTTGGTCAGAGATTTGAATGGTTCCCTGACCTGCCATCCACATTCGCAACATACTCGATTCGGTTCGGCTCAATGATAACGTCGGCATATTTAAAAACGAGGTTATCGTTGTCTCTTTTTTCAGAATATCGCCAAGGATATCGTCGAGAGATTCCGGTTTAATCGATTTAGAACTGATCAATAAATTTTTTCTGACCAATAGATATTCATCAAAATGAACATTGGCAATTGCCATAAAAACGATAAATAACGTATTGGGATGTTGATTAATGATGAGCTTGATACGCTGACTGTTAGAAGCATCGTGGATGAAACAGTCCTCATTAATAAACACCACTGAAGGGCGCTGTGAATCACAAGCTATGGCAAGGTCATCAACGGTTTCAATGTCGTTGATTTCTCTTTTTTTAACCCCTCTACTCAACAGATACCCGGTTAAACCTAGTCGGGTGTAACTACATAAATCCATAATAATCGTTGACATGGCATACCCTCACTCAATGCGTAACGATAATTCCCCTTACCTGAATATTTCATCATGACTAAACGGAACAACATGGGTCACCTAATGCGCCACTCTCGCGATTTTTCAGGCGGACTTACTATCCCGTAAAGTGTTGTATAATTTGCCTGGAATTGTCTTAAAGTAAAGTAAATGTTGCGATATGTGAGTGAGCTTAAAACAAATATTTCGCTGCAGGAGTATCCTGGAAGATGTTCGTAGAAGCTTACTGCTCACAAGAAAAAAGGCACGTCATCTGACGTGCCTTTTTTATTTGTACTACCCTGTACGATTACTGCAGCTCGAGTTAGGATACCGGCACTTTGATCCAACCAGTCGGGTAGATATCCGGTGCTTCGGAGTGCTGGAACCAACGGCTCGGCACAATAACAGTCTTATCCATATTAGGGTTCAGCCAGGCACCCCACCAAGAAAACGTGCTGTTACAAATGATGTGATGTTTGCAATGAGACATCAGCATCATATCCTGCCAGGAGTCTTCATCAGTGTTCCAGTCAATATAAACCGCATTCTGCAGTGGCAGATTTTCTTTAACCCACGCGATATCGTCGGAGAAGATATAGTAAGATGGGCTAGCAACACGACGGGACATTTCCGCGATAGCATTCTGGTAATACGGCAGCTGGCACACGGAACCGGTAGTAGCCCAGTGTTTCGGCTGCAGATAGTCACCACGACGAATGTGCAGGGAAACCGCGTTTTCATCTTTGTCCAGGATTTCCAGCATGTTCAGGCTGCGGGAATTTGCTTTGTTCTTATCAAAGGTGAAGGATTCACGCACTTCGTCTTTGATATCAGCGAAGAAACGCTCGCTCTGATAGAAACCTTTAAAGTACAGCAGCGGCCAGAAATACTTCTTCTCGAACGCACGCAGAGAGTTCGGCGCCTGCTTGCGTTCGTAGATTTTTTTAAAAAACAGGAATTCGATAACTTTTTTCAGCGGTTGGTTGATGCAGAATTCGGTGTGCGGCAGGTTGAACACGCGGTGCATTTCGTAACCGTAATGGACTTTGTAATGCATCATGTCGCTCAGGTCGATACGGACCTTCGGGTAATACTTTTTCATACGCAGATAGAAAGCATAGATAAACATCTGGTTGCCCAGACCGCCAGTCACTTTGATCAGACGCATTATATCTCCTTCTTG

从培养肉汤后发酵产物中纯化通过代谢工程设计的大肠杆菌细胞产生的岩藻糖基化低聚糖。示范性的过程包括五个步骤。(1)净化：收获发酵肉汤并且通过早制备离心机中以6000xg处理30分钟沉淀，以除去细胞。每个生物反应器运行产率大约是5-7升部分澄清的上清液。(2)在粗糙的碳上收获产物：一个装满粗糙的碳(六偏磷酸钠12x40TR)的柱，体积大约为1000毫升(尺寸5厘米直径x 6厘米长度)用1柱体积(CV)的水平衡并用澄清的培养上清液以40毫升/分的流苏装载。该柱具有大约120克糖的容量。在装载和糖捕获之后，用1.5CV的水洗涤柱并用2.5CV50％的乙醇或者25％异丙醇洗提(在此步骤中较少浓度的乙醇(25-30％)就足够进行产物洗提)。该溶剂洗提步骤释放大约95％的柱上总结合糖和一小部分有色体。在第一步骤，收获最大量的糖是主要目标。污染物再溶解不是目的。(3)蒸发：来自捕获柱的2.5升的乙醇或者异丙醇洗提液在56℃下进行旋转蒸发并在水中产生糖浆。该步骤可以使用的替换性的方法包括冷冻干燥法或者喷雾干燥法。(4)在精细碳和离子交换介质上进行快速色谱法：柱(GE医疗HiScale50/40，5x40厘米，最大压力20bar)与BiotageIsolera One FLASH色谱系统相连，所述系统填充有750毫升的Darco活性碳G60(100-筛)∶硅藻土535(粗糙的)1∶1混合物(两种柱填充物都来自Sigma公司)。所述柱用5CV的水平衡并使用硅藻土定量装载器或者直接注入装载来自步骤3的糖(10-50克，取决于2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)与污染物乳糖的比例)。所述柱与蒸发的光散射(ELSD)检测器相连检测色谱法期间洗提的糖的峰值。异丙醇、乙醇或者甲醇分别运行四步梯度从而从单糖(如果存在的话)、乳糖和有色体中分离2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)。在120毫升瓶子、池里自动收集糖峰值所对应的部分直接用于步骤5。在某些纯化工程中，运行时间长于正常的发酵步骤，使包含2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)的部分通过阴离子交换柱和阳离子交换柱，可以去掉过度的蛋白质/DNA/焦糖体污染物。能够成功的实现这些目的的树脂是Dowex 22。

已经成功的使用这里所描述的基因筛查方法确定新型的α(1，2)FT在代谢工程大肠杆菌宿主菌株中有效的生物合成2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)。筛选结果概括在表1中。

宿主菌株的产生

大肠杆菌K-12是一种被广泛研究的细菌，在微生物生理学和遗传学一级商业开发中已经广泛的作为研究主体进行各种工业应用。亲本种大肠杆菌的天然栖息地是哺乳动物的大肠。大肠杆菌K-12具有安全使用的历史，并且其衍生物用于许多工业应用中，包括产生适用于人类给药和消费的化学品和药物。大肠杆菌K-12本来是在1922年从恢复期白喉病人中分离出来的。由于其缺乏毒性特征，容易在普通实验室介质上生长，已经被广泛的用于微生物生理学和遗传学研究，她已经变成标准细菌学菌株用于微生物研究、教课和产生适用于工业和医药的产物。大肠杆菌K-12目前被认为是一种致衰弱的有机体可以在实验室环境下维持70年。因此，在正常情况下K-12不适于移植入人类和其他动物的大肠中。关于这种非常著名的菌株的其他信息可以在以下网址中发现：http：//epa.gov/oppt/biotech/pubs/ fra/fra004.htm.除了大肠杆菌K12之外，多种细菌菌株可以被用于产生宿主菌株，例如，多种细菌菌株可以用于低聚糖生物合成方法，例如，草生欧文氏杆菌(成团泛菌)、弗氏柠檬细菌、柠檬泛菌、胡萝卜软腐病果胶杆菌或者黄单胞菌。还可以使用杆菌类的细菌，包括枯草杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、嗜热杆菌、侧孢芽胞杆菌、巨大芽孢杆菌、霉菌样杆菌、短小芽胞杆菌、迟缓芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌和环状杆菌。同样，使用本发明所述方法可以对乳杆菌属和乳球菌属进行修饰，包括但是不局限于嗜酸乳杆菌、唾液乳杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌、戴耳布吕克氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、保加利亚乳杆菌、卷曲乳杆菌、加氏乳杆菌、干酪乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、詹氏乳杆菌和乳酸乳球菌。嗜热生物链球菌和费氏丙酸杆菌(Propinibacterium freudenreichii)也属于适合于这里所描述的发明的细菌种类。同样作为本发明一部分的是菌株，进行这里所描述的修饰，来源于肠道球菌种类(例如，屎肠球菌和嗜热生物肠道球菌)、双歧杆菌属(例如，牛角椒双歧杆菌、婴儿双岐杆菌和两岐双岐杆菌)、芽孢乳杆菌属、Micromomospora spp.、小球菌属、红球菌属和假单胞菌属(例如，荧光假单胞菌和绿脓杆菌)。

适当的宿主菌株易于进行基因操作，例如，他们维持表达构建物、积累所需终产物的前体，例如，维持乳糖库和鸟苷二磷酸-岩藻糖库，并积累最终产品，例如，2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)。这种菌株在定义的最低限度培养基中生长良好，所述最低限度培养基包含简单的盐并通常含有单一碳源。如上所述进行工程设计的菌株用于产生理想的岩藻糖基化的低聚糖，这种菌株在最低限度培养基中生长。生物反应器中使用的示范性的最低限度培养基(最小“FERM”培养基)如下所述。

Ferm(10升)：最低限度培养基包括：

40g(NH₄)₂HPO₄

100g KH₂PO₄

10g MgSO₄.7H₂O

40g NaOH

1X Trace元素：

1.3g NTA(次氮基三乙酸)

0.5g FeSO₄.7H₂O

0.09g MnCl₂.4H₂O

0.09g ZnSO₄.7H₂O

0.01g CoCl₂.6H₂O

0.01g CuCl₂.2H₂O

0.02g H₃BO₃

0.01g Na₂MoO₄.2H₂O(pH 6.8)

10升水

DF204抗泡沫(0.1毫升/升)

150克甘油(最初的批量生长)，随后用90％甘油-1％ MgSO4-1X痕量元素饲料，不同时间采用不同速率。

合适的生产宿主细菌菌株是与来源细菌菌株不同的菌株，所述来源细菌菌株中可以识别出编码岩藻糖转移酶的核酸序列。

在乳糖存在的情况下培养具有这里所描述的特征的细菌，并且检查来自细菌本身或者来自细菌培养上清液中的岩藻糖基化的低聚糖。纯化岩藻糖基化的低聚糖用于治疗性或者营养性产物，或者细菌直接在这些产物中应用。

实施例

实施例1：：新颖α(1，2)-岩藻糖转移酶的识别

为了识别其他新颖的α(1，2)岩藻糖转移酶，使用CLCbio Main Workbench程序包6.9版本进行校准运算产生多重序列的校准查询(CLCbio，10Rogers Street#101，剑桥，马萨诸塞02142，美国)使用四个之前确定的乳糖-利用性α(1，2)岩藻糖转移酶蛋白质序列：螺杆菌幽门futC(SEQ ID NO：1)、H.mustelae FutL(SEQ ID NO：2)、普通拟杆菌futN(SEQ IDNO：3)和大肠杆菌0126wbgL(SEQ ID NO：4)。图3显示了序列校准和四个预先确定的乳糖-利用性α(1，2)岩藻糖转移酶蛋白质序列之间的序列同一性百分比。进行迭代的PSI-BLAST，使用FASTA-型多重序列对准进行查询，并且在NCBI BLAST+版本2.2.29的本地拷贝上运行NCBI PSI-BLAST程序。使用PSI-BLAST产生起始位置产生特异性划线基质文件(.pssm)，然后使用该程序调整迭代同源性检索运行数值。重复这一过程产生更大组的候选物，并且每次运行的结果用于进一步改善所述基质。

起始位置-特异性划线基质文件的一部分显示如下：

所使用的PSI-BLAST命令行如下所示：

psiblast-db＜LOCAL NR database name＞-max_target_seqs2500-in_msa＜MSAfile in FAST format＞-out＜results output file＞-outfmt“7sskingdoms sscinamesscomnames sseqid stitle evalue length pident”-out_pssm＜PSSM file output＞-out_ascii_pssm＜PSSM(ascii)output＞-num_iterations 6-num_threads 8

对四种已知α(1，2)FT进行的多重序列校准用于PSI-BLAST查询，12种新确定的α(1，2)FT显示在图4中。

实施例2：新型α(1，2)FT的验证

为了检测乳糖-利用性岩藻糖基转移酶活性，在表达候选酶(即，变体)的宿主有机体中评价岩藻糖基化的低聚糖(即，2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL))的产生，并且其包含细胞质的鸟苷二磷酸-岩藻糖和乳糖库。岩藻糖基化低聚糖的产生说明候选酶-编码序列起到了乳糖-利用性α(1，2)岩藻糖转移酶的作用。在所有识别的采样中，对12种新型α(1，2)岩藻糖转移酶进行进一步分析，分析其产生2′-岩藻糖转移酶的能力：产黑素普雷沃菌FutO、梭状芽孢杆菌(Clostridium bolteae)+13FutP、毛螺菌科FutQFutP、甲烷微菌属(Methanosphaerula palustris)FutR、坦纳菌属(tannerella sp.)FutS、粪拟杆菌FutU、丁酸弧菌属FutV、普雷沃菌属FutW、乔治普氏菌(parabacteroides johnsonii)FutX、肠道疣微菌(Akkermansia muciniphilia)FutY、肠道沙门氏菌FutZ、拟杆菌FutZA。

构造包括12种新型α(1，2)FT的变种，结构如下：EcoRI-T7g10RBS-syngene-XhoI.图5A和图5B显示了PCR装配和凝胶提纯后的变体片段。

通过标准分子生物技术将候选α(1，2)FT(即，变种)克隆进入是示范性的表达质粒pEC2-(T7)-Fut syngene-rcsA-thyA中.该质粒利用强有力的左侧启动子噬菌体1(叫做PL)直接表达候选基因(Sanger，F.et al.(1982).J Mol Biol 162，729-773).所述启动子是可控制的，例如，trp-cI构建物被稳定的整合到大肠杆菌宿主基因组(在ampC位点)中，并且通过向生长培养基中加入色氨酸进行控制。使用对温度敏感的cI阻断剂逐步诱导完成蛋白质表达。已经描述了另一个类似控制策略(与温度无关的表达系统)(Mieschendahl et al.，1986，Bio/Technology 4：802-808).该质粒还携带大肠杆菌rcsA基因从而上调鸟苷二磷酸-岩藻糖合成，这是岩藻糖-连接的低聚糖合成的一种至关重要的前体。另外，所述质粒携带一种β-内酰胺酶(bla)基因和一种天然的thyA(胸苷酸合酶)基因，其中，所述β-内酰胺酶(bla)基因用于通过氨苄青霉素选择(为了方便起见在实验室中)将所述质粒维持在宿主菌株中，所述天然thyA(胸苷酸合酶)基因是thyA-宿主中的替换性选择方法。

表达构建物被转入宿主菌株，有效用于产生2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)。用于实验不同α(1，2)FT候选物的宿主菌株整合上述所有遗传修饰，如上所述，并且具有以下基因型：

分析含有不同α(1，2)FT候选物表达质粒的大肠杆菌菌株。菌株在选择性培养基(缺少胸腺嘧啶)中生长到早期指数生长期。然后加入乳糖使其最后浓度为0.5％，并加入色氨酸(200μ M)诱导从PL启动子处表达每个候选α(1，2)FT。在诱导期末端(大约24小时)，收获培养物上清液和细胞。从全细胞中制备热提取物，并且每个菌株0.2OD600单位当量被用于通过薄层色层分析法(TLC)分析2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)的存在，同时每个菌株有2毫升相应的澄清的培养物上清液。

图6显示了由α(1，2)FT-表达细菌产生的低聚糖，通过培养物上清液和细菌细胞提取物的薄层色谱分析确定。通过WbgL(用作参照)、FutO、FutP、FutQ、FutR、FutS、FutU、FutW、FutX、FutZ和FutZA的外源表达产生2′-岩藻糖基乳糖(2′FL)。

表4概括了每个候选变种的岩藻糖转移酶活性，如上所述通过2′-岩藻糖基乳糖(2′FL)合成筛确定。12种候选α(1，2)FT中的11种被发现具有乳糖-利用性岩藻糖转移酶活性。

表4. 2′-岩藻糖基乳糖(2′FL)合成筛结果

实施例3：表达新型α(1，2)FT的培养物的表征

对表达新型α(1，2)FT FutO、FutQ和FutX的细菌被进一步的表征。具体地说，检验增殖比率和外源α(1，2)FT实验。

包含岩藻糖转移酶WbgL(质粒pG204)、FutN(质粒pG217)和新型α(1，2)FT FutO(质粒pG393)、FutQ(质粒pG395)、和FutX(pG401)的表达质粒被引入宿主细菌菌株。例如，这里所利用的宿主菌株具有以下基因型：ΔampC：：P_trp ^BcI，Δ(1acI-lacZ)：：FRT，P_lacIqlacY⁺，ΔwcaJ：：FRT，thyA：：Tn10，Δlon：(npt3，lacZ⁺)，ΔlacA

在乳糖存在的情况下，通过添加色氨酸来诱导表达每个外源岩藻糖转移酶的细菌培养物(为了诱导外源岩藻糖转移酶的表达)。通过在以下时间点，在A600下记录分光光度计读数监控培养物的生长：诱导前4小时和1小时，在诱导时(时间0)，和诱导后3小时、7小时和24小时。结果显示在图7中，并且显示外源岩藻糖转移酶的表达不会防止细胞增殖。而且，适合表达新型α(1，2)岩藻糖转移酶FutO、FutQ、和FutX的细菌培养物的生长曲线与表达已知的α(1，2)FT酶WbgL和FutN的生长曲线相似。

同时，对在诱导后表达每个岩藻糖转移酶的细菌培养物评价蛋白质表达。按照如前所述诱导培养物，并且从细菌培养物中制备蛋白质溶解产物，在诱导的时候(0小时)、3小时、7小时和24小时之后。在SDS-PAGE凝胶上运行蛋白质溶解产物，并染色检验每个时间点的蛋白质分布。如图8所示，对于表达外源FutN、FutO和FutX的细胞培养物，在诱导后7小时和24小时在大约20-28kDa附近显示增加的蛋白质条带。这些结果显示所述诱导导致外源岩藻糖转移酶显著的表达。

最后，额外的薄层色谱分析用于评价表达新型α(1，2)FT FutO、FutQ、和FutX的细菌培养物产生2′-岩藻糖基乳糖(2′FL)的效力和产率，与已知的岩藻糖转移酶WbgL和FutN相比。在第7小时和第24小时诱导培养物并进行薄层色谱。图9A显示了2′-岩藻糖基乳糖(2′FL)在所述细胞上清液中的水平。在细菌细胞中发现的2′-岩藻糖基乳糖(2′FL)水平也被检验。如图9B所示，显示了诱导后第7小时和第24小时后，来自表达新型α(1，2)FT FutO、FutQ和FutX的细菌中的细胞溶解产物产生的2′-岩藻糖基乳糖(2′FL)。

实施例4：FutN显示出增加的产生2′-岩藻糖基乳糖(2′FL)的效率

从培养肉汤后发酵产物中纯化通过代谢工程设计的大肠杆菌细胞表达普通拟杆菌FutN产生的岩藻糖基化低聚糖。

收获发酵肉汤并且通过早制备离心机中以6000xg处理30分钟沉淀，以除去细胞。每个生物反应器运行产率大约是5-7升部分澄清的上清液。一个装满粗糙的碳(六偏磷酸钠12x40TR)的柱，体积大约为1000毫升(尺寸5厘米直径x 6厘米长度)用1柱体积(CV)的水平衡并用澄清的培养上清液以40毫升/分的流苏装载。该柱具有大约120克糖的容量。在装载和糖捕获之后，用1.5CV的水洗涤柱并用2.5CV 50％的乙醇或者25％异丙醇洗提(在此步骤中较少浓度的乙醇(25-30％)就足够进行产物洗提)。该溶剂洗提步骤释放大约95％的柱上总结合糖和一小部分有色体。来自捕获柱的2.5升的乙醇或者异丙醇洗提液在56℃下进行旋转蒸发并在水中产生糖浆。柱(GE医疗HiScale50/40，5x40厘米，最大压力20bar)与Biotage Isolera One FLASH色谱系统相连，所述系统填充有750毫升的Darco活性碳G60(100-筛)∶硅藻土535(粗糙的)1∶1混合物(两种柱填充物都来自Sigma公司)。所述柱用5CV的水平衡并使用硅藻土定量装载器或者直接注入装载来自步骤3的糖(10-50克，取决于2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)与污染物乳糖的比例)。所述柱与蒸发的光散射(ELSD)检测器相连检测色谱法期间洗提的糖的峰值。异丙醇、乙醇或者甲醇分别运行四步梯度从而从单糖(如果存在的话)、乳糖和有色体中分离2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)。在120毫升瓶子中自动收集相对于糖峰值的部分，入库。

图10A和图10B显示了两个发酵运行的结果。培养物生长136小时(运行36B)或者112小时(运行37A)，通过薄层色谱分析产生的2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)的水平。如图10A和图10B所示，在培养的第40小时产生2′-岩藻糖基乳糖，并且产量继续增加直到发酵过程结束。由36B产生的2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)产率是33克每升。由37A产生的2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)产率是36.3克每升。该结果显示外源FutN的表达适合于高产量的产生2′-岩藻糖基乳糖产物。

其他实施方案

尽管本发明已经结合具体实施方式进行了描述，但之前的描述只起到解释作用并不能限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书定义。其他的方面、优势和修饰也被包括在所附权利要求书记载的范围内。

这里所涉及的所有专利和科技文献构成了本领域普通技术人员能够获得的知识。这里引用的所有美国专利和公开的或者未公开的美国专利申请通过引证在此并入本文。这里引用的所有公开的外国专利和专利申请在此通过引证全部并入本文。Genbank和NCBI指明的登记号码也通过引证在此并入本文。这里引用的其他出版的参考文献、文件、原稿和科学文献通过引证在此并入本文。

尽管本发明已经参照其优选的实施方案进行了具体的显示和表述，但是本领域普通技术人员应该理解，在不脱离本发明范围的情况下，在形式和细节上可以存在各种各样的变化，本发明的范围由所附的权利要求书概括。

Claims

1.一种在细菌中产生岩藻糖基低聚糖的方法，包括提供包括外源乳糖-利用性α(1,2)岩藻糖转移酶的细菌，其中所述酶的氨基酸序列与FutC(SEQ ID NO:1)具有至少22％的一致性。

2.一种在细菌中产生岩藻糖基低聚糖的方法，包括提供包括外源乳糖-利用性α(1,2)岩藻糖转移酶的细菌，其中所述酶的氨基酸序列与FutN(SEQ ID NO:3)具有至少25％的一致性。

3.权利要求1或者2的方法，其中，所述α(1,2)岩藻糖转移酶包括选自以下的任意一个的酶：拟杆菌FutX、毛螺菌(Lachnospiraceae sp.)FutQ、产黑素普雷沃菌FutO、普雷沃菌FutW、多形杆状菌属FutZA、坦那菌属(Tannerella sp.)FutS、梭状芽孢杆菌(Clostridiumbolteae)+13FutP、粪拟杆菌(Bacteroides caccae)FutU、肠道沙门氏菌FutZ、黑蒿产甲烷微菌(Methanosphaerula palustries)FutR、丁酸弧菌FutV、肠道疣微菌(Akkermansiamuciniphilia)FutY、梭状芽孢杆菌(Clostridium bolteae)FutP或其功能性变体或片段。

4.根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中，所述α(1,2)岩藻糖转移酶包括氨基酸序列SEQ ID NO:10-21和292中的任意一个或其功能性变体或片段。

5.根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中，进一步包括从所述细菌中或者所述细菌的培养物上清液中收集岩藻糖基化的低聚糖。

6.根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中，所述岩藻糖基化的低聚糖包括2’-岩藻糖基乳糖(2’FL)、乳糖二岩藻四糖(LDFT)、乳-N-岩藻五糖I(LNF I)、或者乳-N-二岩藻六糖I(LDFH I)。

7.根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中，所述细菌进一步包括一种外源乳糖利用性α(1,3)岩藻糖转移酶和/或一种外源乳糖利用性α(1,4)岩藻糖转移酶。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述外源乳糖-利用性α(1,3)岩藻糖转移酶包括幽门螺杆菌26695futA基因。

9.根据权利要求7所述的方法，其中所述外源乳糖-利用性α(1,4)岩藻糖转移酶包括幽门螺杆菌UA948FucTa基因或者幽门螺杆菌DMS6709FucT III基因。

10.根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中，所述细菌进一步包括降低水平的β-半乳糖苷酶活性，有缺陷的柯拉酸合成途径，失活的ATP-依赖型细胞内蛋白酶、失活的lacA或其组合。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述方法进一步包括在色氨酸存在的情况下胸腺嘧啶不存在的情况下培养所述细菌。

12.根据权利要求10所述的方法，其中，所述降低水平的β-半乳糖苷酶活性包括所述细菌缺失内源性lacZ基因或者使内源性lacZ基因失活和/或缺失内源性lacI基因或者使内源性lacI基因失活。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述降低水平的β-半乳糖苷酶活性进一步包括一种外源性lacZ基因或其变体，其中，所述外源lacZ基因或其变体包括的β-半乳糖苷酶活性水平小于野生型细菌。

14.根据权利要求10所述的方法，其中所述降低水平的β-半乳糖苷酶活性包括的活性水平小于野生型细菌。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述降低水平的β-半乳糖苷酶活性包括小于6,000单位的β-半乳糖苷酶活性。

16.根据权利要求14所述的方法，其中所述降低水平的β-半乳糖苷酶活性包括小于1,000单位的β-半乳糖苷酶活性。

17.根据权利要求10所述的方法，其中所述细菌包括lacIq基因启动子，直接位于lacY基因的上游。

18.根据权利要求10所述的方法，其中所述有缺陷的柯拉酸合成途径包括所述细菌wcaJ基因的失活作用被删除。

19.根据权利要求10所述的方法，其中所述失活的ATP-依赖型细胞内蛋白酶是内源性lon基因的无效突变、失活突变或者删除。

20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述内源性lon基因的失活突变包括插入功能性大肠杆菌lacZ⁺基因。

21.根据权利要求10所述的方法，其中所述细菌进一步包括一种功能性乳酸渗透酶基因。

22.根据权利要求10所述的方法，其中所述细菌包括大肠杆菌lacY。

23.根据权利要求10所述的方法，其中所述细菌进一步包括内源性大肠杆菌rcsA基因或者大肠杆菌rcsB基因。

24.根据权利要求10所述的方法，其中所述细菌进一步包括thyA基因突变。

25.根据权利要求10所述的方法，其中所述细菌在外源性乳酸存在的情况下累积细胞内乳酸。

26.根据权利要求10所述的方法，其中所述细菌累计内细胞内GDP-岩藻糖。

27.根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中，所述细菌是大肠杆菌。

28.根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中，所述生产细菌是杆菌、泛菌、乳酸菌、乳球菌、链球菌、Proprionibacterium、肠球菌、双歧杆菌、芽胞乳杆菌、Micromomospora、微球菌、红球菌、或者假单胞菌菌属。

29.根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中，所述生产细菌选自由以下所组成的组中：地衣形芽孢杆菌,枯草芽胞杆菌、凝结芽孢杆菌、嗜热杆菌、侧孢芽胞杆菌、巨大芽孢杆菌、霉菌样杆菌、短小芽胞杆菌、迟缓芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌,和环状杆菌，草生欧文氏杆菌(成团泛菌)、枸橼酸杆菌、柠檬泛菌、软腐病菌(Pectobacterium carotovorum)、野油菜黄单胞菌、嗜酸乳杆菌、唾液乳杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌、戴耳布吕克氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、保加利亚乳杆菌、卷曲乳杆菌、加氏乳杆菌、干酪乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、詹氏乳杆菌和乳酸乳球菌，嗜热生物链球菌和费氏丙酸杆菌屎肠球菌、嗜热生物肠道球菌、牛角椒双歧杆菌、婴儿双岐杆菌和两岐双岐杆菌、荧光假单胞菌和绿脓杆菌。

30.根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中，所述细菌包括一种核酸构建物，所述核酸构建物包括能够编码所述α(1,2)岩藻糖转移酶的分离的核酸。

31.根据权利要求30所述的方法，其中，所述核酸与一种或者一种以上异源控制序列可操作的连接，指导细菌中产生所述酶。

32.根据权利要求31所述的方法，其中，所述异源控制序列包括一种细菌启动子或者操作子、一种细菌核糖结合位点、一种细菌转录终止子、或者一种质粒选择性标记物。

33.由上述任意一项权利要求所述的方法产生的纯化的岩藻糖基化的低聚糖。

34.一种核酸构建物，包括能够编码乳糖-利用性a(1,2)岩藻糖转移酶的分离的核酸，用于在所述宿主细菌生产菌株中产生所述酶，其中，所述酶的氨基酸序列与FutC(SEQ IDNO:1)具有至少22％的一致性。

35.一种核酸构建物，包括能够编码乳糖-利用性a(1,2)岩藻糖转移酶的分离的核酸，用于在所述宿主细菌生产菌株中产生所述酶，其中，所述酶的氨基酸序列与FutN(SEQ IDNO:3)具有至少25％的一致性。

36.根据权利要求34或者35所述的核酸构建物，其中，所述α(1,2)岩藻糖转移酶包括选自以下的任意一个的酶：拟杆菌FutX、毛螺菌(Lachnospiraceae sp.)FutQ、产黑素普雷沃菌FutO、普雷沃菌FutW、多形杆状菌属FutZA、坦那菌属(Tannerella sp.)FutS、梭状芽孢杆菌(Clostridium bolteae)+13FutP、粪拟杆菌(Bacteroides caccae)FutU、肠道沙门氏菌FutZ、黑蒿产甲烷微菌(Methanosphaerula palustries)FutR、丁酸弧菌FutV、肠道疣微菌(Akkermansia muciniphilia)FutY、梭状芽孢杆菌(Clostridium bolteae)FutP或其功能性变体或片段。

37.根据权利要求34-36中任意一项所述的构建物，其中，所述α(1,2)岩藻糖转移酶包括SEQ ID NO:10-21和292中的任意一个氨基酸序列或其功能性变体或其片段。

38.根据权利要求34-37中任意一项所述的构建物，其中，所述核酸与一种或者一种以上异源控制序列可操作的连接，指导细菌中产生所述酶。

39.根据权利要求38所述的构建物，其中，所述异源控制序列包括一种细菌启动子和操作子、一种细菌核糖结合位点、一种细菌转录终止子、一种质粒选择性标记物和/或一种复制起点。

40.一种分离的细菌，包括能够编码乳糖-利用性a(1,2)岩藻糖转移酶的分离的核酸，用于在所述宿主细菌生产菌株中产生所述酶，其中，所述酶的氨基酸序列与FutC(SEQ IDNO:1)具有至少22％的一致性。

41.一种分离的细菌，包括能够编码乳糖-利用性a(1,2)岩藻糖转移酶的分离的核酸，用于在所述宿主细菌生产菌株中产生所述酶，其中，所述酶的氨基酸序列与FutN(SEQ IDNO:3)具有至少25％的一致性。

42.根据权利要求40或者41所述的分离的细菌，其中，所述α(1,2)岩藻糖转移酶包括选自以下的任意一个的酶：拟杆菌FutX、毛螺菌(Lachnospiraceae sp.)FutQ、产黑素普雷沃菌FutO、普雷沃菌FutW、多形杆状菌属FutZA、坦那菌属(Tannerella sp.)FutS、梭状芽孢杆菌(Clostridium bolteae)+13FutP、粪拟杆菌(Bacteroides caccae)FutU、肠道沙门氏菌FutZ、黑蒿产甲烷微菌(Methanosphaerula palustries)FutR、丁酸弧菌FutV、肠道疣微菌(Akkermansia muciniphilia) FutY、梭状芽孢杆菌(Clostridium bolteae)FutP或其功能性变体或片段。

43.根据权利要求40-42中任意一项所述的分离的细菌，其中，α(1,2)岩藻糖转移酶包括SEQ ID NO:10-21和292中的任意一个氨基酸序列或其功能性变体或其片段。

44.根据权利要求40-43中任意一项所述的分离的细菌，进一步包括α(1,3)岩藻糖转移酶和/或α(1,4)岩藻糖转移酶。

45.根据权利要求40-44中任意一项所述的分离的细菌，其中，所述细菌是大肠杆菌。

46.根据权利要求40-45中任意一项所述的分离的细菌，其中，所述细菌进一步包括降低水平的β-半乳糖苷酶活性，有缺陷的柯拉酸合成途径，失活的腺苷酸-5’-三磷酸(ATP)-依赖型细胞内蛋白酶、失活的lacA或其组合。

47.根据权利要求46所述的分离的细菌，其中，所述细菌包括基因型△ampC::P_trp ^BcI,△(lacI-lacZ)::FRT,P_lacIqlacY⁺,△wAcaJ::FRT,thyA::Tn10,△lon:(npt3,lacZ⁺)。