JP2021506337A - シアリルトランスフェラーゼおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2017年12月15日出願の米国仮出願番号62/599,481からの優先権を主張し、その全体をすべての目的のために本明細書に組み入れる。
2018年12月11日に作成された、124,706バイトのサイズの、「37847-522001WO_SequenceListing_ST25.txt」と名付けられたテキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
ラクトースは、すべての哺乳類の母乳の主要な栄養性炭水化物であるが、ヒト母乳は、集合的にヒトミルクオリゴ糖(hMOS)として公知の、より複雑な中性および酸性糖の多様かつ豊富なセットを含む(Kunz, C., et al. (2000). Annu Rev Nutr 20, 699-722(非特許文献1); Bode, L., and Jantscher-Krenn, E. (2012). Adv Nutr 3, 383S-391S(非特許文献2))。数百の異なるhMOS種が同定されており、それらの豊かな構造的多様性および全体量は、ヒトに特有である。これらの分子は、ヒト腸によって十分に吸収されず、直接的な栄養分として幼児に利用されないが、それらは健康な腸ミクロビオームの構築、腸発生、疾患予防および免疫機能において重要な役割を果たしていることが示されている(Newburg, D.S., and Walker, W.A. (2007). Pediatr Res 61, 2-8(非特許文献3))。
本明細書には、特に、シアル化オリゴ糖を生産するための方法、酵素、組成物および遺伝子操作された細菌が提供される。本明細書に提供される酵素は、ラクトースをシアル化し、ラクトースに対するα(2,3)グリコシド結合、α(2,6)結合またはα(2,3)およびα(2,6)結合の両方のいずれかを生成することができ、したがって、特に、ヒト母乳のラクトースベースの分子と同一のオリゴ糖分子を生産する上で有益である。1つの局面において、細菌においてシアル化オリゴ糖を生産するための方法が提供される。いくつかの態様において、細菌は、外因性ラクトース利用性シアリルトランスフェラーゼ酵素、例えば、α(2,3)シアリルトランスフェラーゼまたはα(2,6)シアリルトランスフェラーゼを含む。様々な態様において、この酵素は、少なくとも250アミノ酸のストレッチにわたってPst6-224のアミノ酸配列(SEQ ID NO:1)と5%〜30%同一のアミノ酸配列を有する。特定の態様において、この酵素は、少なくとも250アミノ酸のストレッチにわたってHAC1268のアミノ酸配列(SEQ ID NO:8)と45%〜75%同一のアミノ酸配列を有する。
PlacIq-lacY, Δ(lacI-lacZ), ΔlacA, ΔthyA::(0.8RBS lacZ+), ampC::(Ptrp M13g8 RBS-λcI+, CAT), ΔnanATE::scar
を有する。
ヒト母乳の酸性オリゴ糖は、3'-シアリルラクトースおよび6'-シアリルラクトースを含む主要なシアリルラクトース(SL)画分を含む(Bode, L., and Jantscher-Krenn, E. (2012). Adv Nutr 3, 383S-391S)。構造的に、3'-シアリルラクトース(3'-SL)は、α(2,3)結合を通じてラクトースのガラクトース部分に連結されたN-アセチルノイラミン酸(Neu5Ac)部分からなり(α(2,3)Neu5Ac Gal(β1-4)Glc)、6'-シアリルラクトース(6'-SL)は、α(2,6)結合を通じてラクトースのガラクトース部分に連結されたNeu5Ac部分からなる(α(2,6)Neu5Ac Gal(β1-4)Glc)。3'-SLおよび6'-SLは、合わせて最大約0.5 g/Lの濃度で存在する、ヒト母乳中に存在する最も豊富なシアル化オリゴ糖の2つである(Bao, Y., Zhu, L., and Newburg, D.S. (2007). Anal Biochem 370, 206-214)。
いくつかの態様において、ラクトース利用性シアリルトランスフェラーゼ酵素は、天然に存在するタンパク質の活性(例えば、酵素活性)の少なくとも約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは99.5%または約100%を維持しつつ、天然に存在するタンパク質と比較して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、1〜10、1〜15、1〜20、5〜15、5〜20、10〜25、10〜50、20〜50、25〜75、25〜100またはそれ以上の変異を含む。
(i)本明細書で「Pst6-224」として参照されるフォトバクテリウム種JT-ISH-224由来のラクトース利用性シアリルトランスフェラーゼ酵素(GenBankアクセッション番号BAF92026.1;SEQ ID NO:1);
(ii)本明細書で「BstC」として参照されるアビバクテリウム・パラガリナルム(Avibacterium paragallinarum)由来のラクトース利用性シアリルトランスフェラーゼ酵素[National Center for Biotechnology Information(NCBI)参照配列:WP_021724759.1;SEQ ID NO:2];
(iii)本明細書で「BstD」として参照されるアクチノバチルス・ウレアエ(Actinobacillus ureae)由来のラクトース利用性シアリルトランスフェラーゼ酵素(NCBI参照配列:WP_005625206.1;SEQ ID NO: 3);
を含む。
(iv)本明細書で「BstE」として参照されるヘモフィルス・デュクレイ(Haemophilus_ducreyi)由来のラクトース利用性シアリルトランスフェラーゼ酵素(GenBankアクセッション番号AAP95068.1;SEQ ID NO: 4);
(v)本明細書で「BstH」として参照されるアリスティペス(Alistipes)(複数種)由来のラクトース利用性シアリルトランスフェラーゼ酵素(NCBI参照配列:WP_018695526.1;SEQ ID NO: 5);
(vi)本明細書で「BstI」として参照されるビベルシュタイニア・トレアロシ(Bibersteinia trealosi)由来のラクトース利用性シアリルトランスフェラーゼ酵素(GenBankアクセッション番号AGH37861.1;SEQ ID NO: 6);
(vii)本明細書で「BstJ」として参照されるシュワネラ・ピエゾトレランス(Shewanella piezotolerans)由来のラクトース利用性シアリルトランスフェラーゼ酵素(NCBI参照配列番号YP_002314261.1およびWP_020915003.1;SEQ ID NO: 7);
(viii)本明細書で「HAC1268」として参照されるヘリコバクター・アシノニキス(Helicobacter acinonychis)由来のラクトース利用性シアリルトランスフェラーゼ酵素(GenBankアクセッション番号CAK00018.1;SEQ ID NO: 8);
(ix)本明細書で「BstM」として参照されるヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)由来のラクトース利用性シアリルトランスフェラーゼ酵素(NCBI参照配列:WP_000743106.1;SEQ ID NO: 9);および
(x)本明細書で「BstN」として参照されるヘリコバクター・セトラム(Helicobacter cetorum)由来のラクトース利用性シアリルトランスフェラーゼ酵素(NCBI参照配列WP_014661583.1;SEQ ID NO: 10)
を含む。
本明細書に提供されるオリゴ糖生合成方法においては、様々な細菌種、例えば、大腸菌、エルビニア・ヘルビコーラ(パントエア・アグロメランス)、シトロバクター・フロインディー、パントエア・シトレア、ペクトバクテリウム・カロトボラムまたはキサントモナス・カンペストリスが使用され得る。バチルス・サブティリス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・コアグランス、バチルス・サーモフィルス、バチルス・ラテロスポルス、バチルス・メガテリウム、バチルス・ミコイデス、バチルス・プミルス、バチルス・レンタス、バチルス・セレウスおよびバチルス・サーキュランスを含むバチルス属の細菌も使用され得る。同様に、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・デルブルエッキイー、ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・ブルガリカス、ラクトバチルス・クリスパタス、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・ジェンセニイおよびラクトコッカス・ラクティスを含むがこれらに限定されないラクトバチルス属およびラクトコッカス属の細菌が、本発明の方法を用いて改変され得る。ストレプトコッカス・サーモフィラスおよびプロピオニバクテリウム・フロイデンライシーも、本明細書に記載される発明に適した細菌種である。エンテロコッカス属(例えば、エンテロコッカス・フェシウムおよびエンテロコッカス・サーモフィラス)、ビフィドバクテリウム属(例えば、ビフィドバクテリウム・ロングム、ビフィドバクテリウム・インファンティスおよびビフィドバクテリウム・ビフィダム)、スポロラクトバチルス種、ミクロモノスポラ種、ミクロコッカス種、ロドコッカス種ならびにシュードモナス種(例えば、シュードモナス・フルオレッセンスおよびシュードモナス・エルギノーサ)由来の本明細書に記載されるようにして改変された菌株もまた、本発明の一部として含まれる。様々な態様において、本明細書に記載される特徴を含む細菌は、ラクトースの存在下で培養され、そして細菌自体からまたは細菌の培養上清からのいずれかからシアル化オリゴ糖が回収される。いくつかの態様において、シアル化オリゴ糖は、治療もしくは栄養補給製品において使用するために精製される、または細菌がそのような製品において直接使用される。特定の態様において、適当な生産宿主細菌株は、ラクトース利用性シアリルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸配列が同定された元の細菌株と同じ細菌株でないものである。
フォトバクテリウム種JT-ISH-224株由来のPst6-224を用いた新しいSTの同定
原核生物および真核生物の両方から同定されたシアリルトランスフェラーゼは、5つの異なる配列ファミリー(GT29、GT38、GT42、GT52およびGT80)に分類され、少なくとも2つの構造的フォールド(GT-AおよびGT-B)を有する(Audry, M., et al. (2011). Glycobiology 21, 716-726)。真核生物シアリルトランスフェラーゼ(GT29ファミリーおよびGT-Aフォールド)は、分泌経路において見い出される膜貫通分子であり、したがってそれらは本明細書に記載される改変微生物の細胞質内でのそれらの使用に関して異種発現問題を引き起こす。この理由から、このファミリーにおける新しい実施例は追求されなかった。代わりに、細菌GT80ファミリー(およびGT-Bフォールド)の新しいシアリルトランスフェラーゼ(ST)が、改変された宿主細胞におけるシアリルオリゴ糖の合成において有用であることが同定された。
第2の配列データベーススクリーニングを、検索プローブとして第2のラクトース利用性α(2,6)ST(ヘリコバクター・アシノニキス由来のHAC1268(Schur, M.J., et al. (2012). Glycobiology 22, 997-1006, SEQ ID NO: 8))を用いて行った。HAC1268は、GT42シアリルトランスフェラーゼファミリーのメンバーであり、(上記のように、第1のデータベーススクリーニングにおいてプローブとして使用した)Pst6-224 ST配列と異なる推定の構造的フォールド(GT-Aフォールド)を有している。
発現ベクター
候補bst遺伝子を発現させるため、およびシアリルラクトースを生成するそれらの能力を試験するために使用した発現ベクターは、異種遺伝子の発現を駆動する強バクテリオファージλ pLプロモーターを有するp15A originベースのプラスミドである。加えて、このプラスミドは、(研究室内での利便性から)アンピシリン選択を用いてプラスミドを宿主株内で維持するためのβ-ラクタマーゼ(bla)遺伝子を有し、さらに、thyAマイナス宿主内での代替選択手段としてネイティブ大腸菌thyA(チミジル酸シンターゼ)遺伝子を有する。このプラスミドはまた、pLプロモーターの下流および候補bst遺伝子の下流のオペロン構造内に、カンピロバクター・ジェジュニ由来の3つの異種生合成遺伝子(N-アセチルノイラミン酸シンターゼ、UDP-N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼおよびN-アセチルノイラミン酸シチジリルトランスフェラーゼをコードする、それぞれ、neuB、neuCおよびneuA)を有する。これらの酵素は、大腸菌に、UDP-GlcNAcをCMP-Neu5Acに変化する能力を付与する。CMP-Neu5Acは、その後、候補シアリルトランスフェラーゼが細胞内ラクトースをシアリルラクトースに変換する際に利用するドナー基質として利用可能である。図3は、候補ST遺伝子の1つであるbstNを有するこの発現ベクターのマップである(プラスミドpG543、SEQ ID NO:11)。
候補シアリルトランスフェラーゼ遺伝子発現プラスミドで、シアリルラクトース(SL)の生産に有用な宿主株を形質転換する。SLの生合成は、ラクトースおよびCMP-Neu5Acの両方の拡張された細胞プールの生成を必要とする(図4は、改変された大腸菌におけるSL生合成のスキームを概説している)。シアリルラクトース生産を触媒する候補の能力を試験する宿主バックグラウンドを改変する出発点として、野生型大腸菌K12原栄養株W3110を選択した(Bachmann, B.J. (1972). PBacteriol Rev 36, 525-557)。使用した具体的なW3110派生株は、GI724として知られる大腸菌株を生成する、トリプトファン誘導性PtrpB cI+レプレッサーカセットの(ampC座への)導入により以前に改変されたものであった(LaVallie et al., 2000)。
PlacIq-lacY, Δ(lacI-lacZ), ΔlacA, ΔthyA::(0.8RBS lacZ+), ampC::(Ptrp M13g8 RBS-λcI+, CAT), ΔnanATE::scar
を有していた。
Na2HPO4 = 6g/L
KH2PO4 = 3g/L
NaCl = 0.5g/L
NH4Cl = 1g/L
1mM MgSO4
0.1mM CaCl2
0.5%グルコースw/v
0.4%カザミノ酸(Difco technical)。
個々の候補bst+neuBCA発現プラスミドで形質転換されたE1406を含む菌株を試験管に0.1 OD600/mLになるよう接種し、ついでローラードラムで継続的なエアレーションを行いつつ、30℃で120分間インキュベートした。ついで、培養物に200μg/mLの濃度までトリプトファンを添加してbst遺伝子およびneuBCAオペロン発現を誘導し、同時にアクセプター糖としてラクトースを1%w/vの濃度まで添加した。この培養物を、ローラードラムでエアレーションを行いつつ、30℃で22時間置いた。この期間の最後に、各培養物からの20 OD600の細胞を遠心分離(14,000 x g、1分間)によりペレット化し、200μlの水で再懸濁し、10分間、98℃に加熱して細胞質の糖を放出させた。遠心分離により懸濁物を浄化した後、2μlのアリコートを10x20cmアルミニウム裏張りシリカ薄層クロマトグラフィープレート(Machery-Nagel#818163)にアプライした。クロマトグラムをn-ブタノール/酢酸/水(2:1:1)中で現像し、12%H2SO4/80%エタノール/8%水中3% w/v α-ナフトールを噴霧した後に加熱により可視化させた。図5は、その結果を示している。
HPLCを通じた特徴づけおよび同定
そのアミノ酸配列をデータベーススクリーニング用のプローブとして使用したST酵素Pst6-224およびHAC1268は、以前に生化学的に特徴づけられており、α2,6シアリルトランスフェラーゼであることが公知となっている(Drouillard, S., et al. (2010). Carbohydr Res 345, 1394-99, Schur, M.J., et al. (2012). Glycobiology 22, 997-1006)。しかし、本発明の候補bst酵素のシアリル-アクセプター糖結合特異性(すなわち、α(2,3)またはα(2,6))は未知であった。それらのシアリル-アクセプター糖結合特異性を見出すために、上記のTLCにより分析された同じ細胞質抽出物(図5)を、6'-SLと3'-SLを分解することができるHPLCシステムを利用しても分析した。熱抽出サンプル(上記)は、リン酸カリウム(pH 4)中15 mMおよびアセトニトリル中60%とした。ついでそれらをTSKgel Amide-80カラム(5μm粒子サイズ、4.6x250 mm)にアプライし、67%アセトニトリル/15 mMリン酸カリウム、pH 4.0、1 mL/分、60℃の無勾配条件下で溶出させつつ、210 nmでUV検出を行った。図6A、6Bおよび6Cは、様々な熱抽出物についてのHPLC実施からのUVトレースを示している。このシステムにおいて、3'-SLは、約8.8分で溶出し、6'-SLは約10.1分で溶出した。データを表3に示す。
BstMおよびBstN酵素を用いて生産されたSL(6'-SL)の構造に関して、NMR(核磁気共鳴)分光法を通じた二次的確認を行った。
この目的で、および分析のために十分なSLを生産するため、それぞれBstMまたはBstN発現プラスミド(すなわち、pG549、SEQ ID NO:12またはpG543、SEQ ID NO:11)のいずれかを有するE1406株の派生株において2L発酵を行った。菌株を、種培養物を生成するよう初期指数関数期までFerm4aミネラル培地中で成長させた。
4g (NH4)2HPO4
10g KH2PO4
0.25g MgSO4・7H2O
0.4g NaOH
17gグルコース
(必要に応じて追加のNaOHによりpH6.8に調整)
13.4g NTA(ニトリロ三酢酸)
5g FeSO4・7H2O
0.85g MnCl2・4H2O
0.9g ZnSO4・7H2O
0.14g CoCl2・6H2O
0.085g CuCl2・2H2O
0.17g H3BO3
0.09g Na2MoO4・2H2O
ついで、浄化された培養上清の一部を、以下のプロトコルを用いるNMR分析用のシアリルラクトースサンプルの精製に使用した:
1. pH 2に達する浄化したCaCl2処理ブロスへの固形Amberlite IR120[H+型]の添加によりカチオンを除去した(かつタンパク質を沈降させた)。
2. 処理した上清を遠心分離により浄化した。その後、pH6に達するまでDowex 66樹脂[遊離塩基型]を添加することにより、強酸を除去した。再度、遠心分離により浄化した。
3. Dowex 1x4、200〜400メッシュカラム[HCO3 -型]に投入した。SLはこのカラムに結合する。
4. カラムを水で洗浄した。
5. 0.1M NaHCO3を用いてカラムからSLを溶出させた。
6. pH 3に達するようAmberlite IR120[H+型]を添加することによりシアリルラクトース溶出液からNa+を除去した。
7. NaOHを用いてSL溶液をpH 6に調整し、ロータリーエバポレートし、その後に凍結乾燥により乾燥させた。
酵素BstC、BstE、BstHおよびBstIを含む、上記スクリーニングから選択および試験したbst候補のいくつかは、α(2,6)選択性ではなくα(2,3)選択性であった。α(2,3)からα(2,6)選択性にBstCおよびBstEの位置選択性を変更する酵素可変戦略を調査した(Schmolzer, K., et al. (2015). Chem Commun (Camb) 51, 3083-86; Schmolzer, K., et al. (2013). Glycobiology 23, 1293-1304)。パスツレラ・ダグマティス(Pasteurella dagmatis)由来のシアリルトランスフェラーゼ(PdST、アクセッション番号WP005762792.1、SEQ ID NO:13)は、精製されそしてラクトースおよびCMP-Neu5Ac前駆体からのSL形成を触媒するようインビトロで使用されたとき、α(2,3)選択的活性を示すことが示された(Schmolzer, K., et al. (2015). Chem Commun (Camb) 51, 3083-86)。同じグループによるその後の研究は、PdSTのアクセプター結合部位内の特定のアミノ酸の構造を誘導する置換がこの酵素の位置選択性をα(2,3)選択性からα(2,6)選択性に完全に切り替えることを示した。詳細に、PdST配列におけるP7HおよびM117Aの二重変異は、インビトロでPdSTをα(2,3)選択的STからα(2,6)選択的STに変換する効果を有した(Schmolzer, K., et al. (2013). Glycobiology 23, 1293-1304)。
新しい酵素変種Δ20BstC*の位置選択性を改善するため、さらなる酵素改変戦略を調査した(Guo, Y. et al (2015) Enzyme and Microbial Technology 78, 54-62; McArthur, B. et al. (2017) Organic & Biomolecular Chemistry 15, 1700-1709)。パスツレラ・マルトシダ(Pasteurella multocida)由来のシアリルトランスフェラーゼの二重変異体P34H/M144L(PmST1、アクセッション番号AAY89061)は、この酵素の位置選択性を、3.9%から98.7%α(2,6)選択的に増加させることが見い出された。Δ20BstC*のアミノ酸配列の122位における構造的に等価なアミノ酸置換は、この酵素のα(2,6)位置選択性を改善するであろう。詳細に、アミノ酸置換A122V、A122L、A122MおよびA122FをΔ20BstC*に導入し、それぞれ、Δ20BstC*2(SEQ ID NO:27)、Δ20BstC*3(SEQ ID NO:28)、Δ20BstC*4(SEQ ID NO:29)およびΔ20BstC*5(SEQ ID NO:30)を生成した。
まとめると、野生型Δ20BstCは、本明細書に記載される改変された大腸菌株において3'-SLを生産したラクトース利用性α(2,3)シアリルトランスフェラーゼである。この酵素は、各々変更された位置選択性を有する新しい酵素変種である、6'-SL:3'-SLの85:15、94:6、92:8、90:10および89:9混合物を合成する、それぞれ、Δ20BstC*、Δ20BstC*2、Δ20BstC*3、Δ20BstC*4およびΔ20BstC*5を生成する2つの特定の活性部位変異を導入することによって改変された。これらの酵素変種は、ヒトミルクの主要なシアル化hMOS(Bao, Y., Zhu, L., and Newburg, D.S. (2007) Anal Biochem 370, 206-214)の2つを予想可能な比で生産しつつ、減少した量のKDO-ラクトースを生成する能力を有していた。1回の生物発酵過程で2つのシアリルラクトース種を生産する能力は、2つの別々の発酵よりも製造時間および費用の点で大きな利点を提供し得る。
Claims (60)
- 細菌においてシアル化オリゴ糖を生産するための方法であって、外因性ラクトース利用性シアリルトランスフェラーゼ酵素を含む細菌を提供する工程を含み、該酵素が、
(i)少なくとも250アミノ酸のストレッチにわたってPst6-224のアミノ酸配列(SEQ ID NO:1)と5%〜30%同一、または
(ii)少なくとも250アミノ酸のストレッチにわたってHAC1268のアミノ酸配列(SEQ ID NO:8)と45%〜75%同一
であるアミノ酸配列を含む、方法。 - 前記酵素が、BstN(SEQ ID NO:10)、BstC(SEQ ID NO:2)、Δ20BstC*2(SEQ ID NO:27)、BstD(SEQ ID NO:3)、Δ20BstC*(SEQ ID NO:15)、Δ20BstC(SEQ ID NO:18)、BstE(SEQ ID NO:4)、BstE*(SEQ ID NO:16)、BstH(SEQ ID NO:5)、BstI(SEQ ID NO:6)、BstJ(SEQ ID NO:7)、またはBstM(SEQ ID NO:9)のうちの1つまたは複数のアミノ酸配列と5%〜100%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1記載の方法。
- 前記酵素のアミノ酸配列が、BstN(SEQ ID NO:10)、BstC(SEQ ID NO:2)、ΔBstC*2(SEQ ID NO:27)、BstD(SEQ ID NO:3)、Δ20BstC(SEQ ID NO:18)、Δ20BstC*(SEQ ID NO:15)、BstE(SEQ ID NO:4)、BstE*(SEQ ID NO:16)、BstH(SEQ ID NO:5)、BstI(SEQ ID NO:6)、BstJ(SEQ ID NO:7)、またはBstM(SEQ ID NO:9)のアミノ酸配列と100%未満同一である、請求項1記載の方法。
- 前記酵素が、BstN(SEQ ID NO:10)、BstC(SEQ ID NO:2)、ΔBstC*2(SEQ ID NO:27)、BstD(SEQ ID NO:3)、Δ20BstC(SEQ ID NO:18)、Δ20BstC*(SEQ ID NO:15)、BstE(SEQ ID NO:4)、BstE*(SEQ ID NO:16)、BstH(SEQ ID NO:5)、BstI(SEQ ID NO:6)、BstJ(SEQ ID NO:7)、またはBstM(SEQ ID NO:9)と比較して欠失または挿入を含まない、請求項1記載の方法。
- 前記酵素のアミノ酸配列とBstN(SEQ ID NO:10)、BstC(SEQ ID NO:2)、Δ20BstC*2(SEQ ID NO:27)、BstD(SEQ ID NO:3)、Δ20BstC(SEQ ID NO:18)、Δ20BstC*(SEQ ID NO:15)、BstE(SEQ ID NO:4)、BstE*(SEQ ID NO:16)、BstH(SEQ ID NO:5)、BstI(SEQ ID NO:6)、BstJ(SEQ ID NO:7)、またはBstM(SEQ ID NO:9)のアミノ酸配列との間の相違が、1つまたは複数の保存的アミノ酸置換からなる、請求項4記載の方法。
- 前記酵素が、天然に存在する酵素と5%〜100%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1記載の方法。
- 天然に存在する酵素が、細菌GT80ファミリーのシアリルトランスフェラーゼである、請求項6記載の方法。
- 細菌GT80ファミリーのシアリルトランスフェラーゼが、GT-B構造的フォールドを含む、請求項7記載の方法。
- 天然に存在する酵素が、微生物によって生産される、請求項6記載の方法。
- 微生物が、哺乳類の胃腸管に天然に存在している細菌である、請求項9記載の方法。
- 微生物が、フォトバクテリウム(Photobacterium)属、アビバクテリウム(Avibacterium)属、シュワネラ(Shewanella)属、ビベルシュタイニア(Bibersteinia)属、ヘモフィルス(Haemophilus)属、アリステペス(Alistepes)属、アクチノバチルス(Actinobacillus)属またはヘリコバクター(Helicobacter)属の細菌である、請求項10記載の方法。
- シアリルトランスフェラーゼが、α(2,3)シアリルトランスフェラーゼまたはα(2,6)シアリルトランスフェラーゼを含む、請求項1記載の方法。
- 前記酵素が、天然に存在するα(2,3)シアリルトランスフェラーゼと比較して変異を含む、請求項1記載の方法。
- 前記酵素のアミノ酸配列とBstE*のアミノ酸配列を整列させたとき、該酵素が、BstE*のアミノ酸配列(SEQ ID NO:16)の13位と整列する位置に変異を含んでいる、請求項13記載の方法。
- 前記酵素が、BstE*のアミノ酸配列(SEQ ID NO:16)の13位と整列する位置に非保存的変異を含んでいる、請求項14記載の方法。
- 前記酵素が、BstE*のアミノ酸配列(SEQ ID NO:16)の13位と整列する位置にヒスチジンまたはアラニンを含んでいる、請求項15記載の方法。
- 前記酵素のアミノ酸配列とBstE*のアミノ酸配列を整列させたとき、該酵素が、BstE*のアミノ酸配列(SEQ ID NO:16)の130位と整列する位置に変異を含んでいる、請求項13記載の方法。
- 前記酵素が、BstE*のアミノ酸配列(SEQ ID NO:16)の130位と整列する位置に非保存的変異を含んでいる、請求項17記載の方法。
- 前記酵素が、BstE*のアミノ酸配列(SEQ ID NO:16)の130位と整列する位置にヒスチジンまたはアラニンを含んでいる、請求項18記載の方法。
- 前記変異が、天然に存在するα(2,3)シアリルトランスフェラーゼよりも高いα(2,6)選択性を前記酵素に与える、請求項1記載の方法。
- 前記酵素が、α(2,6)シアリルトランスフェラーゼを含む、請求項1記載の方法。
- 前記酵素の骨格と天然に存在するシアリルトランスフェラーゼの骨格との間のCα平均二乗偏差(RMSD)が3Å未満である、請求項1記載の方法。
- 天然に存在するシアリルトランスフェラーゼが、Pst6-224、BstC、BstD、BstE、BstH、BstI、BstJ、HAC1268、BstMまたはBstNである、請求項1記載の方法。
- 前記細菌が、培養培地中に存在する、請求項1記載の方法。
- 前記細菌が、バイオ発酵装置中で培養される、請求項1記載の方法。
- 前記細菌からまたは該細菌の培養上清からシアル化オリゴ糖を回収する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- シアル化オリゴ糖がシアリルラクトースを含む、請求項1記載の方法。
- シアル化オリゴ糖が、3'-シアリルラクトース(3'-SL)、6'-シアリルラクトース(6'-SL)、3'-シアリル-3-フコシルラクトース(3'-S3FL)、シアリルラクト-N-テトラオースa(SLNT a)、シアリルラクト-N-テトラオースb(SLNT b)、ジシアリルラクト-N-テトラオース(DSLNT)、シアリルラクト-N-フコペンタオースII(SLNFP II)またはシアリルラクト-N-テトラオースc(SLNT c)を含む、請求項1記載の方法。
- 前記細菌が、外因性もしくは内因性ラクトース利用性α(1,3)フコシルトランスフェラーゼ酵素、外因性もしくは内因性ラクトース利用性α(1,4)フコシルトランスフェラーゼ酵素、外因性もしくは内因性β(1,3)ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素、外因性もしくは内因性β(1,4)ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素、外因性もしくは内因性β-1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む、請求項1記載の方法。
- 前記細菌が、外因性もしくは内因性N-アセチルノイラミン酸シンターゼ、外因性もしくは内因性UDP-N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼ、外因性もしくは内因性N-アセチルノイラミン酸シチジリルトランスフェラーゼ、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む、請求項1記載の方法。
- 前記細菌が、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)由来の外因性N-アセチルノイラミン酸シンターゼ、UDP-N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼおよびN-アセチルノイラミン酸シチジリルトランスフェラーゼを含む、請求項30記載の方法。
- 前記細菌が、対応する野生型細菌と比較して低下したレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性を含む、請求項1記載の方法。
- 低下したレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性が、β-ガラクトシダーゼ遺伝子の低下した発現または低下したβ-ガラクトシダーゼ酵素活性を含む、請求項32記載の方法。
- 低下したレベルが、ラクトースの存在下での対応する野生型細菌のレベルの10%未満である、請求項32記載の方法。
- 前記細菌が、欠失したまたは不活性化された内因性β-ガラクトシダーゼ遺伝子を含む、請求項32記載の方法。
- 前記細菌が、欠失したもしくは不活性化された内因性lacZ遺伝子および/または欠失したもしくは不活性化された内因性lacI遺伝子を含む、請求項32記載の方法。
- 前記細菌が内因性β-ガラクトシダーゼ遺伝子を含み、該内因性β-ガラクトシダーゼ遺伝子のプロモーターの少なくとも一部が欠失している、請求項32記載の方法。
- 前記細菌が、対応する野生型細菌の内因性β-ガラクトシダーゼ酵素と比較して低下した酵素活性を有する外因性β-ガラクトシダーゼ酵素を含む、請求項32記載の方法。
- 前記細菌が、対応する野生型細菌内の内因性β-ガラクトシダーゼ遺伝子よりも低いレベルで発現される外因性β-ガラクトシダーゼ遺伝子を含む、請求項32記載の方法。
- 前記細菌が、ラクトースの存在下で培養されたときに、50単位未満のβ-ガラクトシダーゼ活性を含む、請求項39記載の方法。
- 前記細菌が、ラクトースパーミアーゼ遺伝子を含む、請求項1記載の方法。
- 前記細菌が、thyA遺伝子内に変異をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 前記細菌が、β-ガラクトシドトランスアセチラーゼを発現しない、請求項1記載の方法。
- 前記細菌がlacA変異を含む、請求項43記載の方法。
- 前記細菌が、外因性ラクトースの存在下で細胞内ラクトースを蓄積する、請求項1記載の方法。
- 前記細菌が大腸菌(Escherichia coli;E. coli)である、請求項1記載の方法。
- 前記細菌が、バチルス(Bacillus)属、パントエア(Pantoea)属、ラクトバチルス(Lactobacillus)属、ラクトコッカス(Lactococcus)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、プロピオニバクテリウム(Proprionibacterium)属、エンテロコッカス(Enterococcus)属、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)属、スポロラクトバチルス(Sporolactobacillus)属、ミクロモノスポラ(Micromomospora)属、ミクロコッカス(Micrococcus)属、ロドコッカス(Rhodococcus)属またはシュードモナス(Pseudomonas)属のメンバーである、請求項1記載の方法。
- 前記細菌が、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス・サブティリス(Bacillus subtilis)、バチルス・コアグランス(Bacillus coagulans)、バチルス・サーモフィルス(Bacillus thermophilus)、バチルス・ラテロスポルス(Bacillus laterosporus)、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バチルス・ミコイデス(Bacillus mycoides)、バチルス・プミルス(Bacillus pumilus)、バチルス・レンタス(Bacillus lentus)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)およびバチルス・サーキュランス(Bacillus circulans)、エルビニア・ヘルビコーラ(Erwinia herbicola)(パントエア・アグロメランス(Pantoea agglomerans))、シトロバクター・フロインディー(Citrobacter freundii)、パントエア・シトレア(Pantoea citrea)、ペクトバクテリウム・カロトボラム(Pectobacterium carotovorum)、キサントモナス・カンペストリス(Xanthomonas campestris)、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)、ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)、ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)、ラクトバチルス・デルブルエッキイー(Lactobacillus delbrueckii)、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・ブルガリカス(Lactobacillus bulgaricus)、ラクトバチルス・クリスパタス(Lactobacillus crispatus)、ラクトバチルス・ガセリ(Lactobacillus gasseri)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、ラクトバチルス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)、ラクトバチルス・ジェンセニイ(Lactobacillus jensenii)、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)、ストレプトコッカス・サーモフィラス(Streptococcus thermophiles)、プロピオニバクテリウム・フロイデンライシー(Proprionibacterium freudenreichii)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エンテロコッカス・サーモフィラス(Enterococcus thermophiles)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ビフィドバクテリウム・インファンティス(Bifidobacterium infantis)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)またはシュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)細菌である、請求項1記載の方法。
- 大腸菌が、GI724株細菌である、請求項46記載の方法。
- 前記細菌が、lacIqまたはlacPL8プロモーター変異を含む、請求項49記載の方法。
- 前記細菌が、ラクトース利用性シアリルトランスフェラーゼ酵素をコードする単離された核酸を含む核酸構築物を含む、請求項1記載の方法。
- 前記細菌の染色体が、ラクトース利用性シアリルトランスフェラーゼ酵素をコードする単離された核酸を含む核酸構築物を含む、請求項1記載の方法。
- 前記核酸が、前記細菌内で前記酵素の生産を指示する異種制御配列に機能的に連結されている、請求項51記載の方法。
- 異種制御配列が、細菌プロモーター、細菌オペレーター、細菌リボソーム結合部位、細菌転写ターミネーターまたはプラスミド選択マーカーを含む、請求項53記載の方法。
- 前記細菌が、以下の遺伝子型:
PlacIq-lacY, Δ(lacI-lacZ), ΔlacA, ΔthyA::(0.8RBS lacZ+), ampC::(Ptrp M13g8 RBS-λcI+, CAT), ΔnanATE::scar
を含む、請求項1記載の方法。 - 前記酵素が、SEQ ID NO:15、16、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30に示されるアミノ酸配列を含む、請求項2記載の方法。
- SEQ ID NO:15、16、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30に示される配列内のアミノ酸を含む変異酵素をコードする、核酸。
- SEQ ID NO:15、16、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30に示される配列内のアミノ酸を含む、ラクトース利用性シアリルトランスフェラーゼ酵素。
- 外因性ラクトース利用性シアリルトランスフェラーゼ酵素を含む単離された細菌であって、該酵素が、
(i)少なくとも250アミノ酸のストレッチにわたってPst6-224のアミノ酸配列(SEQ ID NO:1)と5%〜30%同一、または
(ii)少なくとも250アミノ酸のストレッチにわたってHAC1268のアミノ酸配列(SEQ ID NO:8)と45%〜75%同一
であるアミノ酸配列を含む、細菌。 - 実質的に純粋なシアリルラクトースおよび5%未満のKDO-ラクトースを含む、組成物。
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