BR112019014116A2 - S-cianidrina liase altamente ativa e aplicação da mesma - Google Patents
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Abstract
a invenção fornece uma s-cianidrina liase altamente ativa obtida por mutação de um resíduo de aminoácido na posição 103 de uma s-cianidrina liase do tipo selvagem de mandioca. a mutação pode aumentar significativamente uma expressão de uma enzima mutante em e. coli e não requer uma diminuição da temperatura quando induzida. adicionalmente mutações na posição 128 e outros sítios foram realizadas para obter mutantes com atividade catalítica aumentada.
Description
“S-CIANIDRINA LIASE ALTAMENTE ATIVA E APLICAÇÃO DA MESMA” CAMPO DA TÉCNICA [001 ]A presente invenção se refere ao campo da biotecnologia e, em particular, a presente invenção se refere a uma S-cianidrina liase altamente ativa, e sua aplicação.
ANTECEDENTES [002]A cianidrina liase é uma enzima industrial que é muito útil na produção química. Sua atividade natural é catalisar a divagem de cianidrina e liberar ácido cianídrico. A cianidrina liase pode catalisar a reação reversa, isto é, a adição de HCN ao aldeído cetona, para obter um produto de a-cianidrina opticamente ativo. A cianidrina do tipo S (SCMB) do m-fenoxibenzaldeído (m-PBAId) é um intermediário-chave para os pesticidas piretroides. O método químico tradicional tem o problema de baixa estereosseletividade, enquanto o processo de produção de SCMB catalisado pela S-cianidrina liase tem a seletividade.
[003]A S-cianidrina liase natural está presente em poucos tecidos vegetais, tais como borracha, mandioca e sorgo, com baixa abundância e dificuldade de purificação. Em 1995, Wajant isolou a cianidrina liase de mandioca MeHNL, a partir da mandioca, pelo método de purificação em cinco etapas (Plant Sei., 1995, 108, 1); White et al. extraíram MeHNL de folhas de mandioca com uso do método de três etapas, e obtiveram uma solução de enzima por meio de relargagem e diálise, mas a estereosseletividade da enzima aplicada na catálise química não foi alta (Plant Physiol 1998, 116, 1219). A cianidrina liase (MeHNL) derivada de Manihot esculenta é uma S-cianidrina liase. Foi relatado que a MeHNL pode catalisar a síntese química de cianidrina quiral do tipo S com um valor de ee > 99%. A liase tem alto valor de aplicação, mas a atividade da enzima ainda não é alta o suficiente para atender às exigências de aplicação prática.
[004]Por essa razão, as pessoas versadas na técnica estão trabalhando para desenvolver uma S-cianidrina liase com atividade mais alta para reduzir o custo de aplicação.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [005]É um objetivo da presente invenção fornecer uma S-cianidrina liase altamente ativa, e a sua aplicação.
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2/36 [006]Em um primeiro aspecto da invenção, é fornecida uma S-cianidrina liase mutada, que sofre mutação em um ou mais sítios selecionados a partir do grupo que consiste em: resíduo de aminoácido de posição 103, resíduo de aminoácido de posição 128, resíduo de aminoácido de posição 2, resíduo de aminoácido de posição 81, resíduo de aminoácido de posição 149, resíduo de aminoácido de posição 94 e resíduo de aminoácido de posição 176, em que os resíduos de aminoácido são numerados conforme mostrado na SEQ ID NO. 1 [007]Em uma outra modalidade preferencial, a atividade catalítica da S-cianidrina liase mutada tem aumento de mais de 30%; preferencialmente, com aumento de mais de 50%; mais preferencialmente, com aumento de mais de 80%, em comparação com aquela da S-cianidrina liase do tipo selvagem.
[008]Em outra modalidade preferencial, a atividade catalítica da S-cianidrina liase mutada é de pelo menos 2 vezes; preferencialmente, pelo menos 5 vezes; mais preferencialmente, pelo menos 10 vezes, daquela da S-cianidrina liase do tipo selvagem.
[009]Em outra modalidade preferencial, a sequência de aminoácidos da S-cianidrina liase do tipo selvagem é mostrada na SEQ ID NO.1.
[0010]Em outra modalidade preferencial, a sequência de aminoácidos da S-cianidrina liase mutada tem pelo menos 80% de homologia com a SEQ ID NO. 1; mais preferencialmente, tem pelo menos 90% de homologia, mais preferencialmente, tem pelo menos 95% de homologia; tal como tem pelo menos 96%, 97%, 98%, 99% de homologia.
[0011]Em outra modalidade preferencial, os sítios de mutação da S-cianidrina liase mutada compreendem o resíduo de aminoácido de posição 103; preferencialmente, o resíduo de aminoácido de posição 103 sofre mutação de H para L, I, V, C, S ou M.
[0012]Em outra modalidade preferencial, os sítios de mutação da S-cianidrina liase mutada compreendem adicionalmente o resíduo de aminoácido de posição 128; preferencialmente, o resíduo de aminoácido de posição 128 sofre mutação de W para A, N, L, V, G ou Y, mais preferencialmente, o resíduo de aminoácido de posição 128 sofre mutação
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3/36 de W para A.
[0013]Em outra modalidade preferencial, os sítios de mutação da S-cianidrina liase mutada compreendem adicionalmente o resíduo de aminoácido de posição 2; preferencialmente, o resíduo de aminoácido de posição 2 sofre mutação de V para P, L, D, I, G, H, R, M, S, C, W, T, Q ou A.
[0014]Em uma outra modalidade preferencial, os sítios de mutação da S-cianidrina liase mutada compreendem adicionalmente o resíduo de aminoácido de posição 81; preferencialmente, o resíduo de aminoácido de posição 81 sofre mutação de C para A, V ou I.
[0015]Em uma outra modalidade preferencial, os locais de mutação da S-cianidrina liase mutada compreendem adicionalmente o resíduo de aminoácido de posição 149; preferencialmente, o resíduo de aminoácido de posição 149 sofre uma mutação de L para I, C, A ou P.
[0016]Em outra modalidade preferencial, os sítios de mutação da S-cianidrina liase mutada compreendem adicionalmente o resíduo de aminoácido de posição 94; preferencialmente, o resíduo de aminoácido de posição 94 sofre mutação de V para P, R, S, K.
[0017]Em outra modalidade preferencial, os sítios de mutação da S-cianidrina liase mutada compreendem adicionalmente o resíduo de aminoácido de posição 176; preferencialmente, o resíduo de aminoácido de posição 176 sofre mutação de K para P.
[0018]Em outra modalidade preferencial, a S-cianidrina liase mutada adicional em um ou mais locais selecionados a partir do grupo que consiste em: resíduo de aminoácido de posição 209, resíduo de aminoácido de posição 94, resíduo de aminoácido de posição 165, resíduo de aminoácido de posição 140, resíduo de aminoácido de posição 224, resíduo de aminoácido de posição 173 e resíduo de aminoácido de posição 36, em que os resíduos de aminoácido são numerados conforme mostrado na SEQ ID NO. 1 [0019]Em outra modalidade preferencial, os sítios de mutação da S-cianidrina liase mutada compreendem adicionalmente o resíduo de aminoácido de posição 209; preferencialmente, o resíduo de aminoácido de posição 209 sofre mutação de K para R, A, S, C, G, M, L, F, S ou C.
[0020]Em outra modalidade preferencial, os sítios de mutação da
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S-cianidrina liase mutada compreendem adicionalmente o resíduo de aminoácido de posição 94; preferencialmente, o resíduo de aminoácido de posição 94 sofre mutação de V para P, S, C, G , R, K, S, A, F, ou T.
[0021 ]Em outra modalidade preferencial, os sítios de mutação da S-cianidrina liase mutada compreendem adicionalmente o resíduo de aminoácido de posição 165; preferencialmente, o resíduo de aminoácido de posição 165 sofre mutação de G para P, D, S, ou T.
[0022]Em outra modalidade preferencial, os sítios de mutação da S-cianidrina liase mutada compreendem adicionalmente o resíduo de aminoácido de posição 140; preferencialmente, o resíduo de aminoácido de posição 140 sofre mutação de T para H, G, K, I, D, W, S, ou R.
[0023]Em outra modalidade preferencial, os sítios de mutação da S-cianidrina liase mutada compreendem adicionalmente o resíduo de aminoácido de posição 224; preferencialmente, o resíduo de aminoácido de posição 224 sofre mutação de K para P, E, V, S, I, H, D, N, A, ou T.
[0024]Em outra modalidade preferencial, os sítios de mutação da S-cianidrina liase mutada compreendem adicionalmente o resíduo de aminoácido de posição 173; preferencialmente, o resíduo de aminoácido de posição 173 sofre mutação de V para Q, L, S, A , C, I, ou T.
[0025]Em outra modalidade preferencial, os sítios de mutação da S-cianidrina liase mutada compreendem adicionalmente o resíduo de aminoácido de posição 36; preferencialmente, o resíduo de aminoácido de posição 36 sofre mutação de L para A, F, I.
[0026]Em outra modalidade preferencial, os sítios de mutação da S-cianidrina liase mutada compreendem adicionalmente o resíduo de aminoácido de posição 128 e o resíduo de aminoácido de posição 103.
[0027]Em outra modalidade preferencial, os sítios de mutação da S-cianidrina liase mutada compreendem adicionalmente o resíduo de aminoácido de posição 128 e o resíduo de aminoácido de posição 103; e a S-cianidrina liase mutada sofre mutação em um ou mais sítios selecionados a partir do grupo que consiste em: resíduo de aminoácido de posição 2, resíduo de aminoácido de posição 81, resíduo de aminoácido de posição 149, resíduo de aminoácido de posição 176, resíduo de aminoácido de posição209, resíduo de aminoácido de posição 94, resíduo de aminoácido
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5/36 de posição 165, resíduo de aminoácido de posição 140, resíduo de aminoácido de posição 224, resíduo de aminoácido de posição 173 e resíduo de aminoácido de posição 36, em que os resíduos de aminoácido são numerados conforme mostrado na SEQ ID NO. 1.
[0028]Em outra modalidade preferencial, o número de sítios de mutação na S-cianidrina liase mutada é de 1 a 5, preferencialmente, 2 a 4, tal como 3.
[0029]Em outra modalidade preferencial, a S-cianidrina liase mutada é selecionada a partir de enzimas específicas com mutação, na Tabela 2.
[0030]Em outra modalidade preferencial, a S-cianidrina liase mutada compreende mutações nos sítios de enzimas específicas com mutação, na Tabela 2.
[0031 ]Em outra modalidade preferencial, a S-cianidrina liase mutada é selecionada a partir das enzimas mutantes 86, 87, 88, 89, 90, 91,
92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108,
109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123,
124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138 ou 139, na Tabela 2.
[0032]Em outra modalidade preferencial, a S-cianidrina liase mutada compreende sítios de mutação selecionados a partir do grupo que consiste em:
| Número de Enzima Mutante | Sítio de Mutação |
| 3 | L36A, H103L,W128A |
| 4 | V94E, H103L,W128A |
| 5 | L36C, H103L,W128A |
| 6 | L36Y, H103L,W128A |
| 9 | V94L, H103L,W128A |
| 10 | L36Q, H103L,W128A |
| 13 | C81Y, H103L,W128A |
| 18 | V94Q, H103L,W128A |
| 20 | V94H, H103L,W128A |
| 21 | H103L,W128A, V173T |
| 22 | C81Y, H103L, W128A |
| 27 | C81V, H103L, W128A |
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6/36
| 29 | H103L,W128A, V173I |
| 30 | V94T, H103L,W128A |
| 31 | H103L,W128A, V173C |
| 34 | H103L,W128A , 149A |
| 35 | V94F, H103L,W128A |
| 36 | H103L,W128A, V173A |
| 37 | L36I, H103L,W128A |
| 38 | H103L,W128A, V173S |
| 39 | L36F, H103L,W128A |
| 40 | H103S |
| 41 | C81I, H103L, W128A |
| 42 | V94A, H103L,W128A |
| 43 | V2P,H103L,W128A |
| 44 | V2W,H103L,W128A |
| 45 | V2T,H103L,W128A |
| 46 | V94S,H103L,W128A, K209R |
| 47 | H103L,W128A, V173L,K209C |
| 48 | V94R,H103L,W128A, K209C |
| 49 | H103V |
| 50 | H103L,W128A, G165T |
| 51 | H103L,W128A, V173L,K209S |
| 52 | V2H,H103L,W128A |
| 53 | H103L,W128A, K224T |
| 54 | V2D,H103L,W128A |
| 55 | V94G, H103L,W128A |
| 56 | V2P,C81A H103L,W128A,L149C |
| 57 | V2S,H103L,W128A |
| 58 | H103L,W128A, K224A |
| 59 | V2Q,H103L,W128A |
| 60 | H103L,W128A, K199P,K176P |
| 61 | V2R,H103L,W128A |
| 62 | V94R, H103L,W128A, V173L |
| 63 | H103I |
| 64 | H103L,W128A, K199P |
| 65 | H103L,W128A, K176P |
| 66 | V94C, H103L,W128A |
| 67 | H103L,W128A, K224N |
| 68 | H103L,W128A, K224D |
| 69 | V94S, H103L,W128A, V173L |
| 70 | H103L,W128A, K199P,K224P |
| 71 | V2C,H103L,W128A |
| 72 | H103L,W128A |
| 73 | H103L,W128A, K224P |
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7/36
| 74 | H103L,W128A, V173L |
| 75 | H103L,W128A, K224H |
| 76 | H103L,W128A, K224I |
| 77 | H103L,W128A, K224S |
| 78 | H103L,W128A, K224V |
| 79 | H103L,W128A, G165S |
| 80 | H103L,W128A, K176P,K224P |
| 81 | H103C |
| 82 | H103L,W128A, V173Q |
| 83 | H103L,W128A, K224E |
| 84 | V94S,H103L,W128A, K209C |
| 85 | H103L,W128A, K224P |
| 86 | H103L,W128A, T140R |
| 87 | H103L |
| 88 | H103L,W128A, T140S |
| 89 | H103L,W128A, T140W |
| 90 | H103L,W128A, T140D |
| 91 | V94S,H103L,W128A, G165D |
| 92 | H103L,W128A, T140I |
| 93 | H103L,W128A, T140K |
| 94 | H103L,W128A, G165P |
| 95 | H103L,W128A, T140G |
| 96 | H103L,W128A, T140H |
| 97 | V94R, H103L,W128A |
| 98 | H103L,W128A, K209F |
| 99 | H103L,W128A, G165D |
| 100 | V94R,H103L,W128A, K209R |
| 101 | V94R,H103L,W128A, G165D |
| 102 | V94S, H103L,W128A |
| 103 | H103L,W128A, K209L |
| 104 | C81A, H103L,W128A |
| 105 | H103L,W128A, K209M |
| 106 | H103L,W128A, K209G |
| 107 | H103L,W128A, K209A |
| 108 | H103L,W128A, K209S |
| 109 | H103L,W128A, K209C |
| 110 | C81 A,H103L,W128A, K224P |
| 111 | C81A, H103L, W128A |
| 112 | H103L,W128A, K209R |
| 113 | V2I, H103L, W128A |
| 114 | C81 A,H103L,W128A, K176P |
| 115 | V2A, C81 A, H103L, W128A, L149C |
| 116 | L36A, H103L,W128A |
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8/36
| 117 | V2G,C81A,H103L,W128A |
| 118 | V2L,C81A,H103L,W128A |
| 119 | V2P,C81A,H103L,W128A |
| 120 | V2H,C81A,H103L,W128A |
| 121 | V2R,C81A,H103L,W128A |
| 122 | V2M,C81A,H103L,W128A |
| 123 | V2S,C81A,H103L,W128A |
| 124 | V2C,C81A,H103L,W128A |
| 125 | V2W,C81A,H103L,W128A |
| 126 | V2T,C81A,H103L,W128A |
| 127 | V2Q,C81A,H103L,W128A |
| 128 | V2A,C81A,H103L,W128A |
| 129 | C81 A,H103L,W128A,L149P |
| 130 | C81 A,H103L,W128A,L149l |
| 131 | C81 A,H103L,W128A,L149C |
| 132 | C81 A, V94P, H103L, W128A, K176P |
| 133 | C81 A,94R, H103L,W128A, L149P |
| 134 | C81 A,94K,H103L,W128A,L149P |
| 135 | V2P,C81A, H103L,W128A,L149C |
| 136 | H103I, W128A |
| 137 | H103V, W128A |
| 138 | H103C, W128A |
| 139 | H103S, W128A |
| 140 | H103I, W128Y |
| 141 | H103L, W128N |
| 142 | H103L, W128G |
| 143 | H103L, W128Y |
| 144 | H103I, W128N |
| 145 | H103I, W128G |
| 146 | H103C,W128V |
| 147 | H103C, W128G |
| 148 | H103C, W128Y; e |
| 149 | 103M, W128L. |
[0033]Em um segundo aspecto da invenção, é fornecida uma molécula de polinucleotídeos que codifica a S-cianidrina liase mutada do primeiro aspecto da invenção.
[0034]Em um terceiro aspecto da invenção, é fornecido um vetor que compreende a molécula de ácido nucleico do segundo aspecto da invenção.
[0035]Em um quarto aspecto da presente invenção, é fornecida uma
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9/36 célula hospedeira que compreende o vetor do primeiro aspecto da invenção ou que tem a molécula de ácido nucleico do segundo aspecto da invenção integrada ao seu genoma.
[0036]Em outra modalidade preferencial, a célula hospedeira é uma célula procariótica ou uma célula eucariótica.
[0037]Em outra modalidade preferencial, a célula procariótica é Escherichia coli.
[0038]Em um quinto aspecto da invenção, é fornecido um método de preparação da S-cianidrina liase mutada, do primeiro aspecto da invenção, que compreende as etapas de:
(i) cultivar a célula hospedeira, do quarto aspecto da invenção, sob condições adequadas, para expressar a cianidrina liase com mutação; e (ii) isolar a cianidrina liase com mutação [0039]Em outra modalidade preferencial, na etapa (i), a temperatura de cultura da célula hospedeira é de 20 a 40 °C; preferencialmente, 25 a 37 °C, tal como 35 °C.
[0040]Em um sexto aspecto da invenção, é fornecida uma preparação de enzima que compreende a S-cianidrina liase mutada, do primeiro aspecto da invenção.
[0041 ]Em um sétimo aspecto da invenção, é fornecido um uso da S-cianidrina liase mutada, do primeiro aspecto da invenção, ou da preparação de enzima, do sexto aspecto da invenção, para preparação de um produto de S-cianidrina opticamente ativo.
[0042]Em outra modalidade preferencial, o uso compreende adicionalmente catalisar a reação de adição de HCN com aldeído cetona.
[0043]Em um oitavo aspecto da invenção, é fornecido um método para a preparação de S-cianidrina, que compreende as etapas de:
(1) colocar a S-cianidrina liase mutada, do primeiro aspecto da invenção, em contato com um substrato de reação para realizar uma reação catalítica, produzindo, desse modo, a S-cianidrina;
(2) isolar e purificar o produto de S-cianidrina.
[0044]Em outra modalidade preferencial, na etapa (1), o substrato de reação compreende m-fenoxibenzaldeído, HCN (ou cianeto de sódio/ cianeto de potássio) e/ou acetona cianidrina.
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10/36 [0045]Em outra modalidade preferencial, na etapa (1), a temperatura da reação catalítica é de 0 a 20 °C.
[0046]Deve ser compreendido, na presente invenção, que cada um dos recursos técnicos descritos de forma específica, acima e abaixo, (tais como aqueles nos Exemplos) pode ser combinado um com o outro, o que constitui, desse modo, soluções técnicas inovadoras ou preferenciais, que não precisam ser descritas uma a uma, devido às limitações de espaço.
DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0047]A Figura 1 mostra os resultados da determinação específica da atividade enzimática do tipo selvagem e de alguns dos mutantes típicos da invenção.
[0048]A Figura 2 mostra os resultados do monitoramento da reação catalítica do tipo selvagem e de alguns dos mutantes típicos da invenção.
MODALIDADES PARA A REALIZAÇÃO DA PRESENTE INVENÇÃO [0049]Depois de vastos e intensos estudos, os inventores constataram, de forma inesperada, que a mutação no resíduo de aminoácido de posição 103 da S-cianidrina liase do tipo selvagem pode aumentar, de forma significativa, a expressão da enzima mutante em E. coli. Além disso, não é necessário reduzir a temperatura durante a indução de expressão, o que reduz de forma significativa o custo de preparação da enzima. Além disso, as mutações em outros sítios, tal como a posição 128, podem obter uma S-cianidrina liase com atividade catalítica melhorada. Os resultados experimentais mostraram que a atividade catalítica da S-cianidrina com mutação, na reação de adição de m-fenoxibenzaldeído (m-PBAId) com HCN, aumentou em mais de 30%, em comparação com aquela do tipo selvagem. Com base nisso, os inventores concluíram a presente invenção.
[0050]Antes de descrever a presente invenção, deve ser compreendido que a invenção não se limita aos métodos específicos e às condições experimentais descritos, uma vez que tais métodos e condições podem ser mudados. Também se compreende que os termos usados no presente documento têm apenas o propósito de descrever as modalidades
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11/36 específicas, e não se destinam a ser restritivos. O escopo da invenção será limitado apenas pelas reivindicações anexas.
[0051 ]A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado daqueles compreendidos, em comum, pelas pessoas versadas na técnica da invenção. Conforme usado no presente documento, quando usado em referência a um valor particular citado, o termo cerca de significa que o valor pode variar em não mais do que 1 % do valor citado. Por exemplo, tal como usado no presente documento, a expressão cerca de 100 compreende todos os valores entre 99 e 101 (por exemplo, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, etc.).
[0052]Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos na presente invenção possam ser usados na prática ou em teste da invenção, os métodos e materiais preferenciais são exemplificados no presente documento.
CIANIDRINA LIASE [0053]A cianidrina liase (hidroxinitrila liase) é derivada, principalmente, de poucos tecidos vegetais, como borracha, mandioca e sorgo, que incluem principalmente: cianidrina liase de mandioca (MeHNL), cianidrina liase da árvore da laca (HbHNL) e cianidrina liase de amêndoa (PaHNL).
[0054]Em uma modalidade preferencial da invenção, a cianidrina liase é cianidrina liase da mandioca.
[0055]Em uma modalidade preferencial da invenção, preferencialmente, a sequência da cianidrina liase da mandioca do tipo selvagem é a seguinte:
[0056]MVTAHFVLIH TICHGAWIWH KLKPALERAG HKVTALDMAA SGIDPRQIEQ INSFDEYSEP 60 [0057]LLTFLEKLPQ GEKVIIVGES CAGLNIAIAA DRYVDKIAAG VFHNSLLPDT VHSPSYTVEK 120 [0058]LLESFPDWRD TEYFTFTNIT GETITTMKLG FVLLRENLFT KCTDGEYELA KMVMRKGSLF 180 [0059]QNVLAQRPKF TEKGYGSIKK VYIWTDQDKI
FLPDFQRWQI ANYKPDKVYQ VQGGDHKLQL 240 [0060]TKTEEVAHIL QEVADAYA
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12/36
258 [0061]SEQ ID NO.: 1 [0062]A sequência genética de codificação do tipo selvagem é conforme a seguir:
[0063]ATGGTTACTGCACACTTCGTTCTGATTCACACCATTTGT CACGGCGCATGGATTTGGCACAAACTGAAACCGGCCCTGGAACGTGCT GGCCACAAAGTTACTGCACTGGACATGGCAGCCAGTGGCATTGACCCG CGTCAAATTGAACAGATCAACTCTTTCGATGAATACTCTGAACCGCTGCT GACTTTCCTGGAAAAACTGCCGCAAGGCGAAAAGGTTATCATTGTTGGT GAAAGCTGTGCAGGCCTGAACATTGCTATTGCTGCTGATCGTTACGTTG ACAAAATTGCAGCTGGCGTTTTCCACAACTCCCTGCTGCCGGACACCGT TCACAGCCCGTCTTACACTGTTGAAAAGCTGCTGGAATCGTTCCCGGAC TGGCGTGACACAGAATATTTCACGTTCACCAACATCACTGGCGAAACCA TCACTACCATGAAACTGGGTTTCGTTCTGCTGCGTGAAAACCTGTTCAC CAAATGCACTGATGGCGAATATGAACTGGCAAAAATGGTTATGCGCAAG GGCTCTCTGTTCCAAAACGTTCTGGCTCAGCGTCCGAAGTTCACTGAAA AAGGCTACGGCTCTATCAAGAAAGTTTATATTTGGACCGATCAAGACAA AATATTCCTGCCGGACTTCCAACGCTGGCAAATTGCAAACTACAAACCG GACAAGGTTTATCAGGTTCAAGGCGGCGATCACAAGCTGCAGCTGACA AAAACTGAAGAAGTAGCTCACATTCTGCAAGAAGTTGCTGATGCATACG CTTAA (SEQ ID NO.2)
CIANIDRINA LIASE DE ALTA ATIVIDADE COM MUTAÇÃO [0064]0s inventores da presente invenção desenvolveram um método de triagem específico de alto rendimento com base na S-cianidrina liase derivada de mandioca MeHNL, e, como consequência, a evolução direcionada foi realizada. A sequência de cianidrina liase com atividade enzimática mais alta foi obtida por meio de triagem adicional. A enzima mutante foi preparada por meio de fermentação de alta densidade de E. coli, e foram determinados seu desempenho catalítico e sua estereosseletividade. Foi constatado que as enzimas mutantes têm valor de aplicação extremamente elevado. A atividade enzimática específica mais alta da enzima mutante, na m-PBAId, é 10 vezes mais alta do que aquela do tipo selvagem, e o valor de ee é tão alto quanto cerca de 99%, que é maior do que aquele de todas as S-cianidrina liases relatadas. A reação catalítica enzimática é mostrada na seguinte fórmula:
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UH
m-PBAId SCMB [0065]Preferencialmente, as condições de reações catalíticas são conforme a seguir:
[0066]Ensaio de atividade enzimática: 1 U de atividade enzimática é definido como a quantidade de enzima exigida para catalisar a produção de 1 pmol de éter e aldeído por minuto.
[0067]0 ensaio de atividade enzimática foi realizado por meio de referência ao método descrito por Selmar (Analytical Biochemistry 166 (1987), p. 208 a 211), com 10 mM de m-fenoxibenzonitrila, 20 uL de metanol, 20 mM de tampão de citrato (pH 5,0) e 10 uL de solução enzimática. A solução de reação acima foi incubada a 25 °C, e a mudança na absorbância a OD 310 nm foi medida dentro de 1 a 5 min. A curva de tempo (min.) e a mudança de absorbância foram retiradas. A inclinação da curva do grupo experimental foi ajustada para ΔΚ, e a inclinação do grupo controle foi zero. Sob as mesmas condições, e sem adição de nenhuma solução enzimática, a mudança na absorbância, em um comprimento de onda de 310 nm, a 25 °C, foi registrada como um grupo de controle. O grupo de controle não deve ter uma mudança na absorbância.
[0068]A inclinação da curva-padrão de concentração de m-oxibenzaldeído foi K. A atividade enzimática foi calculada de acordo com a fórmula:
------ X--x |00θ x 100 x Vezes de diluição
K 1000
VETOR E CÉLULA HOSPEDEIRA [0069]A presente invenção também fornece um vetor que compreende o gene de cianidrina liase otimizado, da presente invenção, e uma célula hospedeira que contém o vetor.
[0070]Em uma modalidade preferencial da invenção, o vetor tem capacidade para ser expresso na E. coli, mais preferencialmente, na cepa de E. coli BL21 (DE3).
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14/36 [0071 ]As sequências genéticas otimizadas de cianidrina liase, da invenção, podem ser obtidas por meio de métodos convencionais, que podem ser usados por uma pessoa de habilidade comum na técnica, tal como a síntese ou a síntese totalmente artificial PCR. Um método preferencial de síntese é o método de PCR assimétrica. O método de PCR assimétrica usa um par de iniciadores, com quantidades desiguais, e uma grande quantidade de DNA de fita simples (ssDNA) é produzida por amplificação por PCR. O par de iniciadores é chamado iniciador sem restrição e iniciador com restrição, respectivamente, e, em geral, a proporção é de 50 a 100:1. Nos primeiros 10 a 15 ciclos da reação de PCR, o produto amplificado é, principalmente, DNA de cadeia dupla. Mas, quando o iniciador com restrição (iniciador de baixa concentração) é consumido, a PCR orientada pelo iniciador sem restrição (iniciador de alta concentração) irá produzir uma grande quantidade de DNA de fita simples. Os iniciadores para PCR podem ser selecionados de forma apropriada, de acordo com as informações de sequência da presente invenção, reveladas no presente documento, e podem ser sintetizados por meio de um método convencional. O fragmento de DNA/ RNA amplificado pode ser isolado e purificado por meio de métodos convencionais, tal como eletroforese em gel.
[0072]A sequência de polinucleotídeos, da presente invenção, pode expressar ou produzir uma proteína-alvo por meio de tecnologia convencional de DNA recombinante, que compreende as etapas de:
(1) transformar ou transduzir uma célula hospedeira adequada, preferencialmente, uma célula de E. coli, com um polinucleotídeo (ou variante) que codifica a proteína da presente invenção, ou com um vetor de expressão recombinante que contém o polinucleotídeo;
(2) cultivar a célula hospedeira em um meio adequado;
(3) isolar e purificar a proteína oriunda do meio de cultura ou da célula.
[0073]Podem ser usados métodos bem conhecidos das pessoas versadas na técnica para construir o vetor de expressão, que contém a sequência de DNA que codifica a proteína da invenção e os sinais adequados de controle de transcrição/ tradução. O vetor com preferência comercial é: pET28. Esses métodos compreendem tecnologia de DNA
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15/36 recombinante in vitro, tecnologia de síntese de DNA, tecnologia recombinante in vivo, e similares. A sequência de DNA pode ser ligada, de forma operacional, a um promotor apropriado, em um vetor de expressão, para direcionar a síntese de mRNA. O vetor de expressão também compreende um sítio de ligação do ribossomo, para iniciação da tradução, e um terminador de transcrição. Além disso, o vetor de expressão compreende, preferencialmente, um ou mais genes marcadores selecionáveis para fornecer traços fenotípicos para a seleção de células hospedeiras transformadas.
[0074]A presente invenção também fornece um vetor recombinante que compreende a sequência otimizada de DNA MeHNL da presente invenção. Em uma modalidade preferencial, o vetor recombinante compreende um sítio de clonagem múltipla, ou pelo menos um sítio de restrição a jusante do promotor. Quando um gene-alvo precisa ser expresso, o gene-alvo pode estar ligado em um sítio de clonagem múltipla adequado ou em um sítio de restrição, ligando, desse modo, de forma operacional, o gene-alvo ao promotor.
[0075]Em outra modalidade preferencial, o vetor recombinante compreende: um promotor, um gene-alvo e um terminador na direção 5' para 3'. Se necessário, o vetor recombinante também pode incluir os seguintes elementos: uma identificação de purificação de proteína; um sinal de polinucleotídeo 3'; uma sequência de ácido nucleico não traduzido; uma sequência de ácido nucleico de transporte e de alvo; um marcador selecionável (gene de resistência a antibiótico, proteína fluorescente, etc.); um intensificador; ou um operador.
[0076]Qs métodos de preparação de vetores recombinantes são bem conhecidos para as pessoas versadas na técnica. O vetor de expressão pode ser um plasmídeo bacteriano, um fago, um plasmídeo de levedura, um vírus de célula vegetal, um vírus de célula de mamífero ou outros vetores. No total, qualquer plasmídeo, e vetor, pode ser empregado, desde que tenha capacidade de se replicar e esteja estável no hospedeiro.
[0077]As pessoas versadas na técnica podem construir o vetor que contém o promotor e/ou a sequência de gene-alvo da presente invenção, com uso dos métodos bem conhecidos. Esses métodos compreendem
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16/36 tecnologia de DNA recombinante in vitro, tecnologia de síntese de DNA, tecnologia recombinante in vivo, e similares.
[0078]0 vetor de expressão da presente invenção pode ser usado para transformar uma célula hospedeira apropriada, de modo que o hospedeiro transcreva o RNA-alvo ou expresse a proteína-alvo. A célula hospedeira pode ser uma célula procariótica, tal como Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, Streptomyces, Agrobacterium; ou uma célula eucariótica inferior, tal como uma célula de levedura; ou uma célula eucariótica superior, tal como uma célula vegetal. Ficará evidente para a pessoa versada na técnica o modo de selecionar um vetor apropriado e uma célula hospedeira. A transformação de células hospedeiras com DNA recombinante pode ser realizada com uso de técnicas convencionais bem conhecidas das pessoas versadas na técnica. Quando o hospedeiro é um procarioto (tal como E. coli), há possibilidade de tratamento com o método de CaCl2 ou o método de eletroporação. Quando o hospedeiro é um eucarioto, os seguintes métodos de transfecção de DNA podem ser usados: método de coprecipitação de fosfato de cálcio, método mecânico convencional (tal como microinjeção, eletroporação, empacotamento de lipossomas, etc.). A transformação da planta pode ser realizada com uso de transformação de agrobactérias ou transformação com pistola de genes, ou por meio de outros métodos, tais como método de disco de folha, método de transformação de embrião imaturo, método de embeber broto de flor e similares. As células vegetais, os tecidos ou os órgãos transformados podem ser regenerados em plantas, com uso do método convencional para obter plantas transgênicas.
[0079]Q termo ligado de forma operacional significa que um gene-alvo pretendido para a expressão transcricional está ligado à sua sequência de controle para expressão de uma maneira convencional na técnica.
CULTURA DE MANIPULAÇÃO GENÉTICA DE BACTÉRIAS E PRODUÇÃO DE FERMENTAÇÃO DE PROTEÍNA-ALVO [0080]Depois de obtida, a célula geneticamente manipulada pode ser cultivada sob condições adequadas para expressar a proteína codificada pela sequência genética da presente invenção. Dependendo da
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17/36 diferença de células hospedeiras, o meio usado na cultura pode ser selecionado a partir de vários meios convencionais, e as células hospedeiras foram cultivadas sob condições adequadas para desenvolvimento. Depois de as células hospedeiras terem se desenvolvido até uma densidade celular apropriada, o promotor selecionado é induzido por meio de um método adequado (tal como conversão de temperatura ou indução química), e as células são cultivadas durante um período de tempo adicional.
[0081 ]Na presente invenção, podem ser empregadas as condições de fermentação convencionais. As condições representativas incluem (mas sem limitação):
(A) em termos de temperatura, a fermentação e a temperatura de indução da cianidrina liase são mantidas entre 25 e 37 °C;
(B) em termos de pH, durante o período de indução, o pH do período de indução é controlado em 3 a 9;
(C) em termos de oxigênio dissolvido (DO), o DO é controlado em 10 a 90%, e pode ser mantido pela passagem da mistura oxigênio/ ar;
(D) em termos de meio adicional, o tipo de meio adicional deve incluir fontes de carbono, tais como glicerina, metanol, glicose, etc., que podem ser alimentadas de forma separada, ou por mistura;
(E) em termos de concentração de IPTG, durante o período de indução, a concentração induzida convencional pode ser usada, na presente invenção, e, de forma usual, concentração de IPTG é controlada a 0,1 a 1,5 mM;
(F) em termos de tempo de indução, não há limitação particular, e de maneira usual, de 2 a 20 horas, preferencialmente, 5 a 15 horas.
[0082]A cianidrina liase de proteína-alvo, da presente invenção, existe nas células de Escherichia coli. As células hospedeiras são coletadas por meio de uma centrífuga. Então, as células hospedeiras se rompem por meio de alta pressão, potência de máquina, digestão enzimática de célula, ou por meio de outros métodos de rompimento de célula, para liberar a proteína recombinante, e, um método preferencial é o método de alta pressão. O lisado de células hospedeiras pode ser purificado de forma preliminar por meio de métodos, tais como floculação, relargagem,
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18/36 ultrafiltração, etc., seguido de purificação, tal como cromatografia, ultrafiltração, etc. A proteína também pode ser diretamente purificada por meio de cromatografia.
[0083]A tecnologia de cromatografia compreende cromatografia por troca catiônica, cromatografia por troca aniônica, cromatografia por filtração em gel, cromatografia hidrofóbica, cromatografia por afinidade, e similares. Os métodos cromatográficos normalmente usados compreendem:
1. Cromatografia por troca aniônica:
[0084]0s meios de cromatografia por troca aniônica compreendem, mas sem limitação, Q-Sefarose, DEAE-Sefarose. Se a concentração de sal da amostra fermentada for excessivamente alta para afetar a ligação ao meio de troca iônica, a concentração de sal precisará ser reduzida antes da cromatografia por troca iônica. O tampão de equilíbrio da amostra pode ser substituído por diluição, ultrafiltração, cromatografia por diálise e filtração em gel, etc., até que seja similar ao sistema de líquido de equilíbrio correspondente da coluna de troca iônica. Em seguida, a amostra é carregada para eluição por gradiente da concentração de sal ou pH.
2. Cromatografia hidrofóbica:
[0085]0 meio de cromatografia hidrofóbica compreende, mas sem limitação: Fenil-Sefarose, Butil-Sefarose, Octil-Sefarose. A concentração de sal da amostra é aumentada por meio de adição de NaCI, (NFUjz SÜ4 e similares. Em seguida, a amostra é carregada e eluída por meio de redução da concentração de sal. A proteína de impureza, com uma grande diferença na hidrofobicidade é removida por meio de cromatografia hidrofóbica.
3. Cromatografia por filtração em gel [0086]0 meio de cromatografia hidrofóbica compreende, mas sem limitação, Sefacril, Superdex, Sefadex. Por meio de cromatografia de filtração em gel, o sistema de tampão é substituído, ou a amostra é adicionalmente purificada.
4. Cromatografia por afinidade [0087]0 meio de cromatografia por afinidade compreende, mas sem limitação, Colunas de Heparina HP HiTrap™.
5. Filtração por membrana [0088]0 meio de ultrafiltração compreende membranas orgânicas
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19/36 (tais como membranas de polissulfona), membranas inorgânicas (tais como membranas de cerâmica e membranas de metal). A concentração e a purificação podem ser alcançadas por meio de filtração por membrana.
PREPARAÇÃO DE COMPOSIÇÃO DE PREPARAÇÃO DE ENZIMA [0089]A presente invenção também fornece uma composição de preparação de enzima que compreende a cianidrina liase da presente invenção.
[0090]A composição da preparação de enzima da presente invenção pode compreender adicionalmente: ácido cítrico, ácido tartárico e/ou ácido bórico.
MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE S-CIANIDRINA [0091 ]A presente invenção também fornece um método de preparação de S-cianidrina, que compreende as etapas de:
(1) colocar a cianidrina liase com mutação, da presente invenção, em contato com um substrato de reação para realizar uma reação catalítica, produzindo, desse modo, a S-cianidrina;
(2) isolar e purificar o produto de S-cianidrina.
[0092]Em uma modalidade preferencial da invenção, na etapa (1), o substrato da reação é m-fenoxibenzaldeído e a acetona cianidrina (ou cianeto de hidrogênio (ou cianeto/ cianeto de sódio)).
[0093]Em uma modalidade preferencial da invenção, na etapa (1), a temperatura da reação catalítica é 0 a 20 °C.
AS VANTAGENS PRINCIPAIS DA INVENÇÃO SÃO:
(1) a atividade catalítica da S-cianidrina liase mutada, de acordo com a presente invenção, melhorou de forma significativa, em comparação com aquela do tipo selvagem, e a atividade catalítica de alguns mutantes é 10 vezes maior do que aquela do tipo selvagem;
(2) a S-cianidrina liase mutada, de acordo com a presente invenção, pode ser expressa em grandes quantidades na Escherichia coli geneticamente manipulada, o que reduz, desse modo, o custo de preparação.
(3) a S-cianidrina liase mutada, de acordo com a presente invenção, pode ser expressa em alta temperatura (cerca de 2 a 37 °C), o que reduz grandemente o custo de produção e simplifica o processo de fermentação, enquanto a liase expressa em alta temperatura, pelo tipo
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20/36 selvagem e por alguns mutantes, não tem atividade, ou tem atividade muito baixa.
[0094]A invenção é adicionalmente ilustrada por meio dos exemplos específicos a seguir. Deve ser compreendido que esses exemplos têm apenas propósitos ilustrativos, e não pretendem limitar o escopo da invenção. Os métodos experimentais nos exemplos a seguir, que não especificam as condições específicas, são normalmente realizados em condições convencionais, por exemplo, condições descritas em Sambrook. J et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual (traduzido por Huang Peitang et al., Beijing: Science Press, 2002.), ou de acordo com as condições recomendadas pelo fabricante. As porcentagens e as partes são em peso, a menos que seja declarado de outro modo. Os materiais e reagentes experimentais usados nos exemplos a seguir estão comercialmente disponíveis, a menos que especificado de outro modo.
EXEMPLO 1: CONSTRUÇÃO DE UMA BIBLIOTECA DE MUTANTES [0095]Tomando a mutação H103 como exemplo, as etapas de construção da biblioteca de mutantes foram as seguintes:
[0096]0 mutante com saturação no sítio foi realizado em H103, e os iniciadores foram projetados.
[0097]H103-f: 5’GCAGCTGGCGTTTTCNNNAACTCCCTGCTGCCG -3’(SEQ ID NO.3) [0098]H103-r: 5’CGGCAGCAGGGAGTTNNNGAAAACGCCAGCTGC -3’ (SEQ ID NO.4) [0099]A banda-alvo foi amplificada por meio de PCR, com uso do plasmídeo pET21a-meHNL como um modelo. O procedimento se deu conforme a seguir:
| 5 °C | 5 min. | |
| 95 °C | 30 s | |
| 50 °C | 30 s | jso |
| J ciclos | ||
| 72 °C | 5 min. |
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21/36 °C 10 min.
°C [00100]0 produto de PCR foi digerido com Dpn I, a 37 °C, por 2 horas. Depois da reação , a solução digestiva foi transformada em E. coli de célula competente BL21 (DE3). Em seguida, as estirpes foram revestidas em meio LB que continha 100 ug/mL de ampicilina, e cultivadas durante a noite a 37 °C, para se obter uma biblioteca de mutantes.
[00101]A construção da biblioteca de mutantes de outros sítios foi realizada da mesma maneira descrita acima. As sequências de iniciador projetadas para a construção de biblioteca de mutantes de outros sítios são mostradas na tabela a seguir:
TABELA 1
| Númer 0 | Nome de iniciador e sítio de mutação | Sequência de iniciador | SEQ ID NO. |
| 1 | H103-f | GCAGCTGGCGTTTTCNNNAACTCCCTGCTG CCG | 3 |
| 2 | Η103-Γ | CGGCAGCAGGGAGTTNNNGAAAACGCCAG CTGC | 4 |
| 3 | W128-f | GAATCGTTCCCGGACNNNCGTGACACAGAA TAT | 5 |
| 4 | W128-r | ATATTCTGTGTCACGNNNGTCCGGGAACGA TTC | 6 |
| 5 | V2-f | G G AG ATATAC ATATG N N N ACTG C AC ACTTC G TT | 7 |
| 6 | V2-r | AACGAAGTGTG CAGTN N N CATATGTATATCT CC | 8 |
| 7 | L36-f | CACAAAGTTACTGCANNNGACATGGCAGCC AGT | 9 |
| 8 | L36-r | ACTGGCTGCCATGTCNNNTGCAGTAACTTTG TG | 10 |
| 9 | C81-f | CATTGTTGGTGAAAGCNNNGCAGGCCTGAA | 11 |
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| CATTG | |||
| 10 | C81-r | CAATGTTCAGGCCTGCNNNGCTTTCACCAA CAATG | 12 |
| 11 | V94-f | GCTGCTGATCGTTACNNNGACAAAATTGCA GCT | 13 |
| 12 | V94-r | AG CTG CAATTTTGTC N N N GTAAC GATCAG CA GC | 14 |
| 13 | L121-f | CTTACACTGTTGAAAAGNNNCTGGAATCGTT CCCG | 15 |
| 14 | L121 -r | CGGGAACGATTCCAGNNNCTTTTCAACAGT GTAAG | 16 |
| 15 | L122-f | ACTGTTGAAAAGCTGNNNGAATCGTTCCCG GAC | 17 |
| 16 | L122-r | GTCCGGGAACGATTCNNNCAGCTTTTCAAC AGT | 18 |
| 17 | F125-f | AAGCTGCTGGAATCGNNNCCGGACTGGCGT GAC | 19 |
| 18 | F125-r | GTCACGCCAGTCCGGNNNCGATTCCAGCAG CTT | 20 |
| 19 | D127-f | CTGGAATCGTTCCCGNNNGCACGTGACACA GAA | 21 |
| 20 | D127-r | TTCTGTGTCACGTGCNNNCGGGAACGATTC CAG | 22 |
| 21 | R129-f | TCGTTCCCGGACGCANNNGACACAGAATAT TTC | 23 |
| 22 | R129-r | GAAATATTCTGTGTCNNNTGCGTCCGGGAA CGA | 24 |
| 23 | T140-f | ACGTTCACCAACATCNNNGGCGAAACCATC ACT | 25 |
| 24 | Τ140-Γ | AGTGATGGTTTCGCCNNNGATGTTGGTGAA CGT | 26 |
| 25 | M147-f | GAAACCATCACTACCNNNAAACTGGGTTTCG TT | 27 |
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| 26 | Μ147-Γ | AACGAAACCCAGTTTNNNGGTAGTGATGGTT TC | 28 |
| 27 | L149-f | CATCACTACCATGAAANNNGGTTTCGTTCTG CTGC | 29 |
| 28 | L149-r | GCAGCAGAACGAAACCNNNTTTCATGGTAG TGATG | 30 |
| 29 | G165-f | ACCAAATGCACTGATNNNGAATATGAACTGG CA | 31 |
| 30 | G165-r | TG C C AGTTC ATATTC N N N ATC AGTG C ATTTG GT | 32 |
| 31 | V173-f | GAACTGGCAAAAATGNNNATGCGCAAGGGC TCT | 33 |
| 32 | V173-r | AGAGCCCTTGCGCATNNNCATTTTTGCCAGT TC | 34 |
| 33 | K176-f | CAAAAATGGTTATGCGCNNNGGCTCTCTGTT CCAAAAC | 35 |
| 34 | Κ176-Γ | GTTTTGGAACAGAGAGCCNNNGCGCATAAC CATTTTTG | 36 |
| 35 | K199-f | GGCTACGGCTCTATCN N NAAAGTTTATATTT GG | 37 |
| 36 | Κ199-Γ | CCAAATATAAACTTTNNNGATAGAGCCGTAG CC | 38 |
| 37 | K209-f | TGGACCGATCAAGACNNNATATTCCTGCCG GAC | 39 |
| 38 | Κ209-Γ | GTCCGGCAGGAATATNNNGTCTTGATCGGT CCA | 40 |
| 39 | Q216-f | TTCCTGCCGGACTTCNNNCGCTGGCAAATT GCA | 41 |
| 40 | Q216-r | TGCAATTTGCCAGCGNNNGAAGTCCGGCAG GAA | 42 |
| 41 | K224-f | CAAATTGCAAACTACNNNCCGGACAAGGTTT ATC | 43 |
| 42 | Κ224-Γ | GATAAACCTTGTCCGGNNNGTAGTTTGCAAT | 44 |
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24/36 ________________________TTG__ [00102]Em que, N nas sequências do presente pedido, representa
A, T, G ou C.
EXEMPLO 2: TRIAGEM DE ALTO RENDIMENTO [00103]A triagem foi de acordo com as etapas experimentais a seguir:
1. Os clones foram selecionados e inoculados em uma placa 1 de 96 poços (500 pL de meio TB por poço), e cultivadas durante a noite a 30 °C;
2. Os meios foram transferidos para uma nova placa 2 de 96 poços (800 pL de meio TB por poço, 0,15 mM de IPTG), em que 100 pL de meio oriundos da placa 1 de 96 poços foram inoculados na placa 2 de 96 poços, e cultivados durante a noite a 30 °C.
3. A cepa na placa 2 de 96 poços foi coletada, foram adicionados 100 pL de Reagente de Extração de Proteína BugBuster (Novagen). A mistura foi tratada por 30 min., e, em seguida, centrifugada que se obtivesse o sobrenadante.
4. A solução e enzima foi diluída até um múltiplo razoável.
5. A placa de elisa foi preparada com 200 pL de sistema de reação que contém 150 pL de tampão de citrato a 50 mM (que contém 15% de metanol), 5 pL de substrato de SCMB (0,05 g/mL dissolvido em metanol), 5 pL de solução enzimática, e a mistura reagiu por 2 min. Em seguida, 10 mL de Solução I (100 mM de N-clorossuccinimida) foram adicionados de forma imediata, e reagiram por 2 min. Em seguida, 30 mL de Solução II (65 mM de ácido isonicotínico e 125 mM de ácido barbitúrico, que foram dissolvidos em 0,2 M de NaOH) foram adicionados. A leitura foi obtida em um comprimento de onda de 600 nm, depois de 20 min.
6. Com uso do tipo selvagem como sistema de referência, o clone com a maior absorbância, a 600 nm, foi selecionado como o clone mais positivo, e sua atividade enzimática e atividade enzimática específica foram analisadas.
[00104]Ensaio de atividade enzimática: 1 U de atividade enzimática foi definido como a quantidade de enzima exigida para catalisar a produção de 1 pmol de éter aldeído por minuto.
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25/36 [00105]O ensaio de atividade enzimática foi realizado por meio de referência ao método descrito por Selmar (Analytical Biochemistry 166 (1987), p. 208 a 211), com 10 mM de m-fenoxibenzonitrila, 20 uL de metanol, 20 mM de tampão de citrato (pH 5,0) e 10 uL de solução enzimática. A solução de reação acima foi incubada a 25 °C, e a mudança na absorbância a OD 310 nm foi medida dentro de 1 a 5 min. A curva de tempo (min.) e a mudança de absorbância foram retiradas. A inclinação da curva do grupo experimental foi ajustada para ΔΚ, e a inclinação do grupo controle foi zero. Sob as mesmas condições, e sem adição de nenhuma solução enzimática, a mudança na absorbância, em um comprimento de onda de 310 nm, a 25 °C, foi registrada como um grupo de controle. O grupo de controle não deve ter uma mudança na absorbância.
[00106]A inclinação da curva-padrão de concentração do m-oxibenzaldeído foi K. A atividade enzimática foi calculada de acordo com a fórmula:
Δ K 1 ------------- x 77777 x 1000 x 100 x Vezes de diluição K 1000 [00107]Determinação de concentração de proteína: A absorção na OD280 é determinada de acordo com o procedimento-padrão de Nanodrop2000, e a concentração c (mg / mL) de proteína, no lisado, é obtida;
[00108]Cálculo de atividade enzimática específica: atividade enzimática específica (U/rng) = atividade enzimática / concentração de proteína.
[00109]EXEMPLO 3: FERMENTAÇÃO DE ALTA DENSIDADE [00110]A sequência de ácido desoxirribonucleico que codifica a enzima mutante foi sintetizada e ligada aos sítios Ndel e Xhol do vetor pET28a (comprado na Novagen) para obter um plasm ideo de E. coli pET28-MeHNL6 que contém um promotor T7. O plasmídeo foi transformado em E. coli BL21 (DE3) (comprado na Invitrogene), e a cepa correspondente foi obtida em uma placa resistente a Kana. Em seguida, a cepa foi inoculada em meio LB e cultivada durante a noite a 37 °C. A cepa foi conservada com
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20% de glicerol.
[00111 ]A cepa foi inoculada em um frasco de agitação de 1 L que contém 200 mL de meio LB, e cultivada a 37 °C, a 180 a 220 rpm, durante 10 a 16 h. As sementes cultivadas acima foram inoculadas em um meio de fermentação de tanque superior (M9) de 3 L (4 g/L de glicose, 12,8 g/L de hidrogenofosfato dissódico, 3 g/L de di-hidrogenofosfato de potássio, 1 g/L de cloreto de amônio, 0,5 g/L de sulfato de sódio, 0,0152 g/L de cloreto de cálcio, 0,41 g/L de cloreto de magnésio hexa-hidratado) a uma proporção de 10% (v/v). A mistura foi incubada a 25 a 35 °C, a 300 a 800 rpm, com 2 a 6 L/min. de fluxo de ar. Depois de 6 a 10 h de cultura, adicionou-se IPTG para indução durante 10 a 12 h, e adicionou-se um meio suplementar que contém 60% de glicerol, a uma taxa de 5 a 20 ml/h, até ao final da fermentação. Foi adicionado o meio suplementar por várias horas, até que a OD 6oo atingisse 80 a 100. A fermentação parou, e a cepa foi coletada por meio de centrifugação, a 5.000 rpm. A atividade enzimática foi medida depois da lise das cepas. O resultado do ensaio de eletroforese em gel foi conforme esperado.
PREPARAÇÃO DE FERMENTAÇÃO PARA O TIPO SELVAGEM E PARA ALGUNS MUTANTES [00112]Foi constatado que, sob fermentação a alta temperatura (cerca de 25 a 37 °C), o tipo selvagem (SEQ ID NO. 1) e alguns mutantes (tais como o mutante 2) expressos pelas bactérias geneticamente manipuladas têm atividade extremamente baixa, e o tipo selvagem não tem nenhuma atividade substancial.
[00113]Por essa razão, o método de fermentação para o tipo selvagem e alguns mutantes (como o mutante 2) é basicamente o mesmo que o descrito acima, exceto que a temperatura é mantida em um nível baixo (cerca de 12 a 16 °C) durante a fermentação.
EXEMPLO 4: PURIFICAÇÃO DE ENZIMA [00114]A enzima obtida por meio de fermentação pode ser purificada com uso de um método convencional na técnica. A enzima obtida por meio de fermentação também pode ser purificada por meio do seguinte método, por exemplo:
[00115]1 L de caldo de fermentação que contém cepas com
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27/36 sequência do tipo selvagem foi centrifugado (4.000 rpm) para obter 50 g de células. As células foram ressuspensas em 20 mM de tampão de fosfato de sódio (pH 5,5), em uma proporção de 4 mL de tampão por grama de células. As células foram esmagadas com um homogeneizador de alta pressão (com uma pressão de 80 MPa a 100 MPa (800 a 1.000 bar)). A poliacrilamida foi adicionada para floculação (1 a 2%), e o sobrenadante foi coletado depois da centrifugação a 4.000 rpm. O sobrenadante foi concentrado 8 vezes, com uma membrana de ultrafiltração (com uma concentração de proteína de 93 mg/mL), e a atividade enzimática foi de 198 LI/mL.
[00116]1 L de caldo de fermentação que contém cepas com a sequência do mutante 9 foi centrifugado (4.000 rpm) para obter 50 g de células. As células foram ressuspensas em tampão de citrato de potássio 20 mM (pH 5,5), em uma proporção de 4 mL de tampão por grama de células. As células foram esmagadas com um homogeneizador de alta pressão (com uma pressão de 80 MPa a 100 MPa (800 a 1.000 bar)). A poliacrilamida foi adicionada para floculação (1 a 2%), e o sobrenadante foi coletado depois da centrifugação a 4.000 rpm. O sobrenadante foi concentrado 5 vezes, com uma membrana de ultrafiltração (com uma concentração de proteína de 65 mg/mL), e a atividade enzimática foi de 522 U/mL.
[00117]1 L de caldo de fermentação que contém cepas com sequência de mutante 27 foi centrifugado (4.000 rpm) para obter 50 g de células. As células foram ressuspensas em 20 mM de tampão de fosfato de potássio (pH 5,5), em uma proporção de 4 mL de tampão por grama de células. As células foram esmagadas com um homogeneizador de alta pressão (com uma pressão de 80 MPa a 100 MPa (800 a 1.000 bar)). A poliacrilamida foi adicionada para floculação (1 a 2%), e o sobrenadante foi coletado depois da centrifugação a 4.000 rpm. O sobrenadante foi concentrado 5 vezes, com uma membrana de ultrafiltração (com uma concentração de proteína de 69 mg/mL), e a atividade enzimática foi de 687 U/mL.
[00118]1 L de caldo de fermentação que contém cepas com sequência de mutante 55 foi centrifugado (4.000 rpm) para obter 50 g de células. As células foram ressuspensas em 50 mM de tampão citrato de sódio (pH 5,5), em uma proporção de 4 mL de tampão por grama de células.
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As células foram esmagadas com um homogeneizador de alta pressão (com uma pressão de 80 MPa a 100 MPa (800 a 1.000 bar)). A poliacrilamida foi adicionada para floculação (1 a 2%), e o sobrenadante foi coletado depois da centrifugação a 4.000 rpm. O sobrenadante foi concentrado 5 vezes com uma membrana de ultrafiltração (com uma concentração de proteína de 62 mg/mL), e a atividade enzimática foi de 958 ll/mL.
[00119]1 L de caldo de fermentação que contém cepas com sequência de mutante 72 foi centrifugado (4.000 rpm) para obter 50 g de células. As células foram ressuspensas em 20 mM de tampão de tartrato de sódio (pH 5,0), em uma proporção de 4 mL de tampão por grama de células. As células foram esmagadas com um homogeneizador de alta pressão (com uma pressão de 80 MPa a 100 MPa (800 a 1.000 bar)). A polietilenoimina foi adicionada para floculação (1 a 2%), e o sobrenadante foi coletado depois da centrifugação, a 4.000 rpm. O sobrenadante foi concentrado 5 vezes, com uma membrana de ultrafiltração (com uma concentração de proteína de 75 mg/mL), e a atividade enzimática foi de 1.530 Ll/mL.
[00120]1 L de caldo de fermentação que contém cepas com sequência do mutante 113 foi centrifugado (4.000 rpm) para obter 50 g de células. As células foram ressuspensas em 20 mM de citrato de sódio - 20 mM de tampão de fosfato de sódio (pH 5,0), em uma proporção de 4 mL de tampão por grama de células. As células foram esmagadas com um homogeneizador de alta pressão (com uma pressão de 80 MPa a 100 MPa (800 a 1.000 bar)). A polietilenoimina foi adicionada para floculação (1 a 2%), e o sobrenadante foi coletado depois da centrifugação, a 4.000 rpm. O sobrenadante foi concentrado 3 vezes, com uma membrana de ultrafiltração (com uma concentração de proteína de 64 mg/mL), e a atividade enzimática foi de 1.613 U/mL.
[00121]1 L de caldo de fermentação que contém cepas com sequência do mutante 135 foi centrifugado (4.000 rpm) para obter 50 g de células. As células foram ressuspensas em 20 mM de citrato de sódio - 20 mM de tampão fosfato de sódio (pH 5,2), em uma proporção de 4 mL de tampão por grama de células. As células foram esmagadas com um homogeneizador de alta pressão (com uma pressão de 80 MPa a 100 MPa (800 a 1.000 bar)). A polietilenoimina foi adicionada para floculação (1 a
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2%), e o sobrenadante foi coletado depois da centrifugação, a 4.000 rpm. O sobrenadante foi concentrado 3 vezes, com uma membrana de ultrafiltração (com uma concentração de proteína de 55 mg/mL), e a atividade enzimática foi de 1.876 U/mL.
[00122]1 L de caldo de fermentação que contém cepas com a sequência do mutante 149 foi centrifugado (4.000 rpm) para obter 50 g de células. As células foram ressuspensas em 20 mM de tampão de fosfato de potássio (pH 5,5), em uma proporção de 4 mL de tampão por grama de células. As células foram esmagadas com um homogeneizador de alta pressão (com uma pressão de 80 MPa a 100 MPa (800 a 1.000 bar)). A poliacrilamida foi adicionada para floculação (1 a 2%), e o sobrenadante foi coletado depois da centrifugação a 4.000 rpm. O sobrenadante foi concentrado 6 vezes, com uma membrana de ultrafiltração (com uma concentração de proteína de 56 mg/mL) e a atividade enzimática foi de 680 U/mL.
[00123]0s resultados da atividade enzimática específica são mostrados na Figura 1.
[00124]0s resultados do ensaio de atividade enzimática do tipo selvagem e das enzimas mutantes selecionadas, da presente invenção, são apresentados na Tabela 2.
TABELA 2
| Número de Enzima Mutante | Sítio de Mutação | Atividade enzimática |
| 1 | WT | * |
| 2 | H103M, W128A | * |
| 3 | L36A, H103L,W128A | ** |
| 4 | V94E, H103L,W128A | ** |
| 5 | L36C, H103L,W128A | ** |
| 6 | L36Y, H103L,W128A | ** |
| 9 | V94L, H103L,W128A | ** |
| 10 | L36Q, H103L,W128A | ** |
| 13 | C81Y, H103L,W128A | ** |
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30/36
| 18 | V94Q, H103L,W128A | ** |
| 20 | V94H, H103L,W128A | ** |
| 21 | H103L,W128A, V173T | ** |
| 22 | C81Y, H103L, W128A | ** |
| 27 | C81V, H103L, W128A | ** |
| 29 | H103L,W128A, V173I | ** |
| 30 | V94T, H103L,W128A | ** |
| 31 | H103L,W128A, V173C | ** |
| 34 | H103L,W128A, 149A | ** |
| 35 | V94F, H103L,W128A | ** |
| 36 | H103L,W128A, V173A | ** |
| 37 | L36I, H103L,W128A | ** |
| 38 | H103L,W128A, V173S | ** |
| 39 | L36F, H103L,W128A | ** |
| 40 | H103S | ** |
| 41 | C81I, H103L, W128A | *** |
| 42 | V94A, H103L,W128A | *** |
| 43 | V2P,H103L,W128A | *** |
| 44 | V2W,H103L,W128A | *** |
| 45 | V2T,H103L,W128A | *** |
| 46 | V94S,H103L,W128A, K209R | *** |
| 47 | H103L,W128A, V173L,K209C | *** |
| 48 | V94R,H103L,W128A, K209C | *** |
| 49 | H103V | *** |
| 50 | H103L,W128A, G165T | *** |
| 51 | H103L,W128A, V173L,K209S | *** |
| 52 | V2H,H103L,W128A | *** |
| 53 | H103L,W128A, K224T | *** |
| 54 | V2D,H103L,W128A | *** |
| 55 | V94G, H103L,W128A | *** |
| 56 | V2P,C81A H103L,W128A,L149C | *** |
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31/36
| 57 | V2S,H103L,W128A | *** |
| 58 | H103L,W128A, K224A | *** |
| 59 | V2Q,H103L,W128A | *** |
| 60 | H103L,W128A, K199P,K176P | *** |
| 61 | V2R,H103L,W128A | *** |
| 62 | V94R, H103L,W128A, V173L | *** |
| 63 | H103I | *** |
| 64 | H103L,W128A, K199P | *** |
| 65 | H103L,W128A, K176P | *** |
| 66 | V94C, H103L,W128A | *** |
| 67 | H103L,W128A, K224N | *** |
| 68 | H103L,W128A, K224D | *** |
| 69 | V94S, H103L,W128A, V173L | **** |
| 70 | H103L,W128A, K199P,K224P | **** |
| 71 | V2C,H103L,W128A | **** |
| 72 | H103L,W128A | **** |
| 73 | H103L,W128A, K224P | **** |
| 74 | H103L,W128A, V173L | **** |
| 75 | H103L,W128A, K224H | **** |
| 76 | H103L,W128A, K224I | **** |
| 77 | H103L,W128A, K224S | **** |
| 78 | H103L,W128A, K224V | **** |
| 79 | H103L,W128A, G165S | **** |
| 80 | H103L,W128A, K176P,K224P | **** |
| 81 | H103C | **** |
| 82 | H103L,W128A, V173Q | **** |
| 83 | H103L,W128A, K224E | **** |
| 84 | V94S,H103L,W128A, K209C | **** |
| 85 | H103L,W128A, K224P | **** |
| 86 | H103L,W128A, T140R | ***** |
| 87 | H103L | ***** |
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32/36
| 88 | H103L,W128A, T140S | ***** |
| 89 | H103L,W128A, T140W | ***** |
| 90 | H103L,W128A, T140D | ***** |
| 91 | V94S,H103L,W128A, G165D | ***** |
| 92 | H103L,W128A, T140I | ***** |
| 93 | H103L,W128A, T140K | ***** |
| 94 | H103L,W128A, G165P | ***** |
| 95 | H103L,W128A, T140G | ***** |
| 96 | H103L,W128A, T140H | ***** |
| 97 | V94R, H103L,W128A | ***** |
| 98 | H103L,W128A, K209F | ***** |
| 99 | H103L,W128A, G165D | ***** |
| 100 | V94R,H103L,W128A, K209R | ***** |
| 101 | V94R,H103L,W128A, G165D | ***** |
| 102 | V94S, H103L,W128A | ***** |
| 103 | H103L,W128A, K209L | ***** |
| 104 | C81A, H103L,W128A | ***** |
| 105 | H103L,W128A, K209M | ***** |
| 106 | H103L,W128A, K209G | ***** |
| 107 | H103L,W128A, K209A | ***** |
| 108 | H103L,W128A, K209S | ***** |
| 109 | H103L,W128A, K209C | ***** |
| 110 | C81A,H103L,W128A, K224P | ***** |
| 111 | C81A, H103L, W128A | ***** |
| 112 | H103L,W128A, K209R | ***** |
| 113 | V2I, H103L, W128A | ***** |
| 114 | C81 A,H103L,W128A, K176P | ***** |
| 115 | V2A, C81 A, H103L, W128A, L149C | ***** |
| 116 | L36A, H103L,W128A | ***** |
| 117 | V2G,C81A,H103L,W128A | ****** |
| 118 | V2L,C81A,H103L,W128A | ****** |
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33/36
| 119 | V2P,C81A,H103L,W128A | ****** |
| 120 | V2H,C81A,H103L,W128A | ****** |
| 121 | V2R,C81A,H103L,W128A | ****** |
| 122 | V2M,C81A,H103L,W128A | ****** |
| 123 | V2S,C81A,H103L,W128A | ****** |
| 124 | V2C,C81A,H103L,W128A | ****** |
| 125 | V2W, C81 A, H103L, W128A | ****** |
| 126 | V2T,C81A,H103L,W128A | ****** |
| 127 | V2Q,C81A,H103L,W128A | ****** |
| 128 | V2A,C81A,H103L,W128A | ****** |
| 129 | C81 A, H103L, W128A, L149P | ****** |
| 130 | C81A,H103L,W128A,L149l | ****** |
| 131 | C81 A, H103L, W128A, L149C | ****** |
| 132 | C81A,V94P,H103L,W128A,K176P | ****** |
| 133 | C81A,94R,H103L,W128A,L149P | ****** |
| 134 | C81 A,94K, H103L, W128A, L149P | ****** |
| 135 | V2P,C81A, H103L,W128A,L149C | ****** |
| 136 | H103I, W128A | **** |
| 137 | H103V, W128A | **** |
| 138 | H103C, W128A | **** |
| 139 | H103S, W128A | **** |
| 140 | H103I, W128Y | ** |
| 141 | H103L, W128N | *** |
| 142 | H103L,W128G | *** |
| 143 | H103L, W128Y | *** |
| 144 | H103I, W128N | *** |
| 145 | H103I, W128G | *** |
| 146 | H103C, W128V | *** |
| 147 | H103C, W128G | *** |
| 148 | H103C, W128Y | *** |
| 149 | H103M, W128L | *** |
Observação: * representa uma atividade específica entre 0 e 3,0
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U/mg; ** representa uma atividade específica entre 3,0 e 10,0 U/mg; *** representa uma atividade específica entre 10,0 e 18,0 U/mg; **** representa uma atividade específica entre 18,0 a 26,0 U/mg; ***** representa uma atividade específica entre 26,0 a 34,0 U/mg; ****** representa uma atividade específica entre de > 34,0 U/mg.
EXEMPLO 5: TRANSFORMAÇÃO BIOCATALÍTICA DE S-CIANIDRINA E MÉTODO DE DETECÇÃO [00125]A transformação biocatalítica da S-cianidrina foi realizada por meio de adição de 20 mL de cianidrina liase, 10 mL de aldeído m-PBAId, 20 mL de éter metil-terc-butílico e 3 g de HCN a um frasco de reação de 100 mL, e por meio de agitação e de reação a 15 °C.
[00126]0 método de detecção foi conforme a seguir:
[00127]A reação foi monitorada por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Foram usadas água e acetonitrila (45:55) como fase móvel. A coluna cromatográfica foi a coluna de fase reversa de ODS-18. Foi usada cromatografia líquida de alta eficiência Shimadzu LC-15C. Foi detectada absorção de UV a 210 nm. O sistema de reação foi diluído com água e acetonitrila (45:55), em seguida, injetado e detectado depois da centrifugação e filtração com uma membrana de náilon. No sistema de reação preferencial da presente invenção, a detecção do progresso da reação por meio de HPLC foi conforme a seguir: após 1 hora de reação, o m-fenoxibenzaldeído foi detectado a 17,3 min., e cianidrina de configuração S foi detectada a 17,5 min.
[00128]A pureza quiral foi analisada por cromatografia líquida Agilent 1260, sob as condições da coluna Chiralpak AD-H, n-hexano:etanol (0,1% de DEA) = 90:10, 0,8 mL/min., e o comprimento de onda de detecção foi de 220 nm. Depois da comparação, o produto de configuração S preparado pela invenção é idêntico à substância-padrão alvo (adquirida da Jiangxi Keyuan Biopharmaceutical Co., Ltd.).
[00129]Reações catalíticas típicas e os resultados de detecção envolvidos na presente invenção são exemplificados conforme a seguir:
1. Tipo Selvagem [00130]20 mL de cianidrina liase (50 mg/mL, tipo selvagem, SEQ ID NO. 1), 10 mL de aldeído m-PBAId, 20 mL de éter metil-terc-butílico e 3 g
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35/36 de HCN foram adicionados a um frasco de reação de 100 ml_, em seguida, foram agitados e reagiram a 15 °C, durante 2 horas. O progresso da reação foi amostrado e detectado a cada 30 minutos. O valor de ee foi de 95,9%.
[00131)2. Mutante 9 [00132]20 mL de concentração de cianidrina liase (50 mg/mL), 10 mL de aldeído m-PBAId, 20 mL de ácido terc-butílico e 3 g de HCN, com um frasco de 100 mL, em seguida, foram agitados e reagiram a 15 °C, durante 2 horas. O progresso da reação foi amostrado e detectado a cada 30 minutos. O valor de ee foi de 99,5%.
[00133)3. Mutante 27 [00134]20 mL de concentração de cianidrina liase (50 mg/mL), 10 mL de aldeído m-PBAId, 20 mL de ácido terc-butílico e 3 g de HCN, com um frasco de 100 mL, em seguida, foram agitados e reagiram a 15 °C, durante 2 horas. O progresso da reação foi amostrado e detectado a cada 30 minutos. O valor de ee foi 97,7%.
[00135]4. Mutante 55 [00136]20 mL de cianidrina liase concentrada (50 mg/mL), 10 mL de aldeído m-PBAId, 20 mL de éter metil-terc-butílico e 4,5 g de acetona cianidrina foram adicionados a um frasco de reação de 100 mL, em seguida, foram agitados e reagiram a 15 °C, por 2 horas. O progresso da reação foi amostrado e detectado a cada 30 minutos. O valor de ee foi de 98,1%.
[00137)5. Mutante 72 [00138]20 mL de cianidrina liase concentrada (50 mg/mL), 10 mL de aldeído m-PBAId, 20 mL de éter metil-terc-butílico, 5 g de NaCN e 1 mL de ácido sulfúrico concentrado foram adicionados a um frasco de reação de 100 mL, em seguida, foram agitados e reagiram a 15 °C, durante 2 horas. O progresso da reação foi amostrado e detectado a cada 30 minutos. O valor de ee foi de 97,8%.
6. Mutante 113 [00139]20 mL de cianidrina liase concentrada (50 mg/mL, mutante SEQ ID NO. 113), 10 mL de aldeído m-PBAId, 20 mL de éter metil-terc-butílico, 5 g de KCN e 1 mL de ácido sulfúrico concentrado para um frasco de reação de 100 mL, em seguida, foram agitados e reagiram a 15 °C durante 2 horas. O progresso da reação foi amostrado e detectado a
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36/36 cada 30 minutos. O valor de ee foi de 99,1 %.
7. Mutante 135 [00140]20 mL de cianidrina liase concentrada (50 mg/mL, mutante SEQ ID NO. 135), 10 mL de aldeído m-PBAId, 20 mL de éter metil-terc-butílico, 3 g de HCN e 1 mL de ácido sulfúrico concentrado para um frasco de reação de 100 mL, em seguida, foram agitados e reagiram 15 °C, durante 2 horas. O progresso da reação foi amostrado e detectado a cada 30 minutos. O valor de ee foi de 98,9%.
8. Mutante 149 [00141 ]20 mL de concentração de cianidrina liase (50 mg/mL), 10 mL de aldeído m-PBAId, 20 mL de ácido terc-butílico e 3 g de HCN, com um frasco de 100 mL, em seguida, foram agitados e reagiram a 15 °C, durante 2 horas. O progresso da reação foi amostrado e detectado a cada 30 minutos. O valor de ee foi de 99,1 %.
[00142]0s resultados de monitoramento da reação catalítica são mostrados na Figura 2.
[00143]Todas as literaturas mencionadas no presente pedido são incorporadas ao presente documento a título de referência, como se cada uma fosse incorporada de forma individual, a título de referência. Além disso, também deve ser compreendido que, após a leitura dos ensinamentos acima, da presente invenção, as pessoas versadas na técnica podem fazer várias mudanças ou modificações, cujos equivalentes se encontram no escopo das reivindicações, conforme definido nas reivindicações anexas.
Claims (2)
1. S-cianidrina liase mutada, CARACTERIZADA pelo fato de que é mutada em um ou mais sítios selecionados a partir do grupo que consiste em: resíduo de aminoácido de posição 103, resíduo de aminoácido de posição 128, resíduo de aminoácido de posição 2, resíduo de aminoácido de posição 81, resíduo de aminoácido de posição 149, resíduo de aminoácido de posição 94 e resíduo de aminoácido de posição 176, em que os resíduos de aminoácido são numerados conforme mostrado na SEQ ID NO. 1.
2. S-cianidrina liase mutada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que os sítios de mutação da S-cianidrina liase mutada compreendem resíduo de aminoácido de posição 103; preferencialmente, o resíduo de aminoácido de posição 103 é mutado de H para L, I, V, C, S ou M; mais preferencialmente, o resíduo de aminoácido de posição 103 é mutado de H para L.
3. S-cianidrina liase mutada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que sítios de mutação da S-cianidrina liase mutada compreendem adicionalmente resíduo de aminoácido de posição 128; preferencialmente, o resíduo de aminoácido de posição 128 é mutado de W para A, N, L, V, G ou Y, mais preferencialmente, o resíduo de aminoácido de posição 128 é mutado de W para A; e/ou os sítios de mutação da S-cianidrina liase mutada compreendem adicionalmente resíduo de aminoácido de posição 2; preferencialmente, o resíduo de aminoácido de posição 2 é mutado de V para P, L, D, I, G, H, R, M, S, C, W, T, Q ou A; e / ou os sítios de mutação da S-cianidrina liase mutada compreendem adicionalmente resíduo de aminoácido de posição 81; preferencialmente, o resíduo de aminoácido de posição 81 é mutado de C para A, V ou I; e/ou os sítios de mutação da S-cianidrina liase mutada compreendem adicionalmente resíduo de aminoácido da posição 149; preferencialmente, o resíduo de aminoácido de posição 149 é mutado de L para I, C, A ou P; e/ou os sítios de mutação da S-cianidrina liase mutada compreendem adicionalmente resíduo de aminoácido da posição 94; preferencialmente, o resíduo de aminoácido de posição 94 é mutado de V para P, R, S, K; e/ou
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2/2 os sítios de mutação da S-cianidrina liase mutada compreendem adicionalmente resíduo de aminoácido de posição 176; preferencialmente, ο resíduo de aminoácido de posição 176 é mutado de K para P.
4. Molécula de polinucleotídeos, CARACTERIZADA pelo fato de que codifica a S-cianidrina liase mutada, conforme definida na reivindicação 1.
5. Vetor, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico, conforme definida na reivindicação 4.
6. Célula hospedeira, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o vetor, conforme definido na reivindicação 5, ou possui a molécula de ácido nucleico, conforme definida na reivindicação 4, integrada ao seu genoma.
7. Método de preparação da S-cianidrina liase mutada, conforme definida na reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de:
(i) cultivar a célula hospedeira, conforme definida na reivindicação 6, sob condições adequadas para expressar a cianidrina liase mutada; e (ii) isolar a cianidrina liase mutada.
8. Preparação de enzima, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende a S-cianidrina liase com mutação, conforme definida na reivindicação 1.
9. Uso da S-cianidrina liase mutada, conforme definida na reivindicação 1, ou da preparação enzimática, conforme definida na reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que é para preparação de produto de S-cianidrina com atividade óptica.
10. Método para prepararação de S-cianidrina, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de:
(1) colocar em contato a cianidrina liase mutada, conforme definida na reivindicação 1, com um substrato de reação para realizar uma reação catalítica, desse modo produzindo a S-cianidrina;
(2) isolar e purificar o produto de S-cianidrina.
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