CN106032543A

CN106032543A - 一种制备s-氰醇的方法

Info

Publication number: CN106032543A
Application number: CN201510498174.XA
Authority: CN
Inventors: 田振华; 程占冰; 孙传民
Original assignee: NANJING ABIOCHEM BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Yikelai Biotechnology (Group) Co.,Ltd.
Priority date: 2015-08-13
Filing date: 2015-08-13
Publication date: 2016-10-19
Anticipated expiration: 2035-08-13
Also published as: CN106032543B

Abstract

本发明提供了一种制备S-氰醇的方法。通过将氰醇裂解酶进行固定化，然后在纯有机溶剂中催化底物反应制备S-氰醇。本发明人对采用固定化氰醇裂解酶制备S-氰醇的方法进行了优化，获得了优化的反应条件，实验结果表明，本发明的优化的制备S-氰醇方法能够高效的制备S-氰醇，产物收率高，固定的氰醇裂解酶能够重复利用，而且工艺稳定。

Description

一种制备S-氰醇的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种氰醇裂解酶及其应用。

背景技术

氰醇裂解酶是一种在化工生产中非常有用的工业用酶，其天然活性是催化氰醇的裂解并释放出氢氰酸。氰醇裂解酶可以催化逆反应，即HCN与醛酮的加成，得到具有光学活性的α-氰醇产物。

天然的S-氰醇裂解酶存在于橡胶、木薯和高粱等少数几种植物组织中，丰度低，纯化难度大。1995年，Wajant采用五步纯化法从木薯中分离得到了木薯氰醇裂解酶MeHNL(Plant Sci.,1995,108,1)；White等人采用三步法从木薯叶中提取了MeHNL，采用盐析和透析的方式得到了酶液，但是应用于化学催化的立体选择性不高(Plant Physiol 1998,116,1219)。来源于木薯(Manihotesculenta)的氰醇裂解酶(MeHNL)是一种S-氰醇裂解酶，已有文献报道将MeHNL用于催化S-型手性氰醇的化学合成，ee值>99％，具有重要的应用价值，例如S-间苯氧基苯甲醛氰醇是新型菊酯类农药的通用中间体。1993年，Wajant等人报道了编码MeHNL的cDNA序列和蛋白序列。

目前的制备S-氰醇的方法产物效率低下，酶利用率低，很难进行产业化的应用，因此本领域技术人员致力于开发制备效率高、酶利用率高，工艺简单适合进行大规模工业化生产的制备S-氰醇的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种氰醇裂解酶、其制备方法及应用。

本发明提供了一种制备S-氰醇的方法，包括步骤：

(1)制备固定化的氰醇裂解酶；

(2)将所述固定化的氰醇裂解酶与反应底物接触，进行催化反应，从而生成所述S-氰醇；

(3)分离并纯化所述S-氰醇产物。

在另一优选例中，所述步骤(1)中，所述固定化的氰醇裂解酶选自下组：氰醇裂解酶的交联酶聚集体(CLEA，氰醇裂解酶酶分子之间发生交联凝集成网状结构，使之不溶于水从而形成固定化氰醇裂解酶)、吸附剂吸附的氰醇裂解酶(优选地，所述吸附剂包括活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等)。

在另一优选例中，所述步骤(1)中固定化的氰醇裂解酶的制备方法如下：

(a)向氰醇裂解酶水溶液中加入戊二醛至终浓度5-15％(v/v)；

(b)向步骤(a)获得的溶液中加入沉淀剂，然后收集沉淀，即获得所述固定化的氰醇裂解酶(氰醇裂解酶的交联酶聚集体)。

在另一优选例中，所述步骤(b)中，所述沉淀剂为硫酸铵，加入硫酸铵固体至30％-50％(w/v)终浓度，优选为35％-40％(w/v)终浓度，最优选为36％(w/v)终浓度。

在另一优选例中，所述步骤(a)中，加入戊二醛至终浓度10％(v/v)。

在另一优选例中，所述沉淀剂为PEG3000，加入PEG3000至10％-30％(w/v)终浓度，优选为15％-25％(w/v)终浓度，最优选为20％(w/v)终浓度。

在另一优选例中，所述步骤(2)中，所述反应底物为间苯氧基苯甲醛、和丙酮氰醇(或，氰氢酸)；优选地，丙酮氰醇的浓度是间苯氧基苯甲醛浓度的2倍。

在另一优选例中，所述步骤(2)中，反应的温度为0℃-40℃，优选为10℃-35℃，更优选地为15-25℃，如21℃。

在另一优选例中，所述步骤(2)中，将所述底物溶于MTBE中，加入所述固定化的氰醇裂解酶进行催化反应。

在另一优选例中，所述步骤(2)中，反应体系为MTBE有机相；反应条件为：固定化的氰醇裂解酶为催化剂，MTBE为溶剂，底物为间苯氧基苯甲醛，丙酮氰醇(或，氰氢酸)，15℃-25℃(优选为20℃)反应3-5小时(优选为4小时)，搅拌速度为400-500rpm；反应体系中间苯氧基苯甲醛浓度为0.1摩尔/升-1.2摩尔/升(优选为0.5摩尔/升)，丙酮氰醇浓度为0.2摩尔/升－2摩尔/升(优选为1.0摩尔/升)，而且丙酮氰醇的浓度是间苯氧基苯甲醛浓度的1.5-3倍(优选为2倍)。

在另一优选例中，所述氰醇裂解酶为天然氰醇裂解酶或重组氰醇裂解酶(包括突变的氰醇裂解酶)。

在另一优选例中，所述氰醇裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.:5或SEQ IDNO.:1所示。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1A显示了实施例1中PCR扩增产物的凝胶电泳图谱。

图1B显示了本发明突变的氰醇裂解酶的凝胶电泳图谱。

图2显示催化活性测定曲线。

图3显示了本发催化反应的HPLC检测结果。

图4显示了本发明所构建的质粒图谱。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种制备S-氰醇的方法，通过将氰醇裂解酶进行固定化，然后在纯有机溶剂中催化底物反应制备S-氰醇。本发明人对采用固定化氰醇裂解酶制备S-氰醇的方法进行了优化，获得了优化的反应条件，实验结果表明，本发明的优化的制备S-氰醇方法能够高效的制备S-氰醇，产物收率高，固定的氰醇裂解酶能够重复利用，而且工艺稳定。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

氰醇裂解酶

氰醇裂解酶(Hydroxynitrile lyase)主要来源于橡胶、木薯和高粱等少数几种植物组织。主要包括：木薯氰醇裂解酶(MeHNL)、漆树氰醇裂解酶(HbHNL)、杏仁氰醇裂解酶(PaHNL)。

在本发明优选的实施方式中，所述氰醇裂解酶为木薯氰醇裂解酶。

在本发明优选的实施方式中，优选地木薯氰醇裂解酶野生型序列如下：

本发明还提供了一种突变型的氰醇裂解酶，该突变型的氰醇裂解酶特别适合用于本发明的制备S-氰醇的方法。使用该突变型的氰醇裂解酶，与野生型酶相比，产物收率更高，而且更适于固定化酶的可重复利用。

在本发明的优选的实施方式中，所述突变的氰醇裂解酶的序列如下：

氰醇裂解酶基因序列优化

在本发明中，提供了优化的、特别适合在大肠杆菌细胞中表达的氰醇裂解酶蛋白的核酸编码序列。

本发明人选用大肠杆菌偏好密码子，在不改变其氨基酸序列的前提下对氰醇裂解酶的DNA序列进行了优化。然而，本发明人发现，仅依据密码子频率获得的优化序列并不完全适合在大肠杆菌中表达。因此本发明人进行了二次优化，其中包括消除不利于表达的二级结构(如发夹结构)，改变基因中A+T组成、改变G+C含量等。

经过大量测试和筛选，本发明人在众多优化序列中获得了一个特别优化的氰醇裂解酶编码序列。所述优化的氰醇裂解酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，

在本发明的一个优选实施方式中，编码本发明的突变型的氰醇裂解酶的多核苷酸序列如下：

载体和宿主细胞

本发明还提供了一种包含本发明的优化的氰醇裂解酶基因的载体，以及含所述载体的宿主细胞。

在本发明的一个优选例中，所述述载体具有在大肠杆菌(更佳地在大肠杆菌BL21(DE3)菌株)中表达的能力。

本领域的普通技术人员可以使用的常规方法获得本发明的优化的氰醇裂解酶基因序列，例如全人工合成或PCR法合成。一种优选的合成法为不对称PCR法。不对称PCR法是用不等量的一对引物，PCR扩增后产生大量的单链DNA(SSDNA)。这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，其比例一般为50-100∶1。在PCR反应的最初10-15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明的多核苷酸序列可以通过常规的重组DNA技术，表达或生产目的蛋白，包括步骤：

(1)用编码本发明蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞，较佳地大肠杆菌细胞；

(2)在合适的培养基中培养宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明蛋白的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体，优选市售的载体：pET28。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。

本发明还提供的重组载体，其包含本发明的经过优化的MeHNL DNA序列。在优选的实施方式中，所述重组载体的启动子下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。需要表达目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点，从而可操作地连接目的基因与启动子。

在另一优选的实施方式中，所述重组载体在5'到3'方向上包括：启动子，目的基因和终止子。如果需要，所述重组载体还可以包括以下元件：蛋白纯化标签；3'多聚核苷酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；选择标记(抗生素抗性基因、荧光蛋白等)；增强子；或操作子。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述重组载体包括色氨酸启动子Trp2，优选地，其序列如下：

CCATGGGCCGACATCATAACGGTTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTAACTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTATGTCGACGGCCGACATCATAACGGTTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTAACTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTATCGATCATATG，SEQ ID NO.:6。

用于制备重组载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。表达载体可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以被采用。

本领域普通技术人员可以采用熟知的方法构建含有本发明启动子和/或目的基因序列的载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。

本发明的表达载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主转录目的RNA或表达目的蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、链霉菌属、农杆菌：或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，可以用CaCl₂法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法(如显微注射、电穿孔、脂质体包装等)。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。

术语“可操作连接”是指将准备转录表达的目的基因以一种本领域的常规方式连接到它的控制序列以被表达。

工程菌的培养和目的蛋白发酵生产

在获得工程细胞后，便可在适合的条件下培养工程细胞，表达本发明的基因序列所编码的蛋白。根据宿主细胞的不同，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基，在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。工程细胞可以是快速利用甲醇型(Mut⁺)或慢速利用甲醇型(Mut^s)。

在本发明中，可采用常规的发酵条件。代表性的条件包括(但并不限于)：

(a)就温度而言，氰醇裂解酶的发酵及诱导温度保持在25-35℃；

(b)就诱导期的pH值而言，诱导期pH控制在3-9；

(c)就溶氧(DO)而言，DO控制在20-90％，溶氧的维持可以用氧气/空气混合气体的通入来解决；

(d)就补料而言，补料种类宜包括甘油、甲醇、葡萄糖等碳源，可单独补料或混合补料；

(e)就诱导期IPTG浓度而言，常规诱导浓度都可用于本发明，通常iptg浓度控制在0.1-1.5mM；

(f)就诱导时间而言，没有特别限制，通常为2-20小时，较佳地为5-15小时。

本发明的目的蛋白氰醇裂解酶存在大肠杆菌细胞胞内，通过离心机收集宿主细胞，然后通过高压、机器力、酶解细胞被或其他细胞破碎方法破碎宿主细胞，释放重组蛋白，优选的是高压法。宿主细胞裂解液可通过盐析、超滤等方法进行初步纯化后再进行层析纯化，也可直接进行层析纯化。

层析技术包括阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析、亲和层析等技术。常用的层析方法包括：

1.阴离子交换层析：

阴离子交换层析介质包括(但不限于)：Q-Sepharose、DEAE-Sepharose。如果发酵样品的盐浓度较高，影响与离子交换介质的结合，则在进行离子交换层析前需降低盐浓度。样品可以用稀释、超滤、透析、凝胶过滤层析等手段进行平衡缓冲液的更换，直至与对应的离子交换柱平衡液系统相似，然后上样，进行盐浓度或pH的梯度洗脱。

2.疏水层析：

疏水层析介质包括(但不限于)：Phenyl-Sepharose、Butyl-Sepharose、Octyle-Sepharose。样品通过添加NaCl、(NH₄)₂SO₄等方式提高盐浓度，然后上样，通过降低盐浓度方法洗脱。通过疏水层析除去疏水性有较大差异的杂蛋白。

3.凝胶过滤层析

疏水层析介质包括(但不限于)：Sephacryl、Superdex、Sephadex类。通过凝胶过滤层析更换缓冲体系，或进一步精纯。

4.亲和层析

亲和层析介质包括(但不限于)：HiTrap^TM Heparin HP Columns。

固定化的氰醇裂解酶

本发明中的术语“固定化的氰醇裂解酶”是指，用物理或化学方法处理水溶性的氰醇裂解酶使之变成不溶于水或固定于固相载体的但仍具有酶活性的氰醇裂解酶衍生物。

在本发明中，优选地固定化的氰醇裂解酶的制备方法包括：

吸附法

利用各种吸附剂将氰醇裂解酶或含氰醇裂解酶菌体吸附在其表面上而使酶固定的方法。通常有物理吸附法和离子吸附法。

常用吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。

采用吸附法固定酶，其操作简便、条件温和，不会引起酶变性或失活，且载体廉价易得，可反复使用。

载体结合法

最常用的是共价结合法，即氰醇裂解酶的非必需基团通过共价键和载体形成不可逆的连接。在温和的条件下能偶联的蛋白质基团包括：氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基。参加和载体共价结合的基团，不能是酶表现活力所必需的基团。

交联法

依靠双功能团试剂使氰醇裂解酶分子之间发生交联凝集成网状结构，使之不溶于水从而形成固定化酶。本发明中优选采用的双功能团试剂有戊二醛、顺丁烯二酸酐等。酶蛋白的游离氨基、酚基、咪唑基及巯基均可参与交联反应。

交联酶聚集体(CLEA)是指酶在某些盐、有机溶剂或非离子聚合物存在下形成的一种稳定的超分子结构，再经过交联即成为具有高活性、高稳定性的交联酶聚集体(CLEAs)。其原理是向未经高度纯化的蛋白质溶液中加入盐、有机溶剂、非离子聚合物等诱导蛋白质分子物理聚集，通过非共价键形成超分子结构，不会破坏蛋白质分子原有的三维结构。

包埋法

氰醇裂解酶被裹在凝胶的细格子中或被半透性的聚合物膜包围而成为格子型和微胶囊型两种。包埋法制备固定化氰醇裂解酶除包埋水溶性酶外还常包埋细胞，制成固定化细胞，例如可用明胶及戊二醛包埋具有氰醇裂解酶的菌体，在本文中包含术语“固定化的氰醇裂解酶”内。

本发明中优选地制备固定化的氰醇裂解酶的方法如下：

取含有氰醇裂解酶的水溶液，加入硫酸铵固体至终浓度50％-70％(w/v)(优选为约60％，可以为55％、65％)，冰浴搅拌，离心收集沉淀。冰浴搅拌下，将蛋白硫酸铵沉淀加入5％-20％(v/v)(优选为优选地为8％-15％(v/v)，最优选地为约11％(v/v)，可以为10％(v/v))戊二醛的水溶液，离心收集沉淀，即可获得固定化的氰醇裂解酶。

制备酶制剂组合物

本发明还提供了一种酶制剂组合物，该酶制剂组合物中包含本发明的氰醇裂解酶。

本发明的酶制剂组合物还可以包含：柠檬酸、和/或乙酸。

S-氰醇的制备方法

本发明还提供了一种S-氰醇的制备方法，所述方法包括步骤：

(1)将本发明的突变的氰醇裂解酶与反应底物接触，进行催化反应，从而生成所述S-氰醇；

(2)分离并纯化所述S-氰醇产物。

在本发明优选地实施方式中，所述步骤(1)中，所述反应底物为间苯氧基苯甲醛、和丙酮氰醇(或，氰氢酸)。

在本发明优选地实施方式中，所述步骤(1)中，催化反应的温度为0-20℃。

本发明优选的反应体系为MTBE有机相；反应条件为：CLEA固定化酶为催化剂，MTBE为溶剂，底物为间苯氧基苯甲醛，丙酮氰醇(或，氰氢酸)，15℃-25℃(优选为20℃)反应3-5小时(优选为4小时)，搅拌速度为400-500rpm。反应体系中间苯氧基苯甲醛浓度为0.1摩尔/升-1.2摩尔/升(优选为0.5摩尔/升)，丙酮氰醇浓度为0.2摩尔/升－2摩尔/升(优选为1.0摩尔/升)，而且丙酮氰醇的浓度是间苯氧基苯甲醛浓度的1.5-3倍(优选为2倍)。

本发明的主要优点在于：

(1)采用本发明的方法制备S-氰醇产物转化率能够达到99％以上，重复利用5次后，转化率仍然能够达到95％以上。

(2)本发明的方法中使用本发明的突变的氰醇裂解酶，催化反应活性远高于野生型的氰醇裂解酶，是野生型的两倍左右。

(3)采用本发明的方法制备S-氰醇，周期短，成本低，适用于工业化生产。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1突变体的构建

根据Wajant报道的MeHNL的蛋白序列1(SEQ ID NO.:1)，根据大肠杆菌的密码子偏好性，合成了MeHNL DNA序列2(SEQ ID NO.:2)，克隆至质粒pET28(购自Invitrogene公司)的NdeI-HindIII位点。以该质粒为模板，设计引物，见序列3和序列4。使用随机诱变试剂盒，通过改变MnSO₄浓度来进行多个反应，从而将1至3个点突变引入MeHNL基因，使MeHNL酶氨基酸序列中1-3个氨基酸被替换。为扩增编码MeHNL酶，分别以引物SEQ ID No.3和SEQ ID No.4作为正向和反向引物。两个引物都含有与使用Gateway Technology通过定点重组克隆获得的PCR扩增MeHNL基因片段相容的位点。PCR扩增产物的凝胶电泳图谱如图1所示，获得扩增产物与预期相符。

易错PCR扩增使用下述温度程序：94℃2min，94℃30s和68℃1min的25个循环，接着68℃10min。首先将易错PCR片段克隆进pDONR载体(购自Invitrogene公司)，制备大规模pENTR(购自Invitrogene公司)质粒文库，起始超过20,000个菌落。然后以pDEST14为载体，将pENTR入门质粒文库构建为表达文库。然后将表达文库转入化学感受态E.coil BL21 Star(DE3)(购自Invitrogene公司)，用于表达突变的MeHNL基因。

转化大肠杆菌JM109(DE3)，得到的Kana抗性的转化子，接种至LB培养基在37℃进行培养。OD600＝0.6-1.0之间时，加入IPTG至终浓度0.1mM，降温至25-30℃，继续培养16小时，4000rpm离心收集菌体。

酶活测定：参考Selmar报道的方法(Analytical Biochemistry 166(1987)，208-211)，间苯氧基苯甲醛10mM，甲醇20uL，20mM柠檬酸缓冲液(pH5.0)，丙酮氰醇50mM，粗酶液10uL。上述反应液于25度温育，上述反应液于25度温育，分别在1-5min测定250nm的吸光度变化。每分钟内催化产生1umole间苯氧基苯甲醛所需要的酶量定义为1个酶活单位。变化速率最快的即为酶活最高的突变体。

检测结果如图2所示，■为突变体，▲为野生型，◆为对照试验(不加酶)。突变体酶活/野生型酶活＝(0.2299-0.086)/(0.1577-0.086)*100％＝200.6％。

从图中可以看出突变体的活性要显著高于野生型的活性，催化活性为野生型的200％。测序获得该高活性的突变型为序列5(SEQ ID NO.:5)。

本实施例中所用引物序列如下：

正向引物：5’-GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTT CGA AGGAGA TAG AAC CAT GGT GAC CGC CCA TTT C-3’ SEQ ID NO.:3；

反向引物：5’-GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC TTA AGCATA AGC ACG GCC-3’ SEQ ID NO.:4。

实施例2菌种构建和高密度发酵

合成含有序列6(SEQ ID NO.:6)的色氨酸启动子，并连接到pET28a的NcoI和NdeI位点，然后分别将实施例1中的序列1和5的编码多核苷酸连接到前述的NdeI-XhoI位点，得到含有串联色氨酸启动子的大肠杆菌质粒pTrp2-MeHNL1和pTrp2-MeHNL5(质粒图谱如图4所示)。将质粒转化大肠杆菌JM109(购自Invitrogene公司)，在Kana抗性平板上得到相应的菌种，接种到LB培养基中，37℃过夜培养，用20％甘油保存菌种。

将菌种接种于装有200mL LB培养基的1L摇瓶中，于37℃，180-220rpm培养10-16h。将上述培养好的种子按10％(v/v)的比例接种于3L上罐发酵培养基(M9)中(葡萄糖4g/L，磷酸氢二钠12.8g/L，磷酸二氢钾3g/L，氯化铵1g/L，硫酸钠0.5g/L，氯化钙0.0152g/L，六水氯化镁0.41g/L。)，在25-35℃，300-800rpm，空气流量2-6L/min的条件下培养。培养6-10h后，以5-20mL/h的速率流加含60％甘油的补料培养基，持续至发酵结束。流加补料培养基数小时至OD₆₀₀达到80-100时，放罐，5000rpm离心收集菌体。菌体裂解后测定酶活，分别为73U/mg粗蛋白和143U/g粗蛋白。凝胶电泳检测与预期相符。

实施例3MeHNL的固定化(交联酶聚集体，CLEA)

方案1：分别取含有序列1和序列5的大肠杆菌80g湿菌体，重悬于260mL柠檬酸缓冲液(50mM，pH 5.5)，超声破菌，14000rpm离心30min收取上清液，加入戊二醛至终浓度10％，搅拌下加入硫酸铵固体至终浓度36％，冰浴上搅拌15min，14000rpm离心收集沉淀，分别得到4.1g(序列1)和4.5g(序列5)固定化MeHNL。

方案2：分别取含有序列1和序列5的大肠杆菌80g湿菌体，重悬于260mL乙酸缓冲液(50mM，pH 5.5)，超声破菌，14000rpm离心30min收取上清液，加入戊二醛至终浓度15％，搅拌下加入乙二醇二甲醚至终浓度80％，冰浴上搅拌30min，14000rpm离心收集沉淀，分别得到3.9g(序列1)和4.1g(序列5)固定化MeHNL。

方案3：分别取含有序列1和序列5的大肠杆菌80g湿菌体，重悬于260mL乙酸缓冲液(50mM，pH 5.5)，超声破菌，14000rpm离心30min收取上清液，加入戊二醛至终浓度15％，搅拌下加入PEG3000(聚乙二醇)至终浓度20％，冰浴上搅拌30min，14000rpm离心收集沉淀，分别得到4g(序列1)和4.1g(序列5)固定化MeHNL。三种方案所得交联酶聚集体的活力如下表所示：

表1

注：总酶活＝固定化酶比酶活×固定化酶重量。

虽然沉淀剂选用PEG3000的固定化酶比酶活较高，但是成本比硫酸铵高；并且采用硫酸铵的总酶活回收率更高,因此采用硫酸铵作为固定化酶沉淀剂。

实施例4-5固定化酶的使用(纯有机相)

在100mL MTBE(methyl tert-butyl ether，甲基叔丁基醚)(实施例4)，或异丙醚(实施例5)中，加入10mL间苯氧基苯甲醛，2.5g MeHNL固定化酶，5mL丙酮氰醇，20℃搅拌反应，搅拌速度为400-500rpm。反应4小时取样用HPLC检测反应转化率，过滤回收固定化酶，投入下一批次。重复使用的情况见表2。

表2

注：Δ为突变型；WT为野生型。液相色谱检测，转化率计算方式为，转化率＝产物/(产物+底物)*100％。

实施例6-7固定化酶的使用(水+有机相)

在50mL柠檬酸溶液(50mM，pH5)中，加入10mL间苯氧基苯甲醛，5g MeHNL(序列1)固定化酶，5mL氰氢酸，分别加入50mL MTBE(实施例6)，或50mL异丙醚(实施例7)，20℃搅拌反应，搅拌速度为400-500rpm。反应4小时后取样用HPLC检测转化率，结束反应后，过滤回收固定化酶，投入下一批次。重复使用的情况见表3。

表3

根据实施例4-7的结果，本发明优选的反应体系为MTBE有机相；反应条件为：CLEA固定化酶为催化剂，MTBE为溶剂，底物为间苯氧基苯甲醛，丙酮氰醇(或，氰氢酸)，15℃-25℃(优选为20℃)反应3-5小时(优选为4小时)，搅拌速度为400-500rpm。反应体系中间苯氧基苯甲醛浓度为0.1摩尔/升-1.2摩尔/升(优选为0.5摩尔/升)，丙酮氰醇浓度为0.2摩尔/升－2摩尔/升(优选为1.0摩尔/升)，而且丙酮氰醇的浓度是间苯氧基苯甲醛浓度的1.5-3倍(优选为2倍)。

实施例9分析检测

采用高效液相色谱(HPLC)法监测反应：以水和乙腈(45:55)为流动相，色谱柱为ODS-18反相柱，岛津LC-15C高效液相色谱，210nm下检测紫外吸收；反应体系用水和乙腈(45:55)进行稀释，离心并用尼龙膜过滤后进样检测。在本发明优选地反应体系中，HPLC检测反应进程(图3)：反应1小时后，检测，17.3min为间苯氧基苯甲醛，17.5min为S-构型氰醇.

手性纯度采用Agilent 1260液相色谱进行分析，检测条件为：ChiralpakAD-H柱，正己烷:乙醇(0.1％DEA)＝90:10，0.8mL/min，检测波长为220nm。经过比对本发明制得的S-构型的产物与目标物质标准品(购自江西科苑生物药业有限公司)一致。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种制备S-氰醇的方法，其特征在于，包括步骤：

(1)制备固定化的氰醇裂解酶；

(3)分离并纯化所述S-氰醇产物。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述固定化的氰醇裂解酶选自下组：氰醇裂解酶的交联酶聚集体(CLEA，氰醇裂解酶酶分子之间发生交联凝集成网状结构，使之不溶于水从而形成固定化氰醇裂解酶)、吸附剂吸附的氰醇裂解酶(优选地，所述吸附剂包括活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等)。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中固定化的氰醇裂解酶的制备方法如下：

(a)向氰醇裂解酶水溶液中加入戊二醛至终浓度5-15％(v/v)；

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中，所述沉淀剂为硫酸铵，加入硫酸铵固体至30％-50％(w/v)终浓度，优选为35％-40％(w/v)终浓度，最优选为36％(w/v)终浓度。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)中，加入戊二醛至终浓度10％(v/v)。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述反应底物为间苯氧基苯甲醛、和丙酮氰醇(或，氰氢酸)；优选地，丙酮氰醇的浓度是间苯氧基苯甲醛浓度的2倍。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，反应的温度为0℃-40℃，优选为10℃-35℃，更优选地为15-25℃，如21℃。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，将所述底物溶于MTBE中，加入所述固定化的氰醇裂解酶进行催化反应。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，反应体系为MTBE有机相；反应条件为：固定化的氰醇裂解酶为催化剂，MTBE为溶剂，底物为间苯氧基苯甲醛，丙酮氰醇(或，氰氢酸)，15℃-25℃(优选为20℃)反应3-5小时(优选为4小时)，搅拌速度为400-500rpm；反应体系中间苯氧基苯甲醛浓度为0.1摩尔/升-1.2摩尔/升(优选为0.5摩尔/升)，丙酮氰醇浓度为0.2摩尔/升－2摩尔/升(优选为1.0摩尔/升)，而且丙酮氰醇的浓度是间苯氧基苯甲醛浓度的1.5-3倍(优选为2倍)。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氰醇裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.:5或SEQ ID NO.:1所示。