CN109797174A - 一种氟苯尼考中间体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种氟苯尼考中间体的制备方法，具体地，本发明公开了部分酮还原酶可以用于氟苯尼考中间体的制备，在此基础上获得了一种反应条件温和、收率高、成本低的氟苯尼考中间体的制备方法。

Description

一种氟苯尼考中间体的制备方法

技术领域

本发明属于生物催化领域，具体涉及一种酮还原酶在制备氟苯尼考中间体中的应用。

背景技术

氟苯尼考又称氟甲砜霉素、氯砜尼可等，为新一代的动物专用广谱抗菌药，其结构类似于甲砜霉素，但其抗菌能力可达甲砜霉素的10倍之多，而且它抗菌谱广，杀菌作用强大，安全高效，没有再生障碍性贫血、致畸、致癌和致突变作用，故其被广泛应用。目前，世界上已有20多个国家批准并允许其销售使用。在国内氟苯尼考已被批准用于猪、禽、鱼等多种动物。

(1R,2R)-2-氨基-1-(4-(甲磺酰基)苯基)丙烷-1,3-二醇是其重要中间体，其关键是手性中心的构建，目前，其制备方法主要有手性拆分法，化学合成法。

美国专利US3927054报道了D-酒石酸的手性拆分法。先由对甲砜基苯甲醛与甘氨酸，采用氨水为碱，硫酸铜为催化剂，在温和条件下通过Aldol缩合反应，非对映选择性的得到了苏式的DL-threo-对甲砜基苯丝氨酸，基本上没有赤式非对映异构体的存在，然后再通过H₂S气体去铜离子，酯化得DL-threo-对甲砜基苯丝氨酸乙酯。随后经D-酒石酸拆分，以41％拆分收率得到了光学纯的D--threo-对甲砜基苯丝氨酸乙酯，再酯基还原获得光学纯的(1R,2R)-2-氨基-1-(4-(甲磺酰基)苯基)丙烷-1,3-二醇。但是此拆分方法收率较低，原料利用率低，成本较高。

复旦大学专利CN105152989B公开了由2-(N-叔丁氧甲酰胺基)-3-(4-甲砜基苯基)-3-氧代丙酸乙酯经重排获得2-叔丁氧甲酰胺基-3-(4-甲砜基苯基)-3-氧代丙酸乙酯，再经钌催化剂催化不对称氢化伴随动态动力学拆分，制得(2S，3R)-3-羟基-2-(叔丁氧甲酰胺基)-3-(4-甲砜基苯基)丙酸乙酯，再经甲磺酰氯酯化，硼氢化钠还原，和脱保护制得(1R,2R)-2-氨基-1-(4-(甲磺酰基)苯基)丙烷-1,3-二醇。此方法需要昂贵的金属催化剂，以及产生重金属污染，对环境污染严重，不利用工业化生产。

因此，本领域技术人员致力于开发收率更高、环境友好、生产成本低且手性纯度更高的氟苯尼考中间体的制备工艺。

发明内容

本发明的目的在于提供一种收率更高、环境友好、生产成本低且手性纯度更高的氟苯尼考中间体的制备方法。

在本发明的第一方面，提供了一种酮还原酶在制备(1R,2R)-2-氨基-1-(4-(甲磺酰基)苯基)丙烷-1,3-二醇中的应用，其中，所述酮还原酶选自下组：

(A)具有SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:6中任一所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；更优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性，如≥99％的同源性)的多肽，且所述多肽具有催化活性；

(C)将SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:6中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保留催化活性的衍生多肽。

在另一优选例中，所述酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1所示。

在另一优选例中，所述酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1，或SEQ ID NO:6所示。

在另一优选例中，所述催化活性指所述酮还原酶可催化作为底物的化合物3反应得到化合物2，其反应式如下：

本发明的第二方面，提供了一种制备(1R,2R)-2-氨基-1-(4-(甲磺酰基)苯基)丙烷-1,3-二醇的方法，包括步骤：

(1)配制反应体系并进行酶催化反应

所述反应体系中包括作为底物的化合物3、和酮还原酶；以化合物3为底物，在酮还原酶作用下，得到化合物2；

其反应式如下：

在另一优选例中，所述酮还原酶选自下组：

(A)具有SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:6中任一所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；更优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性，如≥99％的同源性)的多肽，且所述多肽具有催化活性；

(C)将SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:6中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保留催化活性的衍生多肽。

在另一优选例中，所述酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:6所示。

在另一优选例中，所述酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1，或SEQ ID NO:6所示。

在另一优选例中，所述步骤(1)中，所述反应体系还包括还原型辅酶NADH或NADPH。

在另一优选例中，所述步骤(1)中，所述反应体系还包括脱氢酶和供氢体，在脱氢酶以及供氢体的存在下，将氧化型辅酶NAD+或NADP+进行还原反应，从而得到所述的还原型辅酶NADH或NADPH。

在另一优选例中，所述的脱氢酶为葡萄糖脱氢酶、醇脱氢酶和甲酸脱氢酶；和/或，所述的供氢体为葡萄糖、异丙醇或甲酸盐；较佳地，当所述的脱氢酶为醇脱氢酶时，所述的供氢体为异丙醇；当所述的脱氢酶为葡萄糖脱氢酶时，所述的供氢体为葡萄糖；当所述的脱氢酶为甲酸脱氢酶时，所述的供氢体为甲酸盐。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：将N-((1R,2R)-1,3-二羟基-1-(4-(甲磺酰基)苯基)丙烷-2-基)乙酰胺进行水解制得(1R,2R)-2-氨基-1-(4-(甲磺酰基)苯基)丙烷-1,3-二醇。

在另一优选例中，所述步骤(1)中，所述反应体系的pH为7.0-10.0，优选为8.0-9.0。

在另一优选例中，所述步骤(1)中，酶催化反应的温度为20-40℃。

本发明的第三方面，提供了一种制备氟苯尼考的方法，其包括下述步骤：

(1)按照本发明第二方面所述的方法，制得(1R,2R)-2-氨基-1-(4-(甲磺酰基)苯基)丙烷-1,3-二醇；

(2)将步骤(1)制得的(1R,2R)-2-氨基-1-(4-(甲磺酰基)苯基)丙烷-1,3-二醇作为中间体进行反应，得到氟苯尼考。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，意外发现部分酮还原酶可以用于氟苯尼考中间体的制备，在此基础上获得了一种反应条件温和、收率高、成本低的氟苯尼考中间体的制备方法。

现有(1R,2R)-2-氨基-1-(4-(甲磺酰基)苯基)丙烷-1,3-二醇的制备方法中收率低，环境危害严重等缺陷，因此本发明提出了一种酮还原酶在制备氟苯尼考中间体(1R,2R)-2-氨基-1-(4-(甲磺酰基)苯基)丙烷-1,3-二醇中的应用。利用本发明的方法得到的(1R,2R)-2-氨基-1-(4-(甲磺酰基)苯基)丙烷-1,3-二醇，手性纯度高，环境友好，生产成本低，利于工业化生产。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

酮还原酶

本发明提供了酮还原酶在制备氟苯尼考中间体(1R,2R)-2-氨基-1-(4-(甲磺酰基)苯基)丙烷-1,3-二醇(化合物1)中的应用。

在本发明的一个优选地实施方式中，在酮还原酶、还原型辅酶NADH或NADPH催化下，将N-[1-羟甲基-2-(4-甲磺酰基-苯基)-2-氧-乙基]-乙酰胺(化合物3)进行还原反应制得N-((1R,2R)-1,3-二羟基-1-(4-(甲磺酰基)苯基)丙烷-2-基)乙酰胺(化合物2)：

在本发明的一个优选地实施方式中，所述酮还原酶选自下组：SEQ ID NO.:1所示的酶1，SEQ ID NO.:2所示的酶2，SEQ ID NO.:3所示的酶3，SEQ ID NO.:4所示的酶4，SEQID NO.:5所示的酶5，SEQ ID NO.:6所示的酶6，SEQ ID NO.:7所示的酶7。

酶1的氨基酸序列如下：

MYMEKLRLDNRVAIVTGGAQNIGLACVTALAEAGARVIIADLDEAMATKAVEDLRMEGHDVSSVVMDVTNTESVQNAVRSVHEQEGRVDILVACAGICISEVKAEDMTDGQWLKQVDINLNGMFRSCQAVGRIMLEQKQGVIVAIGSMSGLIVNRPQQQAAYNASKAGVHQYIRSLAAEWAPHGIRANAVAPTYIETTLTRFGMEKPELYDAWIAGTPMGRVGQPDEVASVVQFLASDAASLMTGAIVNVDAGFTVW(SEQ ID NO.:1)。

酶2的氨基酸序列如下：

MSTTGTTPATTGYAAEFAGRTALVTGAASGIGLATARRLGAGGARVVVADFNAEGAEKAAAELRAGGVEAAAVELDVTRPESVEAAVGFAVDTFGSLDLAVNNAGIGGPSAPTGEYDVAAYQRVVRTNLDGVFYSMRYELPAIEAAGKGGSIVNVASILGSVGFAGSPAYVAAKHGVVGLTKAAAAEYAARGIRINAVGPGFIDTPLLKTMDEAAYKGLVALHPAGRLGRSEEVAELIAFLLSDRASFVAGSYHLVDGAYTAV(SEQ ID NO.:2)。

酶3的氨基酸序列如下：

MSNGKTFTLSNGVKIPGVGFGTFASEGSKGETYTAVTTALKTGYRHLDCAWYYLNEGEVGEGIRDFLKENPSVKREDIFVCTKVWNHLHRYEDVLWSIDDSLKRLGLDYVDMFLVHWPIAAEKNGQGEPKIGPDGKYVILKDLTENPEPTWRAMEKIYEDRKARSIGVSNWTIADLEKMSKFAKVMPHANQIEIHPFLPNEELVQYCFSKNIMPVAYSPLGSQNQVPTTGERVSENKTLNEIAEKGGNTLAQVLIAWGLRRGYVVLPKSSNPKRIESNFKSIELSDADFEAINAVAKGRHFRFVNMKDTFGYDVWPEETAKNLSA(SEQ ID NO.:3)。

酶4的氨基酸序列如下：

MSIPEMQWAQVAEQKGGPLIYKQIPVPKPGPDEILVKVRYSGVCHTDLHALKGDWPLPVKMPLVGGHEGAGVVVARGDLVTEFEIGDHAGLKWLNGSCLACEFCKQADEPLCPNASLSGYTVDGTFQQYAIGKATHASKLPKNVPLDAVAPVLCAGITVYKGLKESGVRPGQTVAIVGAGGGLGSLALQYAKAMGIRVVAIDGGEEKQAMCEQLGAEAYVDFTKTQDLVADVKAATPEGLGAHAVILLAVAEKPFQQAAEYVRSRGTVVAIGLPAGAFLRAPVFNTVVRMINIKGSYVGNRQDGVEAVDFFARGLIKAPFKTAPLQDLPKIFELMEQGKIAGRYVLEIPE(SEQ ID NO.:4)。

酶5的氨基酸序列如下：

MVPKFYKLSNGFKIPSIALGTYDIPRSQTAEIVYEGVKCGYRHFDTAVLYGNEKEVGDGIIKWLNEDPGNHKREEIFYTTKLWNSQNGYKRAKAAIRQCLNEVSGLQYIDLLLIHSPLEGSKLRLETWRAMQEAVDEGLVKSIGVSNYGKKHIDELLNWPELKHKPVVNQIEISPWIMRQELADYCKSKGLVVEAFAPLCHGYKMTNPDLLKVCKEVDRNPGQVLIRWSLQHGYLPLPKTKTVKRLEGNLAAYNFELSDEQMKFLDHPDAYEPTDWECTDAP(SEQ ID NO.:5)。

酶6的氨基酸序列如下：

MPATLHDSTKILSLNTGAQIPQIGLGTWQSKENDAYKAVLTALKDGYRHIDTAAIYRNEDQVGQAIKDSGVPREEIFVTTKLWCTQHHEPEVALDQSLKRLGLDYVDLYLMHWPARLDPAYIKNEDILSVPTKKDGSRAVDITNWNFIKTWELMQELPKTGKTKAVGVSNFSINNLKDLLASQGNKLTPAANQVEIHPLLPQDELINFCKSKGIVVEAYSPLGSTDAPLLKEPVILEIAKKNNVQPGHVVISWHVQRGYVVLPKSVNPDRIKTNRKIFTLSTEDFEAINNISKEKGEKRVVHPNWSPFEVFK(SEQ ID NO.:6)。

酶7的氨基酸序列如下：

MTTDTTVFVSGATGFIALHIMNDLLKAGYTVIGSGRSQEKNDGLLKKFNNNPKLSMEIVEDIAAPNAFDEVFKKHGKEIKIVLHTASPFHFETTNFEKDLLTPAVNGTKSILEAIKKYAADTVEKVIVTSSTAALVTPTDMNKGDLVITEESWNKDTWDSCQANAVAAYCGSKKFAEKTAWEFLKENKSSVKFTLSTINPGFVFGPQMFADSLKHGINTSSGIVSELIHSKVGGEFYNYCGPFIDVRDVSKAHLVAIEKPECTGQRLVLSEGLFCCQEIVDILNEEFPQLKGKIATGEPATGPSFLEKNSCKFDNSKTKKLLGFQFYNLKDCIVDTAAQMLEVQNEA(SEQ ID NO.:7)。

本发明还提供了一种氟苯尼考中间体的制备方法，其包括步骤：在酮还原酶、还原型辅酶NADH或NADPH催化下，将N-[1-羟甲基-2-(4-甲磺酰基-苯基)-2-氧-乙基]-乙酰胺(化合物3)进行还原反应制得N-((1R,2R)-1,3-二羟基-1-(4-(甲磺酰基)苯基)丙烷-2-基)乙酰胺(化合物2)。

在本发明的一个优选地实施方式中，所述方法中，在酮还原酶以及供氢体的存在下，将氧化型辅酶NAD+或NADP+进行还原反应，得到所述的还原型辅酶NADH或NADPH。

在本发明的一个优选地实施方式中，所述的脱氢酶为葡萄糖脱氢酶、醇脱氢酶或甲酸脱氢酶；和/或，所述的供氢体为葡萄糖、异丙醇或甲酸盐；较佳地，当所述的脱氢酶为醇脱氢酶时，所述的供氢体为异丙醇；当所述的脱氢酶为葡萄糖脱氢酶时，所述的供氢体为葡萄糖；当所述的脱氢酶为甲酸脱氢酶时，所述的供氢体为甲酸盐。

在本发明的一个优选地实施方式中，所述的制备方法还包括：将N-((1R,2R)-1,3-二羟基-1-(4-(甲磺酰基)苯基)丙烷-2-基)乙酰胺(化合物2)进行水解制得(1R,2R)-2-氨基-1-(4-(甲磺酰基)苯基)丙烷-1,3-二醇(化合物1)。

葡萄糖脱氢酶

本发明根据来源于枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)168(NCBI登录号为NP_388275.1)的葡萄糖脱氢酶基因序列，全合成葡萄糖脱氢酶基因，并进行了重组表达，从而制备了葡萄糖脱氢酶。

在本发明的一个优选地实施方式中，在反应体系中添加葡萄糖脱氢酶和葡萄糖，从而实现NADH和/或NADPH的再生，为生物催化还原反应提供还原力氢。

本领域的普通技术人员可以使用的常规方法获得本发明涉及的酶基因序列，例如全人工合成或PCR法合成。一种优选的合成法为不对称PCR法。不对称PCR法是用不等量的一对引物，PCR扩增后产生大量的单链DNA(ssDNA)。这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，其比例一般为50-100∶1。在PCR反应的最初10-15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明的酶可以通过常规的重组DNA技术进行表达或生产，包括步骤：

(1)用编码本发明蛋白的多核苷酸，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化目的蛋白质，从而获得目标酶。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明相关酶的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体，优选市售的载体：pET28a。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。

所述重组载体在5'到3'方向上包括：启动子，目的基因和终止子。如果需要，所述重组载体还可以包括以下元件：蛋白纯化标签；3'多聚核苷酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；选择标记(抗生素抗性基因、荧光蛋白等)；增强子；或操作子。

用于制备重组载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。表达载体可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以被采用。

本领域普通技术人员可以采用熟知的方法构建含有本发明启动子和/或目的基因序列的载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。

本发明的表达载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主转录目的RNA或表达目的蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、链霉菌属、农杆菌：或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，可以用CaCl₂法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法(如显微注射、电穿孔、脂质体包装等)。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。

术语“可操作连接”是指将准备转录表达的目的基因以一种本领域的常规方式连接到它的控制序列以被表达。

工程菌的培养和目的蛋白发酵生产

在获得工程细胞后，便可在适合的条件下培养工程细胞，表达本发明的基因序列所编码的蛋白。根据宿主细胞的不同，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基，在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在本发明中，可采用常规的发酵条件。代表性的条件包括(但并不限于)：

(a)就温度而言，酶的发酵及诱导温度保持在25-37℃；

(b)就诱导期的pH值而言，诱导期pH控制在3-9；

(c)就溶氧(DO)而言，DO控制在10-90％，溶氧的维持可以用氧气/空气混合气体的通入来解决；

(d)就补料而言，补料种类宜包括甘油、甲醇、葡萄糖等碳源，可单独补料或混合补料；

(e)就诱导期IPTG浓度而言，常规诱导浓度都可用于本发明，通常IPTG浓度控制在0.1-1.5mM；

(f)就诱导时间而言，没有特别限制，通常为2-20小时，较佳地为5-15小时。

本发明的目的酶存在大肠杆菌细胞内，通过离心机收集宿主细胞，然后通过高压、机器力、酶解细胞被或其他细胞破碎方法破碎宿主细胞，释放重组蛋白，优选的是高压法。宿主细胞裂解液可通过絮凝、盐析、超滤等方法进行初步纯化后再进行层析、超滤等纯化，也可直接进行层析纯化。

层析技术包括阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析、亲和层析等技术。常用的层析方法包括：

1.阴离子交换层析：

阴离子交换层析介质包括(但不限于)：Q-Sepharose、DEAE-Sepharose。如果发酵样品的盐浓度较高，影响与离子交换介质的结合，则在进行离子交换层析前需降低盐浓度。样品可以用稀释、超滤、透析、凝胶过滤层析等手段进行平衡缓冲液的更换，直至与对应的离子交换柱平衡液系统相似，然后上样，进行盐浓度或pH的梯度洗脱。

2.疏水层析：

疏水层析介质包括(但不限于)：Phenyl-Sepharose、Butyl-Sepharose、Octyle-Sepharose。样品通过添加NaCl、(NH₄)₂SO₄等方式提高盐浓度，然后上样，通过降低盐浓度方法洗脱。通过疏水层析除去疏水性有较大差异的杂蛋白。

3.凝胶过滤层析

疏水层析介质包括(但不限于)：Sephacryl、Superdex、Sephadex类。通过凝胶过滤层析更换缓冲体系，或进一步精纯。

4.亲和层析

亲和层析介质包括(但不限于)：HiTrap^TMHeparinHPColumns。

5.膜过滤

超滤介质包括：有机膜如聚砜膜、无机膜如陶瓷膜、金属膜类。通过膜过滤可以达到纯化和浓缩的目的。

本发明的主要优点在于：

(1)首次提供了酮还原酶在制备(1R,2R)-2-氨基-1-(4-(甲磺酰基)苯基)丙烷-1,3-二醇中的应用，并经过大量实验、筛选获得了具有较高转化率和ee值的较佳醇脱氢酶；

(2)提供了一种制备(1R,2R)-2-氨基-1-(4-(甲磺酰基)苯基)丙烷-1,3-二醇的方法，该方法使用酮还原酶进行催化，反应条件温和。

(3)本发明筛选到了具有较高活性的酮还原酶用于制备(1R,2R)-2-氨基-1-(4-(甲磺酰基)苯基)丙烷-1,3-二醇，实验结果表明获得的目标产物ee值可达100％，转化率可达约95％。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1：酮还原酶的制备

1.1酮还原酶基因的获取

从NCBI数据库中检索到酮还原酶基因序列，全基因合成酮还原酶基因。各酶的信息如下表1：

表1酮还原酶酶库

1.2酮还原酶基因的表达

酮还原酶基因酶连pET28a，酶切位点NdeI&HindIII，将酶连好的载体，转化宿主大肠杆菌BL21感受态细胞。将构建好的菌种接种TB培养基于37℃下，200rpm摇床，IPTG浓度0.1mM诱导过夜，收菌。

1.3酮还原酶菌体的培养与粗酶液的制备及酶活的测定

LB液体培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，用去离子水溶解后定容，121℃灭菌20min，待用。

将含有酮还原酶基因的工程菌在经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/ml卡那霉素的5ml LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。按2％接种量转接至150ml同样含50μg/ml卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡至OD600达到0.8左右时，加入IPTG至其终浓度为0.5mM，18℃诱导培养16h。培养结束后，将培养液10000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体，置于-80℃超低温冰箱中保存，待用。

将培养结束后收集到的菌体，用50mM pH8.0磷酸缓冲液洗涤两次，之后重悬于50mLpH8.0的磷酸缓冲液中，均质破碎，破碎液离心去除沉淀，得到含重组酮还原酶的粗酶液。

酶活检测方法：总反应体系1mL，在50mM含5％DMSO的pH7.0的磷酸盐缓冲液体系中，加底物2-(叔丁氧羰基)氨基-3-(4-甲磺酸苯基)-3-氧代丙酸乙酯终浓度至5mg/ml,NAD+/NADP+终浓度1mM，最后加适量的酶液，25℃测340nm波长的光吸收，做酶动力学曲线，根据NADH/NADPH标准曲线计算酶活。

底物结构式：

单位酶活定义：在特定反应条件(25℃)下，每分钟生成1μmol NADPH/NADH所需的酶量。

备注：“+”表示酶活为0-0.5U/mg；“++”表示酶活为0.5-2U/mg；“+++”表示酶活为2-5U/mg；“++++”表示酶活为5-10U/mg；“+++++”表示酶活大于10U/mg。

实施例2：葡萄糖脱氢酶的制备

2.1葡萄糖脱氢酶基因的获取

根据来源于枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis 168(NCBI登录号为NP_388275.1)的葡萄糖脱氢酶基因，全合成葡萄糖脱氢酶基因。

2.2葡萄糖脱氢酶基因的表达

葡萄糖脱氢酶基因酶连pET28a，酶切位点NdeI&HindIII，将酶连好的载体，转化宿主大肠杆菌BL21感受态细胞。菌种接种TB培养基于37℃下，200rpm摇床，加入IPTG浓度0.1mM诱导过夜，收菌。菌株加入终浓度为25％的无菌甘油后，编号，置于-80℃低温冰箱保藏备用。

2.3葡萄糖脱氢酶菌株的培养与粗酶液的制备

LB液体培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，用去离子水溶解后定容，121℃灭菌20min，待用。

将含有葡萄糖脱氢酶基因的工程菌在经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/ml卡那霉素的5ml LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。按2％接种量转接至50ml同样含50μg/ml卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡至OD600达到0.8左右时，加入IPTG至其终浓度为0.5mM，18℃诱导培养16h。培养结束后，将培养液10000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体，置于-80℃超低温冰箱中保存，待用。

将培养结束后收集到的菌体，用50mM pH8.0磷酸缓冲液洗涤菌体两次，之后将菌体重悬于pH8.0的磷酸缓冲液中，超声破碎，破碎液离心去除沉淀，得到上清液含重组葡萄糖脱氢酶的粗酶液。

酶活检测方法：1mL反应体系，25℃条件下，先加980μL的pH 7.0 50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(含葡萄糖400mM)，再加10μL NADP⁺(25mM)，最后加10μL适量的酶液，紫外分光光度计测定340nm处OD值。

单位酶活定义：在特定反应条件(30℃)下，每分钟产生1μmol NADPH所需要的酶量。

实施例3：2-溴-1-(4-甲磺酰基)苯乙酮(化合物6)的制备

4-甲砜基苯乙酮(化合物7)19.8g溶于60mL乙酸中，控温20℃，滴加液溴16.2g(1.01eq)，滴完后继续保温反应2h后TLC显示原料消失，浓缩除去乙酸，100mL EA溶解水洗后浓缩得2-溴-1-(4-甲磺酰基)苯乙酮(化合物6)粗品28g，未纯化直接投下一步反应。

实施例4：2-氨基-1-(4-甲磺酰基)苯乙酮盐酸盐(化合物5)的制备

2-溴-1-(4-甲磺酰基)苯乙酮(化合物6)粗品27.7g溶于140mL二氯甲烷中，加入六亚甲基四胺14.7g(1.05eq)室温反应8h后过滤，滤饼悬浮于300mL甲醇中，加入40mL浓盐酸(36％)回流反应3h。反应液冷却至20℃后过滤得2-氨基-1-(4-甲磺酰基)苯乙酮盐酸盐(化合物5)的粗品22.8g，收率91.3％。

实施例5：N-(4-甲磺酰基-苯甲酰甲基)-乙酰胺(化合物4)的制备

2-氨基-1-(4-甲磺酰基)苯乙酮盐酸盐(化合物5)20g悬浮于80mL二氯甲烷中，加入醋酸酐9.2g(1.1eq)，室温下慢慢滴入醋酸钠水溶液(20％，80mL)，滴完后继续反应2h，TLC显示反应完全，分相后，水相用80mL二氯甲烷萃取一次后合并有机相，浓缩得N-(4-甲磺酰基-苯甲酰甲基)-乙酰胺(化合物4)的粗品18.8g，收率92％。

实施例6：N-[1-羟甲基-2-(4-甲磺酰基-苯基)-2-氧-乙基]-乙酰胺(化合物3)的制备

N-(4-甲磺酰基-苯甲酰甲基)-乙酰胺(化合物4)15g悬浮于45mL异丙醇中，加入多聚甲醛(3.5g，2eq)和碳酸钾(2.4eq，0.3eq)，室温搅拌0.5h后加热到60℃反应2h。TLC显示原料消失，过滤后滤液浓缩，乙酸乙酯溶解后水洗，有机相浓缩，甲叔醚打浆后得11.5g N-[1-羟甲基-2-(4-甲磺酰基-苯基)-2-氧-乙基]-乙酰胺(化合物3)，收率69％。

实施例7：N-((1S,2S)-1,3-二羟基-1-(4-(甲磺酰基)苯基)丙烷-2-基)乙酰胺(化合物2)的制备

N-[1-羟甲基-2-(4-甲磺酰基-苯基)-2-氧-乙基]-乙酰胺(化合物3)10g悬浮于20mL甲叔醚中，加入实施例1制得的酮还原酶50mL，GDH 10mL，葡萄糖6.9g(1.1eq)，10mgNAD+。饱和碳酸钠水溶液控制体系pH 8.0，30℃反应8h。HPLC检测原料<2％，加浓盐酸调体系pH至1.0，过滤除去变性的蛋白。滤液乙酸乙酯萃取3次，浓缩有机相得粗品N-((1R,2R)-1,3-二羟基-1-(4-(甲磺酰基)苯基)丙烷-2-基)乙酰胺(化合物2)。

各酮还原酶的转化效果如下表。

实施例8：(1S,2S)-2-氨基-1-(4-(甲磺酰基)苯基)丙烷-1,3-二醇(化合物1)的制备

N-((1R,2R)-1,3-二羟基-1-(4-(甲磺酰基)苯基)丙烷-2-基)乙酰胺(化合物2)8.0g溶于24mL四氢呋喃中，加入氢氧化钠水溶液(30％，4mL)，回流反应6h，TLC显示原料消失。浓缩后EA溶解，水洗，硫酸钠干燥，减压浓缩除去溶剂后甲醇重结晶得6.1g(1R,2R)-2-氨基-1-(4-(甲磺酰基)苯基)丙烷-1,3-二醇(化合物1)，收率90％，ee值100％。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海弈柯莱生物医药科技有限公司

<120> 一种氟苯尼考中间体的制备方法

<130> 000000

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 257

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

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<213> 人工序列(Artificial sequence)

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<212> PRT

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<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

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325 330 335

Ala Ala Gln Met Leu Glu Val Gln Asn Glu Ala

340 345

Claims (10)

1.一种酮还原酶在制备(1R,2R)-2-氨基-1-(4-(甲磺酰基)苯基)丙烷-1,3-二醇中的应用，其中，所述酮还原酶选自下组：

(A)具有SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1中任一所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；更优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性，如≥99％的同源性)的多肽，且所述多肽具有催化活性；

(C)将SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保留催化活性的衍生多肽；

优选地，所述酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:6，或SEQ ID NO:1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其中，所述催化活性指所述酮还原酶可催化作为底物的化合物3反应得到化合物2，其反应式如下：

3.一种制备(1R,2R)-2-氨基-1-(4-(甲磺酰基)苯基)丙烷-1,3-二醇的方法，其特征在于，包括步骤：

(1)配制反应体系并进行酶催化反应

所述反应体系中包括作为底物的化合物3、和酮还原酶；以化合物3为底物，在酮还原酶作用下，得到化合物2；

其反应式如下：

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述酮还原酶选自下组：

(A)具有SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:6中任一所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；更优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性，如≥99％的同源性)的多肽，且所述多肽具有催化活性；

(C)将SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:6中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保留催化活性的衍生多肽。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述反应体系还包括还原型辅酶NADH或NADPH。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述反应体系还包括脱氢酶和供氢体，在脱氢酶以及供氢体的存在下，将氧化型辅酶NAD+或NADP+进行还原反应，从而得到所述的还原型辅酶NADH或NADPH。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的脱氢酶为葡萄糖脱氢酶、醇脱氢酶和甲酸脱氢酶；和/或，所述的供氢体为葡萄糖、异丙醇或甲酸盐。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，当所述的脱氢酶为醇脱氢酶，所述的供氢体为异丙醇；或者，

所述的脱氢酶为葡萄糖脱氢酶，所述的供氢体为葡萄糖；或者，

所述的脱氢酶为甲酸脱氢酶，所述的供氢体为甲酸盐。

9.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤：将N-((1R,2R)-1,3-二羟基-1-(4-(甲磺酰基)苯基)丙烷-2-基)乙酰胺进行水解制得(1R,2R)-2-氨基-1-(4-(甲磺酰基)苯基)丙烷-1,3-二醇。

10.一种制备氟苯尼考的方法，其特征在于，其包括下述步骤：

(1)按照权利要求3所述的方法，制得(1R,2R)-2-氨基-1-(4-(甲磺酰基)苯基)丙烷-1,3-二醇；

(2)将步骤(1)制得的(1R,2R)-2-氨基-1-(4-(甲磺酰基)苯基)丙烷-1,3-二醇作为中间体进行反应，得到氟苯尼考。