CN114591991A - 一种基于短链羰基还原酶制备钙泊三醇关键手性中间体的方法 - Google Patents

一种基于短链羰基还原酶制备钙泊三醇关键手性中间体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种基于短链羰基还原酶制备钙泊三醇关键手性中间体的方法，该方法包括如下步骤：用地下新鞘氨醇菌的短链脱氢酶SR03构建得到表达CBR54的第一基因工程菌，将表达CBR54的第一基因工程菌分离纯化培养后得到表达短链羰基还原酶的第二基因工程菌，将第二基因工程菌冷冻干燥得到CBR54粗酶粉，以CBR54粗酶粉、GDH酶粉和NADH辅酶为催化剂，以环丙基羰基甲基‑苯并噻唑‑2‑硫醚为底物，加入缓冲液催化反应8‑24h，得到2‑[(S)‑2‑羟基‑2‑环丙基)‑1‑乙硫基]‑苯并噻唑，即得到钙泊三醇关键手性中间体；该方法能够解决现目前制备手性体成本高、底物损耗大以及产物纯度低的技术问题。

Description

一种基于短链羰基还原酶制备钙泊三醇关键手性中间体的 方法
技术领域
本发明涉及生物化学技术领域，具体而言，涉及一种基于短链羰基还原酶制备钙泊三醇关键手性中间体的方法。
背景技术
钙泊三醇改善局部皮肤角质增生和角化异常的作用，大多是用于寻常型银屑病或者由于各种银屑病处于稳定期状态导致的皮肤损害，对银屑病的局部皮损增生和炎症具有明显的改善作用，所以在临床上应用比较广。手性中间体2-[(S)-2-羟基-2-环丙基)-1-乙硫基]-苯并噻唑(Ⅰ)是制备钙泊三醇的关键中间体，其手性纯度对合成制备钙泊三醇的纯度具有重要影响，原有方法采用金属化学催化，需要昂贵的金属试剂、反应条件较为苛刻，且产物光学纯度低，后处理困难。
来源于地下新鞘氨醇菌(Novosphingobium subterraneum)其表达的短链脱氢酶SR03(SDR03)是一种NADH/NADPH依赖的氧化还原酶，能将醛酮可逆性还原为手性醇，在催化不对称还原时具有高度的化学、区域、立体选择性，是制备光学纯的手性醇的重要催化剂。传统的化学制备手性醇如手性拆分、不对称合成虽然已经用于工业生产，但是污染较大，且催化过程中容易导致底物损失，进而造成产物纯度低以及成本高的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于短链羰基还原酶制备钙泊三醇关键手性中间体的方法，该方法能够解决现目前制备手性体成本高、底物损耗大以及产物纯度低的技术问题。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
本申请提供了一种基于短链羰基还原酶制备钙泊三醇关键手性中间体的方法，包括如下步骤：用地下新鞘氨醇菌的短链脱氢酶SR03构建得到表达CBR54的第一基因工程菌，将表达CBR54的第一基因工程菌分离纯化培养后得到表达短链羰基还原酶的第二基因工程菌，将第二基因工程菌冷冻干燥得到CBR54粗酶粉，以CBR54粗酶粉、GDH酶粉和NADH辅酶为催化剂，以环丙基羰基甲基-苯并噻唑-2-硫醚为底物，加入缓冲液催化反应8-24h，得到2-[(S)-2-羟基-2-环丙基)-1-乙硫基]-苯并噻唑，即得到钙泊三醇关键手性中间体。本发明是首次使用生物酶法制备钙泊三醇关键手性中间体2-[(S)-2-羟基-2-环丙基)-1-乙硫基]-苯并噻唑，不仅产物浓度高，而且光学纯度好，反应条件温和，操作简便，易于放大，因此在药物钙泊三醇的生产中具有很好的工业应用前景。
相对于现有技术，本发明至少具有如下优点或有益效果：
本发明提供了一种基于短链羰基还原酶制备钙泊三醇关键手性中间体的方法，该方法通过使用本发明的羰基还原酶CBR54，作为一种新的短链羰基还原酶，能够催化噻唑乙酮产生手性噻唑乙醇，且产物ee值高达100％，该方法比化学还原法催化效率好，光学纯度高，反应条件温和。并将该还原酶插入表达载体pET28a(+)上，转入大肠杆菌进行异源表达。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例中重组质粒构建的流程示意图；
图2为本发明实施例中CBR54蛋白电泳图；
图3为本发明实施例中CBR54蛋白纯化与未纯化的电泳图；
图4为本发明试验例中的色谱图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本发明。
本申请提供了一种基于短链羰基还原酶制备钙泊三醇关键手性中间体的方法，其特征在于，包括如下步骤：用地下新鞘氨醇菌的短链脱氢酶SR03构建得到表达CBR54的第一基因工程菌，将表达CBR54的第一基因工程菌分离纯化培养后得到表达短链羰基还原酶的第二基因工程菌，将第二基因工程菌冷冻干燥得到CBR54粗酶粉，以CBR54粗酶粉、GDH酶粉和NADH辅酶为催化剂，以环丙基羰基甲基-苯并噻唑-2-硫醚为底物，加入缓冲液催化反应8-24h，得到2-[(S)-2-羟基-2-环丙基)-1-乙硫基]-苯并噻唑，即得到钙泊三醇关键手性中间体。该方法通过使用本发明的羰基还原酶CBR54，作为一种新的短链羰基还原酶，能够催化噻唑乙酮产生手性噻唑乙醇，且产物ee值高达100％，该方法比化学还原法催化效率好，光学纯度高，反应条件温和。并将该还原酶插入表达载体pET28a(+)上，转入大肠杆菌进行异源表达。
上述构建包括如下步骤：将地下新鞘氨醇菌的短链脱氢酶SR03进行密码子优化后克隆到载体上，得到重组质粒，将重组质粒转化到大肠杆菌表达宿主内，即得到表达CBR54的第一基因工程菌。通过密码子优化能够提高短链脱氢酶SR03的翻译效率，从而提升短链脱氢酶SR03在后续大肠杆菌宿主内的表达效率。
上述载体为pET28a，大肠杆菌表达宿主为Bl21(DE3)。大肠杆菌宿主Bl21(DE3)的染色体上由于携带有由lacUV5启动子控制的T7 RNA聚合酶基因，故在IPTG诱导下，可以高效表达T7启动子驱动的外源基因，从而促进短链还原酶CBR54的表达，且该宿主缺失lon和ompT两个蛋白酶基因，有利于短链还原酶CBR54的纯化。
上述分离纯化培养包括如下步骤：将第一基因工程菌的单菌落接种于LB培养基内后加入异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷0.25-1mM于15-30℃培养10-18h再离心收集沉淀，即得到第二基因工程菌。异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷即IPTG，通过IPTG的诱导，能够高效表达T7启动子驱动的外源基因即促进短链还原酶CBR54的表达。
将上述第一基因工程菌的单菌落接种于LB培养基内培养至OD600为0.6及以上后再加入异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷。当OD600在0.6及以上时，说明单菌落中细菌浓度较高，这样保证菌株能够与IPTG充分接触，从而保证IPTG对菌株进行诱导，以促进短链还原酶CBR54的表达。
上述粗酶粉在催化反应前还包括目的蛋白检测步骤，目的蛋白检测包括如下步骤：取部分粗酶粉和离心后得到的上清液分别进行SDS-PAGE电泳并比对，鉴定目的蛋白是否成功表达。通过检测目的蛋白是否成功表达以验证IPTG诱导是否成功以及第一工程菌是否构建成功。
上述缓冲液为Tris缓冲液或PBS缓冲液，缓冲液的pH值为6-9。使用缓冲液能够为该催化反应构建合适的反应条件，从而提高催化反应的效率。
上述催化反应的反应温度为30-40℃，催化反应的pH值为5-7。该温度和pH能够保证该催化反应的反应速度稳定且反应效率维持在较高水平。
上述CBR54粗酶粉的浓度为1-20g/L，GDH酶粉的浓度为1-10g/L，NADH辅酶的浓度为90-110mM。该浓度区间能够保证粗酶粉、GDH酶粉和NADH辅酶与底物充分混和，既不会因为催化剂过多而导致浪费，也不会因为催化剂浓度过低而影响反应速度。
上述CBR54粗酶粉与底物的重量比为1:(18-22)。该比例区间能够保证CBR54粗酶粉能够充分催化底物反应的同时，也不会导致CBR54粗酶粉由于剩余较多而产生浪费。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例
步骤1：构建表达CBR54的基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-CBR54
CBR54的基因序列如SEQ ID NO.1所示，根据其基因序列设计特异性引物CBR54-F/R，使用PCR技术进行扩增该基因，通过双酶切获得线性化载体，无缝克隆对线性化载体和基因进行连接，获得重组质粒，并使用大肠杆菌进行表达，纯化。
用于扩增目的基因的PCR引物的序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
构建重组质粒和在大肠杆菌中表达的具有步骤如下：
目的基因的提取：将合成后获得的CBR54-pUC57-DH5α菌株进行活化，并于37℃，200rpm条件下过夜培养，使用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取质粒CBR54-pUC57。
PCR扩增：以此质粒为模板，使用2×Taq Plus PCR MasterMix进行PCR扩增，该PCR扩增的体系如表1所示，PCR的扩增程序如表2所示。
表1 PCR扩增体系
试剂 体积(μL)
模板 1
F’ 1
R’ 1
2×Taq Plus PCR Master Mix 25
ddH<sub>2</sub>O 22
表2 PCR扩增程序
Figure BDA0003575090840000071
将PCR产物以1.0％琼脂糖浓度进行核酸凝胶电泳，与DNA标准Marker进行对比，将扩增的目的基因进行切割，并使用胶回收试剂盒回收产物。
线性化载体的制备：将本实验的pet28a(+)-DH5α菌株进行活化，并在37℃，200rpm条件下过夜培养，使用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取质粒pet28a(+)，使用限制性内切酶EcoRI、HindIII对pet28a质粒进行双酶切。该双酶切体系如表3所示。
表3 双酶切体系
试剂 体积(μL)
pet28a(+)质粒 34
EcoRI 1
HindIII 1
10×H buffer 4
将反应体系置于37℃金属浴进行酶切4h，65℃热失活25min后，将酶切产物进行凝胶核酸电泳，与DNA标准分子量Marker进行对比，并切割产物，使用胶回收试剂盒回收。
无缝克隆连接：将获得的PCR产物与酶切产物进行无缝克隆连接，无缝克隆的克隆体系如表4所示。
表4 无缝克隆体系
试剂 体积(μL)
Vector 4
Insert 1
2×Cloning Mix 10
ddH<sub>2</sub>O 5
依次加入上述组分，轻轻混匀后将连接体系置于50℃金属浴孵育30min后，得到重组质粒CBR54-pet28a(+)，重组质粒构建的流程示意图如图1所示。
转化：取出BL21(DE3)感受态置于冰上，待刚刚开始融化，取连接产物10μl加入感受态中，轻轻混匀后，冰浴30min，热机90s，冰浴5min，加入500ml无抗LB培养基，在37℃，200rpm条件下复苏1h后，涂布于Kan抗性LB平板，37℃过夜培养。
菌落PCR鉴定：待平板长出单克隆，随机挑选转化子于10ul无菌水中吹打混匀，取5μl沸水煮5min后离心，取上清做为模板进行菌落PCR验证；剩余5μl接种于1ml含有kan抗性的LB中进行培养，并做好标记。菌落PCR体系如表5所示。
表5 菌落PCR体系
试剂 体积(μL)
上清模板 4
F 0.5
R 0.5
2×Taq Plus PCR Master Mix 5
PCR程序与目的基因PCR扩增程序相同。
将PCR产物进行核酸凝胶电泳，与Marker比对，将对应的阳性克隆菌株送测序，准确。
步骤2，培养基因工程菌BL21(DE3)/pET28a-CBR54和诱导表达CBR54
培养、诱导、表达：将测序正确的CBR54-pET28a(+)-BL21菌株接种于含有Kan抗性的LB中进行过夜培养，再以1/100的比例接种于100mL的LB中，37℃，200rpm培养至OD600≈0.6时，加入IPTG诱导剂至终浓度为0.5mM，20℃，180rpm诱导16h后，收集菌体，用磷酸缓冲液(0.1M，pH＝7.4)洗涤菌体两次后，加入5mL的缓冲液，冰浴超声破碎10min，12000rpm离心5min后，取上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳，鉴定蛋白表达情况。
蛋白电泳图如图2所示，根据图2结果显示，在目的蛋白32KDa处有明显的特异性条带，表明重组蛋白成功表达。
纯化：将重组蛋白使用NI-IDA亲和层析柱进行纯化，使用Elution Buffer(250mM咪唑)进行洗脱，并收集洗脱液，脱盐处理后，将收集液进行SDS-PAGE，所得蛋白纯化和未纯化的蛋白电泳图如图3所示，根据图3结果所示，经纯化后的蛋白呈现单一条带，且大小与目标蛋白未纯化前一致，因此可以得出，CBR54酶可在大肠杆菌中进行高效异源表达。
步骤3，催化制备手性砌块：
称取环丙基羰基甲基-苯并噻唑-2-硫醚(Ⅰ)作为底物，使用pH＝6-9的Tris或PBS缓冲液，再加入1-20g/L的CBR54粗酶粉和1-10g/L的GDH酶粉及100mM的辅酶NADH，20-50℃反应8-24h，得到钙泊三醇关键手性中间体2-[(S)-2-羟基-2-环丙基)-1-乙硫基]-苯并噻唑(Ⅱ)，该反应的反应方程式如下所示：
Figure BDA0003575090840000101
试验例
酶还原反应体系：称取5g/L酶粉，1g/mL NADP,2g/L GDH,20g/L葡萄糖，900mLPBS充分溶解，将底物Ⅰ溶解于100mL DMSO中，混匀，30℃，150rpm反应24h。反应产物8000rpm离心5min后，取上清加入适量的乙酸乙酯进行萃取，进行TLC检测反应进程。其中在TLC检测反应中所用的展开剂为石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂，石油醚和乙酸乙酯的体积比为4:1。
反应产物选择性测定：HPLC检测使用大赛璐
Figure BDA0003575090840000102
AYH0CE-VB023(0.46cm I.D.×25cm L×5μm)手性柱，流动相为正己烷：异丙醇的体积比＝90:10，检测波长254nm，流速1.0mL/min，柱温35℃，根据峰面积来计算产物的光学纯度，所得结果如图4所示，根据图4结果计算光学纯度，所得结果如表6所示。
表6 光学纯度检测表
编号 R-产物 S-产物
CBR01 4％ 96％
CBR02 / 100％
CBR04 2.7％ 97.2％
CBR06 / 100％
CBR 19 5％ 95％
CBR 20 / 100％
CBR 54 / 100％
CBR 55 100％ /
从上述结果可以看到，CBR54可以立体选择性还原环丙基羰基甲基-苯并噻唑-2-硫醚(Ⅰ)制备钙泊三醇手性砌块2-[(S)-2-羟基-2-环丙基)-1-乙硫基]-苯并噻唑(Ⅱ)，且产物的光学纯度高，反应条件温和，操作简便，该酶可在大肠杆菌中进行高效异源表达。
表7 序列表
Figure BDA0003575090840000111
Figure BDA0003575090840000121
Figure BDA0003575090840000131
综上所述，本发明提供了一种基于短链羰基还原酶制备钙泊三醇关键手性中间体的方法：
该方法通过使用本发明的羰基还原酶CBR54，作为一种新的短链羰基还原酶，能够催化噻唑乙酮产生手性噻唑乙醇，且产物ee值高达100％，该方法比化学还原法催化效率好，光学纯度高，反应条件温和。并将该还原酶插入表达载体pET28a(+)上，转入大肠杆菌进行异源表达。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种基于短链羰基还原酶制备钙泊三醇关键手性中间体的方法，其特征在于，包括如下步骤：用地下新鞘氨醇菌的短链脱氢酶SR03构建得到表达CBR54的第一基因工程菌，将所述表达CBR54的第一基因工程菌分离纯化培养后得到表达短链羰基还原酶的第二基因工程菌，将所述第二基因工程菌冷冻干燥得到CBR54粗酶粉，以所述CBR54粗酶粉、GDH酶粉和NADH辅酶为催化剂，以所述环丙基羰基甲基-苯并噻唑-2-硫醚为底物，加入缓冲液催化反应8-24h，得到2-[(S)-2-羟基-2-环丙基)-1-乙硫基]-苯并噻唑，即得到所述钙泊三醇关键手性中间体。
2.根据权利要求1所述的基于短链羰基还原酶制备钙泊三醇关键手性中间体的方法，其特征在于，所述构建包括如下步骤：将所述地下新鞘氨醇菌的短链脱氢酶SR03进行密码子优化后克隆到载体上，得到重组质粒，将所述重组质粒转化到大肠杆菌表达宿主内，即得到所述表达CBR54的第一基因工程菌。
3.根据权利要求2所述的基于短链羰基还原酶制备钙泊三醇关键手性中间体的方法，其特征在于，所述载体为pET28a，所述大肠杆菌表达宿主为Bl21。
4.根据权利要求1所述的基于短链羰基还原酶制备钙泊三醇关键手性中间体的方法，其特征在于，所述分离纯化培养包括如下步骤：将所述第一基因工程菌的单菌落接种于LB培养基内后加入异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷0.25-1mM于15-30℃培养10-18h再离心收集沉淀，即得到所述第二基因工程菌。
5.根据权利要求4所述的基于短链羰基还原酶制备钙泊三醇关键手性中间体的方法，其特征在于，将所述第一基因工程菌的单菌落接种于LB培养基内培养至OD600为0.6及以上后再加入所述异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷。
6.根据权利要求4所述的基于短链羰基还原酶制备钙泊三醇关键手性中间体的方法，其特征在于，所述粗酶粉在所述催化反应前还包括目的蛋白检测步骤，所述目的蛋白检测包括如下步骤：取部分所述粗酶粉和所述离心后得到的上清液分别进行SDS-PAGE电泳并比对，鉴定所述目的蛋白是否成功表达。
7.根据权利要求1所述的基于短链羰基还原酶制备钙泊三醇关键手性中间体的方法，其特征在于，所述缓冲液为Tris缓冲液或PBS缓冲液，所述缓冲液的pH值为6-9。
8.根据权利要求1所述的基于短链羰基还原酶制备钙泊三醇关键手性中间体的方法，其特征在于，所述催化反应的反应温度为30-40℃，所述催化反应的pH值为5-7。
9.根据权利要求1所述的基于短链羰基还原酶制备钙泊三醇关键手性中间体的方法，其特征在于，所述CBR54粗酶粉的浓度为1-20g/L，所述GDH酶粉的浓度为1-10g/L，所述NADH辅酶的浓度为90-110mM。
10.根据权利要求9所述的基于短链羰基还原酶制备钙泊三醇关键手性中间体的方法，其特征在于，所述CBR54粗酶粉与所述底物的重量比为1:(18-22)。
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