CN110791483A - 一种短链还原酶及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种短链还原酶及其制备方法和应用。制备还原酶时，先制备具有如SEQ.ID NO.3所示基因序列的目的DNA片段；然后将该片段克隆入表达载体，得重组质粒；再将重组质粒转化感受态细胞，并将其转接到培养基中培养至OD600为0.5～0.7后，加入IPTG继续培养20～24h；最后取菌液，收集、纯化其中的可溶性蛋白，得短链还原酶。采用本发明的方法制得的短链还原酶可以克服目前酶法拆分并同步回收手性物质过程中存在的成本高、连续化生产困难、产物抑制带来的反应效率低、反应时间长等难题，使手性化合物的拆分工艺得以简化，拆分时间短，成本降低，经济可行。

Description

一种短链还原酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种短链还原酶及其制备方法和应用。

背景技术

短链还原酶(SDR)是一种NAD(P)(H)依赖酶，是一类可以将前手性的羰基化合物不对称的转化为手性醇的催化剂，通常具有250个氨基酸残基，它们能催化类固醇、醇、糖和芳香族化合物等底物。SDR是一个大家族，根据长度和辅因子结合基序不同分为经典SDR和扩展SDR，已知有约2000种形式，已经有近20个成员确定了三维结构。该家族差异很大，在成对比较中残基同一性通常为15％～30％。尽管不同成员之间的残基同一性很低，但折叠模式仍保留了大部分可重叠的肽骨架。SDR家族判断的标准是以特定方式排列的典型序列的出现。这些基序包含用于核苷酸结合的Rossmann折叠元件和活性位点的特定残基，包括其高度保守的Ser，Tyr和Lys残基三联体。Tyr151氨基酸残疾非常保守，被认为在与底物结合时是和羰基上的氧原子形成配位键，起到稳定底物-酶复合物的作用。短链脱氢酶利用NAD(P)H作为氢供体作为还原力将羰基化合物转化为相应的醇，酶法还原相对于化学法催化形成醇相比，具有反应条件温和，反应速度快等优点。而且酶催化往往具有高度的区位选择性、化学选择性和立体选择性，在反应中往往能生成一种构型的对映异构体。手性醇是合成手性药物和其他手性化合物的重要中间体，手性醇合成方法的进步有利于更好的合成手性药物。目前常用的使用水解酶类对外消旋体的底物进行不对称水解拆分具有收率低、过程复杂的缺点。

色满醇类化合物存在于自然界并具有特殊的药理活性，因此此类化合物的研究受到国内外的广泛关注。有文献报道称4-色满醇类化合物具有抗炎、抗血小板聚集和抗菌等生物活性。6-氟-4-色满醇是一种合成用于治疗糖尿病和白内障等疾病的醛糖还原酶抑制剂索比尼尔的重要中间体。由于含氟有机物具有较高的脂溶性和疏水性，可以促进其在生物体内吸收与传递速度，是生理作用发生变化，因此很多含氟药物在性能上相对具有用量少、毒性低、药效高、代谢能力强等特点。基于此，开发一种快速完全拆分色满酮的试剂和方法很有必要。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供一种短链还原酶及其制备方法和应用，以解决外消旋体水解拆分收率低、过程复杂的问题。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：提供一种短链还原酶，本发明中的短链还原酶经过以下步骤制得：

S1：制备具有如SEQ.ID NO.3所示基因序列的目的DNA片段；

CCCTTAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACGATTGCTCTCAACAATGTGGTCGCCGTCGTCACCGGCGCGGCGGGAGGCATCGGCCGCGAACTGGTCAAGGCGATGAAGGCCGCCAACGCCATCGTCATCGCCACCGACATGGCCCCCTCGGCCGATGTCGAAGGCGCGGACCATTATCTCCAGCACGACGTGACGAGCGAGGCCGGCTGGAAGGCCGTCGCGGCGCTGGCCCAGGAAAAGTACGGGCGCGTCGATGCGCTGGTGCACAACGCGGGCATCTCGATCGTCACGAAGTTCGAAGACACTCCGCTGTCCGATTTCCACCGCGTGAACACGGTCAACGTCGATTCCATCATCATCGGTACGCAGGTCCTGCTGCCGCTGCTCAAGGAAGGCGGCAAGGCGCGCGCAGGGGGCGCCTCGGTGGTCAACTTCTCCAGCGTCGCGGGCCTGCGCGGCGCGGCGTTCAATGCGGCCTATTGCACCAGCAAGGCGGCGGTGAAGATGCTCTCGAAGTGCCTCGGCGCGGAATTCGCGGCGCTCGGCTACAACATCCGCGTCAACTCCGTGCATCCGGGCGGCATCGATACCCCGATGCTCGGCTCGCTCATGGACAAGTACGTCGAACTCGGCGCTGCCCCCTCGCGCGAGGTGGCCCAGGCCGCGATGGAAATGCGCCACCCGATCGGTCGCATGGGTCGCCCTGCCGAAATGGGCGGCGGCGTGGTCTATCTCTGCTCCGACGCAGCAAGCTTCGTCACCTGCACGGAATTCGTGATGGACGGCGGCTTCAGCCAGGTCTGAGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGAGCTATTTGT(SEQ.ID NO.3)；

S2：将目的DNA片段克隆入表达载体，得重组质粒；

S3：将重组质粒转化感受态细胞，然后将其转接到培养基中培养至OD600为0.5～0.7后，加入IPTG继续培养20～24h；

S4：取经过S3培养后的菌液，收集、纯化其中的可溶性蛋白，得短链还原酶。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，目的DNA片段的制备包括以下步骤：

(1)提取鞘氨醇单胞菌Sphingomonas paucimobilis的DNA；

(2)以鞘氨醇单胞菌的短链还原酶序列为基础设计上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物的序列分别如SEQ.ID NO.1和SEQ.ID NO.2所示；

上游引物：ACAGCAAATGGGTCGCGCACCCTTAGGGGAATTGTG(SEQ.ID NO.1)，

下游引物：GCAAGCTTGTCGACGGAGCTACAAATAGCTCTTTCGGGC(SEQ.ID NO.2)；

(3)以鞘氨醇单胞菌Sphingomonas paucimobilis的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得目的DNA片段。

进一步，表达载体为pET-28a(+)质粒载体。

进一步，感受态细胞为大肠杆菌DH5α感受态。

进一步，S3中转化感受态后的重组质粒在培养基中的转接量占培养基体积的1％～3％；所加入的IPTG的终浓度为0.5mM

进一步，S4中可溶性蛋白的纯化包括以下步骤：

SS1：配制平衡缓冲液和洗脱缓冲液；所述平衡缓冲液包括0.15M的NaCl和20mM的咪唑，所述洗脱缓冲液有三种，其中，第一洗脱缓冲液包括0.15M的NaCl和50mM的咪唑，第二洗脱缓冲液包括0.15M的NaCl和100mM的咪唑，第三洗脱缓冲液包括0.15M的NaCl和300mM的咪唑；

SS2：破碎可溶性蛋白，并过Ni柱；

SS3：用平衡缓冲液洗去Ni柱上未吸附的样品；

SS4：依次用第一洗脱缓冲液、第二洗脱缓冲液和第三洗脱缓冲液冲洗经SS3处理后的Ni柱，共洗脱5～10个柱体积，收集洗脱液，即得纯化后的蛋白。

本发明制备的短链还原酶可用于催化还原色满酮生成手性色满醇，具体的还原过程包括：

(1)向磷酸缓冲液中加入终浓度为10～300mmol/L的6-氟-4-色满酮、质量百分浓度为2～15％的助溶剂和质量百分浓度为0.01～1％的重组脂肪酶，于25～30℃下反应16～24h；

(2)用萃取剂萃取反应后的混合物，取水相并调节其pH值为1，然后减压浓缩至析出结晶，得6-氟-4-色满醇。

上述过程中所用到的助溶剂为二甲基亚砜或甲醇；所用到的萃取剂为二氯甲烷。

本发明的有益效果是：

本发明制备的短链还原酶克服了目前酶法拆分并同步回收手性物质过程中，存在的成本高、连续化生产困难、产物抑制带来的反应效率低、反应时间长等难题，使手性化合物的拆分工艺得以简化，拆分时间短，成本降低，经济可行。

本发明在制备手性色满醇时，采用“一锅煮”的方式，即将底物和酶同时加入并反应，直接得到手性色满醇终产物，中间无需分离提纯。而且反应结束后，产品易于分离和纯化，使整个拆分工艺成本低、转化率高，更适合工业生产。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

实施例一：制备短链还原酶

1.将实验室保存的鞘氨醇单胞菌Sphingomonas paucimobilis使用含糖LB培养基复苏，在30℃恒温摇床中需氧培养36小时，使用紫外分光光度计测量细菌浓度。

2.细菌DNA提取，使用Universal Genomic DNA Kit(ComWin Biotech,Beijing,China)进行提取，依次包括以下步骤：

(1)取1mL菌液，加入20μL Proteinase K；

(2)加入200μL Buffer GL，涡旋震荡充分混匀，56℃水浴10分钟；

(3)短暂离心以去除管盖内壁的水珠，然后加入200μL无水乙醇，涡旋震荡充分混匀；

(4)上一个步骤中所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱(Spin ColumnsDM)中，若一次不能加完溶液，可分多次转入；12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

(5)向吸附柱中加入500μL Buffer GW1(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

(6)向吸附柱中加入500μL Buffer GW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

(7)2000rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干；

(8)将吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入100μL灭菌水，室温放置5分钟，12000rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。

3.根据GenBank中提供鞘氨醇单胞菌的短链还原酶序列，按照无缝克隆引物设计要求设计引物，上下游引物要加上15～25bp的Pet28a(+)线性载体接头处同源序列；所设计上游引物和下游引物如下：

上游引物：ACAGCAAATGGGTCGCGCACCCTTAGGGGAATTGTG(SEQ.ID NO.1)；

下游引物：GCAAGCTTGTCGACGGAGCTACAAATAGCTCTTTCGGGC(SEQ.ID NO.2)。

然后以鞘氨醇单胞菌Sphingomonas paucimobilis的基因组DNA为模板，利用聚合酶链式反应(PCR)进行基因扩增，扩增体系如下表所示，获得包含短链还原酶全长基因的PCR产物，扩增产物序列如SEQ.ID NO.3所示。

4.将目的DNA片段和Pet28a(+)线性化载体以一定的摩尔比加到PCR管中以20μL的反应体系进行重组反应。

5.5.转化受体细胞

(1)将大肠杆菌DH5α感受态从-80℃冰箱取出，置于冰上融化；

(2)100μL DH5α感受态加入10μL步骤4重组反应后的产物，冰浴30min；

(3)42℃热激90s，随后立即置于冰上冰浴3min；

(4)加入500μL无菌LB培养基，置于干式恒温金属浴上，37℃，700rpm震荡，培养1h；

(5)取100μL步骤(4)培养后的菌液，涂布在含有抗生素Kana(100μg/mL)的LB平板上，37℃恒温培养箱中倒置培养过夜；

(6)次日挑取单菌落到含有抗生素Kana(100μg/mL)的液体培养基中，在37℃恒温摇床中需氧培养至OD600>0.8；

6.吸取1mL DH5α菌液，使用细菌DNA提取试剂盒按照说明书中方法提取DNA，用pET28a(+)通用引物进行PCR扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳和测序，验证转化是否成功。

7.将转化成功的菌液转接到50mL含有抗生素Kana(100μg/mL)的液体培养基中，转接量为1mL(v/v＝2％)，37℃恒温摇床中需氧培养至OD600达到0.6。取上述培养后的菌液并加入0.5mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，随后将菌液置于25℃震荡培养过夜。

8.取4mL步骤7诱导培养后的菌液，10000rpm离心1min，弃去上清，用2mL PBSbuffer(50mM,pH＝8)重悬菌体。重悬后的菌体用超声细胞破碎仪破碎。将破碎后的细胞10000rpm离心1min，取出上清液，沉淀用2mL PBS buffer(50mM,pH＝8)重悬。上清与沉淀各取30μL，加入10μL蛋白上样缓冲液，沸水煮10min。处理后的样品用于SDS-PAGE分析。

9.可溶性蛋白的破碎

(1)收集转化成功的大肠杆菌培养发酵液，20℃，5000rpm离心8分钟，沉淀转移到离心管中，10℃，13000rpm离心1分钟，收集沉淀的菌体；

(2)取8～10g菌体加40～50ml破碎缓冲液，加入Leupeptin与Pepstantin的终浓度1μg/ml，加入TCEP的终浓度1mM/mL；

(3)把混合菌体在冰水中用超声探头破碎，超声3s，间隔8s，超声15～20min；

(4)破碎后的液体4℃、13000rpm离心10分钟，取上清，再次4℃、13000rpm离心10分钟，然后把上清和沉淀分别留样，先做上清纯化，如果沉淀中只有目标蛋白，那就用变性条件下去提取；

(5)取纯化Ni柱，清洗干净柱子，加入3～4mL镍琼脂糖凝胶，用洗瓶清洗柱子5次，再用平衡液平衡柱子2次；

(6)将柱子和上清充分结合，放置四维旋转混匀器上孵育1～2h后拿出纯化。

10.可溶性蛋白的纯化

(1)配制平衡缓冲液和洗脱缓冲液

平衡缓冲液：pH＝8.0的50mM Tris缓冲液含0.15M NaCl，含20mM咪唑。

洗脱缓冲液：①pH＝8.0的50mM Tris缓冲液含0.15M NaCl，含50mM咪唑。

②pH＝8.0的50mM Tris缓冲液含0.15M NaCl，含100mM咪唑。

③pH＝8.0的50mM Tris缓冲液含0.15M NaCl，含300mM咪唑。

(2)过柱，流出FT，取样FT。

(3)用20倍柱体积平衡缓冲液洗去未吸附的样品，流速1～2mL/min，直到流出液点样G250显示无蓝色时开始洗脱柱子上吸附的蛋白。

(4)用50mM、100mM、300mM咪唑浓度的洗脱缓冲液分阶段洗脱柱子，洗脱5～10个柱体积左右，流速1～2mL/min，4mL/管收集。

(5)将收集的各浓度梯度洗脱下来的蛋白，取样，跑SDS-Page，验证表达结果。

实施例二：短链还原酶催化还原色满酮

向pH为10左右的磷酸缓冲液中加入终浓度为200mmol/L的6-氟-4-色满酮、质量百分浓度为10％的二甲基亚砜和质量百分浓度为0.5％的实施例一中制备的短链还原酶，组成的反应体系进行反应；将反应体系置于30℃的条件下反应24h；通过HPLC监测反应；反应结束后，采用二氯甲烷萃取混合物，分别收集油相和水相；然后用1N盐酸将水相酸化至pH为1，减压浓缩水相，至有结晶析出，再缓慢加热，至晶体完全析出，得化合物一；用盐水洗涤有机相，并旋蒸除去二氯甲烷，得化合物二。采取高效液相分别对化合物一和化合物二进行检测，谱图中均出现单一峰(ee大于99％)，表明化合物一和化合物二均为纯净的手性化合物，并且比照对照样品的出峰位置可以得知，化合物一为R构型的醇类化合物，化合物二为S构型的酯类化合物，即由水相中结晶得到的化合物为6-氟-4-色满醇。高效液相色谱(手性柱-Chirasil-OD-H)分析，测定底物转化率和还原产物的ee值。具体分析条件为：柱温度25℃，流动相为正己烷-异丙醇(95：1)，流速1.0ml/ml，检测波长254nm。

虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。

序列表

<110> 西南交通大学

<120> 一种短链还原酶及其制备方法和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acagcaaatg ggtcgcgcac ccttagggga attgtg 36

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcaagcttgt cgacggagct acaaatagct ctttcgggc 39

<210> 3

<211> 961

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cccttagggg aattgtgagc ggataacaat tcccctctag aaataatttt gtttaacttt 60

aagaaggaga tatacatatg acgattgctc tcaacaatgt ggtcgccgtc gtcaccggcg 120

cggcgggagg catcggccgc gaactggtca aggcgatgaa ggccgccaac gccatcgtca 180

tcgccaccga catggccccc tcggccgatg tcgaaggcgc ggaccattat ctccagcacg 240

acgtgacgag cgaggccggc tggaaggccg tcgcggcgct ggcccaggaa aagtacgggc 300

gcgtcgatgc gctggtgcac aacgcgggca tctcgatcgt cacgaagttc gaagacactc 360

cgctgtccga tttccaccgc gtgaacacgg tcaacgtcga ttccatcatc atcggtacgc 420

aggtcctgct gccgctgctc aaggaaggcg gcaaggcgcg cgcagggggc gcctcggtgg 480

tcaacttctc cagcgtcgcg ggcctgcgcg gcgcggcgtt caatgcggcc tattgcacca 540

gcaaggcggc ggtgaagatg ctctcgaagt gcctcggcgc ggaattcgcg gcgctcggct 600

acaacatccg cgtcaactcc gtgcatccgg gcggcatcga taccccgatg ctcggctcgc 660

tcatggacaa gtacgtcgaa ctcggcgctg ccccctcgcg cgaggtggcc caggccgcga 720

tggaaatgcg ccacccgatc ggtcgcatgg gtcgccctgc cgaaatgggc ggcggcgtgg 780

tctatctctg ctccgacgca gcaagcttcg tcacctgcac ggaattcgtg atggacggcg 840

gcttcagcca ggtctgagga tccgaattcg agctccgtcg acaagcttgc ggccgcactc 900

gagcaccacc accaccacca ctgagatccg gctgctaaca aagcccgaaa gagctatttg 960

t 961

Claims (10)

1.一种短链还原酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：制备具有如SEQ.ID NO.3所示基因序列的目的DNA片段；

S2：将目的DNA片段克隆入表达载体，得重组质粒；

S3：将重组质粒转化感受态细胞，然后将其转接到培养基中培养至OD600为0.5～0.7后，加入IPTG继续培养20～24h；

S4：取经过S3培养后的菌液，收集、纯化其中的可溶性蛋白，得短链还原酶。

2.根据权利要求1所述的短链还原酶的制备方法，其特征在于，所述目的DNA片段的制备包括以下步骤：

(1)提取鞘氨醇单胞菌Sphingomonas paucimobilis的DNA；

(2)以鞘氨醇单胞菌的短链还原酶序列为基础设计上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物的序列分别如SEQ.ID NO.1和SEQ.ID NO.2所示；

(3)以鞘氨醇单胞菌Sphingomonas paucimobilis的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得目的DNA片段。

3.根据权利要求1所述的短链还原酶的制备方法，其特征在于：所述表达载体为pET-28a(+)质粒载体。

4.根据权利要求1所述的短链还原酶的制备方法，其特征在于：所述感受态细胞为大肠杆菌DH5α感受态。

5.根据权利要求1所述的短链还原酶的制备方法，其特征在于：S3中转化感受态后的重组质粒在培养基中的转接量占培养基体积的1％～3％；所加入的IPTG的终浓度为0.5mM。

6.根据权利要求1所述的短链还原酶的制备方法，其特征在于，S4中可溶性蛋白的纯化包括以下步骤：

SS1：配制平衡缓冲液和洗脱缓冲液；所述平衡缓冲液包括0.15M的NaCl和20mM的咪唑，所述洗脱缓冲液有三种，其中，第一洗脱缓冲液包括0.15M的NaCl和50mM的咪唑，第二洗脱缓冲液包括0.15M的NaCl和100mM的咪唑，第三洗脱缓冲液包括0.15M的NaCl和300mM的咪唑；

SS2：破碎可溶性蛋白，并过Ni柱；

SS3：用平衡缓冲液洗去Ni柱上未吸附的样品；

SS4：依次用第一洗脱缓冲液、第二洗脱缓冲液和第三洗脱缓冲液冲洗经SS3处理后的Ni柱，共洗脱5～10个柱体积，收集洗脱液，即得纯化后的蛋白。

7.采用权利要求1～6任一项所述的制备方法制备的短链还原酶。

8.如权利要求7所述的短链还原酶在制备手性色满醇中得到应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

(1)向磷酸缓冲液中加入终浓度为10～300mmol/L的6-氟-4-色满酮、质量百分浓度为2～15％的助溶剂和质量百分浓度为0.01～1％的重组脂肪酶，于25～30℃下反应16～24h；

(2)用萃取剂萃取反应后的混合物，取水相并调节其pH值为1，然后减压浓缩至析出结晶，得6-氟-4-色满醇。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述助溶剂为二甲基亚砜或甲醇；所述萃取剂为二氯甲烷。