WO2018126469A1 - 一种熊去氧胆酸的制备方法及其制备用酶2 - Google Patents

一种熊去氧胆酸的制备方法及其制备用酶2 Download PDF

Info

Publication number
WO2018126469A1
WO2018126469A1 PCT/CN2017/070605 CN2017070605W WO2018126469A1 WO 2018126469 A1 WO2018126469 A1 WO 2018126469A1 CN 2017070605 W CN2017070605 W CN 2017070605W WO 2018126469 A1 WO2018126469 A1 WO 2018126469A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
steroid dehydrogenase
ursodeoxycholic acid
seq
amino acid
acid sequence
Prior art date
Application number
PCT/CN2017/070605
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
刘立辉
傅荣昭
刘滔滔
曹磊
彭亭
Original Assignee
深圳市邦泰绿色生物合成研究院
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 深圳市邦泰绿色生物合成研究院 filed Critical 深圳市邦泰绿色生物合成研究院
Priority to CN201780001726.9A priority Critical patent/CN107980064B/zh
Priority to PCT/CN2017/070605 priority patent/WO2018126469A1/zh
Publication of WO2018126469A1 publication Critical patent/WO2018126469A1/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C12P33/02—Dehydrogenating; Dehydroxylating
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01201—7-Beta-hydroxysteroid dehydrogenase (NADP+) (1.1.1.201)

Definitions

  • the present invention relates to the field of molecular biology and biotechnology, and more particularly to a method for preparing ursodeoxycholic acid by using a biological enzyme catalytic technique and a 7 ⁇ -steroid dehydrogenase for preparation thereof.
  • Ursodeoxycholic acid is the main active ingredient of the precious Chinese medicine bear bile. It has the effect of increasing bile acid secretion, changing bile composition, facilitating the gradual dissolution of cholesterol in gallstones, and lowering cholesterol and cholesterol in bile. Mainly used to treat gallstone disease. As we all know, bear bile is a very scarce resource, because the traditional way of its acquisition is mainly dependent on the method of artificially breeding live bears. At present, this traditional method with long cycle, low yield and inhumanity is gradually replaced by synthetic methods.
  • An object of the present invention is to provide a novel preparation method of ursodeoxycholic acid, which solves the problem of residual organic solvents, harsh conditions, and long reaction time in the prior preparation methods mentioned in the above background art.
  • the invention has the disadvantages of cumbersome operation, environmental pollution, and the like, and the present invention provides a biological enzyme suitable for the new preparation method.
  • the specific forms of the two enzymes used in the above methods include liquid enzyme solution, solid state, and various immobilized enzymes, which may be in the form of unpurified crude enzyme, or may be partially purified or completely purified. .
  • the catalytic process is controlled at a temperature of 25 to 35 ° C and a pH of 7.5 to 8.5.
  • the buffer solution is a 50-100 mM potassium phosphate buffer.
  • the above preparation method further comprises the following purification step: after the end of the catalytic process, the pH is adjusted to 10.5 to 12.5, the insoluble matter is removed, and the pH is adjusted to 1.0 to 2.0, and the water bath is 50-60°. C, stirring for 20 ⁇ 30min, after cooling, filtering, washing three times with water and then vacuum drying to obtain the finished product of ursodeoxycholic acid.
  • the above preparation method further comprises the following refining step: using the obtained ursodeoxycholic acid product as 10-20 times absolute ethanol 50-60. Under reflux with C water bath, 0.5-lh, heat filtration, take the filtrate and vacuum to concentrate to 1/4 - 1 / 5 volume, then add 5-10 times pure water for 1 hour to crystallize, filter, filter cake vacuum drying , that is, the refined product of ursodeoxycholic acid.
  • the 7 ⁇ -steroid dehydrogenase used in the above preparation method is a protein of the following (a) or (b):
  • amino acid sequence is a protein derived from (a) having a high parental 7 ⁇ -steroid dehydrogenase catalytic activity as shown in SEQ ID NO: 2.
  • the 7 ⁇ -steroid dehydrogenase has at least one mutation selected from at least one of the following positions compared to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2: 66th, 67th Bit, 90th, 91st, 150th, 153th, and 200th.
  • the 7 ⁇ -steroid dehydrogenase has at least one of the following mutations: D66N, L67K, Y90 W, V91A, A150I, I153K and D200N.
  • the present invention also provides a 7 ⁇ -steroid dehydrogenase, characterized in that: the 7 ⁇ -steroid dehydrogenase is derived from Enterococ cm silesiacus for catalyzing 3 ⁇ -hydroxy-7 oxo-5 ⁇ -biliary Preparation of ursodeoxycholic acid from an alkanoic acid, the 7 ⁇ -steroid dehydrogenase being a protein of (a) or (b) below:
  • NO: 2 is a parent-derived 7 ⁇ -steroid dehydrogenase catalytically active protein derived from (a).
  • the 7 ⁇ -steroid dehydrogenase has at least one mutation selected from at least one of the following positions compared to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2: 66th , 67th , 90th , 91st
  • the 7 ⁇ -steroid dehydrogenase has at least one of the following mutations: D66N, L67K, Y90W, V91A, A150I, I153K, and D200N.
  • the method provided by the invention has the advantages of simple operation, mild and easy control of reaction conditions, short reaction time, no use of organic solvent, no toxicity and no pollution.
  • the invention has the advantages of low cost, and has been proved by practice that the reaction time of the method provided by the invention only needs 8 ⁇ 15 hours, the conversion rate of the substrate is more than 99.6%, and the content of the obtained product is above 98.5%.
  • the present invention screens a 7 ⁇ -steroid dehydrogenase gene suitable for extracellular biocatalysis to prepare ursodeoxycholic acid, and optimizes on the basis of the sequence to obtain an activity enhancement and substrate removal inhibition. Mutant enzymes, these mutant enzymes exhibit high selectivity such that the method does not form by-products, and the high catalytic activity and high specificity of these mutant enzymes make the cost of mass production of ursodeoxycholic acidase more Low, with high industrial application value.
  • the reaction solution was diluted 50 to 100 times with the mobile phase at regular intervals, and the liquid phase was analyzed by microfiltration. Liquid phase testing using Phen omenx Gemini 110 ⁇ 250x4.6mm for the analytical column, the mobile phase is acetonitrile: buffer solution
  • the specific forms of the two enzymes used in the above methods include liquid enzymes, solid enzymes, and various immobilized enzymes, either in the form of unpurified crude enzymes or in partially or completely purified form. .
  • the 7 ⁇ -steroid dehydrogenase gene BHSDH5 derived from Enterococc silesiac and the glucose dehydrogenase gene GDH derived from Bacillus megaterium are utilized, respectively.
  • AAGA3' and 5'CCGCTCGAGTTAGCCTCTTCCCGTTTGGA3' were obtained by PCR amplification technique and then digested, and inserted into the expression vector pET22b (+) fe l and E CO R
  • the I site and the EcoR I site and the Xho I site were co-expressed with the recombinant plasmid pET22b-BHSDH5-GDH.
  • the nucleotide sequence of the cloned parent 7 ⁇ -steroid dehydrogenase is determined by DNA sequencing as shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence thereof is shown in SEQ ID NO: 2; determining the cloned parental glucose
  • the nucleotide sequence of the hydrogenase is shown in SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence thereof is shown in SEQ ID NO: 4.
  • the PCR system is: TaKaRa EX Taq HS 0.25ul; ⁇ Taq Buffer
  • the PCR procedure is: First 98. C2min; then 98. C10s, 50-65 ° C 30s, 72. C7min, 30 cycles
  • Example 3 The parental and mutant co-expression recombinant plasmids prepared in Example 1 and Example 2 were separately transferred into Escherichia coli Ro setta (de3), and the obtained recombinant Escherichia coli was inoculated into a small volume of LB medium (containing 10 (Vg/mL of Amp), after 30 ⁇ 37 °C overnight culture, transfer to a volume of LB medium (containing 10 (Vg/mL of Amp), in 30 ⁇ with an inoculation amount of 1 ⁇ 5 ⁇ 3 ⁇ 4
  • the OD 600 was further cultured at 37 ° C to reach 0.6 to 1.0, and isopropyl- ⁇ -D-thiogalactoside (IPTG) was added at a final concentration of 0.1 mM to 1 M, and the expression was induced at 20 to 37 ° C for 8 to 20 hours.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactoside
  • fermenting cells were collected. fermenting cells were suspended in a volume of 50 ⁇ 100mM potassium phosphate buffer (pH8.0) and ultrasonic lysing, centrifugation and that was containing glucose dehydrogenase parent steroid dehydrogenase 7 ⁇ - or 7 and A crude enzyme solution of a ⁇ -steroid dehydrogenase mutant, which can be used for the determination of enzyme activity and biocatalytic preparation of ursodeoxycholic acid.
  • pH8.0 potassium phosphate buffer
  • a crude enzyme solution of a ⁇ -steroid dehydrogenase mutant which can be used for the determination of enzyme activity and biocatalytic preparation of ursodeoxycholic acid.
  • 7 ⁇ -steroid dehydrogenase enzyme activity assay method using 3ot-hydroxy-7 ox-5 ⁇ -cholanoic acid as a substrate, adding 10uL of 150 mM 3a-hydroxy-7 oxo in a 3 mL reaction system -5 ⁇ -cholanoic acid, lOOuL diluted enzyme solution, NADP+ final concentration of 0.2 mM, reacted at pH 8.0 and 25 ° C for a certain period of time, measured at 340 nm The absorbance increases.
  • Glucose dehydrogenase enzyme activity assay method using glucose as a substrate, adding 100 uL of 50 mM glucose, lOOuL of diluted enzyme solution in a 3 mL reaction system, NADPH final concentration of 0.2 mM, at pH 8.0 and The reaction at 25 ° C was constant, and the decrease in absorbance was measured at 340 nm.
  • the crude enzyme solution prepared in Example 3 is used, and the input amount of the enzyme solution is controlled by the weight of the enzyme solution in the whole reaction system, and the substrate 3d is controlled.
  • the final concentration of -hydroxy-7 oxo-5 ⁇ -cholanoic acid was 100 mg/mL, and the other specific parameters are shown in Table 3. After the reaction was carried out for 8 ⁇ 15h, the substrate conversion rate was above 99.6%, the finished product content was above 98.5%, and the yield was 86 ⁇ 92%.
  • the reaction was carried out at 25 ° C, 250 rpm and pH 8.0 for 12 h, and the conversion rate was 99.8 ⁇ 3 ⁇ 4.
  • the finished product of ursodeoxycholic acid was dried to obtain 55.8 g.
  • the obtained ursodeoxycholic acid product was dissolved in 800 ml of absolute ethanol, 60. After stirring for 1 hour in a water bath, the mixture was filtered, and the filter cake was washed with a small amount of ethanol.
  • the filtrate was concentrated to a concentration of 200 ml under reduced pressure. Then, 2 L of pure water was added and stirred for 1 hour, filtered, and the filter cake was washed three times with water, and the obtained cake was dried by vacuum. 50.6 g of ursodeoxycholic acid refined product.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种利用生物酶催化技术制备熊去氧胆酸的方法及其制备用7β-类固醇脱氢酶。该方法以3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸为底物，在NADP、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶以及缓冲溶液存在的条件下，用7β-类固醇脱氢酶催化3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸制备熊去氧胆酸，其中7β-类固醇脱氢酶来源于肠球菌 Enterococcus silesiacus。该方法操作简单、反应条件温和易控、反应时间短、对底物的转化率高达99.6%以上，所获得的产品的含量在98.5%以上。

Description

一种熊去氧胆酸的制备方法及其制备用酶 2 技术领域
[0001] 本发明涉及分子生物学与生物技术领域， 特别涉及一种利用生物酶催化技术制 备熊去氧胆酸的方法及其制备用 7β-类固醇脱氢酶。
背景技术
[0002] 熊去氧胆酸是名贵中药熊胆的主要有效成分， 具有增加胆汁酸分泌、 并使胆汁 成分改变、 有利于胆结石中的胆固醇逐渐溶解、 降低胆汁中胆固醇及胆固醇脂 等功效， 主要用于治疗胆石疾病。 众所周知， 熊胆是一种非常稀缺的资源， 原 因在于其获取的传统途径主要是依赖于人工养殖活熊取胆的方法。 目前， 这种 周期长、 收率低且不人道的传统途径逐渐被人工合成方法所取代。
[0003] 起初， 熊去氧胆酸的人工合成方法多为化学法， 并且被广泛应用于工业生产中 。 但是化学法存在操作条件苛刻、 选择性低、 污染环境、 使用大量有机溶剂、 存在有机溶剂残留、 有毒有害等缺点。 为了解决化学法存在的诸多缺点， 人们 另辟蹊径， 寻找更好的生产途径。 中国发明专利申请 CN105368828A公幵了一种 采用全细胞催化制备 3α-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸熊去氧胆酸的方法， 但是此种方法 需进行细胞发酵培养， 存在反应吋间长、 操作繁琐、 产物复杂等缺点。
技术问题
[0004] 本发明的目的在于提供一种熊去氧胆酸的新的制备方法， 以解决上述背景技术 中提到的现有制备方法所存在的有机溶剂残留、 条件苛刻、 反应吋间长、 操作 繁琐、 污染环境等缺点， 本发明同吋提供了该新制备方法适用的生物酶。
问题的解决方案
技术解决方案
[0005] 为实现上述目的， 发明人经过长期大量的实验摸索， 在经历上百次的失败尝试 之后， 终于筛选出适用于细胞外生物催化制备熊去氧胆酸的生物酶， 并在此序 列基础上进行优化， 获得了活性提高和去除底物抑制的突变体酶， 从而幵发出 一种新的制备熊去氧胆酸的方法， 其特征在于： 以 3α-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸为底 物， 在 NADP、 葡萄糖、 葡萄糖脱氢酶以及缓冲溶液存在的条件下， 用 7β-类固 醇脱氢酶催化 3d-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸制备熊去氧胆酸， 所述 7β-类固醇脱氢酶 来源于肠球菌 Enterococcus silesiacus， 所述葡萄糖脱氢酶来源于巨大芽孢杆菌 Bacillus megaterium , 其基因序列如 SEQ ID NO: 3所示， 在整个催化反应体系中 ， 所述底物的浓度为 50〜100mg/mL， 所述 NADP的浓度为 0.01〜0.25mg/mL， 所 述葡萄糖的浓度为 30〜50mg/mL。
[0006] 上述方法中所使用的两种酶的具体存在形式包括液态酶液、 固态以及各种固定 化酶， 可以是未经纯化的粗酶形式， 也可以是经部分纯化或完全纯化的形式。
[0007] 优选地， 控制所述催化过程在温度为 25〜35°C， pH值为 7.5〜8.5的条件下进行
[0008] 优选地， 所述缓冲溶液为 50〜100mM磷酸钾缓冲液。
[0009] 优选地， 上述制备方法还包括如下提纯步骤： 待所述催化过程反应结束后， 调 节 pH值为 10.5〜12.5， 除去不溶物， 再调节 pH值为 1.0〜2.0， 水浴 50-60°C， 搅拌 20〜30min， 待冷却后过滤、 经水洗三次后真空干燥即得熊去氧胆酸的成品。
[0010] 更优选地， 上述制备方法还包括如下精制步骤： 将获得的熊去氧胆酸的成品用 10-20倍无水乙醇 50-60。C水浴条件下搅拌回流 0.5-lh， 热过滤， 取滤液进行真空 减压浓缩至 1/4- 1/5体积， 再加入 5-10倍纯水搅拌 lh进行结晶， 过滤， 将滤饼真空 干燥， 即得熊去氧胆酸的精制品。
[0011] 优选地， 上述制备方法中所使用的 7β-类固醇脱氢酶为如下 （a) 或 （b) 的蛋 白质：
[0012] (a) 其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 2所示的蛋白质，
[0013] (b) 在 （a) 限定的氨基酸序列中经过取代、 缺失或添加一个或几个氨基酸并 且在 NADP存在下以 3ot-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸为底物具有比氨基酸序列如 SEQ ID NO : 2所示的亲本高的 7β-类固醇脱氢酶催化活性的由 （a) 衍生的蛋白质。
[0014] 更优选地， 所述 7β-类固醇脱氢酶与如 SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列相比在 选自至少一个下述位点处具有至少一个突变： 第 66位、 第 67位、 第 90位、 第 91 位、 第 150位、 第 153位以及第 200位。
[0015] 更优选地， 所述 7β-类固醇脱氢酶具有至少一个下述突变： D66N、 L67K、 Y90 W、 V91A、 A150I、 I153K以及 D200N。
[0016] 本发明还提供了一种 7β-类固醇脱氢酶， 其特征在于： 所述 7β-类固醇脱氢酶来 源于肠球菌 Enterococcm silesiacus , 用于催化 3α-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸制备熊去 氧胆酸， 所述 7β-类固醇脱氢酶为如下 （a) 或 （b) 的蛋白质：
[0017] (a) 其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 2所示的蛋白质，
[0018] (b) 在 （a) 限定的氨基酸序列中经过取代、 缺失或添加一个或几个氨基酸并 且在 NADP存在下以 3ot-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸为底物具有比氨基酸序列如 SEQ ID
NO : 2所示的亲本高的 7β-类固醇脱氢酶催化活性的由 （a) 衍生的蛋白质。
[0019] 优选地， 所述 7β-类固醇脱氢酶与如 SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列相比在选 自至少一个下述位点处具有至少一个突变： 第 66位、 第 67位、 第 90位、 第 91位
、 第 150位、 第 153位以及第 200位。
[0020] 优选地， 所述 7β-类固醇脱氢酶具有至少一个下述突变： D66N、 L67K、 Y90W 、 V91A、 A150I、 I153K以及 D200N。
发明的有益效果
有益效果
[0021] 1、 与现有的熊去氧胆酸的制备方法相比， 本发明提供的方法具有操作简单、 反应条件温和易控、 反应吋间短、 不使用有机溶剂、 无毒无污染且成本低廉的 优点， 经实践证明， 本发明提供的方法的反应吋长仅需 8〜15小吋， 其对底物的 转化率高达 99.6%以上， 所获得的产品的含量在 98.5%以上。
[0022] 2、 本发明筛选出了适用于细胞外生物催化制备熊去氧胆酸的 7β-类固醇脱氢酶 基因， 并在此序列基础上进行优化， 获得了活性提高和去除底物抑制的突变体 酶， 这些突变体酶表现出高的选择性使得该方法不会形成副产物， 这些突变体 酶的高催化活性和高专一性使得熊去氧胆酸酶法大规模生产的成本更低， 具有 较高的工业应用价值。
本发明的实施方式
[0023] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明， 以下实施例是对本发明的 解释， 本发明并不局限于以下实施例， 实施例中未注明具体条件者， 按常规条 件或制造商建议的条件进行。
[0024] 本发明提供的熊去氧胆酸的制备方法的具体实施过程如下：
[0025] 将 3α-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸悬浮于 50〜100mM磷酸钾缓冲液 （pH8.0) 中， 用 1 0M的 NaOH调节 pH到 8.0， 再加入终浓度为 30〜50mg/mL的葡萄糖并用 10M的 Na OH调节 pH到 7.8〜8.0， 加入 7β-类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶， 最后加入终浓度 为 0.01〜0.25mg/mL的 NADP, 底物终浓度为 50〜100mg/mL， 反应在温度 25〜35 °C、 200〜400rpm和 pH7.5〜8.5进行， 反应吋间为 8〜15h。 每隔一定吋间取反应 液用流动相稀释 50〜100倍， 微孔过滤后进样进行液相分析。 液相检测使用 Phen omenx Gemini
Figure imgf000005_0001
110Α 250x4.6mm为分析柱， 流动相为乙腈：缓冲溶液
(取磷酸二氢钠 0.78g,溶解 1L水中， 用磷酸调 pH值为 3， 即可） ：甲醇 =30:37:40 ， 用 0.45um滤膜过滤后备用。 柱温为 40°C， 示差检测器 （RID) ， 流速为 0.8mIJ min。 待催化过程反应结束后， 在快速搅拌的情况下加入 5〜10M的 NaOH调整反 应液的 pH值为 10.5〜12.5， 过滤取滤液， 滤液滴加盐酸至 pH值为 1.0〜2.0， 水浴 5 0-60°C， 搅拌 20〜30min， 待冷却后过滤、 经水洗三次后真空干燥即得熊去氧胆 酸的成品。 再将成品用 10-20倍无水乙醇 50-60°C水浴条件下搅拌回流 0.5-lh， 热 过滤， 取滤液进行真空减压浓缩至 1/4- 1/5体积， 再加入 5-10倍纯水搅拌 lh进行结 晶， 过滤， 将滤饼真空干燥过夜， 即得熊去氧胆酸的精制品。
[0026] 上述方法中所使用的两种酶的具体存在形式包括液态酶、 固态酶以及各种固定 化酶， 可以是未经纯化的粗酶形式， 也可以是经部分纯化或完全纯化的形式。
[0027] 实施例 1
[0028] 含有亲本基因的共表达重组质粒 pET22b-BHSDH5-GDH的制备
[0029] 将来源于肠球菌 Enterococc silesiac ) 的 7β-类固醇脱氢酶基因 BHSDH5和 来源于巨大芽孢杆菌 Bacillus megaterium) 的葡萄糖脱氢酶基因 GDH分别利用
CCTCTTCCCGTTTGGA3'
AAGA3'和 5'CCGCTCGAGTTAGCCTCTTCCCGTTTGGA3'通过 PCR扩增技术获 得 PCR产物后经过酶切处理， 同吋插入到表达载体 pET22b (+) 的 fe l和 ECOR I位点以及 EcoR I位点和 Xho I位点， 得到共表达重组质粒 pET22b-BHSDH5-GDH 。 经 DNA测序， 确定该被克隆的亲本 7β-类固醇脱氢酶的核苷酸序列如 SEQ ID NO : 1所示， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 2所示； 确定该被克隆的亲本葡萄糖 脱氢酶的核苷酸序列如 SEQ ID NO: 3所示， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO : 4所示
[0030] 实施例 2
[0031] 含有 7β-类固醇脱氢酶突变体的共表达重组质粒的制备
[0032] 通过反向 PCR技术对 7β-类固醇脱氢酶亲本进行定点突变， 在突变位置通过设计 反向引物， 利用上下游突变引物扩增目的片段， 并在引物上引入相应突变， 以 重组质粒 pET22b-BHSDH5-GDH作为模板进行反向 PCR， PCR产物经 Dpn I酶消 化模板处理后转化到大肠杆菌 RoSetta(de3)， 经过 Amp的筛选后挑取菌落送测序 。 突变位点及引物设计如表 1所示。
[0033] PCR体系为： TaKaRa EX Taq HS 0.25ul; ΙΟχΕχ Taq Buffer
5ul; 模板质粒 lul; dNTP (2.5mM each) 4ul; 上游引物 lul;下游引物 lul; 无菌 水 up to 50 ul。
[0034] PCR程序为： 首先 98。C2min; 然后 98。C10s， 50-65°C30s , 72。C7min， 30个循环
； 最后 72°C10min。
[0035] 表 1
[]
[表 1]
Figure imgf000007_0001
[0036] 实施例 3
[0037] 酶液的制备
[0038] 将实施例 1和实施例 2制备的亲本和突变体共表达重组质粒分别转入大肠杆菌 Ro setta(de3), 再将获得的重组大肠杆菌接种在小体积的 LB培养基 （含有 10(Vg/mL 的 Amp) ， 30〜37°C过夜培养后， 以 1〜5<¾的接种量转接到一定体积的 LB培养 基中 （含有 10(Vg/mL的 Amp) ， 在 30〜37°C继续培养 OD 600达到 0.6〜1.0加入终 浓度为 0.1mM〜lmM的异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)， 在 20〜37°C诱导表达 8 〜20h后离心收集菌体。 发酵菌体悬浮于一定体积的 50〜100mM的磷酸钾缓冲液 (pH8.0) 中并超声波破胞， 离心即得含有葡萄糖脱氢酶与 7β-类固醇脱氢酶亲本 或者与 7β-类固醇脱氢酶突变体的粗酶液， 可用于酶活力的测定以及熊去氧胆酸 的生物催化制备。
[0039] 实施例 4
[0040] 酶活力的测定
[0041] 7β-类固醇脱氢酶的酶活测定方法： 以 3ot-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸为底物， 在一 个 3mL的反应体系中加入 lOuL的 150mM3a-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸， lOOuL的稀释 酶液， NADP+终浓度为 0.2mM， 在 pH8.0和 25°C反应一定吋间， 在 340nm处测定 吸光值增加。
[0042] 葡萄糖脱氢酶的酶活测定方法： 以葡萄糖为底物， 在一个 3mL的反应体系中加 入 lOOuL的 50mM葡萄糖， lOOuL的稀释酶液， NADPH终浓度为 0.2mM， 在 pH8.0 和 25°C反应一定吋间， 在 340nm处测定吸光值减少。
[0043] 酶活力的测定结果如表 2所示， 其中 GDH为葡萄糖脱氢酶， 7p-HSDH为 7β-类固 醇脱氢酶。
[0044] 表 2
[] [表 2]
Figure imgf000008_0001
[0045] 实施例 5
[0046] 熊去氧胆酸的制备
[0047] 参照前述熊去氧胆酸的制备方法的具体实施过程， 使用实施例 3制备的粗酶液 ， 酶液的投入量以酶液的重量占整个反应体系的体积计， 控制底物 3d-羟基 -7氧 代 -5β-胆烷酸的终浓度为 100mg/mL， 其余各具体参数如表 3所示。 反应 8〜15h后 测得， 底物转化率在 99.6%以上， 成品含量在 98.5%以上， 收率为 86〜92%。
[0048] 表 3
[] [表 3]
Figure imgf000009_0001
[0049] 实施例 6
[0050] 熊去氧胆酸的制备
[0051] 总体系 1L， 取 50g含量为 99%的 3α-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸， 悬浮于 lOOmM的磷 酸钾缓冲液 （pH8.0) ，用 lO M NaOH的调节 pH到 8.0后加入终浓度 45g/L的葡萄糖 ， 并依次加入 0.1g7p-类固醇脱氢酶冻干粉 （D200N突变体酶） 和 0.07g葡萄糖脱 氢酶冻干粉， 最后加入终浓度为 0.15g/L的 NADP, 底物终浓度为 50g/L。 在 25°C 、 250rpm和 pH8.0左右进行反应 12h， 转化率达 99.8<¾。 反应结束后， 在快速搅拌 的情况下加入 lOM NaOH至 pH为 12.5， 过滤取滤液， 滤液滴加盐酸至 pH值为 1.0 ， 水浴 55°C， 搅拌 30min， 待冷却后过滤、 经水洗三次后真空干燥得到熊去氧胆 酸的成品 55.8g。 再将得到的熊去氧胆酸的成品用 800ml无水乙醇溶解， 60。C水浴 条件下搅拌 lh， 热过滤， 并用少量乙醇洗涤滤饼， 取滤液进行减压浓缩至 200ml ， 再加入 2L纯水搅拌 lh， 过滤， 并用水洗滤饼三次， 所得滤饼通过真空干燥后 得到熊去氧胆酸的精制品 50.6g。

Claims

权利要求书
一种熊去氧胆酸的制备方法， 其特征在于： 以 3d-羟基 -7氧代 -5β-胆烷 酸为底物， 在 NADP、 葡萄糖、 葡萄糖脱氢酶以及缓冲溶液存在的条 件下， 用 7β-类固醇脱氢酶催化 3(x-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸制备熊去氧 胆酸， 所述 7β-类固醇脱氢酶来源于肠球菌 Enterococcus silesiacus , 所述葡萄糖脱氢酶来源于巨大芽孢杆菌 Bacillus megaterium， 其基因 序列如 SEQ ID NO: 3所示， 在整个催化反应体系中， 所述底物的浓 度为 50〜100mg/mL， 所述 NADP的浓度为 0.01〜0.25mg/mL， 所述葡 萄糖的浓度为 30〜50mg/mL。
根据权利要求 1所述的熊去氧胆酸的制备方法， 其特征在于： 控制所 述催化过程在温度为 25〜35°C， pH值为 7.5〜8.5的条件下进行。 根据权利要求 1所述的熊去氧胆酸的制备方法， 其特征在于： 所述缓 冲溶液为 50〜 lOOmM磷酸钾缓冲液。
根据权利要求 1所述的熊去氧胆酸的制备方法， 其特征在于， 所述制 备方法还包括如下提纯步骤： 待所述催化过程反应结束后， 调节 pH 值为 10.5〜12.5， 除去不溶物， 再调节 pH值为 1.0〜2.0， 水浴 50-60°C ， 搅拌 20〜30min , 待冷却后过滤、 经水洗三次后真空干燥即得熊去 氧胆酸的成品。
根据权利要求 1至 4任一项所述的熊去氧胆酸的制备方法， 其特征在于 所述 7β-类固醇脱氢酶为如下 （a) 或 （b) 的蛋白质：
(a) 其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 2所示的蛋白质，
(b) 在 ) 限定的氨基酸序列中经过取代、 缺失或添加一个或几个 氨基酸并且在 NADP存在下以 3ot-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸为底物具有比 氨基酸序列如 SEQ ID NO: 2所示的亲本高的 7β-类固醇脱氢酶催化活 性的由 ) 衍生的蛋白质。
根据权利要求 5所述的熊去氧胆酸的制备方法， 其特征在于所述 7β-类 固醇脱氢酶与如 SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列相比在选自至少一 个下述位点处具有至少一个突变： 第 66位、 第 67位、 第 90位、 第 91位 、 第 150位、 第 153位以及第 200位。
根据权利要求 6所述的熊去氧胆酸的制备方法， 其特征在于所述 7β-类 固醇脱氢酶具有至少一个下述突变： D66N、 L67K、 Y90W、 V91A、 A150I、 I153K以及 D200N。
一种 7β-类固醇脱氢酶， 其特征在于： 所述 7β-类固醇脱氢酶来源于肠 球菌 Enterococc silesiacus , 用于催化 3α-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸制备 熊去氧胆酸， 所述 7β-类固醇脱氢酶为如下 （a) 或 （b) 的蛋白质：
(a) 其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 2所示的蛋白质，
(b) 在 （a) 限定的氨基酸序列中经过取代、 缺失或添加一个或几个 氨基酸并且在 NADP存在下以 3ot-羟基 -7氧代 -5β-胆烷酸为底物具有比 氨基酸序列如 SEQ ID NO: 2所示的亲本高的 7β-类固醇脱氢酶催化活 性的由 （a) 衍生的蛋白质。
根据权利要求 8所述的 7β-类固醇脱氢酶， 其特征在于所述 7β-类固醇 脱氢酶与如 SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列相比在选自至少一个下 述位点处具有至少一个突变： 第 66位、 第 67位、 第 90位、 第 91位、 第 150位、 第 153位以及第 200位。
根据权利要求 9所述的 7β-类固醇脱氢酶， 其特征在于所述 7β-类固醇 脱氢酶具有至少一个下述突变： D66N、 L67K、 Y90W、 V91A、 A15 01、 I153K以及 D200N。
PCT/CN2017/070605 2017-01-09 2017-01-09 一种熊去氧胆酸的制备方法及其制备用酶2 WO2018126469A1 (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201780001726.9A CN107980064B (zh) 2017-01-09 2017-01-09 一种熊去氧胆酸的制备方法及其制备用酶2
PCT/CN2017/070605 WO2018126469A1 (zh) 2017-01-09 2017-01-09 一种熊去氧胆酸的制备方法及其制备用酶2

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/CN2017/070605 WO2018126469A1 (zh) 2017-01-09 2017-01-09 一种熊去氧胆酸的制备方法及其制备用酶2

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018126469A1 true WO2018126469A1 (zh) 2018-07-12

Family

ID=62006138

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/CN2017/070605 WO2018126469A1 (zh) 2017-01-09 2017-01-09 一种熊去氧胆酸的制备方法及其制备用酶2

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN107980064B (zh)
WO (1) WO2018126469A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115521964A (zh) * 2022-09-19 2022-12-27 湖北共同生物科技有限公司 一种甾体激素药物中间体的制备方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108546691B (zh) * 2018-05-09 2020-02-21 华东理工大学 7β-羟基甾醇脱氢酶突变体及其在制备熊脱氧胆酸中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102994604A (zh) * 2012-11-21 2013-03-27 上海凯宝药业股份有限公司 两步酶促法制备结合态熊去氧胆酸的方法
CN106086149A (zh) * 2016-06-20 2016-11-09 苏州汉酶生物技术有限公司 一种化学‑酶法制备熊去氧胆酸的方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105274070B (zh) * 2015-10-20 2019-01-22 苏州天绿生物制药有限公司 7β-羟基类固醇脱氢酶突变子及其应用和合成方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102994604A (zh) * 2012-11-21 2013-03-27 上海凯宝药业股份有限公司 两步酶促法制备结合态熊去氧胆酸的方法
CN106086149A (zh) * 2016-06-20 2016-11-09 苏州汉酶生物技术有限公司 一种化学‑酶法制备熊去氧胆酸的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE Protein [O] 27 November 2016 (2016-11-27), "Hypothetical protein [Enterococcus silesiacus]", XP055518943, Database accession no. WP-071876048 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115521964A (zh) * 2022-09-19 2022-12-27 湖北共同生物科技有限公司 一种甾体激素药物中间体的制备方法
CN115521964B (zh) * 2022-09-19 2024-04-12 湖北共同生物科技有限公司 一种甾体激素药物中间体的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN107980064A (zh) 2018-05-01
CN107980064B (zh) 2021-07-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106636285B (zh) 一种熊去氧胆酸的制备方法及其制备用酶
JP2021509804A (ja) 生体内変換によるタウロウルソデオキシコール酸の調製方法およびその応用
WO2017185549A1 (zh) 一种制备烟酰胺单核苷酸的方法2
WO2018023209A1 (zh) 一种制备烟酰胺单核苷酸的方法
CN105274070A (zh) 7β-羟基类固醇脱氢酶突变子及其应用和合成方法
CN111407780A (zh) 一种人工熊胆粉的制作工艺
WO2018023210A1 (zh) 一种制备烟酰胺单核苷酸的方法
CN114015712A (zh) 一种熊去氧胆酸的制备方法
WO2018126469A1 (zh) 一种熊去氧胆酸的制备方法及其制备用酶2
WO2018126468A1 (zh) 一种熊去氧胆酸的制备方法及其制备用酶1
WO2018126466A1 (zh) 一种3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的制备方法及其制备用酶1
CN106520889B (zh) 一种3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的制备方法及其制备用酶3
CN106609292B (zh) 一种3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的制备方法及其制备用酶
CN109679978B (zh) 一种用于制备l-2-氨基丁酸的重组共表达体系及其应用
CN109694892B (zh) 制备红景天苷的方法和试剂盒
CN113528607B (zh) 一种化学-酶法制备螺内酯的方法
CN110791483B (zh) 一种短链还原酶及其制备方法和应用
CN110004121B (zh) 一种胆固醇氧化酶及其应用
WO2018126467A1 (zh) 一种3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的制备方法及其制备用酶2
CN108796021B (zh) 一种工程菌及其用于制备睾丸酮的用途
CN112645952A (zh) 一种(r)-(+)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的合成方法
CN115786292B (zh) 一种3β-羟基甾体脱氢酶及其在制备去氢表雄酮中的应用
CN114621965B (zh) 一种3-甾酮-δ1-脱氢酶突变体及应用
CN116254279B (zh) 一种利用双酶级联重组大肠杆菌催化木糖醇生物合成l-木糖的方法
CN112553174B (zh) 一种脱氢酶在(r)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤制备中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17889882

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

32PN Ep: public notification in the ep bulletin as address of the adressee cannot be established

Free format text: NOTING OF LOSS OF RIGHTS PURSUANT TO RULE 112(1) EPC (EPO FORM 1205A DATED 22/11/2019)

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 17889882

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1