CN111407780A - 一种人工熊胆粉的制作工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药领域，涉及一种熊胆粉的制作工艺，具体涉及一种人工熊胆粉的制作工艺。本方案通过使用含细胞活性物质的转化液，解决了酶的纯化步骤复杂且成本高和酶活不易保持的技术问题。采用本方案进行禽畜胆粉的生物转化后，获得的人工熊胆粉的牛磺熊去氧胆酸和牛磺鹅去氧胆酸比例与天然熊胆粉近似，本方案的人工熊胆粉可以作为天然熊胆粉的替代品进行精深加工和进一步应用。采用本方案生产的人工熊胆粉产品批次差异小，采用本工艺可将生产过程标准化，并且提升转化效率，可工业化放大生产。

Description

一种人工熊胆粉的制作工艺

技术领域

本发明涉及生物医药领域，涉及一种熊胆粉的制作工艺，具体涉及一种人工熊胆粉的制作工艺。

背景技术

熊胆粉，由熊科动物黑熊或棕熊干燥胆囊胆汁得到，是名贵中药材，有2000余年的入药历史，大量处方中都含有熊胆成分。熊胆粉具有解痉、抗惊厥、抗炎及溶胆石等作用，是保肝护胆的良药。各种现代临床实践应用也表明，熊胆能够治疗多种肝胆疾病。由于野生熊资源有限，现在普遍使用人工养殖“引流取胆”的方法生产熊胆粉(即天然熊胆粉)。目前，我国每年的天然熊胆粉产量约30吨，无法满足人们日益增长的健康需求。

为了解决天然熊胆粉短缺的问题，大量人工熊胆粉应运而生，例如：以其他动物胆为原料，将其中的牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)通过化学或生物方法转化为牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)，获得人工熊胆粉。中国发明专利CN201410588581.5，以禽畜胆汁直接冷冻干燥制得的禽畜胆粉为原料，用固定化的7α-羟基类固醇脱氢酶和固定化的7β-羟基类固醇脱氢酶进行生物转化后，制得人工熊胆粉。此种方法，底物(禽畜胆粉)成分复杂，对两种酶的酶活造成了较大影响，需要将生物转化所用到的酶固定到壳聚糖载体上制成固定化酶柱，步骤繁琐，成本高昂，反应体系不易放大。并且在对酶进行固定化处理之前，纯化富集上述两种酶的过程也较为复杂和耗时。现有技术的人工熊胆的生物转化存在酶的纯化步骤复杂且成本高和酶活不易保持的问题，使得工艺不易放大，严重影响了人工熊胆粉的制备效率，无法满足市场对人工熊胆粉的需求。

发明内容

本发明意在提供一种人工熊胆粉的制作工艺，通过使用含有两种酶的菌悬液或者上清液作为转化液，解决了酶的纯化步骤复杂且成本高和酶活不易保持的技术问题。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种人工熊胆粉的制作工艺，包括用于将牛磺鹅去氧胆酸转换为牛磺熊去氧胆酸的生物转化步骤：包括含有禽畜胆粉、转化缓冲液和转化液的转化体系；所述转化液为包含酶菌体的菌悬液或者包含酶菌体的原生质体的上清液；所述酶菌体表达有7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶。

本方案的原理及优点是：本方案直接使用酶菌体或酶菌体裂解后的上清液进行禽畜胆粉的生物转化，经生物转化后获得的反应液经后续处理之后，可获得人工熊胆粉。本方案的生物转化过程使得禽畜胆粉中的一定量的牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)转化为牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)。牛磺鹅去氧胆酸向牛磺熊去氧胆酸转化的过程具体是：在7α-羟基类固醇脱氢酶的催化作用下，牛磺鹅去氧胆酸转换为中间体牛磺7-酮石胆酸(T-7-KLCA)；牛磺7-酮石胆酸再在7β-羟基类固醇脱氢酶的催化下转换成牛磺熊去氧胆酸。经转化后的禽畜胆粉(即人工熊胆粉)的功效成分组成和天然熊胆粉的功效成分保持一致(在天然熊胆粉中，TUDCA/TCDCA＝1.1-1.5：1)。在本方案中，禽畜胆粉是指从禽类或者畜类动物的胆中提取胆汁等物质，再制备获得禽畜胆粉。本方案的工程菌的构建的大致过程为：将7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶两种酶的基因构建在表达载体上，再将表达载体转入菌(例如大肠杆菌)中，从而制备获得工程菌。酶菌体是诱导工程菌大量繁殖并表达7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶而形成。

7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶的活性受外界环境(特别是酶促反应进行的环境)影响较大。特别是在本方案的含有大量禽畜胆粉的转化体系中，由于禽畜胆粉含有较多杂质(特别是一些对7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶具有毒性或抑制作用的物质)，对这两种酶的活性带来了较大的抑制作用，较为严重地影响了禽畜胆粉的生物转化过程。现有技术中，为了减少禽畜胆粉对酶活的影响，研究人员采用了用壳聚糖固定酶的方法。但是，现有的方案步骤繁琐，成本高昂，反应体系不易放大。发明人尝试了多种方法来避免禽畜胆粉中的杂质对7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶的酶活的影响，发现酶菌体的原生质体(其中含有大量生物活性物质)对抵抗转化体系中的毒性环境有较好的作用。传统观念认为，将酶提取纯化和富集之后，足量的酶可以和底物充分结合。但是在含有禽畜胆粉的转化体系中，杂质(禽畜胆粉中非牛磺鹅去氧胆酸的部分被认为是杂质)对这两种酶形成一定的抑制，阻碍了两种酶与目的化合物(牛磺鹅去氧胆酸以及反应中间体牛磺7-酮石胆酸)的结合，影响了催化效率。当使用菌悬液或者上清液作为两种酶的载体的时候，酶菌体或者原生质体对酶形成保护，阻碍了杂质对酶活性的影响，但是，酶菌体或者原生质体并未阻碍酶和牛磺鹅去氧胆酸等目的成分的结合，仍然可以对底物进行有效催化。

本方案使用两种酶同时催化禽畜胆粉的生物转化，不同于现有技术中的分步转化的过程，容易产生较多的中间体牛磺7-酮石胆酸。发明人在生产实践的过程中发现，在大量底物(禽畜胆粉)存在的情况下，7β-羟基类固醇脱氢酶的活性受到较大的影响，导致反应中间体牛磺7-酮石胆酸不能被7β-羟基类固醇脱氢酶转化为牛磺熊去氧胆酸，中间体增多，影响最终产物的品质。但是由于本方案使用转化液，工程菌的原生质体内的活性物质对7β-羟基类固醇脱氢酶具有较强保护作用(比对7α-羟基类固醇脱氢酶的保护作用更强)，该酶催化反应中间体牛磺7-酮石胆酸形成牛磺熊去氧胆酸的效率更高。采用本方案的制备方法，中间体牛磺7-酮石胆酸在最终产物中的含量非常低，提升了产品质量。

综上所示，本方案的有益效果在于：

(1)由于转化液的使用，酶的活性得到保证，催化禽畜胆粉生物转化的效率提升，提高了人工熊胆粉中的牛磺熊去氧胆酸的含量。

(2)在禽畜胆粉溶液中，加入菌悬液或者上清液进行转化，不用再进行酶的纯化步骤，避免纯化过程中引入外源性杂质，节约了时间和经济成本。

(3)相对于壳聚糖固定化酶的现有技术中的方案，本方案的转化过程能够按比例进行放大，放大后转化效果可控，易于工业化放大生产。

(4)本方案的转化体系中不含有培养基等成分，体系黏度低，可以在体系中加入较为大量的底物(禽畜胆粉)，实现一次性对大量底物的生物转化。

(5)生物转化后，牛磺熊去氧胆酸和牛磺鹅去氧胆酸比例与天然熊胆粉近似，本工艺的产品可以作为天然熊胆粉的替代品进行精深加工。

进一步，所述菌悬液的制备方法为：将酶菌体分散于转化缓冲液中，获得菌悬液；所述上清液的制备方法为：对所述菌悬液中的酶菌体进行破碎处理后，离心获得上清液。

采用上述方案，菌悬液和上清液的制备方法简单，适合于扩大生产。

进一步，所述酶菌体为表达有7α-羟基类固醇脱氢酶的工程菌A和表达有7β-羟基类固醇脱氢酶的工程菌B组成的混合物；或者所述酶菌体为同时表达有7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶两种酶的工程菌C。

采用上述方案，工程菌C共表达两种酶，或者工程菌A和B分别表达7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶，两种方式均可实现对底物的催化转化。

进一步，每10g酶菌体使用20-100ml转化缓冲液分散，获得菌悬液；表达有7α-羟基类固醇脱氢酶的工程菌A和表达有7β-羟基类固醇脱氢酶的工程菌B的质量比为1:10-1:2。

采用上述方案，上述用量的酶菌体可提供足量的7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶，以催化禽畜胆粉的生物转化过程。使用的酶菌体量过大，催化反应已达到饱和，成本的增加并不能增加催化效果；用量过少转化效果差，达不到预期的转化比例。

采用配比为1:10-1:2的A类工程菌和B类工程菌，可产生合理配比的7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶，催化反应向牛磺熊去氧胆酸方向进行(该反应是一种可逆反应)。

进一步，所述转化缓冲液为0-15mM的甘氨酸缓冲液；所述转化液的体积为转化体系的体积的1/5-4/5。

采用上述方案，转化缓冲液为0-15mM的甘氨酸缓冲液，降低了转化反应中甘氨酸的使用浓度，减少了甘氨酸杂质的引入。发明人发现甘氨酸缓冲液的浓度过高会降低酶活，降低最终产品质量。转化液的体积为转化体系的体积的1/5-4/5，上述用量的转化液中含有足够量的7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶，可催化禽畜胆粉的生物转化过程。用量过少，酶的量过少，不足以进行充分酶促反应；用量过多，酶的催化作用已趋于饱和，导致酶的浪费。

进一步，辅酶Ⅰ或者辅酶Ⅱ在转化体系中的浓度为0.1-5mM，禽畜胆粉在转化体系中的浓度为50-250g/L。

采用上述方案，由于本方案采用了菌悬液或者上清液作为转化液，并且不含培养基，整个体系黏度小，较为大量的底物(禽畜胆粉)也能在本转化体系中实现分散，进而对底物进行酶促催化。

进一步，所述转化体系的pH值为6.0-9.0；所述转化体系的pH值为6.0-9.0；所述转化体系进行酶促反应的温度为20-30℃，时长为2-24h。

采用上述方案，上述参数范围符合酶促反应适合的反应条件，可保证催化反应的顺利进行，使得禽畜胆粉充分转化为人工熊胆粉。

进一步，7α-羟基类固醇脱氢酶的基因的序列为SEQ ID NO:1；7β-羟基类固醇脱氢酶的基因的序列为SEQ ID NO:3；控制7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶的基因的表达的操纵子均为乳糖操纵子。

采用上述方案，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3均为经密码子改造的基因，使得7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶可在大肠杆菌中大量表达，获得富集这两种酶的酶菌体。乳糖操纵子为常规控制基因表达的操纵子，易于制备和获取。

进一步，在所述生物转化步骤之前还包括发酵步骤：使用IPTG诱导工程菌A表达7α-羟基类固醇脱氢酶，并使用IPTG诱导工程菌B表达7β-羟基类固醇脱氢酶；或者使用IPTG诱导工程菌C同时表达7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶。

采用上述方案，经过IPTG诱导发酵，使得7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶大量表达，以供后续的生物转化过程使用。

进一步，在所述生物转化步骤之后还包括人工熊胆粉制备步骤：转化体系经生物转化步骤的酶促反应获得反应液，除去所述反应液中的沉淀，再经浓缩获得浸膏；使用乙醇溶液分散浸膏，获得浸膏分散液；除去浸膏分散液中的沉淀，经浓缩和干燥处理之后获得人工熊胆粉。

采用上述方案，通过乙醇处理，除去物料中的酶菌体和蛋白等成分，提高人工熊胆粉中的目的成分的浓度。

具体实施方式

实施例1：工程菌的制备

对7α羟基类固醇脱氢酶基因S1-a-1和7β羟基类固醇脱氢酶基因Y1-b-1进行大肠杆菌表达密码子优化，加入亲和标签，并进行全基因合成。优化后的7α羟基类固醇脱氢酶基因S1-a-1在本文中简称为7α-类固醇脱氢酶基因，记为7α-HSDH(SEQ ID NO:1)；优化后的7β羟基类固醇脱氢酶基因Y1-b-1在本文中简称7β-类固醇脱氢酶基因，记为7β-HSDH(SEQ IDNO:3)。

1.表达载体的构建

a)含有7α-类固醇脱氢酶基因的重组质粒pET28a-7α-HSDH的制备

将7α-HSDH(DNA序列：SEQ ID NO:1，编码的蛋白质序列：SEQ ID NO:2)，用引物对5′-GGAATTCCATATGGGCAGCAGCCATCATCA-3′(SEQ ID NO:5)和5′-TCCCTCGAGTTAACGGCTGCGCTCCATCAT-3′(SEQ ID NO:6)通过PCR进行扩增，用Nde I和Xho I酶切，用Dpn I酶(甲基化模板消化酶)消化模板。用Nde I和Xho I酶切pET28a载体。用连接酶连接7α-类固醇脱氢酶基因片段和pET28a载体，获得连接产物。使用连接产物转化DH5α，涂布在卡那霉素抗性的LB平板进行筛选。待菌落形成后，挑选单克隆，接种到5mL LB中进行过夜培养。收集菌体，用天根质粒提取试剂盒提取质粒，送测序。保存测序正确的质粒，获得质粒pET28a-7α-HSDH。

b)含有7β-类固醇脱氢酶基因的重组质粒pET28a-7β-HSDH的制备

将7β-HSDH(DNA序列：SEQ ID NO:3，编码的蛋白质序列：SEQ ID NO:4)用引物对5′-CGGGATCCATGGGCAGCAGCCATCATCA-3′(SEQ ID NO:7)和5′-CGGAATTCTTATTTCTCGTAAAAGGAACC-3′(SEQ ID NO:8)通过PCR进行扩增，用BamH I和EcoR I酶切，用Dpn I酶消化模板。用BamH I和EcoR I酶切pET28a载体。用连接酶连接7β-类固醇脱氢酶基因片段和载体，获得连接产物。使用连接产物转化DH5α，涂布在卡那霉素抗性的LB平板进行筛选。待菌落形成后，挑选单克隆，接种到5mL LB中进行过夜培养。收集菌体，用天根质粒提取试剂盒提取质粒，送测序，保存测序正确的质粒，获得质粒pET28a-7β-HSDH。

c)含有7α-类固醇脱氢酶基因和7β-类固醇脱氢酶基因的重组质粒pETDuet-1-7α-HSDH/7β-HSDH的制备

将7α-HSDH用引物对SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6通过PCR进行扩增，用Nde I和XhoI酶切，用Dpn I酶消化模板。将上述测序正确的pETDuet-1载体用Nde I和Xho I酶切，用连接酶连接7α-类固醇脱氢酶基因片段和载体，获得连接产物。使用连接产物转化DH5α，涂布在氨苄抗性的LB平板进行筛选。待菌落形成后，挑选单克隆，接种到5ml LB中进行过夜培养。收集菌体，用天根质粒提取试剂盒提取质粒，送测序。保存测序正确的质粒，获得质粒pETDuet-1-7α-HSDH。

将7β-HSDH用引物对SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8通过PCR进行扩增，用BamH I和EcoR I酶切，用Dpn I酶消化模板。用BamH I和EcoR I酶切pETDuet-1-7α-HSDH-载体。用连接酶连接7β-类固醇脱氢酶基因片段和载体，获得连接产物。使用连接产物转化DH5α，涂布在氨苄抗性的LB平板进行筛选。挑选单克隆，接种到5mL LB中进行过夜培养。收集菌体，用天根质粒提取试剂盒提取质粒，送测序。保存测序正确的质粒，获得质粒pETDuet-1-7α-HSDH/7β-HSDH。

2、工程菌构建

将pET28a-7α-HSDH和pET28a-7β-HSDH，以及pETDuet-1-7α-HSDH/7β-HSDH分别转化入大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞中，得到三种工程菌，分别命名为工程菌A(含pET28a-7α-HSDH)、工程菌B(pET28a-7β-HSDH)和工程菌C(含有pETDuet-1-7α-HSDH/7β-HSDH)。

实施例2：工程菌的发酵表达

(1)菌种制备

工程菌A和工程菌B的菌液分别涂布卡那抗性的LB平板，工程菌C的菌液涂布氨苄抗性的LB平板，待形成菌落后，挑选单克隆，分别接种至5mL含有卡那或氨苄的LB培养基中，37℃，220rpm，进行培养，OD值为0.8-1.2时，加入1mM IPTG诱导2h，SDS-PAGE检测表达量，选取表达量高的克隆，作为中间菌种(中间菌种A、中间菌种B和中间菌种C)进行保藏。

取20μL含有重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)菌种(三种中间菌种：中间菌种A、中间菌种B和中间菌种C)，分别接种至200mL卡那或氨苄抗性LB培养基中，37℃，220rpm，过夜培养，OD₆₀₀值为2.5-4.0。取20mL培养液接种至1L卡那或氨苄抗性培养基中，37℃，140rpm，培养3小时，OD₆₀₀值为1时，加入0.5mM IPTG诱导过夜表达，然后离心收集菌体，分别获得菌种A(含有pET28a-7α-HSDH)、菌种B(含有pET28a-7β-HSDH)和菌种C(pETDuet-1-7α-HSDH/7β-HSDH)。

(2)大量发酵表达

取20μL菌种A、菌种B或者菌种C，接种至200mL卡那或氨苄抗性LB培养基中，37℃，220rpm，过夜培养，OD₆₀₀值为2.5-4.0。取20mL培养液接种至1L卡那或氨苄抗性培养基中，37℃，140rpm，过夜培养。将10L种子液无菌接种至装有200L大肠杆菌高密度发酵培养基的发酵罐中，37℃，通气搅拌培养8小时后，向发酵罐中加入终浓度为0.5mM的IPTG溶液进行诱导，诱导10-12h后发酵结束，放液，离心收集菌体并4℃保存，分别获得酶菌体A(由菌种A经上述过程获得)、酶菌体B(由菌种B经上述过程获得)和酶菌体C(由菌种C经上述过程获得)。

7α-类固醇脱氢酶的酶活测定方法：以牛磺鹅去氧胆酸为底物，在一个3mL的反应体系中加入2.97mL的100mM磷酸缓冲液(pH8.0)，终浓度0.5mM的牛磺鹅去氧胆酸，10μL的梯度稀释的粗酶液，终浓度0.5mM的NADP+，在pH8.0和25℃反应1min，在340nm处测定吸光值变化情况，然后计算7α-类固醇脱氢酶的酶活。粗酶液的制备方法为：取10g菌体(酶菌体A或B)重悬于100mM磷酸盐缓冲液中，超声破碎，过滤取上清得到粗酶液。7β-类固醇脱氢酶的酶活测定方法：以牛磺熊去氧胆酸为底物，在一个3mL的反应体系中加入2.97mL的100mM磷酸缓冲液，终浓度0.5mM的牛磺熊去氧胆酸，10μL的梯度稀释的粗酶液，终浓度0.5mM的NADP+，在pH8.0和25℃反应1min，在340nm处测定吸光值变化情况，然后计算7β-类固醇脱氢酶的酶活。经计算，酶菌体A中7α-类固醇脱氢酶的酶活与酶菌体B中7β-类固醇脱氢酶的酶活，酶活符合后续应用需求，说明酶菌体均能用于进行人工熊胆的生物转化。

实施例3：禽胆粉的制备

禽胆粉的制备的工艺路线为：将新鲜禽畜胆或解冻禽畜胆用绞肉机切开，过100目筛取液相部分(主要是胆汁)，在液相部分中加入90-95％乙醇至乙醇终浓度为60-85％，离心或过滤去除沉淀，上清液经减压浓缩和真空干燥制得禽胆粉。

在本实施例中具体为：取20Kg解冻鸡胆，用绞肉机切开，用100目不锈钢滤网及多层100目尼龙网过滤，取液相，将液相部分减压除水至膏状(密度控制在1.10±0.05g/ml)，膏体中加入25L 95％乙醇混匀后过夜，3800rpm离心5min去除沉淀，上清液经减压除水至膏状、真空干燥制得鸡胆粉。使用HPLC-ELSD，依照《中国药典(2015)》(GBT16631-2008高效液相色谱法通则)进行检测，鸡胆粉中TCDCA含量为61.3％。

实施例4：生物转化以及人工熊胆粉的制备(100L反应体系)

将禽胆粉转化成熊胆粉的工艺为：将禽畜胆粉溶解于0-15mM甘氨酸缓冲液中，加入0.1-5mM的NADP+，加入转化液，然后补加20-100mM甘氨酸缓冲液至最终体积，用氢氧化钠调节pH至6.0-9.0，获得转化体系，然后20-30℃，反应2-24h，即可完成生物转化，获得转化完成的反应液。以上转化反应过程中，底物(禽畜胆粉)的浓度为50-250g/L。其中，转化液为酶菌体A和酶菌体B(两种酶菌体的混合菌)分散在甘氨酸缓冲液后形成的菌悬液。每10g酶菌体A和酶菌体B组成的混合菌使用20-100ml甘氨酸缓冲液分散，获得菌悬液。也可以为对酶菌体A和酶菌体B组成的混合菌进行破碎处理，经过滤后取上清，上清即为转化液。酶菌体A和酶菌体B的质量比为1:10-1:2。转化液的加入量为整个转化体系的1/5-4/5。也可以使用酶菌体C代替酶菌体A和酶菌体B的混合物。

离心或过滤转化完成的反应液，去除沉淀，上清液减压浓缩至膏状(膏状反应液)，加入膏状反应液体积的4-10倍的90-95％乙醇至乙醇终浓度为60-85％，离心或过滤去除沉淀，上清液经减压浓缩、真空干燥得人工熊胆粉。

在本实施例中具体为：将20kg鸡胆粉溶解于40L的15mM甘氨酸缓冲液中，加入5mMNADP+，加入转化液，补加15mM甘氨酸缓冲液至100L，用5M NaOH调节pH至6.5，获得转化体系。25℃，反应16h。转化液经0.22um滤膜过滤澄清，上清液浓缩成膏状(50L，密度控制在1.10±0.05g/ml)，再加入250L 95％乙醇混匀后过夜，醇沉液经0.22um滤膜过滤澄清，上清液经减压浓缩、真空干燥制得人工熊胆粉。转化液的制备方法为在甘氨酸缓冲液中加入酶菌体，每10g酶菌体使用50ml甘氨酸缓冲液分散，获得菌悬液，菌悬液即为转化液。转化液的加入量为转化体系的体积的3/5。酶菌体包括酶菌体A(表达有7α-羟基类固醇脱氢酶的A类工程菌)和酶菌体B(表达有7β-羟基类固醇脱氢酶的B类工程菌)两种，两者的质量比为1:5。

使用HPLC-ELSD，依照《中国药典(2015)》(GBT16631-2008高效液相色谱法通则)进行检测，本实施例中的人工熊胆粉中TUDCA含量32.0％，TCDCA含量26.5％，T-7-KLCA含量1.4％。

实施例5-实施例11的生物转化以及人工熊胆粉的制备过程同实施例4，不同点在于具体参数的选择，详见表1。在转化液类型中，Ⅰ型是指将酶菌体分散于转化缓冲液中，获得菌悬液，所述菌悬液为转化液，Ⅱ型是指将酶菌体分散于转化缓冲液中，获得菌悬液，然后对酶菌体进行破碎处理后，离心取上清液，所述上清液为转化液。在Ⅱ型转化液中，使用800-1200bar的压力对酶菌体进行破碎处理，然后12000-25000rpm离心0.5-2h取上清液。上述条件(参数范围)均能有效地将酶菌体破碎，并将酶菌体的原生质体和细胞壁分离，具体实施时，选择一具体参数即可。上述条件可以将酶菌体的原生质体和细胞壁分离，获得具有催化活性的上清液。上清液中含有7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶，原生质体中的各种活性物质对这两种酶形成包裹和保护，使得这两种酶免受禽畜胆粉中的杂质的干扰，顺利催化禽畜胆粉向人工熊胆粉的生物转化过程。在实施例10中，转化缓冲液浓度为0mM，即使用的是去离子水，转化体系不具有自调节pH值的能力，需要实时监测反应体系的pH值，并调整pH值至7.0(至少维持在6.0-9.0之间)。在实施例11中，使用的是酶菌体C，而不是酶菌体A和酶菌体B的混合物。

对比例1-对比例4的生物转化以及人工熊胆粉的制备过程同实施例4，不同点在于具体参数的选择，详见表1。在对比例4中，没有使用甘氨酸缓冲液，而是使用一般培养基以维持酶菌体活性，该培养基具体为LB培养基。在对比例1中，禽畜胆粉只加入了5kg，是因为酶菌体的用量过大，体系中无法再溶解过多的禽畜胆粉。

表1：实施例4-11，以及对比例1-4的参数选择列表

对实施例1-实施例11以及对比例1-对比例4中制备的人工熊胆粉进行HPLC检测，结果如表2所示。由实验结果可知，实施例1-11制备的人工熊胆粉的TUDCA和TCDCA的含量比例均符合天然熊胆粉的含量比例范围，TUDCA的含量符合《中国药典(2015)》对于熊胆粉的规定，并且中间产物T-7-KLCA的含量低，证明了工艺生物转化效率高，获得的最终产品的品质有保证。对比例1的酶菌体用量较大，但是对反应效率并没有很大的提升作用。对比例2的酶菌体使用量过小，导致催化作用不能充分进行，获得的人工熊胆粉各项指标离实施例1-11有一定差距。对比例3中使用了高浓度的甘氨酸缓冲液，对催化作用产生了一定抑制，导致获得的人工熊胆粉各项指标不符合理想。对比例4利用培养基代替甘氨酸缓冲液，培养基的使用是用来维持细胞活性，避免细胞在仅有缓冲液的环境中出现应激状态(可能会影响酶的活性)。但是，培养基的加入并没有提升反应效率，反而使得最终产物的质量变差，不管是TUDCA/TCDCA还是中间体的含量，均离理想状态相差甚远。说明培养基并不利于酶与底物的结合，细胞的活性高并不利于其产生的7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶对底物的催化作用。

表2：HPLC检测以及计算结果

实验例1

为验证使用本方案的转化液的催化效果与纯化的酶的催化效果的区别，在本实验例中，同样酶活的条件下，测试了两种转化液和纯化的酶的催化能力。

待测物的制备：

在第一测试组中，将酶菌体A或B分别加入15mM甘氨酸缓冲液中(每10g酶菌体A或B中分别加入50ml甘氨酸缓冲液)，1000bar高压破碎，20000rpm离心1h取上清液，使用Ni柱亲和纯化(质粒构建的时候已经加入亲和标签)，即可获得纯化的酶(分别获得7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶)。在第二测试组中，将酶菌体A或B分别加入15mM甘氨酸缓冲液中(每10g酶菌体A或B中分别加入50ml甘氨酸缓冲液)，1000bar高压破碎，20000rpm离心1h取上清液即得(两种：含7α-羟基类固醇脱氢酶的上清液和含7β-羟基类固醇脱氢酶的上清液)。在第三测试组中，将酶菌体A或B加入15mM甘氨酸缓冲液中(每10g酶菌体A或B中分别加入50ml甘氨酸缓冲液)即得(两种：含7α-羟基类固醇脱氢酶的菌悬液和含7β-羟基类固醇脱氢酶的菌悬液)。参照实施例2的方法测定上述2×3种待测物的酶活，并按照酶活来两两复配三组中的两种溶液，获得三组待测物。复配的过程为：将7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶依照酶活混合，确保第一测试组的待测物中的酶活组成为7α-类固醇脱氢酶2000U和7β-类固醇脱氢酶100U。同理复配出第二测试组的待测物和第三测试组的待测物。然后使用三种待测物催化禽胆粉的生物转化。本实验例的催化反应使用2g禽胆粉作为底物，转化体系为10ml，pH6.5，反应温度25℃，催化时间16h，缓冲液浓度10mM，NADP+含量2mM。结果如表3所示。

表3：催化能力检测结果

如上表所示，相同的反应体系中分别加入总酶活相等的三种待测物转化反应，第三测试组和第二测试组TUDCA/TCDCA和TUDCA的含量均大于第一测试组，可见在高浓度禽胆粉的环境中，菌悬液或上清液更能保障酶的活性和稳定性，对转化效果更有利。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

SEQUENCE LISTING

<110> 重庆极泽生物科技有限公司

<120> 一种人工熊胆粉的制作工艺

<130> 2020.05.28

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 831

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgggcagca gccatcatca tcatcatcat aaaaagctag aagataaagt agctataatc 60

acggcggcga ccaaaggtat tggtcttgcc tcagctgagg tgttggcaga gaatggcgcg 120

ttggtgtaca tcgcggcgcg tagcgaagag ctggcgaaag aggttatttc caacatcgag 180

agcaacggtg gcagagcaaa gttcgtgtac ttcaacgcac gtgaaccgca gacctatacc 240

acgatggttg aaactgtagc gcagaacgaa ggccgtctgg acatcctggt taacaactat 300

ggtgaaacca atgttaaact ggatcgtgac ctggtgaatg gcgataccga agagtttttc 360

cgcattgtcc aggataatct gcaaagtgtt tacctgccga gcaaagcggc gattccgcgt 420

atggcaaaga acggcggcgg tagcattgtg aacatctcga ccattggttc cgtggtgcca 480

gatctgggtc gcatcgcgta ctgcgtgagc aaggctgcga tcaacagcct gacgcagaat 540

atcgcgctcc aatacgcacg ccagggtgtt cgttgtaatg cggtcttacc gggtttgatc 600

ggcaccaagg ctgctatgga gaacatgacc gatgaatttc gtgactcttt tctgcgtcac 660

gttccgatta accgcgtggg gaaaccggaa gacatcgcca aggcggtttt gtactacgct 720

tctgacgact ccgactatgt taccggtatg attcatgaag tcgccggtgg ctatgccctg 780

ggctcgccgc aatatgcgga gttcagcgca atgatggagc gcagccgtta a 831

<210> 2

<211> 276

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Glu Ser Ser His His His His His His Lys Lys Leu Glu Asp Lys

1 5 10 15

Val Ala Ile Ile Thr Ala Ala Thr Lys Gly Ile Gly Leu Ala Ser Ala

20 25 30

Glu Val Leu Ala Glu Asn Gly Ala Leu Val Tyr Ile Ala Ala Arg Ser

35 40 45

Glu Glu Leu Ala Lys Glu Val Ile Ser Asn Ile Glu Ser Asn Gly Gly

50 55 60

Arg Ala Lys Phe Val Tyr Phe Asn Ala Arg Glu Pro Gln Thr Tyr Thr

65 70 75 80

Thr Met Val Glu Thr Val Ala Gln Asn Glu Gly Arg Leu Asp Ile Leu

85 90 95

Val Asn Asn Tyr Gly Glu Thr Asn Val Lys Leu Asp Arg Asp Leu Val

100 105 110

Asn Gly Asp Thr Glu Glu Phe Phe Arg Ile Val Gln Asp Asn Leu Gln

115 120 125

Ser Val Tyr Leu Pro Ser Lys Ala Ala Ile Pro Arg Met Ala Lys Asn

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Ile Val Asn Ile Ser Thr Ile Gly Ser Val Val Pro

145 150 155 160

Asp Leu Gly Arg Ile Ala Tyr Cys Val Ser Lys Ala Ala Ile Asn Ser

165 170 175

Leu Thr Gln Asn Ile Ala Leu Gln Tyr Ala Arg Gln Gly Val Arg Cys

180 185 190

Asn Ala Val Leu Pro Gly Leu Ile Gly Thr Lys Ala Ala Met Glu Asn

195 200 205

Met Thr Asp Glu Phe Arg Asp Ser Phe Leu Arg His Val Pro Ile Asn

210 215 220

Arg Val Gly Lys Pro Glu Asp Ile Ala Lys Ala Val Leu Tyr Tyr Ala

225 230 235 240

Ser Asp Asp Ser Asp Tyr Val Thr Gly Met Ile His Glu Val Ala Gly

245 250 255

Gly Tyr Ala Leu Gly Ser Pro Gln Tyr Ala Glu Phe Ser Ala Met Met

260 265 270

Glu Arg Ser Arg

275

<210> 3

<211> 825

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgggcagca gccatcatca tcatcatcat aatatgaacc taagggaaaa atatggagag 60

tggggtatta tcctgggggc gaccgagggc gtgggcaagg cgttctgcga aaaaattgcc 120

gccggtggca tgaatgtggt aatggttggt cgtcgcgagg aaatgctgaa agatttgggt 180

cgtgagatct ccaacaaata cggcgtcgag cacttggtta ttaaagcgga cttcgcggac 240

ccgtctagcg tggataagat cttcgaacaa accaaagaac tggatatggg ttttatgagc 300

tacgttgcgt gttttcatac ctttggtaag ttgcaggata ccccatggga aaagcacgaa 360

cagatgatta acgtgaatgt tatcaccttc tttaaatgct tctaccatta tatgggcatt 420

tttgcaaagc aagatcgtgg tgcgattatc aacgtcagct ctctgaccgg tatcagctcg 480

tcaccgtaca atgcacagta tggtgctggc aagagctaca tcctaaagct cacggaagct 540

gtggcttgcg aggctgcgaa aaccaatgtg gacgttgaag ttatcaccct gggcacgacg 600

attaccccgt ccttgctgaa gaacctgccg ggtggtccgg caggcgaggc ggtgatgaaa 660

agcgcactga ctccggaagc gtgtgttgac gaggccttcg agaacctggg taagaccttc 720

agcgtcatcg ctggcgaaca caataagaaa aacgtgcaca actggaaagc gaaccatacc 780

gcggacgagt atattactta tatgggttcc ttttacgaga aataa 825

<210> 4

<211> 274

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Gly Ser Ser His His His His His His Asn Met Asn Leu Arg Glu

1 5 10 15

Lys Tyr Gly Glu Trp Gly Ile Ile Leu Gly Ala Thr Glu Gly Val Gly

20 25 30

Lys Ala Phe Cys Glu Lys Ile Ala Ala Gly Gly Met Asn Val Val Met

35 40 45

Val Gly Arg Arg Glu Glu Met Leu Lys Asp Leu Gly Arg Glu Ile Ser

50 55 60

Asn Lys Tyr Gly Val Glu His Leu Val Ile Lys Ala Asp Phe Ala Asp

65 70 75 80

Pro Ser Ser Val Asp Lys Ile Phe Glu Gln Thr Lys Glu Leu Asp Met

85 90 95

Gly Phe Met Ser Tyr Val Ala Cys Phe His Thr Phe Gly Lys Leu Gln

100 105 110

Asp Thr Pro Trp Glu Lys His Glu Gln Met Ile Asn Val Asn Val Ile

115 120 125

Thr Phe Phe Lys Cys Phe Tyr His Tyr Met Gly Ile Phe Ala Lys Gln

130 135 140

Asp Arg Gly Ala Ile Ile Asn Val Ser Ser Leu Thr Gly Ile Ser Ser

145 150 155 160

Ser Pro Tyr Asn Ala Gln Tyr Gly Ala Gly Lys Ser Tyr Ile Leu Lys

165 170 175

Leu Thr Glu Ala Val Ala Cys Glu Ala Ala Lys Thr Asn Val Asp Val

180 185 190

Glu Val Ile Thr Leu Gly Thr Thr Ile Thr Pro Ser Leu Leu Lys Asn

195 200 205

Leu Pro Gly Gly Pro Ala Gly Glu Ala Val Met Lys Ser Ala Leu Thr

210 215 220

Pro Glu Ala Cys Val Asp Glu Ala Phe Glu Asn Leu Gly Lys Thr Phe

225 230 235 240

Ser Val Ile Ala Gly Glu His Asn Lys Lys Asn Val His Asn Trp Lys

245 250 255

Ala Asn His Thr Ala Asp Glu Tyr Ile Thr Tyr Met Gly Ser Phe Tyr

260 265 270

Glu Lys

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggaattccat atgggcagca gccatcatca 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tccctcgagt taacggctgc gctccatcat 30

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cgggatccat gggcagcagc catcatca 28

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cggaattctt atttctcgta aaaggaacc 29

Claims (10)

1.一种人工熊胆粉的制作工艺，其特征在于，包括用于将牛磺鹅去氧胆酸转换为牛磺熊去氧胆酸的生物转化步骤：包括含有禽畜胆粉、转化缓冲液和转化液的转化体系；所述转化液为包含酶菌体的菌悬液或者包含酶菌体的原生质体的上清液；所述酶菌体表达有7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶。

2.根据权利要求1所述的一种人工熊胆粉的制作工艺，其特征在于，所述菌悬液的制备方法为：将酶菌体分散于转化缓冲液中，获得菌悬液；所述上清液的制备方法为：对所述菌悬液中的酶菌体进行破碎处理后，离心获得上清液。

3.根据权利要求2所述的一种人工熊胆粉的制作工艺，其特征在于，所述酶菌体为表达有7α-羟基类固醇脱氢酶的工程菌A和表达有7β-羟基类固醇脱氢酶的工程菌B组成的混合物；或者所述酶菌体为同时表达有7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶两种酶的工程菌C。

4.根据权利要求3所述的一种人工熊胆粉的制作工艺，其特征在于，每10g酶菌体使用20-100ml转化缓冲液分散，获得菌悬液；表达有7α-羟基类固醇脱氢酶的工程菌A和表达有7β-羟基类固醇脱氢酶的工程菌B的质量比为1:10-1:2。

5.根据权利要求4所述的一种人工熊胆粉的制作工艺，其特征在于：所述转化缓冲液为0-15mM的甘氨酸缓冲液；所述转化液的体积为转化体系的体积的1/5-4/5。

6.根据权利要求5所述的一种人工熊胆粉的制作工艺，其特征在于：辅酶Ⅰ或者辅酶Ⅱ在转化体系中的浓度为0.1-5mM，禽畜胆粉在转化体系中的浓度为50-250g/L。

7.根据权利要求6所述的一种人工熊胆粉的制作工艺，其特征在于：所述转化体系的pH值为6.0-9.0；所述转化体系进行酶促反应的温度为20-30℃，时长为2-24h。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的一种人工熊胆粉的制作工艺，其特征在于：7α-羟基类固醇脱氢酶的基因的序列为SEQ ID NO:1；7β-羟基类固醇脱氢酶的基因的序列为SEQID NO:3；控制7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶的基因的表达的操纵子均为乳糖操纵子。

9.根据权利要求8所述的一种人工熊胆粉的制作工艺，其特征在于：在所述生物转化步骤之前还包括发酵步骤：使用IPTG诱导工程菌A表达7α-羟基类固醇脱氢酶，并使用IPTG诱导工程菌B表达7β-羟基类固醇脱氢酶；或者使用IPTG诱导工程菌C同时表达7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶。

10.根据权利要求9所述的一种人工熊胆粉的制作工艺，其特征在于：在所述生物转化步骤之后还包括人工熊胆粉制备步骤：转化体系经生物转化步骤的酶促反应获得反应液，除去所述反应液中的沉淀，再经浓缩获得浸膏；使用乙醇溶液分散浸膏，获得浸膏分散液；除去浸膏分散液中的沉淀，经浓缩和干燥处理之后获得人工熊胆粉。