CN113930439B - 5-氨基乙酰丙酸生产菌及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种5‑氨基乙酰丙酸生产菌及其构建方法，包括以下步骤：(1)将枯草芽孢杆菌中的pxpR、PoxB、ptsG、sucC、sucD和pta基因敲除，获得枯草芽孢杆菌工程菌；(2)将质粒pHT43‑J用AatⅡ和SmaⅠ双酶切处理，将hemA基因整合到双酶切处理后的质粒pHT43‑J上，得到重组质粒pHT43‑J‑hemA，再用XbaⅠ和BamHⅠ对重组质粒pHT43‑J‑hemA进行酶切处理，将rhtA基因整合到酶切处理后的重组质粒pHT43‑J‑hemA上，获得第一重组表达载体；将质粒pHT01用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切，再将hemF基因整合到双酶切处理后的质粒pHT01上，获得第二重组表达载体；(3)将获得的第一重组表达载体和第二重组表达载体导入到枯草芽孢杆菌工程菌中，构建得到5‑氨基乙酰丙酸生产菌。本发明的生产菌提高了5‑氨基乙酰丙酸的产量。

Description

5-氨基乙酰丙酸生产菌及其构建方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种5-氨基乙酰丙酸生产菌及其构建方法。
背景技术
5-氨基乙酰丙酸(5-Aminolevulinic acid，简称ALA)，是合成吡咯类化合物(血红素、叶绿素、血红素及维生素B12等)的重要中间体，在动植物细胞和微生物细胞中均可合成。ALA因其易分解、在环境中无残留而作为绿色的农用化学品广泛应用于除草剂、杀虫剂以及植物生长调节剂等，在农业领域内有着广泛的用处。近年来，因其在光驱动疗法治疗癌症上的特殊重要作用而重新引起人们的广泛的重视，在癌症治疗领域，ALA也有其独有的优点：治疗效果好、毒副作用小、治疗确切稳定。因此在皮肤癌、膀胱癌、直肠癌等各类癌症的临床治疗中也有广泛的应用。
ALA的合成方法主要有化学合成法和微生物发酵法两种，其中化学合成法因其步骤繁复、造成的污染严重，产物收率较低等缺点日益被微生物发酵法所取代。微生物发酵法是通过诱变菌株或重组工程菌株，经过优化发酵条件等方法让微生物经C4或者C5途径其大量积累ALA的方法。
随着生物技术的高速发展，基因工程菌的构建成为了高效生产活性蛋白质产物的重要方法。目前利用大肠杆菌表达系统合成ALA的研究较多，Mariet和Zeikus获得Escherichia coli重组菌株，ALA发酵产量达到了3.79g/L。L.Xie et al.等利用含有R.sphaeroides的ALA合成酶基因的重组大肠杆菌，经发酵优化，ALA产量达到5.2g/L。浙江大学林建平课题组通过优化hemA基因的表达和发酵条件，ALA最高产量达到了7.3g/L。但是大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取困难，且内毒素很难除去。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是革兰氏阳性菌，细胞壁不含内毒素，能形成芽孢，是一些重要工业酶制剂的生产菌。刘锦妮构建了hemA和hemL基因的表达载体，将两个表达载体分别电转化至B.subtilis 1A747感受态细胞中，获得重组菌，用麦芽糖进行诱导表达，结果表明得到较大量的谷氨酰t-RNA还原酶蛋白和谷氨酰t-RNA合成酶蛋白，并促进了枯草芽孢杆菌中5-氨基乙酰丙酸的合成，重组菌的发酵上清液中5-氨基乙酰丙酸的含量最高为46.75mg/L(西北农林科技大学硕士学位论文，2008年)。
但与现有大肠杆菌表达系统相比，利用枯草芽孢杆菌生产5-氨基乙酰丙酸的产量仍有待进一步提高。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种5-氨基乙酰丙酸生产菌及其构建方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种5-氨基乙酰丙酸生产菌的构建方法，包括以下步骤：
(1)采用Red同源重组技术将枯草芽孢杆菌中的pxpR、PoxB、ptsG、sucC、sucD和pta基因敲除，获得枯草芽孢杆菌工程菌；
(2)将质粒pHT43-J用AatⅡ和SmaⅠ双酶切处理，将hemO基因整合到双酶切处理后的质粒pHT43-J上，得到重组质粒pHT43-J-hemO，再用XbaⅠ和BamHⅠ对重组质粒pHT43-J-hemO进行酶切处理，将rhtA基因整合到酶切处理后的重组质粒pHT43-J-hemO上，获得第一重组表达载体(pHT43-J-hemO-rhtA)；
将质粒pHT01用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切，再将hemF基因整合到双酶切处理后的质粒pHT01上，获得第二重组表达载体(pHT01-hemF)；
(3)将获得的第一重组表达载体和第二重组表达载体导入到枯草芽孢杆菌工程菌中，构建得到5-氨基乙酰丙酸生产菌。
优选的，质粒pHT43-J的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
优选的，步骤(2)中，所述hemO基因经密码子优化处理，其核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示；所述rhtA基因经密码子优化处理，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
优选的，步骤(2)中，所述hemF基因经密码子优化处理，其核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示。
本发明的第二方面，提供上述方法构建得到的5-氨基乙酰丙酸生产菌。
本发明的第三方面，提供上述5-氨基乙酰丙酸生产菌在发酵生产5-氨基乙酰丙酸中的应用。
本发明的有益效果：
(1)为提高ALA的产量、降低ALA的生产成本，本发明从基因工程菌株入手，构建得到了一种新的5-氨基乙酰丙酸生产菌。本发明的5-氨基乙酰丙酸生产菌是从两个维度进行构建的：
一是对于受体菌枯草芽孢杆菌，本发明通过对琥珀酰CoA和甘氨酸合成途径的深入研究，将枯草芽孢杆菌中的pxpR、PoxB、ptsG、sucC、sucD和pta基因敲除；其中：sucC和sucD是succinate dehydrogenase的两个亚基，敲除sucC和sucD会让琥珀酰CoA大量积累；pxpR翻译之后是transcriptional regulator of the pxp operon，是用来增加琥珀酰CoA的积累的，敲除pxpR也能够增加琥珀酰CoA的积累；敲PoxB和Pta能够阻止乙酸盐的生成，使更多的碳源流向TCA循环；ptsG(phosphotransferase system(PTS)glucose-specificenzyme IICBA component)主要作用是增加流入TCA循环的PEP和Pyr的量；本发明通过将枯草芽孢杆菌中的上述系列基因敲除，使糖更多的流向琥珀酰CoA，显著提高了琥珀酰CoA的积累量。
二是对于ALA的合成及转运，本发明通过外源转入hemO基因和hemF基因提高了ALA的合成效果，其中，hemO基因的表达产物为ALA合成酶(ALAS)，其能催化琥珀酰CoA和甘氨酸生成ALA；hemF基因则对ALA的合成有促进作用；通过外源转入rhtA基因，提高了合成的ALA的胞外分泌能力。
(2)虽然枯草芽孢杆菌是外源基因常用的表达宿主菌，但有些外源蛋白往往得不到有效的表达，其原因很可能是枯草芽孢杆菌本身的翻译系统不能满足外源基因表达的需要。为了使hemO基因、hemF基因和rhtA基因能够更适用于原核表达系统，本发明还对上述基因进行了密码子优化，采用优化后的编码基因进行原核表达，进一步提高了5-氨基乙酰丙酸的表达量。
附图说明
图1：质粒pHT43-J的结构图谱。
图2：优化前hemO基因的密码子相对适应度图。
图3：优化后hemO基因的密码子相对适应度图。
图4：优化前rhtA基因的密码子相对适应度图。
图5：优化后rhtA基因的密码子相对适应度图。
图6：优化前hemF基因的密码子相对适应度图。
图7：优化后hemF基因的密码子相对适应度图。
图8：构建枯草芽孢杆菌工程菌(Bacillus subtilisΔpxpRΔPoxBΔptsGΔsucCΔsucDΔpta)的基因敲除验证；图中，A为敲除PoxB基因的验证结果，B为敲除ptsG基因的验证结果，C为敲除pta基因的验证结果，D为敲除pxpR基因的验证结果，E为敲除sucC&sucD基因的验证结果；A-E中，最左侧泳道均为marker，中间泳道是str.168原种，最右侧泳道是敲完相应基因。
图9：本发明实施例3构建的第一重组表达载体的酶切验证结果；图中，M：Marker，泳道1：四酶切验证。
图10：本发明实施例4构建的第二重组表达载体的酶切验证结果；图中，M：Marker，泳道1：双酶切验证。
图11：本发明实施例5所得到的阳性转化子的Western bolt检测结果。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例和对比例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。其中：
本实施例和对比例中所使用的枯草芽孢杆菌购自中国微生物菌种查询网(https://www.biobw.org/China-strain/bio-81799.html)，菌种的编号为bio-81799，菌株名称为枯草芽胞杆菌168。
质粒pHT43-J为枯草芽孢杆菌诱导型双增强子载体，其结构图谱如图1所示，质粒序列如SEQ ID NO.5所示。自本申请申请日之日起20年内，公众可从申请人处获得质粒pHT43-J以用于重复本试验。
需要说明的是，本发明5-氨基乙酰丙酸生产菌的构建方法，是本领域技术人员能够重复实施的方法，故无需对生产菌进行生物保藏。
实施例1：密码子优化
发明人从现有数据库中获得的hemO基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。rhtA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。hemF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
为了使hemO基因、hemF基因和rhtA基因能够更适用于原核表达系统，本发明分别对上述基因的核苷酸序列组成进行了密码子优化。
经密码子优化后的hemO基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；优化前的密码子相对适应度图如图2所示；优化后的密码子相对适应度图如图3所示。
经密码子优化后的rhtA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；优化前的密码子相对适应度图如图4所示；优化后的密码子相对适应度图如图5所示。
经密码子优化后的hemF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；优化前的密码子相对适应度图如图6所示；优化后的密码子相对适应度图如图7所示。
由图2-图7可以看出，经密码子优化后的hemO基因、hemF基因和rhtA基因的密码子相对适应度可以达到1.0，显著提高了蛋白编码基因在原核表达系统中的适应性。
实施例2：枯草芽孢杆菌工程菌的构建
采用Red同源重组技术将枯草芽孢杆菌中的pxpR、PoxB、ptsG、sucC、sucD和pta基因敲除，获得枯草芽孢杆菌工程菌(Bacillus subtilisΔpxpRΔPoxBΔptsGΔsucCΔsucDΔpta)；具体过程如下：
1)线性打靶盒子的构建：
敲除质粒选择pK18mobSacB，有卡那霉素抗性；PoxB和ptsG的同源臂40bp，pta和sucC&D的同源臂35bp，pxpR的同源臂35bp；
敲除不同基因所对应的同源臂引物如下：
Pk-pxpR-F：AGATGGAATGGCTGACATAGCAAAGGGGATGAATG；(SEQ ID NO.9)
Pk-pxp-R：GTAGCCAATCTTTTCTCTGCTGCGTACATTAACGT。(SEQ ID NO.10)
Pk-poxB-F：TCTCCTGTGGTATTGAAAAAAGGAAAAAGGAGGATACGTT；(SEQ ID NO.11)
Pk-poxB-R：AAAAAACAGGGGCCCTAAGAGCCCTTGTTTTTTTTTTTTT。(SEQ ID NO.12)
Pk-ptsG-F：GCTGTAAGGTCAGACTAGTAAAAAGAGGAGGTCAATTCTT；(SEQ ID NO.13)
Pk-ptsG-R:GGGTGTTAGTACGCCGTGCTTGTCAGATGACAAGTACGGT。(SEQ ID NO.14)
Pk-sucC&sucD-R:TTTTAGTTTTGTTACATAAGTTAGGAGGATGGGAA；(SEQ ID NO.15)
Pk-sucC&sucD-F:TAAAAAAGGGACAGCCGTCAAGGCTGTTCCTGCTT。(SEQ ID NO.16)
Pk-pta-F:AAGGGACAGCCGTCAAGGCTGTTCCTGCTTTTTCT；(SEQ ID NO.17)
Pk-pta-R:GCCACAATAAAACCTCCTCAAAAAGTTACAAAAAC。(SEQ ID NO.18)
说明：SucC和sucD是同一个酶的两个亚基，因此，将SucC和sucD同时予以敲除。
敲除不同基因后所使用的Test引物如下：
Test-pxpR-F：TCCCTCCAGGAGGCAGAAGCGCTTG；(SEQ ID NO.19)
Test-pxpR-R:CAGCTCTGGGCGATTCCTTGACGACA。(SEQ ID NO.20)
Test-poxB-F:TTGATCATGTATACGGCATCCCCGGA；(SEQ ID NO.21)
Test-poxB-R:AATGATCGGTATATGTATTAGGAACTG。(SEQ ID NO.22)
Test-ptsG-F:CAGTTGCGATCCTTCCGGCTGCGGG；(SEQ ID NO.23)
Test-ptsG-R:AAAGGAGAATGATAAAAATGGCACAA。(SEQ ID NO.24)
Test-sucC&D-F:GTTCCTGAAGGTAAAGTGGCTTTTAC；(SEQ ID NO.25)
Test-sucC&D-R:CCTAACGATTTGCAGAATCAATCAAT。(SEQ ID NO.26)
Test-pta-F:CATCCTCTTGAAAGGTCGTTTACAG；(SEQ ID NO.27)
Test-pta-R:TTTCATTATAGCGCTTTCATAAAAA。(SEQ ID NO.28)
2)电转感受态的制备：
用试管摇菌过夜，第二天以1％(体积分数)的接种量至LB培养基中，30℃培养1小时后，加入0.3％(质量分数)的L-阿拉伯糖，30℃诱导2小时。冰浴冷却。用10％(体积分数)甘油洗两次，最终浓缩至200μl，以10％甘油重悬。
3)电击转化：
将2mm电转杯从70％(体积分数)乙醇中取出，用灭菌超纯水洗2次，紫外灯照射30分钟。预冷。取100μl最终重悬的细胞，移至预冷的离心管，加入5μl线性打靶盒子，用枪轻轻吸打混匀。冰浴2分钟。
电转参数：2500V，200欧，25μF；电击后显示，电击时间为4.8ms。
4)复苏与涂布：
加入1ml的LB，30℃，200rpm，1小时。
涂布前先离心，去除部分上清后再重悬，然后涂布在AMP平板。涂干。30℃培养24个小时。筛选重组子，同时利用菌落PCR进一步验证重组子的正确性。
5)抗性基因的去除：
将质粒pCP20转入成功敲除基因的菌株中，并在30℃下培养8h，后转入42℃培养过夜。pCP20在42℃下诱导表达FLP内切酶从而将FRT位点间的抗性基因从基因组上切除掉。
对基因敲除后的菌株进行验证，结果如图8的A-E所示。结果表明：枯草芽孢杆菌中的pxpR、PoxB、ptsG、sucC、sucD和pta基因已被成功敲除，构建得到枯草芽孢杆菌工程菌(Bacillus subtilisΔpxpRΔPoxBΔptsGΔsucCΔsucDΔpta)。
实施例3：第一重组表达载体的构建
将质粒pHT43-J用AatⅡ和SmaⅠ双酶切处理，将密码子优化后的hemO基因(SEQ IDNO.6所示)整合到双酶切处理后的质粒pHT43-J上，得到重组质粒pHT43-J-hemO，再用XbaⅠ和BamHⅠ对重组质粒pHT43-J-hemO进行酶切处理，将密码子优化后的rhtA基因(SEQ IDNO.7所示)整合到酶切处理后的重组质粒pHT43-J-hemO上，获得第一重组表达载体(pHT43-J-hemO-rhtA)；
将构建的第一重组表达载体用AatⅡ、SmaⅠ、XbaⅠ、BamHⅠ四个酶进行酶切验证，结果如图9所示。结果表明：hemO基因(SEQ ID NO.6所示)和rhtA基因(SEQ ID NO.7所示)已成功整合到质粒pHT43-J上。
实施例4：第二重组表达载体的构建
将质粒pHT01用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切，再将密码子优化后的hemF基因(SEQ ID NO.8所示)整合到双酶切处理后的质粒pHT01上，获得第二重组表达载体(pHT01-hemF)；
将构建的第二重组表达载体用BamHⅠ和XbaⅠ两个酶进行酶切验证，结果如图10所示。结果表明：hemF基因(SEQ ID NO.8所示)已成功整合到质粒pHT01上。
实施例5：5-氨基乙酰丙酸生产菌的构建
将实施例3构建的第一重组表达载体和实施例4构建的第二重组表达载体导入到实施例2构建的枯草芽孢杆菌工程菌(Bacillus subtilisΔpxpRΔPoxBΔptsGΔsucCΔsucDΔpta)中，获得转化子。
将转化子在LB平板上涂布，等长出单菌落之后用影印法分别在LB琼脂平板(氯霉抗性，含34μg/ml Chloramphenicol抗生素)和AMP平板(含100μg/ml AMP的LB平板)上接种，待两个抗性平板上都长出单菌落之后，通过对比位置，在LB平板中挑出能同时在LB琼脂平板(氯霉抗性)和AMP平板中生长的单菌落，将其作为阳性转化子。
将阳性转化子接种至含有34μg/ml Chloramphenicol和100μg/ml AMP的LB培养基中，30℃培养至OD600＝0.6，加入IPTG(使IPTG的终浓度为0.5mmol/L)，诱导培养42h。诱导培养结束后，超声破菌，离心，分离上清液，采用Western bolt检测，其结果如图11所示，在44.7kDa、31.2kDa、34.3kDa处有表达条带，分别与外源插入的目的基因Hemo、RhtA和HemF所表达蛋白的理论计算得到的分子量一致。
将阳性转化子与枯草芽孢杆菌工程菌(Bacillus subtilisΔpxpRΔPoxBΔptsGΔsucCΔsucDΔpta)分别接种于同一发酵培养基(发酵培养基的组成为：葡萄糖80g/L、(NH4)2SO4 5g/L、玉米浆干粉2g/L、琥珀酸1g/L、KH2PO4 5g/L、MgSO4·7H2O 2g/L、FeSO4·7H2O 0.2g/L、维生素B1 1mg/L、甘氨酸2g/L)中，在相同条件进行培养，培养结束后采用相同的条件进行破菌处理，检测破菌处理后的液体中的5-氨基乙酰丙酸含量。结果表明：阳性转化子生产得到的5-氨基乙酰丙酸含量显著高于枯草芽孢杆菌工程菌(Bacillus subtilisΔpxpRΔPoxBΔptsGΔsucCΔsucDΔpta)。
由此证明：本实施例已成功构建得到稳定的5-氨基乙酰丙酸生产菌。
对比例1：
以枯草芽胞杆菌168作为5-氨基乙酰丙酸生产菌A。
对比例2：
以实施例2构建得到枯草芽孢杆菌工程菌(Bacillus subtilisΔpxpRΔPoxBΔptsGΔsucCΔsucDΔpta)作为5-氨基乙酰丙酸生产菌B。
对比例3：
以枯草芽胞杆菌168作为受体菌，将实施例3构建的第一重组表达载体和实施例4构建的第二重组表达载体导入到受体菌中，按实施例5的方法筛选阳性转化子，构建5-氨基乙酰丙酸生产菌C。
试验例：
将实施例5、对比例1-对比例3构建的5-氨基乙酰丙酸生产菌接入同样组成的发酵培养基中，发酵培养基的组成为：葡萄糖80g/L、(NH4)2SO4 5g/L、玉米浆干粉2g/L、琥珀酸1g/L、KH2PO4 5g/L、MgSO4·7H2O 2g/L、FeSO4·7H2O 0.2g/L、维生素B1 1mg/L。
在相同进行发酵培养，发酵培养的温度为30℃，pH为6.0-6.5，溶氧(DO)为25-35％；培养过程中监测体系的残糖含量，当体系的残糖含量≤10g/L时开始补糖，通过流加葡糖糖溶液使体系中的葡萄糖浓度保持在10-12g/L；
发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD600值为0.40-0.50时，向体系中加入IPTG，使IPTG在体系中的终浓度为0.5mmol/L；同时流加质量浓度为20％的甘氨酸溶液，甘氨酸溶液的加入量为发酵培养基重量的20％；在温度30℃，pH 6.0-6.5，溶氧(DO)25-35％的条件下进行诱导培养，诱导培养32h；诱导培养过程中，降低葡萄糖溶液的流加速度，使体系的残糖含量降至≤1g/L，并将体系的残糖含量保持在0.5-1g/L。
培养结束后采用相同的条件进行破菌处理，分离上清液，采用高效液相色谱法检测上清液中的5-氨基乙酰丙酸含量。液相色谱条件如下：
流动相：
A相：水：0.1％甲酸水溶液＝90：10(V/V)比例配制混合溶液；
B相：乙睛：水＝70：30(V/V)比例配制混合溶液；
色谱条件：
色谱柱：4.6*150mm C18
流速：1.0mL/min
柱温：30℃
进样体积：20μL
检测波长：256nm
梯度洗脱：
时间 A相 B相
0min 95 5
8min 20 80
20min 95 5
30min 95 5
先用A相冲柱0.5-2小时，流速0.5ml/min，基线稳定后，按照梯度设置流动相比例，以初始比例，流速1ml/min，冲柱稳定后，进样，检测。
结果计算：外标法
结果见表1。
表1：
生产菌 5-氨基乙酰丙酸含量
实施例5构建的5-氨基乙酰丙酸生产菌 24.5g/L
对比例1构建的5-氨基乙酰丙酸生产菌A 2.1g/L
对比例2构建的5-氨基乙酰丙酸生产菌B 9.5g/L
对比例3构建的5-氨基乙酰丙酸生产菌C 8.4g/L
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 新泰市佳禾生物科技有限公司,汕头市佳禾生物科技有限公司
<120> 5-氨基乙酰丙酸生产菌及其构建方法
<130> 2021
<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1230
<212> DNA
<213> hemO基因
<400> 1
atgcagtaca atcaattctt tcaagacgct ctcacccgcc tccacgacga gcgtcgttac 60
cgggtgttcg ctgatctcga gcggatggcc ggtaggtttc cgcatgccac gtggcactcg 120
aactccggac ctcgcgatgt tgtgatctgg tgctcgaacg actatctcgg catgggccag 180
cacccgaagg tggtcggcgc aatggtcgag accgcgacgc ggatcggcac cggtgccggt 240
ggtacccgca atatcgccgg tacgcatcac ccgctggtgc agctcgagca ggaaatcgcc 300
tcgctgcacg gcaaggaagc ggcgctgctg ttcacctcgg gctatgtctc caaccagacc 360
ggcctgtcga cgctcggcaa gttgatcccg aactgcctga tcctgtcgga cgcgctcaat 420
cacaattcga tgattgaagg catccgccag tcgggctgcg agcgcgtggt gtggcgccac 480
aacgataccg cgcacctcga agagctgctg atcgccgccg gtcccgaccg accgaagctg 540
atcgcattcg agagtctgta ctcgatggac ggtgacaccg cgccgctggc gaagatctgc 600
gatctcgccg agaagtacaa cgcgatgacc tactgcgacg aagtgcatgc ggtcggcatg 660
tacggtgccc acggtgccgg cgtcgccgag cgtgacggcg tgatggatcg catcgacatc 720
atcgaagcga ccctggccaa ggcgttcggc tgtctcggcg gctacatcac aggcaagaac 780
gaagtgatcg acgccgtacg ctcctacgcg ccgggcttca tcttcaccac gtcgctgccg 840
ccgccgatct gcgccgccgc gactgccgcg atcaagcatc tgcgcagctc gacctgggag 900
cgtgaacgcc atcaggaccg cgctgcccgc gtcaaagcgg tgctgaacaa cgccggcatt 960
ccggtgatgc cgaccgacac ccacatcgtg ccggtgttcg tcggcgacgc cgagaagtgc 1020
aagaaggcgt ccgatctgct gctcgaacag cacaacatct acattcagcc gatcaactac 1080
ccgaccgttg cccgcggcct cgaacggctc cgcatcacgc cgtcgccgta tcacgacgac 1140
aagctgatcg atgcgctcgc cgaagccctg gtgcaggtct ggaacgagct cggcctgccg 1200
ctcggcgcca aggcgatcgc tgcggagtga 1230
<210> 2
<211> 409
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Gln Tyr Asn Gln Phe Phe Gln Asp Ala Leu Thr Arg Leu His Asp
1 5 10 15
Glu Arg Arg Tyr Arg Val Phe Ala Asp Leu Glu Arg Met Ala Gly Arg
20 25 30
Phe Pro His Ala Thr Trp His Ser Asn Ser Gly Pro Arg Asp Val Val
35 40 45
Ile Trp Cys Ser Asn Asp Tyr Leu Gly Met Gly Gln His Pro Lys Val
50 55 60
Val Gly Ala Met Val Glu Thr Ala Thr Arg Ile Gly Thr Gly Ala Gly
65 70 75 80
Gly Thr Arg Asn Ile Ala Gly Thr His His Pro Leu Val Gln Leu Glu
85 90 95
Gln Glu Ile Ala Ser Leu His Gly Lys Glu Ala Ala Leu Leu Phe Thr
100 105 110
Ser Gly Tyr Val Ser Asn Gln Thr Gly Leu Ser Thr Leu Gly Lys Leu
115 120 125
Ile Pro Asn Cys Leu Ile Leu Ser Asp Ala Leu Asn His Asn Ser Met
130 135 140
Ile Glu Gly Ile Arg Gln Ser Gly Cys Glu Arg Val Val Trp Arg His
145 150 155 160
Asn Asp Thr Ala His Leu Glu Glu Leu Leu Ile Ala Ala Gly Pro Asp
165 170 175
Arg Pro Lys Leu Ile Ala Phe Glu Ser Leu Tyr Ser Met Asp Gly Asp
180 185 190
Thr Ala Pro Leu Ala Lys Ile Cys Asp Leu Ala Glu Lys Tyr Asn Ala
195 200 205
Met Thr Tyr Cys Asp Glu Val His Ala Val Gly Met Tyr Gly Ala His
210 215 220
Gly Ala Gly Val Ala Glu Arg Asp Gly Val Met Asp Arg Ile Asp Ile
225 230 235 240
Ile Glu Ala Thr Leu Ala Lys Ala Phe Gly Cys Leu Gly Gly Tyr Ile
245 250 255
Thr Gly Lys Asn Glu Val Ile Asp Ala Val Arg Ser Tyr Ala Pro Gly
260 265 270
Phe Ile Phe Thr Thr Ser Leu Pro Pro Pro Ile Cys Ala Ala Ala Thr
275 280 285
Ala Ala Ile Lys His Leu Arg Ser Ser Thr Trp Glu Arg Glu Arg His
290 295 300
Gln Asp Arg Ala Ala Arg Val Lys Ala Val Leu Asn Asn Ala Gly Ile
305 310 315 320
Pro Val Met Pro Thr Asp Thr His Ile Val Pro Val Phe Val Gly Asp
325 330 335
Ala Glu Lys Cys Lys Lys Ala Ser Asp Leu Leu Leu Glu Gln His Asn
340 345 350
Ile Tyr Ile Gln Pro Ile Asn Tyr Pro Thr Val Ala Arg Gly Leu Glu
355 360 365
Arg Leu Arg Ile Thr Pro Ser Pro Tyr His Asp Asp Lys Leu Ile Asp
370 375 380
Ala Leu Ala Glu Ala Leu Val Gln Val Trp Asn Glu Leu Gly Leu Pro
385 390 395 400
Leu Gly Ala Lys Ala Ile Ala Ala Glu
405
<210> 3
<211> 888
<212> DNA
<213> rhtA基因
<400> 3
atgcctggtt cattacgtaa aatgccggtc tggttaccaa tagtcatatt gctcgttgcc 60
atggcgtcta ttcagggtgg agcctcgtta gctaagtcac tttttcctct ggtgggcgca 120
ccgggtgtca ctgcgctgcg tctggcatta ggaacgctga tcctcatcgc gttctttaag 180
ccatggcgac tgcgctttgc caaagagcaa cggttaccgc tgttgtttta cggcgtttcg 240
ctgggtggga tgaattatct tttttatctt tctattcaga cagtaccgct gggtattgcg 300
gtggcgctgg agttcaccgg accactggcg gtggcgctgt tctcttctcg tcgcccggta 360
gatttcgtct gggttgtgct ggcggttctt ggtctgtggt tcctgctacc gctggggcaa 420
gacgtttccc atgtcgattt aaccggctgt gcgctggcac tgggggccgg ggcttgttgg 480
gctatttaca ttttaagtgg gcaacgcgca ggagcggaac atggccctgc gacggtggca 540
attggttcgt tgattgcagc gttaattttc gtgccaattg gagcgcttca ggctggtgaa 600
gcactctggc actggtcggt tattccattg ggtctggctg tcgctattct ctcgaccgct 660
ctgccttatt cgctggaaat gattgccctc acccgtttgc caacacggac atttggtacg 720
ctgatgagca tggaaccggc gctggctgcc gtttccggga tgattttcct cggagaaaca 780
ctgacaccca tacagctact ggcgctcggc gctatcatcg ccgcttcaat ggggtctacg 840
ctgacagtac gcaaagagag caaaataaaa gaattagaca ttaattaa 888
<210> 4
<211> 912
<212> DNA
<213> hemF基因
<400> 4
atggaaagac cgcaactgcc acagggcctg ccggccgaca tcgaagacaa gaaggcagcg 60
gcaaaggctt ggttcgaaag ccttcgcgac acgatctgcg ccgccttcga ggcgatagag 120
gacgaattga cgggtccgct gtcggatcgt ccggcaggcc ggttcgtcgc caaggactgg 180
ctgcgcgagg aaggcgccgg cggcggcggt cgcatgtcca tgatggaagg acgcgtcttc 240
gagaaagtgg gggttcacac ctccaccgtc ttcggcgagt tctcgccgga gttccgcgaa 300
cagatacccg gcgcgagcga agatccgcgc ttctgggcat cgggcatttc gctgatcgcc 360
cacccggtca accccaatgt ccccgccgtg cacatgaaca cgcgcatggt cgtgaccacc 420
agcaactggt tcggcggcgg tgcggacctc acgccggtcc tcgaccgccg gcgcatcatg 480
accgatccgg ataccgtgct ctttcatcgt gccatggaga tcgcctgcaa tcggcatccc 540
gtcgccgatc atgcaaaatt caagcagtgg tgcgacgagt atttctacct gaagcaccgg 600
aacgagccgc gcggcaccgg cgggattttc tacgattggc tgcgttctgc ggaggagctc 660
ggcggctggg atgcggattt cgccttcacg cgcgatgtcg gcaaggcctt cgcactcgtc 720
tatccgagaa tcgtccggac gaatttcaac aagccctgga ccgagcagga tcgaaacgag 780
cagctcgtgc gccgtggccg gtacgtcgag ttcaaccttc tttacgaccg tggcacgatc 840
ttcggtctca agaccggtgg caatgtggag tcgattctct cctccctgcc cccactcgta 900
cgctggccgt ga 912
<210> 5
<211> 7463
<212> DNA
<213> 质粒pHT43-J
<400> 5
ttaagttatt ggtatgactg gttttaagcg caaaaaaagt tgctttttcg tacctattaa 60
tgtatcgttt tagaaaaccg actgtaaaaa gtacagtcgg cattatctca tattataaaa 120
gccagtcatt aggcctatct gacaattcct gaatagagtt cataaacaat cctgcatgat 180
aaccatcaca aacagaatga tgtacctgta aagatagcgg taaatatatt gaattacctt 240
tattaatgaa ttttcctgct gtaataatgg gtagaaggta attactatta ttattgatat 300
ttaagttaaa cccagtaaat gaagtccatg gaataataga aagagaaaaa gcattttcag 360
gtataggtgt tttgggaaac aatttccccg aaccattata tttctctaca tcagaaaggt 420
ataaatcata aaactctttg aagtcattct ttacaggagt ccaaatacca gagaatgttt 480
tagatacacc atcaaaaatt gtataaagtg gctctaactt atcccaataa cctaactctc 540
cgtcgctatt gtaaccagtt ctaaaagctg tatttgagtt tatcaccctt gtcactaaga 600
aaataaatgc agggtaaaat ttatatcctt cttgttttat gtttcggtat aaaacactaa 660
tatcaatttc tgtggttata ctaaaagtcg tttgttggtt caaataatga ttaaatatct 720
cttttctctt ccaattgtct aaatcaattt tattaaagtt catttgatat gcctcctaaa 780
tttttatcta aagtgaattt aggaggctta cttgtctgct ttcttcatta gaatcaatcc 840
ttttttaaaa gtcaatatta ctgtaacata aatatatatt ttaaaaatat cccactttat 900
ccaattttcg tttgttgaac taatgggtgc tttagttgaa gaataaagac cacattaaaa 960
aatgtggtct tttgtgtttt tttaaaggat ttgagcgtag cgaaaaatcc ttttctttct 1020
tatcttgata ataagggtaa ctattgccga tcgtccattc cgacagcatc gccagtcact 1080
atggcgtgct gctagcgcca ttcgccattc aggctgcgca actgttggga agggcgatcg 1140
gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta 1200
agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc cagtgaattc 1260
gagctcaggc cttaactcac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga 1320
aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt 1380
attgggcgcc agggtggttt ttcttttcac cagtgagacg ggcaacagct gattgccctt 1440
caccgcctgg ccctgagaga gttgcagcaa gcggtccacg ctggtttgcc ccagcaggcg 1500
aaaatcctgt ttgatggtgg ttgacggcgg gatataacat gagctgtctt cggtatcgtc 1560
gtatcccact accgagatat ccgcaccaac gcgcagcccg gactcggtaa tggcgcgcat 1620
tgcgcccagc gccatctgat cgttggcaac cagcatcgca gtgggaacga tgccctcatt 1680
cagcatttgc atggtttgtt gaaaaccgga catggcactc cagtcgcctt cccgttccgc 1740
tatcggctga atttgattgc gagtgagata tttatgccag ccagccagac gcagacgcgc 1800
cgagacagaa cttaatgggc ccgctaacag cgcgatttgc tggtgaccca atgcgaccag 1860
atgctccacg cccagtcgcg taccgtcttc atgggagaaa ataatactgt tgatgggtgt 1920
ctggtcagag acatcaagaa ataacgccgg aacattagtg caggcagctt ccacagcaat 1980
ggcatcctgg tcatccagcg gatagttaat gatcagccca ctgacgcgtt gcgcgagaag 2040
attgtgcacc gccgctttac aggcttcgac gccgcttcgt tctaccatcg acaccaccac 2100
gctggcaccc agttgatcgg cgcgagattt aatcgccgcg acaatttgcg acggcgcgtg 2160
cagggccaga ctggaggtgg caacgccaat cagcaacgac tgtttgcccg ccagttgttg 2220
tgccacgcgg ttgggaatgt aattcagctc cgccatcgcc gcttccactt tttcccgcgt 2280
tttcgcagaa acgtggctgg cctggttcac cacgcgggaa acggtctgat aagagacacc 2340
ggcatactct gcgacatcgt ataacgttac tggtttcatc aaaatcgtct ccctccgttt 2400
gaatatttga ttgatcgtaa ccagatgaag cactctttcc actatcccta cagtgttatg 2460
gcttgaacaa tcacgaaaca ataattggta cgtacgatct ttcagccgac tcaaacatca 2520
aatcttacaa atgtagtctt tgaaagtatt acatatgtaa gatttaaatg caaccgtttt 2580
ttcggaagga aatgatgacc tcgtttccac cggaattagc ttggtaccag ctattgtaac 2640
ataatcggta cgggggtgaa aaagctaacg gaaaagggag cggaaaagaa tgatgtaagc 2700
gtgaaaaatt ttttatctta tcacttgaaa ttggaaggga gattctttat tataagaatt 2760
gtggaattgt gagcggataa caattcccaa ttaaaggagg aaggatcaat gattcaaaaa 2820
cgaaagcgga cagtttcgtt cagacttgtg cttatgtgca cgctgttatt tgtcagtttg 2880
ccgattacaa aaacatcagc cgtaggatcc tctagagtcg acgtccccgg ggcagcccgc 2940
ctaatgagcg ggcttttttc acgtcacgcg tccatggaga tctttgtctg caactgaaaa 3000
gtttatacct tacctggaac aaatggttga aacatacgag gctaatatcg gcttattagg 3060
aatagtccct gtactaataa aatcaggtgg atcagttgat cagtatattt tggacgaagc 3120
tcggaaagaa tttggagatg acttgcttaa ttccacaatt aaattaaggg aaagaataaa 3180
gcgatttgat gttcaaggaa tcacggaaga agatactcat gataaagaag ctctaaaact 3240
attcaataac cttacaatgg aattgatcga aagggtggaa ggttaatggt acgaaaatta 3300
ggggatctac ctagaaagcc acaaggcgat aggtcaagct taaagaaccc ttacatggat 3360
cttacagatt ctgaaagtaa agaaacaaca gaggttaaac aaacagaacc aaaaagaaaa 3420
aaagcattgt tgaaaacaat gaaagttgat gtttcaatcc ataataagat taaatcgctg 3480
cacgaaattc tggcagcatc cgaagggaat tcatattact tagaggatac tattgagaga 3540
gctattgata agatggttga gacattacct gagagccaaa aaacttttta tgaatatgaa 3600
ttaaaaaaaa gaaccaacaa aggctgagac agactccaaa cgagtctgtt tttttaaaaa 3660
aaatattagg agcattgaat atatattaga gaattaagaa agacatggga ataaaaatat 3720
tttaaatcca gtaaaaatat gataagatta tttcagaata tgaagaactc tgtttgtttt 3780
tgatgaaaaa acaaacaaaa aaaatccacc taacggaatc tcaatttaac taacagcggc 3840
caaactgaga agttaaattt gagaagggga aaaggcggat ttatacttgt atttaactat 3900
ctccatttta acattttatt aaaccccata caagtgaaaa tcctctttta cactgttcct 3960
ttaggtgatc gcggagggac attatgagtg aagtaaacct aaaaggaaat acagatgaat 4020
tagtgtatta tcgacagcaa accactggaa ataaaatcgc caggaagaga atcaaaaaag 4080
ggaaagaaga agtttattat gttgctgaaa cggaagagaa gatatggaca gaagagcaaa 4140
taaaaaactt ttctttagac aaatttggta cgcatatacc ttacatagaa ggtcattata 4200
caatcttaaa taattacttc tttgattttt ggggctattt tttaggtgct gaaggaattg 4260
cgctctatgc tcacctaact cgttatgcat acggcagcaa agacttttgc tttcctagtc 4320
tacaaacaat cgctaaaaaa atggacaaga ctcctgttac agttagaggc tacttgaaac 4380
tgcttgaaag gtacggtttt atttggaagg taaacgtccg taataaaacc aaggataaca 4440
cagaggaatc cccgattttt aagattagac gtaaggttcc tttgctttca gaagaacttt 4500
taaatggaaa ccctaatatt gaaattccag atgacgagga agcacatgta aagaaggctt 4560
taaaaaagga aaaagagggt cttccaaagg ttttgaaaaa agagcacgat gaatttgtta 4620
aaaaaatgat ggatgagtca gaaacaatta atattccaga ggccttacaa tatgacacaa 4680
tgtatgaaga tatactcagt aaaggagaaa ttcgaaaaga aatcaaaaaa caaataccta 4740
atcctacaac atcttttgag agtatatcaa tgacaactga agaggaaaaa gtcgacagta 4800
ctttaaaaag cgaaatgcaa aatcgtgtct ctaagccttc ttttgatacc tggtttaaaa 4860
acactaagat caaaattgaa aataaaaatt gtttattact tgtaccgagt gaatttgcat 4920
ttgaatggat taagaaaaga tatttagaaa caattaaaac agtccttgaa gaagctggat 4980
atgttttcga aaaaatcgaa ctaagaaaag tgcaataaac tgctgaagta tttcagcagt 5040
tttttttatt tagaaatagt gaaaaaaata taatcaggga ggtatcaata tttaatgagt 5100
actgatttaa atttatttag actggaatta ataattaaca cgtagactaa ttaaaattta 5160
atgagggata aagaggatac aaaaatatta atttcaatcc ctattaaatt ttaacaaggg 5220
ggggattaaa atttaattag aggtttatcc acaagaaaag accctaataa aatttttact 5280
agggttataa cactgattaa tttcttaatg ggggagggat taaaatttaa tgacaaagaa 5340
aacaatcttt taagaaaagc ttttaaaaga taataataaa aagagctttg cgattaagca 5400
aaactcttta ctttttcatt gacattatca aattcatcga tttcaaattg ttgttgtatc 5460
ataaagttaa ttctgttttg cacaaccttt tcaggaatat aaaacacatc tgaggcttgt 5520
tttataaact cagggtcgct aaagtcaatg taacgtagca tatgatatgg tatagcttcc 5580
acccaagtta gcctttctgc ttcttctgaa tgtttttcat atacttccat gggtatctct 5640
aaatgatttt cctcatgtag caaggtatga gcaaaaagtt tatggaattg atagttcctc 5700
tctttttctt caactttttt atctaaaaca aacactttaa catctgagtc aatgtaagca 5760
taagatgttt ttccagtcat aatttcaatc ccaaatcttt tagacagaaa ttctggacgt 5820
aaatcttttg gtgaaagaat ttttttatgt agcaatatat ccgatacagc accttctaaa 5880
agcgttggtg aatagggcat tttacctatc tcctctcatt ttgtggaata aaaatagtca 5940
tattcgtcca tctacctatc ctattatcga acagttgaac tttttaatca aggatcagtc 6000
ctttttttca ttattcttaa actgtgctct taactttaac aactcgattt gtttttccag 6060
atctcgagag ctattgtaac ataatcggta cgggggtgaa aaagctaacg gaaaagggag 6120
cggaaaagaa tgatgtaagc gtgaaaaatt ttttatctta tcacttgaaa ttggaaggga 6180
gattctttat tataagaatt gtggaattgt gagcggataa caattcccaa ttaaaggagg 6240
aaggatcaat gattcaaaaa cgaaagcgga cagtttcgtt cagacttgtg cttatgtgca 6300
cgctgttatt tgtcagtttg ccgattacaa aaacatcagc cgtaggatcc tctagagtcg 6360
gtctcgcggt atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat 6420
ctacacgacg gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg 6480
tgcctcactg attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat 6540
tgatttaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct 6600
catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa 6660
gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa 6720
aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc 6780
gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta 6840
gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct 6900
gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg 6960
atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag 7020
cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc 7080
cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg 7140
agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt 7200
tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg 7260
gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca 7320
catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg 7380
agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc 7440
ggaagagcgc ccaatacgca tgc 7463
<210> 6
<211> 1234
<212> DNA
<213> 经密码子优化后的hemO基因
<400> 6
catgcaatac aaccaattct tccaagatgc tcttacacgt cttcatgatg aacgtcgtta 60
ccgtgttttc gctgatcttg aacgtatggc tggccgtttc cctcatgcta catggcattc 120
taactctggc cctcgtgatg ttgttatctg gtgctctaac gattaccttg gcatgggcca 180
acatcctaaa gttgttggcg ctatggttga aacagctaca cgtatcggca caggcgctgg 240
cggcacacgt aacatcgctg gcacacatca tcctcttgtt caacttgaac aagaaatcgc 300
ttctcttcat ggcaaagaag ctgctcttct tttcacatct ggctacgttt ctaaccaaac 360
aggcctttct acacttggca aacttatccc taactgcctt atcctttctg atgctcttaa 420
ccataactct atgatcgaag gcatccgtca atctggctgc gaacgtgttg tttggcgtca 480
taacgataca gctcatcttg aagaacttct tatcgctgct ggccctgatc gtcctaaact 540
tatcgctttc gaatctcttt actctatgga tggcgataca gctcctcttg ctaaaatctg 600
cgatcttgct gaaaaataca acgctatgac atactgcgat gaagttcatg ctgttggcat 660
gtacggcgct catggcgctg gcgttgctga acgtgatggc gttatggatc gtatcgatat 720
catcgaagct acacttgcta aagctttcgg ctgccttggc ggctacatca caggcaaaaa 780
cgaagttatc gatgctgttc gttcttacgc tcctggcttc atcttcacaa catctcttcc 840
tcctcctatc tgcgctgctg ctacagctgc tatcaaacat cttcgttctt ctacatggga 900
acgtgaacgt catcaagatc gtgctgctcg tgttaaagct gttcttaaca acgctggcat 960
ccctgttatg cctacagata cacatatcgt tcctgttttc gttggcgatg ctgaaaaatg 1020
caaaaaagct tctgatcttc ttcttgaaca acataacatc tacatccaac ctatcaacta 1080
ccctacagtt gctcgtggcc ttgaacgtct tcgtatcaca ccttctcctt accatgatga 1140
taaacttatc gatgctcttg ctgaagctct tgttcaagtt tggaacgaac ttggccttcc 1200
tcttggcgct aaagctatcg ctgctgaata accc 1234
<210> 7
<211> 894
<212> DNA
<213> 经密码子优化后的rhtA基因
<400> 7
gatccatgcc tggctctctt cgtaaaatgc ctgtttggct tcctatcgtt atccttcttg 60
ttgctatggc ttctatccaa ggcggcgctt ctcttgctaa atctcttttc cctcttgttg 120
gcgctcctgg cgttacagct cttcgtcttg ctcttggcac acttatcctt atcgctttct 180
tcaaaccttg gcgtcttcgt ttcgctaaag aacaacgtct tcctcttctt ttctacggcg 240
tttctcttgg cggcatgaac taccttttct acctttctat ccaaacagtt cctcttggca 300
tcgctgttgc tcttgaattc acaggccctc ttgctgttgc tcttttctct tctcgtcgtc 360
ctgttgattt cgtttgggtt gttcttgctg ttcttggcct ttggttcctt cttcctcttg 420
gccaagatgt ttctcatgtt gatcttacag gctgcgctct tgctcttggc gctggcgctt 480
gctgggctat ctacatcctt tctggccaac gtgctggcgc tgaacatggc cctgctacag 540
ttgctatcgg ctctcttatc gctgctctta tcttcgttcc tatcggcgct cttcaagctg 600
gcgaagctct ttggcattgg tctgttatcc ctcttggcct tgctgttgct atcctttcta 660
cagctcttcc ttactctctt gaaatgatcg ctcttacacg tcttcctaca cgtacattcg 720
gcacacttat gtctatggaa cctgctcttg ctgctgtttc tggcatgatc ttccttggcg 780
aaacacttac acctatccaa cttcttgctc ttggcgctat catcgctgct tctatgggct 840
ctacacttac agttcgtaaa gaatctaaaa tcaaagaact tgatatcaac taat 894
<210> 8
<211> 918
<212> DNA
<213> 经密码子优化后的hemF基因
<400> 8
gatccatgga acgtcctcaa cttcctcaag gccttcctgc tgatatcgaa gataaaaaag 60
ctgctgctaa agcttggttc gaatctcttc gtgatacaat ctgcgctgct ttcgaagcta 120
tcgaagatga acttacaggc cctctttctg atcgtcctgc tggccgtttc gttgctaaag 180
attggcttcg tgaagaaggc gctggcggcg gcggccgtat gtctatgatg gaaggccgtg 240
ttttcgaaaa agttggcgtt catacatcta cagttttcgg cgaattctct cctgaattcc 300
gtgaacaaat ccctggcgct tctgaagatc ctcgtttctg ggcttctggc atctctctta 360
tcgctcatcc tgttaaccct aacgttcctg ctgttcatat gaacacacgt atggttgtta 420
caacatctaa ctggttcggc ggcggcgctg atcttacacc tgttcttgat cgtcgtcgta 480
tcatgacaga tcctgataca gttcttttcc atcgtgctat ggaaatcgct tgcaaccgtc 540
atcctgttgc tgatcatgct aaattcaaac aatggtgcga tgaatacttc taccttaaac 600
atcgtaacga acctcgtggc acaggcggca tcttctacga ttggcttcgt tctgctgaag 660
aacttggcgg ctgggatgct gatttcgctt tcacacgtga tgttggcaaa gctttcgctc 720
ttgtttaccc tcgtatcgtt cgtacaaact tcaacaaacc ttggacagaa caagatcgta 780
acgaacaact tgttcgtcgt ggccgttacg ttgaattcaa ccttctttac gatcgtggca 840
caatcttcgg ccttaaaaca ggcggcaacg ttgaatctat cctttcttct cttcctcctc 900
ttgttcgttg gccttaat 918
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
agatggaatg gctgacatag caaaggggat gaatg 35
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gtagccaatc ttttctctgc tgcgtacatt aacgt 35
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tctcctgtgg tattgaaaaa aggaaaaagg aggatacgtt 40
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
aaaaaacagg ggccctaaga gcccttgttt tttttttttt 40
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gctgtaaggt cagactagta aaaagaggag gtcaattctt 40
<210> 14
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gggtgttagt acgccgtgct tgtcagatga caagtacggt 40
<210> 15
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ttttagtttt gttacataag ttaggaggat gggaa 35
<210> 16
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
taaaaaaggg acagccgtca aggctgttcc tgctt 35
<210> 17
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
aagggacagc cgtcaaggct gttcctgctt tttct 35
<210> 18
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gccacaataa aacctcctca aaaagttaca aaaac 35
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
tccctccagg aggcagaagc gcttg 25
<210> 20
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
cagctctggg cgattccttg acgaca 26
<210> 21
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
ttgatcatgt atacggcatc cccgga 26
<210> 22
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
aatgatcggt atatgtatta ggaactg 27
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
cagttgcgat ccttccggct gcggg 25
<210> 24
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
aaaggagaat gataaaaatg gcacaa 26
<210> 25
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
gttcctgaag gtaaagtggc ttttac 26
<210> 26
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
cctaacgatt tgcagaatca atcaat 26
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
catcctcttg aaaggtcgtt tacag 25
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
tttcattata gcgctttcat aaaaa 25

Claims (3)

1.一种5-氨基乙酰丙酸生产菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采用Red同源重组技术将枯草芽孢杆菌中的pxpR、PoxB、ptsG、sucC、sucD和pta基因敲除，获得枯草芽孢杆菌工程菌；敲除pxpR基因所对应的同源臂引物如SEQ ID NO.9和SEQID NO.10所示；敲除PoxB基因所对应的同源臂引物如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示；
(2)将质粒pHT43-J用AatⅡ和SmaⅠ双酶切处理，将hemA基因整合到双酶切处理后的质粒pHT43-J上，得到重组质粒pHT43-J-hemA，再用XbaⅠ和BamHⅠ对重组质粒pHT43-J-hemA进行酶切处理，将rhtA基因整合到酶切处理后的重组质粒pHT43-J-hemA上，获得第一重组表达载体；
将质粒pHT01用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切，再将hemF基因整合到双酶切处理后的质粒pHT01上，获得第二重组表达载体；
(3)将获得的第一重组表达载体和第二重组表达载体导入到枯草芽孢杆菌工程菌中，构建得到5-氨基乙酰丙酸生产菌；
质粒pHT43-J的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
步骤(2)中，所述hemA基因经密码子优化处理，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述rhtA基因经密码子优化处理，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
步骤(2)中，所述hemF基因经密码子优化处理，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
2.由权利要求1所述的构建方法构建的5-氨基乙酰丙酸生产菌。
3.权利要求2所述的5-氨基乙酰丙酸生产菌在发酵生产5-氨基乙酰丙酸中的应用。
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Title
代谢工程改造大肠杆菌血红素合成途径生产5-氨基乙酰丙酸;张俊丽;《中国博士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》;20170215;B018-19 *
枯草芽孢杆菌谷氨酰t-RNA还原酶基因（hemA）和谷氨酰t-RNA合成酶基因（hemL）表达载体的构建及优化;刘锦妮;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》;20081215;A006-107 *

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