CN116121225A - 一种低温海藻糖酶、其编码序列、高产重组菌株及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种低温海藻糖酶Mptre15A及其编码基因。低温海藻糖酶MpTre15A，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；低温海藻糖酶MpTre15A编码基因的核苷酸序列如SEQID NO.2或SEQ ID NO.3所示。本发明制得的酶蛋白分子量为66.2KDa，最佳pH值为5.0，最佳温度为50℃，可在4℃‑50℃温度范围内水解海藻糖为葡萄糖，以初始浓度5mg/mL的海藻糖为底物37℃反应60min水解率可达99％以上，4℃反应120min水解率可达89％。该重组表达的海藻糖酶可以用于生物发酵，食品，工业及其它一些领域海藻糖含量测定。

Description

一种低温海藻糖酶、其编码序列、高产重组菌株及应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种低温海藻糖酶MpTre15A及其编码基因与应用。

背景技术

海藻糖是一种由两个葡萄糖单位以1，1-糖苷键连接而成的稳定的双糖，广泛的存在于各种生物中，包括古细菌、细菌、酵母、真菌、昆虫、甲壳类、无脊椎动物和植物，但在脊椎动物中没有。在这些生物体中，海藻糖不仅作为碳能的来源，而且还作为各种应激条件的保护剂，如干燥、渗透胁迫、氧化和温度变化(Elbeinetal，2003)。此外，海藻糖还诱导自噬(Sarkar，2007)，是许多病原体的必要代谢物，如结核分枝杆菌(MycobacteriumtubercuLosis)引起的结核病。Mizunoe等最近提出了一种细胞保护氧化应激的机制，并提出海藻糖可能用于治疗许多涉及氧化应激和自噬功能障碍的慢性疾病。因此，这种双糖被认为是一种在制药，食品和化妆品行业中有价值成分。(Elbein et，2003；Ohtake andWang，2011)。

海藻糖酶(葡萄糖苷水解酶，EC3.2.1.28)水解海藻糖产生两个葡萄糖分子，广泛存在于真核生物，细菌和古菌中。在碳水化合物活性酶(CAZy，http://www.cazy.org/)数据库中，海藻糖酶被分为糖苷水解酶37，65和15家族(GH37，GH65，GH15)。GH37家族只含有海藻糖酶，而酸性海藻糖酶和一些磷酸化酶属于GH65家族，少数来源于古菌和细菌的海藻糖酶属于GH15家族。GH15糖酶发现较晚，其生化和结构特征没有得到广泛的研究。

据目前报道的文献来看，热源体属(Thermoplasma sp.)来源的海藻糖酶TVN1315和Ta0286其最适作用温度分别为60℃和50℃，在30～70℃下处理60min稳定性不变；两种海藻糖酶在pH约为3.7时具有最佳活性，在狭窄的pH范围内活跃(Sakaguchi，2015)。硫化叶菌(S.acidocaldarius)来源的海藻糖酶SaTreH1和SaTreH2其最适作用温度分别为60℃和70℃，在30～70℃下处理60min稳定性几乎不变(Mitsuhiro，2018)。分枝杆菌(Mycolicibacterium smegmatis)来源的海藻糖酶最适作用温度为37℃，最适作用pH为7.0(David Carroll，2007)。

目前，酿酒酵母进行的酒精发酵主要是以淀粉质原料为主，在玉米酒精工厂中未发酵残糖中二糖的主要成分通常是海藻糖，如果在发酵前用海藻糖酶将海藻糖水解为葡萄糖，就可以有更多的葡萄糖用于生产更多的乙醇。也有文献报道谷氨酸发酵过程中会产生海藻糖，影响糖酸转化率。在发酵的后期添加海藻糖酶，可以提高糖源的转化效率以及提高最后的谷氨酸产量。此外，在食品工业中，海藻糖被作为一种食品添加剂，但一些地区人群中存在着肠道糖酶缺乏症，不能将糖水解为葡萄糖。高活性海藻糖酶可以开发为治疗海藻糖酶缺乏的酶制剂药物。因此，高活性海藻糖酶在发酵工业和药物酶开发中都具有良好的应用前景。

低温酶具有在低温下的高活性及容易热灭活的优势，在发酵工业中具有独特的应用优势。已有大量低温淀粉酶、低温蛋白酶及低温葡萄糖苷酶等不同类型低温酶的文献记载，但低温下具有高活性的海藻糖酶尚未见报道。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种新的低温海藻糖酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1，低温海藻糖酶的核苷酸序列为SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3。

本发明的又一个目的是提供携带编码低温海藻糖酶核苷酸序列的重组表达载体及其重组菌株。

本发明的又一个目的是提供利用所述的重组表达载体和重组菌株在生产低温海藻糖酶中的应用。

本发明的又一目的是提供一种低温海藻糖酶的制备方法。

本发明的目的通过如下技术方案实现。

本发明所公开的一种低温海藻糖酶其特在于：氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

本发明所公开的一种低温海藻糖酶，其特征在于：核苷酸序列为SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3。

本发明还公开了一种含有所述的用于编码低温海藻糖酶的核苷酸序列的重组表达载体、高产重组菌。

所述重组表达载体是将上述的核苷酸序列插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达低温海藻糖酶的重组表达载体。

所述大肠杆菌表达载体为pET21a-MpTre15A_o

所述的高产重组菌株是将上述的重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到高产重组菌株。

所述的大肠杆菌为BL21(DE3)。

所述的核苷酸序列、所述的重组表达载体、高产重组菌株在生产低温海藻糖酶中的应用。

一种低温海藻糖酶的制备方法，是培养所述的高产重组菌得到的低温海藻糖酶。

一种低温海藻糖酶(MpTre15A)的制备方法，包括以下步骤：

a、低温海藻糖酶基因的扩增；

b、低温海藻糖酶基因原核表达载体构建；

c、低温海藻糖酶蛋白的表达；

d、低温海藻糖酶蛋白的纯化即得到低温海藻糖酶。

有益效果：本发明相对于现有技术，具有以下优点：

1.本发明提供一种新的从微杆菌(Microbacterium phyllosphaerae LW106)得到的低温海藻糖酶，酶蛋白分子量约为66.2KDa。选用大肠杆菌作为表达菌株，该海藻糖酶基因经密码子优化后进行重组表达，摇瓶发酵海藻糖酶的表达水平的可以达到26.4mg/L，纯化的重组海藻糖酶比酶活可达到77.6U/mg。

2.本发明的低温海藻糖酶最适作用温度为50℃，最佳作用pH为5.0，在pH4.0-8.0稳定性好，pH4.0-8.0范围内反应，酶活力为最高酶活力的80％以上；最适作用温度下的k_cat为347.45s^-1，高于目前发现的其他GH15家族海藻糖酶，即使在4℃下，k_cat为104.50s^-1，也明显高于其他GH15家族海藻糖酶。

3.本发明的低温海藻糖酶在4℃-50℃温度范围内均可高效水解海藻糖为葡萄糖，以初始浓度5mg/mL的海藻糖为底物50℃反应10min水解率可达100％，37℃反应60min水解率可达99％以上，25℃反应120min水解率可达97％以上，4℃反应120min水解率可达89％。以初始浓度50mg/mL的海藻糖为底物50℃反应120min水解率可达99％，37℃反应120min水解率可达93％以上，25℃反应120min水解率可达89％，4℃反应120min水解率可达73％。

附图说明

图1是MpTre15A重组表达产物纯化分析电泳图。

图2是葡萄糖含量标准曲线。

图3是pH对MpTre15A活性(a)和pH稳定性(b)的影响。

图4是温度对MpTre15A活性(a)和热稳定性(b)的影响。

图5是低温海藻糖酶MpTre15A水解海藻糖时间过程的HPLC分析。

具体实施方式

下面结合实例以及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。以下实施例中未作具体说明的分子生物学试验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂盒生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1：低温海藻糖酶基因的克隆、表达载体构建、重组表达及纯化

(1)低温海藻糖酶基因的克隆及密码子优化

从天山一号冰川冻土土样筛选、分离得到的一株耐冷微杆菌Microbacteriumphyllosphaerae。通过提取总DNA并进行全基因组测序获得该耐冷微杆菌的海藻糖酶基因MpTre15A，基因全长1794bp，编码597个氨基酸，其所编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2。上述海藻糖酶基因经密码子优化后的核苷酸序列为SEQ IDNO.3。

(2)海藻糖酶基因MpTre15A原核表达系统的构建

将上述海藻糖酶基因经密码子优化后的核苷酸序列SEQ ID NO.3通过NdeI和BamHI酶切后与同样酶切的大肠杆菌表达载体pET21a，利用T4连接酶进行连接，构建获得重组表达质粒pET21a-MpTre15A，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞Top10，在含氨苄(50ug/mL)的LB琼脂糖平板培养筛选阳性克隆。提取阳性克隆的质粒，送样基因测序。测序结果表明，得到的重组表达载体构建正确，命名为pET21a-MpTre15A。

将鉴定正确的重组质粒pET21-MpTre15A转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后涂布到含氨苄(50ug/mL)的平板上，37℃培养过夜；从转化后培养过夜的平板上挑单克隆到10mL含50ug/mL氨苄的LB培养基中，37℃摇床中振荡培养过夜；次日将菌液按1％的比例接种到LB液体培养基(含50ug/mL氨苄)中，37℃摇床中培养2-3h，在菌液的0D₆₀₀达到0.6-0.8之间时，取1mL菌液做诱导前对照样品，其余培养液中加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导培养12h，离心少量菌体，加适量PBS溶液(pH7.0)，震荡悬浮后加入等体积的2×SDS上样缓冲液，100℃水浴5min，SDS-PAGE电泳检测。

(3)海藻糖酶在大肠杆菌中的诱导、表达及纯化

在含氨苄(50ug/mL)的的LB培养基平板上“之”字形划线，37℃培养过夜；从培养过夜的平板上挑单克隆到20mL含50ug/mL氨苄的LB培养基中，37℃摇床中振荡培养过夜；次日将菌液按1％的比例接种到LB液体培养基(含50μg/mL氨苄)中，37℃摇床中培养2-3h，在菌液的0D₆₀₀达到0.6-0.8之间时，加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导培养20h，8000rpm离心10min获得菌体。将细胞重悬在30mL裂解缓冲液中，用超声破碎仪超声裂解，在4℃、12000rpm离心20min，去除细胞碎片，获得上清液。2倍柱体积裂解液(50mM磷酸钠，300mM氯化钠，30mM咪唑，pH7.0)加入到Ni-NTA树脂纯化柱中。非特异性结合蛋白用10倍柱体积的洗涤缓冲液(50mM磷酸钠，300mM氯化钠，50mM咪唑，pH7.0)洗涤。然后用3倍柱体积的洗脱缓冲(50mM磷酸钠，300mM氯化钠，250mM咪唑，pH7.0)洗脱目标蛋白。为了去除残留的盐和咪唑，将洗脱的蛋白溶液加入到超滤管(10kDa截止)中，用100mM(pH7.0)磷酸钠缓冲液置换二到三次。取50μL裂解液和纯化蛋白分别与50μL2×蛋白上样缓冲液于离心管中，再用100℃沸水煮10min。取7μL变性处理的样品应用于SDS-PAGE凝胶上。通过结合相应洗脱组分的酶活和纯度来收集目标蛋白(图1)。采用微量蛋白含量测定仪NanoDrop2000对纯化的海藻糖酶进行蛋白浓度的测定，测得摇瓶发酵海藻糖酶的表达水平的可以达到26.4mg/L。

实施例2：海藻糖酶酶活的测定方法

海藻糖酶在一定条件下催化水解海藻糖生成葡萄糖，3，5-二硝基水杨酸与还原糖溶液共热后被还原为显棕红色的氨基络合物，在一定范围内其颜色深浅与还原糖的量成正比，故可以在540nm的波长下进行比色，计算酶活力。

酶反应体系：

55uL稀释后的纯酶，55uL以pH5.0的柠檬酸钠缓冲液为溶剂配置的9mM海藻糖溶液，混合，50℃反应10分钟，生成还原糖采用3，5-二硝基水杨酸法测定。

海藻糖酶活定义：

在上述条件下，每分钟水解海藻糖产生1μmoL葡萄糖所需的酶量为一个酶活单位。

试剂和溶液：

柠檬酸钠缓冲液：分别准确称取柠檬酸钠9.606g，柠檬酸12.9035g溶于500mL水中。柠檬酸溶液和柠檬酸钠溶液体积比按41：59混合，然后用pH计校正至5.0。

DNS试剂：准确称取3，5-二硝基水杨酸2g放于盛有100mL蒸馏水的烧杯中，少量多次加氢氧化钠3.2g，于45℃水浴锅中水浴溶解，加酒石酸钾钠60g，搅拌至溶解并澄清，冷却至室温，用蒸馏水定容至200mL，过滤，贮于棕色瓶中放置7天后使用。

葡萄糖标准曲线的绘制：

分别吸取0.1％(W/V)标准葡萄糖液0.08，0.12，0.16，0.20，0.24，0.28，0.32mL，依次加入到刻度试管中，用蒸馏水补加至1mL，配制成每毫升分别含有葡萄糖80，120，160，200，240，280，320ug的标准液，摩尔浓度分别对应为0.44，0.67，0.89，1.11，1.44，1.89umM。各加入DNS试剂1mL，于沸水中沸腾10分钟(样品放入重新沸腾时算起)，冷却后，向96孔板中加入200uL反应液，以pH5.0的柠檬酸钠缓冲液为空白，酶标仪测定波长540nm处的光密度值，以光密度值为纵坐标，以对应的标准葡萄糖摩尔浓度为横坐标，绘制标准曲线，见图2。

测定步骤：

在55uL适当稀释的酶液中加入55uL 9mM海藻糖溶液，50℃保温10min，加入110uLDNS，在沸水中煮沸10分钟，冷却。按制作标准曲线时同样的操作测定光密度值(OD540)。

55uL柠檬酸钠缓冲液加入55uL9mM海藻糖溶液，50℃保温10min，加入110uL DNS，在沸水中煮沸10分钟，冷却。按制作标准曲线时同样的操作测定光密度值(OD540)，作为空白。

酶活力的计算：

酶活＝[(OD₅₄₀-b值)×0.11×N×(1000/55)]/10×k值

实施例3：海藻糖酶的最适反应温度

以pH5.0的柠檬酸钠缓冲液配置海藻糖溶液作为底物，分别在10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃下，用DNS法测定重组海藻糖酶MpTre15A的酶活力，以pH5.0、50℃条件下测得的相对酶活为100％，制作优化的海藻糖酶最适作用温度曲线。为了确定酶的热稳定性，将低温海藻糖酶，在不同温度下孵育12小时，每隔两个小时提取反应等分物进行活性测定。残留活性在50℃，pH为5.0下测定，以初始测得的相对酶活为100％，结果如图3。

结果表明低温海藻糖酶的最适作用温度为50℃，在40℃条件下孵育12h保持着原始酶活的70％左右。

实施例4：海藻糖酶的最适反应pH

在50℃条件下，海藻糖酶分别在pH为3.0、3.4、3.8、4.2、4.6、5.0、5.4、5.8、6.2、6.6、7.0、7.4、7.8、8.2、8.6和9.0的缓冲液中与海藻糖溶液反应，用DNS法测定重组海藻糖酶MpTre15A的酶活力。以50℃、pH5.0条件下测得的相对酶活为100％，制作海藻糖酶的最适作用pH曲线。为了确定酶的pH稳定性，将低温海藻糖酶，在pH4.0-9.0条件下孵育12小时，每隔两个小时提取反应等分物进行活性测定。残留活性在50℃，pH为5.0下测定，以初始测得的相对酶活为100％，结果如图4。

结果表明重组低温海藻糖酶MpTre15A的最佳反应pH为5.0，在pH4.0～5.5的区间都具有较好的酶活。在pH4.0-8.0孵育12h保持着原始酶活的80％左右。

实施例5：不同温度海藻糖酶酶动力学常数的测定

以pH5.0的柠檬酸钠缓冲液配置4mM-50mM的海藻糖溶液作为底物，分别在4、25、37、50℃下检测海藻糖酶酶活，用DNS法测定。利用Origin中的Michaelis Menten函数，将实验数据与Michaelis Menten方程进行非线性拟合，计算出酶动力学参数K_m，利用MpTre15A的理论分子量(62.5kDa)计算得到该酶的催化速率常数k_cat。

表1不同GH15家族海藻糖酶对底物海藻糖的动力学参数

由表一可知重组低温海藻糖酶MpTre15A在最适条件下的k_cat和K_m分别为347.45s^-1和37.96mM，且最适作用温度下的k_cat高于目前发现的其他GH15家族海藻糖酶，即使在4℃下k_cat也明显高于其他GH15家族海藻糖酶。

实施例6：海藻糖酶的水解率

以pH5.0的柠檬酸钠缓冲液为溶剂配制不同浓度的海藻糖溶液：5mg/mL，50mg/mL；海藻糖酶MpTre15A与不同浓度海藻糖溶液分别在50、37、25、4℃下反应2h，反应结束后沸水浴10min终止反应。样品经0.22um滤膜过滤后采用高效液相色谱仪(HPLC，Shimazu，日本)进样分析。色谱柱为Hi-Plex Na低聚糖分析柱，流动相为三蒸水，流速为0.2mL/min，柱温80℃，进样量20uL。通过峰面积及出峰时间计算海藻糖的转化效率。结果如图5。

结果表明重组低温海藻糖酶的水解效率高。以初始浓度5mg/mL的海藻糖为底物50℃反应10min水解率可达100％，37℃反应60min水解率可达99％以上，25℃反应120min水解率可达97％以上，4℃反应120min水解率可达89％。以初始浓度50mg/mL的海藻糖为底物50℃反应120min水解率可达99％，37℃反应120min水解率可达93％以上，25℃反应120min水解率可达89％，4℃反应120min水解率可达73％。

Claims (7)

1.一种低温海藻糖酶，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

2.一种低温海藻糖酶，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3。

3.一种低温海藻糖酶重组表达载体，其特征在于，将权利要求2所述的核苷酸序列插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达低温海藻糖酶的重组表达载体。

4.如权利要求4所述的低温海藻糖酶重组表达载体，其特征在于，大肠杆菌表达载体为PET21a。

5.一种高产重组菌株，其特征在于，将权利要求3或4所得到的重组表达导入大肠杆菌中，筛选得到高产重组菌株。

6.根据权利要求5所述的细胞，其特征在于，大肠杆菌为BL21(DE3)。

7.一种低温海藻糖酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

a、低温海藻糖酶基因的扩增；

b、低温海藻糖酶基因原核表达载体构建；

c、低温海藻糖酶蛋白的表达；

d、低温海藻糖酶蛋白的纯化即得到低温海藻糖酶。

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