CN101613681A - 重组极端耐热α-淀粉酶的复性与纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种嗜热α－淀粉酶的制备方法，包括：用去垢剂溶液溶解嗜热α－淀粉酶的包涵体，从而获得含嗜热α－淀粉酶的溶液；和从所获得的溶液中分离出所述的嗜热α－淀粉酶。本发明的方法获得的嗜热α－淀粉酶具有天然蛋白一致的酶活性及耐热性。本发明的方法具有简便、高效、低成本及易于放大的特点，特别适用于重组嗜热α－淀粉酶的较大规模制备。同时该方法亦适用于其它以不溶性包涵体形式表达的嗜热蛋白质的复性纯化。

Description

重组极端耐热α-淀粉酶的复性与纯化方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种嗜热α-淀粉酶的重组表达与制备方法。

背景技术

α-淀粉酶是工业上最常用的酶制剂之一，广泛应用于食品、纺织、化工工业以及发酵工业中的淀粉加工。寻求与开发耐受高热的淀粉酶长期以来始终是工业酶研究领域的重点与热点课题。对于淀粉酶耐热性，生产产率以及酶活性的任何提高均具有十分重要的理论意义与直接商业价值。

目前已经发现了多种嗜热α淀粉酶。例如，获自嗜热古菌(Pyrococcusfuriosus)的α-淀粉酶PFA；获自火球菌属的嗜热α-淀粉酶、获自沃氏火球菌(Pyrococcus woesei)的嗜热α-淀粉酶等等。P furiosus是从海底火山温泉中分离得到的绝对厌氧菌，最适生长温度100℃，培养相对较为复杂，难以实现大规模工业培养，PFA的较大量制备只能通过外源重组表达方能够实现。至今尚未有适宜于该酶的较大规模的制备方法的公开报道。

目前多家实验室在大肠杆菌及酵母中进行了α-淀粉酶的重组表达研究，但表达量均较低。以往的研究思路主要偏重于提高其可溶性的表达，包括采用低温诱导，以提高重组蛋白质可溶性表达的策略，从菌体破碎上清中纯化得到该重组蛋白；以及采用与Intein融合表达的方式，提高了蛋白可溶性表达量等方法，但总的表达量仍不高。

本发明人在以往的工作中也致力于重组PFA的重组表达研究，尝试采用了与现有技术思路不同的研究策略，即首先实现重组PFA蛋白质分子的大量与高效表达，即使是以不溶性的包涵体形式，之后再研究采用合适的纯化复性方法以获得较高活性的重组酶。以往的研究中，本发明人已经建立碱变性-加热-稀释复性的纯化方法，较高效率地纯化获得了具有较高生物活性重组PFA。然而，碱变性-加热-稀释复性方法存在的问题是对操作条件要求高，对温度和PH具有严格的要求。

综上，本领域还需要进一步研究改进嗜热α-淀粉酶表达的策略，提供简便、高效、低成本、易于放大的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种嗜热α-淀粉酶的制备方法。

在本发明的第一方面，提供一种嗜热α-淀粉酶的制备方法，它包括步骤：

(1)用去垢剂溶液溶解嗜热α-淀粉酶的包涵体，从而获得含嗜热α-淀粉酶的溶液；和

(2)从(1)获得的溶液中分离出所述的嗜热α-淀粉酶。

在另一优选例中，所述的嗜热α-淀粉酶选自：火球菌属(Pyrococcus)的嗜热α-淀粉酶、嗜热古菌(Pyrococcus furiosus)的嗜热α-淀粉酶(PFA)、沃氏火球菌(Pyrococcus woesei)的嗜热α-淀粉酶或来源于其他嗜热微生物的嗜热α-淀粉酶。

在另一优选例中，所述的去垢剂是离子型去垢剂。

在另一优选例中，在步骤(1)之前，还包括：利用原核表达系统表达嗜热α-淀粉酶，从而获得嗜热α-淀粉酶的包涵体。

在另一优选例中，原核表达系统是大肠杆菌。

在另一优选例中，用于表达嗜热α-淀粉酶的表达载体为pT7473或pET21a。

在另一优选例中，在步骤(1)中，所述的去垢剂选自：十二烷基磺酸钠(SDS)或十二烷基肌氨酸钠(SLS)。

在另一优选例中，所述的去垢剂溶液中去垢剂的浓度按照重量体积比(w/v)是0.01-10％；较佳的是0.02-5％；更佳的是0.1-3％；进一步更佳的是0.1-1％；如0.15％，0.2％，0.3％，0.5％，0.8％。

在另一优选例中，所述的去垢剂溶液含有：按照重量体积比0.01-10％的去垢剂和缓冲溶液。

在另一优选例中，所述的缓冲液是醋酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液。

在另一优选例中，在步骤(1)中，去垢剂溶液溶解嗜热α-淀粉酶的包涵体的时间是1-200分钟；较佳的是10-100分钟；如40分钟、60分钟、80分钟。

在另一优选例中，所述的去垢剂溶液的PH值是2.5-10.0；较佳的PH值是4.0-7.0。

在另一优选例中，在步骤(2)中，采用疏水层析法从含嗜热α-淀粉酶的溶液中分离嗜热α-淀粉酶。

在另一优选例中，采用Phenyl Sepharose 6Fast Flow疏水层析柱进行疏水层析；用乙二醇(优选包含在醋酸钠缓冲液中)梯度洗脱。

在另一优选例中，还包括：收集用含10-80％(较佳的是30-70％)乙二醇洗脱的样品。

在本发明的第二方面，提供一种去垢剂的用途，用于溶解嗜热α-淀粉酶的包涵体，获得酶活力不变或增强的嗜热α-淀粉酶。

在另一优选例中，所述的去垢剂选自：十二烷基磺酸钠(SDS)、十二烷基肌氨酸钠(SLS)。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1变性剂及有机溶剂对PFA淀粉酶活力的影响。

图2不同起始浓度的包涵体在各种浓度SDS中的溶解情况。

包涵体蛋白质浓度：A，6mg/ml；B，15mg/ml；C，26mg/ml；D，52mg/ml。

◆蛋白质浓度，△酶活。

图3SDS法PFA疏水柱纯化图谱及SDS-PAGE分析图。

A：疏水层析图谱，其中，峰1，流过样品；峰2，乙二醇洗脱峰I；峰3，乙二醇洗脱峰II。

B：SDS-PAGE电泳结果。其中，M，分子量标准；1，PFA重组菌；2，PFA包涵体；3，去垢剂溶解后样品；4，疏水柱上样样品；5，6，乙二醇洗脱样品。

图4十二烷基肌氨酸钠法PFA疏水柱纯化图谱及SDS-PAGE分析图。

A：疏水层析图谱，其中，峰1，流过样品；峰2，乙二醇洗脱峰I；峰3，乙二醇洗脱峰II。

B：SDS-PAGE电泳结果。其中，M，分子量标准；1，PFA重组菌；2，PFA包涵体；3，去垢剂溶解后样品；4，疏水柱上样样品；5，6，乙二醇洗脱样品。

图5去垢剂方法纯化的PFA耐热性鉴定。

A：去垢剂法纯化的PFA与碱-加热法纯化得到的PFA耐热性比较，其中，■，去垢剂法100℃；◆，碱法100℃；×，去垢剂法120℃；▲，碱法120℃。

B：去垢剂法纯化得到的PFA在不同温度下的耐热性比较，其中，◆，90℃；▲，100℃；×，110℃；+，120℃。

图6碱-加热方法与SDS方法纯化获得的PFA酶水解产物HPLC分析图谱，其中，

A：碱加热方法；

B：SDS方法。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，出乎意料地发现采用一定浓度的去垢剂来处理嗜热α-淀粉酶包涵体，不仅可良好地溶解嗜热α-淀粉酶包涵体，而且不会对嗜热α-淀粉酶的酶活性产生影响，甚至还可一定程度地提高嗜热α-淀粉酶的酶活性；也即嗜热α-淀粉酶对于去垢剂及一些有机溶剂具有较强的抵御作用。并且，经去垢剂溶解的嗜热α-淀粉酶可直接通过疏水层析的方法进行纯化。本发明的方法具有简便、高效、成本低廉、收率高且易于放大的特点，克服了现有技术中嗜热α-淀粉酶重组表达量低下或表达条件烦琐等技术缺陷。

原核表达系统(如大肠杆菌)以其易于操作、遗传背景清楚、发酵成本低和蛋白表达水平高等优点，依然是生产重组蛋白的首选表达系统。但是原核表达的蛋白常常以包涵体的形式沉积于细胞内，表现为无活性的不溶性聚集物，如何高效地复性蛋白是基因工程蛋白生产过程中最关键和最困难的一步。包涵体溶解变性与复性是蛋白纯化过程中的最为关键的因素。在大肠杆菌中表达的外源重组蛋白质包涵体，其蛋白质分子间主要通过非共价作用相互结合在一起，这些非共价作用包括疏水作用、范德华力、氢键以及离子键作用，唯一的共价作用是蛋白质分子中半胱氨酸残基间的-S-S-键。

目前常用的包涵体溶解方法是高浓度的尿素与盐酸胍等变性剂。然而，蛋白包涵体的溶解受到多种因素的限制，不适合的溶解方法极易于影响蛋白的活性，如去垢剂类蛋白变性剂的采用极易于影响蛋白活性，被本领域人员列为慎用的对象。而嗜热α-淀粉酶属于水解酶类的蛋白，更需要慎重地选择变复性方法和试剂以良好地保留其酶活性。本发明人试验了多种对于包涵体溶解可能有用的试剂，最终意外地发现SDS等去垢剂对于嗜热α-淀粉酶的活性没有任何影响，甚至还可能提高嗜热α-淀粉酶的活性，其耐热性与天然蛋白一致，其水解产物也与已报道的一致。并且，采用变性剂进行嗜热α-淀粉酶包涵体的溶解操作条件简单，成本低廉。

因此，本发明提供一种嗜热α-淀粉酶的制备方法，它包括步骤：(1)用去垢剂溶液溶解嗜热α-淀粉酶的包涵体，从而获得含嗜热α-淀粉酶的溶液；和(2)从(1)获得的溶液中分离出所述的嗜热α-淀粉酶。

可用于本发明的嗜热α-淀粉酶可以是来自嗜热古菌(也译为激烈火球菌)的嗜热α-淀粉酶、火球菌属的嗜热α-淀粉酶、沃氏火球菌(Pyrococcus woesei)的嗜热α-淀粉酶以及来源于其他嗜热微生物的嗜热α-淀粉酶。在本发明中，所述的嗜热α-淀粉酶也可以是嗜热α-淀粉酶的变异体。代表性的嗜热α-淀粉酶包括(但并不限于)由以下基因编码的嗜热α-淀粉酶：GenBank登录号U96622、AF001268、AF177906.1、AE010170.1、AF240464.1、DQ192528.1等。较佳的是来自嗜热古菌的嗜热α-淀粉酶。

可用于本发明的包涵体没有特别限制，只要该包涵体含有重组表达的嗜热α-淀粉酶。本发明所用的包涵体可由本领域常规的重组方法获得，其中可以选用本领域常规的各种宿主细胞(一般是原核表达系统，如大肠杆菌)、质粒、启动子等材料构建重组表达宿主细胞，并且在常规条件下发酵，从而获得包涵体。一种获得所述包涵体的方法是：用编码嗜热α-淀粉酶的多核苷酸，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；培养该宿主细胞，使其大量表达嗜热α-淀粉酶，形成包涵体。优选的，所述的宿主细胞是大肠杆菌；所述的用于表达嗜热α-淀粉酶的表达载体为pT7473或pET21a。

作为本发明的优选方式，所述的去垢剂是离子型去垢剂。任何具有上述特点的去垢剂在本发明中均是可用的。更佳的，所述的去垢剂选自：十二烷基磺酸钠(SDS)、十二烷基肌氨酸钠等。进一步更佳的，所述的去垢剂是SDS。

由于去垢剂对于嗜热α-淀粉酶的酶活性没有负面影响，因此当用于溶解嗜热α-淀粉酶时，可采用的去垢剂的浓度范围是较宽的。合适的去垢剂的浓度可根据包涵体蛋白的浓度来确定。作为本发明的优选方式，所述的去垢剂溶液中去垢剂的浓度按照重量体积比(w/v)是0.01-10％；较佳的是0.02-5％；更佳的是0.1-3％；进一步更佳的是0.1-1％；如0.15％，0.2％，0.3％，0.5％，0.8％。

当用于溶解包涵体时，所述的去垢剂可以存在于任何合适的溶剂或缓冲液中，只需将该溶剂或缓冲液的pH调节到特定的数值。合适的缓冲液可以包括(但并不限于)以下种类：磷酸盐、硼酸盐、醋酸盐、Tris-HCl、碳酸盐、甘氨酸-NaOH或它们的组合。合适的缓冲液的选择是本领域人员熟知的。

作为本发明的一种方式，所述的去垢剂溶液含有：0.01-10％的去垢剂和10-500mmol/L(较佳的是20-300mmol/L；更佳的是40-200mmol/L)醋酸盐溶液。

去垢剂溶液溶解嗜热α-淀粉酶的包涵体的时间没有特别的限制，一般根据包涵体蛋白的浓度以及去垢剂的浓度的不同而不同，通常是1-200分钟；较佳的是10-100分钟；如40分钟、60分钟、80分钟。

在充分溶解后，多种蛋白纯化方法均可用于从含嗜热α-淀粉酶的溶液中分离出α-淀粉酶，包括但不限于分子筛法、离子交换层析、疏水层析等；或者也可采用一种以上的蛋白纯化方法，主要视所需的蛋白纯度而定。本发明人意外地发现，经去垢剂溶解的嗜热α-淀粉酶蛋白仍可以吸附于疏水层析介质上，并可通过适当的洗脱液洗脱下来得以纯化。与采用分子筛法相比，采用疏水层析法不仅可极好地从含嗜热α-淀粉酶的溶液中分离嗜热α-淀粉酶，而且上柱量大，成本低廉，适合较大规模的蛋白纯化。

作为本发明的优选方式，采用Phenyl Sepharose 6Fast Flow疏水层析柱进行疏水层析；用乙二醇(优选包含在醋酸钠缓冲液中)梯度洗脱。

进一步的实验结果证实，采用本发明的方法溶解和纯化获得的嗜热α-淀粉酶在酶的比活性、耐热性以及酶水解产物等方面均具有与天然嗜热α-淀粉一致的性质。

本发明的主要优点在于：

(1)首次发现采用一定浓度的去垢剂来处理嗜热α-淀粉酶包涵体，不仅可良好地溶解嗜热α-淀粉酶包涵体，而且不会对嗜热α-淀粉酶的酶活性产生影响。

(2)建立了一种新的适合于复性和纯化包涵体形式表达的重组嗜热α-淀粉酶的方法，该方法具有简便、高效、低成本、易于放大的特点，可以方便地应用于重组嗜热α-淀粉酶的较大规模制备。同时该方法亦适用于其它以不溶性包涵体形式表达的嗜热蛋白质的复性纯化。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

I.材料与方法

1.菌株及载体

携带pET21a-PFA表达载体的Ecoli BL21-Codon Plus(DE3)-RIL表达菌株的构建方法如下：

以Pyrococcus furiosus DSM3638(参见CN 200610025974.0)基因组DNA为模板进行PCR扩增，上游引物为5ATGAAATACTTGGAGCTTGAAGAG 3；下游引物为5AAGAAGCTTATCACCCAACACCACAATAACTC 3；扩增程序为：94℃变性3min，94℃ 1min，55℃ 1min，72℃2min，35个循环，72℃延伸10min。

PCR扩增产物Hind III酶切，经1.0％琼脂糖凝胶电泳，胶回收试剂盒回收，pET21a(Novagen)以Nde I酶切，以T4DNA聚合酶补平，再以Hind III酶切，胶回收试剂盒回收，以T4DNA连接酶连接回收PCR片段和载体，转化E.coliDH5α感受态，菌落PCR方法鉴定转化子，DNA序列测定与GenBank收录的PFA蛋白序列对比完全相同。

将测序正确的重组质粒pET21a-PFA转化到Ecoli BL21-Codon Plus(DE3)-RIL(参见CN 200610025974.0)中，获得重组PFA表达菌株。

2.主要试剂和溶液

超声破碎缓冲液：Tris.HCl(pH8.0)50mM，EDTA 10mM，NaCl 100mM。

120mmol/L Britton-Robinson缓冲液：醋酸、磷酸、硼酸各40mmol/L，用NaOH调至所需pH值。

DNS试剂：1g 3，5-二硝基水杨酸溶解于20ml 2mol/LNaOH中，加入30g酒石酸钠钾，稀释至100ml。

3.变性剂和有机溶剂对PFA淀粉酶活性的影响

取适量的酶液，分别加入含8M尿素、6M盐酸胍、1％去垢剂(如SDS)的120mmol/L Britton-Robinson缓冲液(pH8.5)，使终浓度分别为6M尿素、4M盐酸胍、0.2％(w/v)SDS。

取适量的酶液，按酶液∶有机溶剂体积比为7∶1的比例分别加入甲醇、乙醇、丙酮三种有机溶剂。

室温放置1小时，用含相应变性剂或有机溶剂的缓冲液稀释后测定酶活。

4.重组菌的发酵

在15L发酵罐中进行PFA重组菌的高密度发酵，采用分批补料培养模式，最终每立升发酵培养液中可获得约60g湿菌体。重组PFA蛋白质表达量占菌体总蛋白含量约20％。

5.包涵体在不同浓度去垢剂中的溶解性

取发酵所得菌体，悬浮于超声破碎缓冲液中超声破碎，离心后弃去上清，反复三次，获得包涵体。水悬浮包涵体，调整蛋白浓度为5～8mg/ml，按100μl、200μl、400μl、800μl/管分装入Eppendorf管中，各分装5管，14000rpm离心40分钟，弃去上清。每管加入100μl 120mmol/L Britton-Robinson缓冲液(pH8.5)，超声使蛋白悬浮均匀。加入1/10悬浮液体积的不同浓度的去垢剂溶液，使得去垢剂终浓度分别为0.05～2％。振荡均匀后室温放置1小时使充分溶解。14000rpm离心40分钟，测定上清的蛋白量和酶活力。

6.去垢剂方法溶解、纯化包涵体

每克包涵体湿重悬浮于50ml含0.2％去垢剂的50mmol/L，pH5.0醋酸钠溶液中。室温搅拌1小时使充分溶解。离心，取上清上柱。

用50mmol/L，pH5.0醋酸钠溶液平衡Phenyl Sepharose 6Fast Flow疏水层析柱，上样后用10倍柱体积50mmol/L，pH5.0醋酸钠溶液洗柱。依次用含30％、50％、65％乙二醇的50mmol/L，pH6.0醋酸钠缓冲液梯度洗脱。收集洗脱液，同时A280检测；SDS-PAGE电泳分析蛋白的分布和纯度。以Bradford法对纯化后的目的蛋白进行浓度测定；DNS法进行酶活力的测定。

7.淀粉酶活力测定方法(DNS法)

将稀释的酶液加入到0.5ml含1％淀粉的50mmol/L，pH5.0醋酸钠溶液中，100℃反应15min，迅速放入冰水浴中终止反应。加入0.5ml DNS试剂，沸水煮5分钟，冰水冷却，加入5ml水，用分光光度计检测在波长546nm的吸光度，以葡萄糖与DNS试剂反应作标准曲线。以1分钟降解淀粉产生1μmol葡萄糖的酶量定义为1个酶活力单位(U)。

8.PFA淀粉酶的热稳定性

为检验去垢剂方法对PFA淀粉酶热稳定性的影响，分别对碱-加热法(参见CN 200610025974.0)和去垢剂法获得的纯化蛋白进行耐热性的测定。

将两种方法获得的纯化蛋白透析后调整到适当浓度，在0.6ml PCR管中加入20μl蛋白，加20μl矿物油以防止加热过程中挥发。分别于90℃、100℃、110℃、120℃放置0.5h、1h、1.5h、2h、4h。100℃以内在PCR仪中进行，100℃在沸水浴中进行，100℃以上在高压灭菌锅中进行，并忽略升降温时间。取出后立即置于冰水中冷却。对照置于室温。用50mmol/L醋酸钠(pH6.0)20倍稀释热处理后的酶液，取20μl用DNS法测残余酶活。将室温放置的酶活力定为100％，其他与之比较得出相对酶活。

9.重组PFA酶水解产物分析

将纯化的重组PFA(2.5U/ml)加入到1％可溶性淀粉溶液中95℃保温4小时以上，冷却后取上清进行HPLC检测分析(Aglient 1100高效液相色谱)。

色谱条件如下：

色谱柱：DIKMA Inertsil NH₂，5u，4.6*250mm。流动相：70％乙腈/水，流速：1.0ml/min，柱温：25C，检测器：SEDEX 75ELSD蒸发光检测器。以葡萄糖及相应麦芽寡糖作为标准品。

II.实施例

实施例1变性剂和有机溶剂对PFA淀粉酶活性的影响

由于以往报道PFA具有较强的抗逆性。本发明人研究了几种变性剂与有机溶剂对PFA酶活力的影响。将PFA淀粉酶分别置于6M尿素、4M盐酸胍、0.2％SDS以及1/8(V/V)甲醇、丙酮、乙醇中测定其酶活力，发现4M盐酸胍会降低酶活力，三种有机溶剂对PFA的酶活力影响不大。而SDS对PFA的酶活力不仅没有影响，且有一定程度的增强作用，结果见图1。

实施例2包涵体在不同浓度去垢剂中的溶解性

SDS曾被用于难溶蛋白质的溶解。经前述验证，去垢剂不会抑制PFA的淀粉酶活力，因此本发明人尝试采用去垢剂溶解PFA包涵体，以期获得更简便、高效的纯化方法。

通过测定几种浓度的包涵体在不同浓度去垢剂的溶解性，发现随包涵体蛋白浓度升高，充分溶解包涵体所需的去垢剂浓度随之升高，见图2。

实施例3PFA的纯化1

取发酵所得菌体，悬浮于超声破碎缓冲液中超声破碎，离心后弃去上清，将沉淀悬浮，继续超声破碎，反复三次，获得包涵体。用水悬浮。从100g湿菌体中可以获得15-20g湿的PFA包涵体。

取纯化好的湿重为2.0g的包涵体，悬浮于80ml含0.2％SDS去垢剂的50mmol/L，pH5.0的醋酸钠溶液中。室温搅拌1小时使其充分溶解。离心，取上清上Phenyl Sepharose 6Fast Flow疏水层析柱进行分离纯化。

实验结果发现，加入去垢剂溶解后的PFA蛋白质仍能够结合到PhenylSepharose FF凝胶分离介质上，并可用一定浓度的乙二醇进行洗脱。层析图谱及SDS-PAGE电泳分析结果如图3，纯化过程中各步骤的酶活性收率如表1。

表1SDS法蛋白纯化表

步骤	蛋白总量(mg)	总活力(U)	比活力(U/mg)	总蛋白收率(％)	酶活性总收率(％)	提纯倍数
							包涵体	656.1	104550	159.3	100	100	1
0.2％去垢剂溶解	598.3	542080	906.0	91.2	518.5	5.69
							上样	548.2	504100	919.5	83.6	482.2	5.77
50％乙二醇洗脱	58.4	187430	3209.4	8.9	179.3	20.15

实施例4PFA的纯化2

取纯化好的湿重为1.0g的包涵体，悬浮于28ml含有一定浓度十二烷基肌氨酸钠的50mmol/L，pH5.0的醋酸钠溶液中。室温搅拌1小时使其充分溶解。离心，取上清上Phenyl Sepharose 6Fast Flow疏水层析柱。

样品上柱完毕后用2-5倍柱体积德相应缓冲液洗柱，用含有一定浓度乙二醇的缓冲液进行洗脱。层析图谱及SDS-PAGE电泳分析结果如图4，纯化过程中各步骤的酶活性收率如表2。

表2十二烷基肌氨酸钠法PFA蛋白纯化表

步骤	蛋白总量(mg)	总活力(U)	比活力(U/mg)	总蛋白收率(％)	酶活性总收率(％)	提纯倍数
							包涵体	324.0	68040	210	100	100	1
0.2％去垢剂溶解	275.7	289485	1050	85.1	425.5	5.00
							上样	103.8	267804	2580	32.0	393.6	12.28
50％乙二醇洗脱	36.3	144474	3980	11.2	212.3	18.95

实施例5耐热性的测定

对去垢剂溶解法纯化出的蛋白进行耐热性的鉴定，以碱-加热溶解法获得的纯化蛋白作为对照。以往的实验数据表明碱法所获蛋白和天然的PFA蛋白的性质一致(Lisa Wang等，Efficient solubilization，purification of recombinantextracellular α-amylase from pyrococcus furiosus expressed as inclusion bodies inEscherichia coli，Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，(2007)，vol34，NO.3，187-192.)。

实验结果如图5所示，显示在100℃和120℃时，去垢剂溶解法获得的重组PFA具有和对照相同的耐热性。

在已报道的相关研究(Grzybowska B等，Cloning of the thermostable α-amylase gene from Pyrococcus woesei in Escherichia coli.(2004)Mol Biotechnol26：101 109)中，Grzybowska等测定了PFA的耐热性，发现该酶在110℃的半衰期为3.5小时，120℃加热2小时仍有24％的酶活力。与上述已报道的研究相比，本发明人测定了本发明的SDS法纯化的PFA在不同温度下的耐热性，发现其在110℃加热4小时仍能维持50％以上的酶活力。120℃加热2小时仍有34％的酶活力，表明采用去垢剂方法所获得的蛋白具有与天然蛋白一致的耐热性。

实施例6PFA酶水解产物分析

对用碱-加热变性方法及去垢剂溶解方法分离纯化得到的PFA酶水解产物进行分析。

结果如图6。HPLC分析结果显示，两种方法纯化获得的PFA其水解淀粉后的产物组分及其百分含量均无区别。PFA的主要水解产物为G2至G7的寡糖(麦芽2糖至麦芽7糖)，其中葡萄糖的产生量很少。表2中列出了根据HPLC结果得到的两种方法纯化获得的PFA水解淀粉后各种寡糖的百分含量，以及文献报道(Dong G等，Appl Environ Microbiol.63：3577 3584，1997)所对应得结果，表明此两种方法纯化的PFA其水解产物组分等与文献报道结果一致。

表3不同方法纯化获得的PFA水解淀粉后产生的寡糖产物分析

产物(％)	G1	G2	G3	G4	G5	G6	G7	＞G7
									碱-加热法	1.00	23.17	15.95	7.61	15.01	25.89	9.44	1.92
SDS法	0.76	20.46	14.55	6.52	9.83	24.93	19.81	3.15
									Dong G等	2.0	27.5	18.2	12.1	16.4	16.0	11.4	5.0

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种嗜热α-淀粉酶的制备方法，其特征在于，它包括步骤：

(1)用去垢剂溶液溶解嗜热α-淀粉酶的包涵体，从而获得含嗜热α-淀粉酶的溶液；和

(2)从(1)获得的溶液中分离出所述的嗜热α-淀粉酶。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的嗜热α-淀粉酶选自：火球菌属的嗜热α-淀粉酶、嗜热古菌的嗜热α-淀粉酶、沃氏火球菌的嗜热α-淀粉酶或来源于其他嗜热微生物的嗜热α-淀粉酶。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的去垢剂是离子型去垢剂。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，

所述的去垢剂选自：十二烷基磺酸钠或十二烷基肌氨酸钠。

5.如权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述的去垢剂溶液中去垢剂的浓度按照重量体积比是0.01-10％。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的去垢剂溶液含有：

按照重量体积比0.01-10％的去垢剂，和

缓冲溶液。

7.如权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述的去垢剂溶液的PH值是2.5-10.0。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，采用疏水层析法从含嗜热α-淀粉酶的溶液中分离嗜热α-淀粉酶。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，采用Phenyl Sepharose 6 FastFlow疏水层析柱进行疏水层析；用乙二醇梯度洗脱。

10.一种去垢剂的用途，其特征在于，用于溶解嗜热α-淀粉酶的包涵体，获得酶活力不变或增强的嗜热α-淀粉酶。

Images