CN116790561B - 一种几丁质酶突变体ChiPcM及其应用 - Google Patents
一种几丁质酶突变体ChiPcM及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116790561B CN116790561B CN202310889388.4A CN202310889388A CN116790561B CN 116790561 B CN116790561 B CN 116790561B CN 202310889388 A CN202310889388 A CN 202310889388A CN 116790561 B CN116790561 B CN 116790561B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- chitinase
- mutant
- chipc
- chipcm
- recombinant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 title claims abstract description 113
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 title claims abstract description 106
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 26
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 8
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 4
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 64
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 63
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 63
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 32
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 24
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 abstract description 8
- 238000009510 drug design Methods 0.000 abstract description 5
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 abstract description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 42
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 38
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 34
- 239000000047 product Substances 0.000 description 28
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 26
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 25
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 21
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 20
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 20
- 230000008569 process Effects 0.000 description 20
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 20
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 14
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 14
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 14
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 13
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 11
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 11
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 11
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 10
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 9
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 8
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 7
- 241000754833 Pochonia chlamydosporia Species 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241001002196 Pochonia Species 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 6
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 5
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 4
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 4
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 4
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 102220613801 Angiotensin-converting enzyme 2_Q42L_mutation Human genes 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 3
- QLTSDROPCWIKKY-PMCTYKHCSA-N beta-D-glucosaminyl-(1->4)-beta-D-glucosamine Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](N)[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](N)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 QLTSDROPCWIKKY-PMCTYKHCSA-N 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 3
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LWFUFLREGJMOIZ-UHFFFAOYSA-N 3,5-dinitrosalicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC([N+]([O-])=O)=CC([N+]([O-])=O)=C1O LWFUFLREGJMOIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 2
- RQFQJYYMBWVMQG-IXDPLRRUSA-N chitotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](N)[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](N)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)N)[C@@H](CO)O1 RQFQJYYMBWVMQG-IXDPLRRUSA-N 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 2
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 238000010587 phase diagram Methods 0.000 description 2
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000036632 reaction speed Effects 0.000 description 2
- 102220005437 rs34751764 Human genes 0.000 description 2
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001556567 Acanthamoeba polyphaga mimivirus Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SFAYBQDGCKZKMH-UHFFFAOYSA-N BNCC Chemical compound BNCC SFAYBQDGCKZKMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000195585 Chlamydomonas Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- LLQPHQFNMLZJMP-UHFFFAOYSA-N Fentrazamide Chemical compound N1=NN(C=2C(=CC=CC=2)Cl)C(=O)N1C(=O)N(CC)C1CCCCC1 LLQPHQFNMLZJMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 description 1
- DUKURNFHYQXCJG-UHFFFAOYSA-N Lewis A pentasaccharide Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)C(NC(C)=O)C(OC2C(C(OC3C(OC(O)C(O)C3O)CO)OC(CO)C2O)O)OC1CO DUKURNFHYQXCJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 241000223260 Trichoderma harzianum Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000443 biocontrol Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000007433 bsm medium Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010799 enzyme reaction rate Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 239000000416 hydrocolloid Substances 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010813 internal standard method Methods 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 238000000643 oven drying Methods 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- VZOPRCCTKLAGPN-ZFJVMAEJSA-L potassium;sodium;(2r,3r)-2,3-dihydroxybutanedioate;tetrahydrate Chemical compound O.O.O.O.[Na+].[K+].[O-]C(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O VZOPRCCTKLAGPN-ZFJVMAEJSA-L 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229940074446 sodium potassium tartrate tetrahydrate Drugs 0.000 description 1
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- CIJQGPVMMRXSQW-UHFFFAOYSA-M sodium;2-aminoacetic acid;hydroxide Chemical compound O.[Na+].NCC([O-])=O CIJQGPVMMRXSQW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 238000002945 steepest descent method Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2442—Chitinase (3.2.1.14)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01014—Chitinase (3.2.1.14)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于分子生物学以及蛋白质工程领域，特别涉及一种几丁质酶突变体ChiPcM及其应用。本发明通过基因克隆获得几丁质酶ChiPc，进一步利用理性设计获得热稳定性提升的突变体ChiPcM，最终获得的突变体ChiPcM的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其热稳定性显著提高，在55℃、60℃和65℃热处理60分钟后的剩余酶活分别是出发模板ChiPc的2.1倍，5.1倍和9.8倍。本发明构建的几丁质酶突变体ChiPcM为其下一步产业化应用奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学以及蛋白质工程领域，特别涉及一种几丁质酶突变体ChiPcM及其应用。
背景技术
几丁质作为自然界仅次于纤维素的自然多糖，由于其内部致密结晶结构，导致其溶解性差，从而限制其产业化应用。研究表明几丁质是由乙酰氨基葡萄糖通过糖苷键连接而成。几丁质降解形成聚合度小于10的几丁质寡糖，能够有效改善溶解性。此外有研究表明几丁质寡糖具有多种生物活性，以及良好的生物降解性和生物相容性，因此几丁质寡糖在许多领域具有巨大的应用潜力。目前几丁质寡糖的制备主要以化学法为主，通过强酸将几丁质降解成几丁质寡糖，此种工艺具有副产物多，产物结构不完整、污染环境等缺点。因此需要开发一种更绿色环保的方法用于几丁质寡糖的制备。
几丁质酶通过水解几丁质内部糖苷键，将几丁质转换为不同聚合度几丁质寡糖。根据几丁质酶来源可将几丁质酶分为动物、植物以及微生物来源。其中微生物来源几丁质酶具有作用pH广、催化活性高等特性，因此其更适合产业化应用。微生物来源几丁质酶进一步可细分为细菌和真菌来源几丁质酶。前期许多报道表明真菌来源几丁质酶具有酶比活高，作用温度广等特点。本课题组前期实验发现，丝状真菌厚垣普奇尼亚菌发酵液能够有效水解胶体几丁质。但是天然菌厚垣普奇尼亚菌发酵过程不稳定，限制其产业化应用。
因此，开发一种酶活性高，稳定性强的几丁质酶，对于扩大其产业化应用范围是十分重要的。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种几丁质酶突变体ChiPcM及其应用。本专利技术提高了几丁质酶的热稳定性，为下一步应用奠定了基础。
本发明采用的技术方案具体如下：
一种几丁质酶突变体ChiPcM，所述氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选地，编码所述氨基酸的序列为多聚核苷酸序列，所述多聚核苷酸序列如SEQID NO.4所示。
本发明还提供了一种重组表达载体pPICZαA-chipcm，包含所述几丁质酶突变体ChiPcM的多聚核苷酸序列。
本发明还提供了一种重组菌株，包括所述的重组表达载体pPICZαA-chipcm。
优选地，所述重组菌株以毕赤酵母工程菌作为宿主。
进一步优选地，所述毕赤酵母工程菌包括毕赤酵母X33。
本发明还提供了一种所述的几丁质酶突变体ChiPcM在制备几丁质寡糖中的应用。
本发明主要通过如下技术方案实现的：（1）基于同源RT-PCR获得几丁质酶ChiPc及其编码基因chipc；（2）通过基因工程方法构建异源表达几丁质酶ChiPc重组毕赤酵母工程菌；（3）纯化重组几丁质酶ChiPc并进行特性表征；（4）通过同源建模获得几丁质酶ChiPc三维构象，基于分子动力学模拟解析几丁质酶ChiPc蛋白柔性区域；（5）结合二硫键理性设计和优化蛋白结构自由能获得热稳定性提升几丁质酶突变体ChiPcM；（6）特性表征和分析突变体ChiPcM酶学特性；（7）高效制备重组几丁质酶突变体ChiPcM。
与现有技术相比，本发明具有如下优势：本发明通过基因克隆获得厚垣普奇尼亚菌几丁质酶ChiPc编码基因chipc，通过理性设计二硫键和优化蛋白结构自由能获得热稳定性显著提升突变体ChiPcM，可以将突变体ChiPcM应用于酶法制备几丁质寡糖，有效扩大了几丁质的应用范围，并为下一步产业化应用奠定基础。
附图说明
图1几丁质酶ChiPc的pH特性图；
图2几丁质酶ChiPc温度特性图；
图3几丁质酶ChiPc及几丁质酶突变体ChiPcM三维构象图；
图4高效制备几丁质酶突变体ChiPcM发酵曲线及蛋白电泳图；
图5几丁质酶突变体ChiPcM温度特性图；
图6 水解产物高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。本发明中涉及到的实验材料和试剂：
1.菌株与载体：丝状真菌厚垣普奇尼亚菌（菌种编号BNCC354981）购自北京北纳创联生物技术研究院，保存于实验室-60℃冰箱；毕赤酵母X33和表达载体pPICZαA均购自武汉淼灵生物科技有限公司。大肠杆菌感受态细胞Top10购自深圳辉诺生物技术有限公司。
2.酶与试剂盒：高保真Taq酶PrimeSTAR®HS (Premix)、Taq酶EmeraldAmp GTPCRMaster Mix、反转录试剂盒RNA to cDNA EcoDry Premix以及限制性内切酶（SacI、EcoRI和NotI）均购自宝日医生物技术(北京)有限公司；真菌总RNA提取试剂盒(DP419)、质粒提取试剂盒（#DP103-03）、DNA 产物纯化试剂盒（#DP204）以及胶纯化试剂盒（#DP209-02）均购自天根生化科技(北京)有限公司；Zeocin购自美国Invitrogen公司；几丁质酶购自上海源叶生物科技有限公司；其它化学试剂均购自上海麦克林生化科技有限公司。
3.培养基：
厚垣普奇尼亚菌培养基为：液体PDA培养基，由马铃薯200克葡萄糖20克，蒸馏水1000毫升组成。
厚垣普奇尼亚菌产几丁质酶诱导培养基：由1.5% （w/v）蛋白胨，1.0%（w/v）胶体几丁质，0.1%（w/v）MgSO4•7H2O，0.05%（w/v），FeSO4•7H2O 和 0.3%（w/v） K2HPO4。
大肠杆菌培养基为LB，包括（1%（w/v）蛋白胨，0.5%（w/v）酵母提取物（上海源叶生物科技有限公司，MLP0021B），1%（w/v）NaCl， pH7.0），LBZ为LB培养基加25μg/mL Zeocin（博莱霉素）。
酵母培养基为YPD，包括（1%（w/v）酵母提取物，2%（w/v）蛋白胨，2%（w/v）葡萄糖）。
酵母筛选培养基为YPDZ（YPD培养基添加不同浓度的zeocin）。
酵母摇瓶培养基为BMGY培养基，包括 1％（w/v）酵母提取物、2％（w/v）蛋白胨、1.34％（w/v）YNB、0.00004％（w/v）Biotin、1％甘油(V/V)。
酵母摇瓶诱导培养基为BMMY培养基，除以0.5%（v/v）甲醇代替甘油，其余成份相与BMGY相同。
注：YNB为酵母氮源基础(Yeast Nitrogen Base)；Biotin为生物素（上海源叶生物科技有限公司，S13004，CAS号58-85-5）。
毕赤酵母高密度发酵培养BSM培养基：0.047％（w/v）CaSO4•2H2O, 0.091％（w/v）K2SO4,0.075％（w/v）MgSO4•7H2O, 0.062％（w/v） KOH, 1.3% (V/V) H3PO4， 2%(V/V) 甘油。
4.几丁质酶活性测定所用试剂及测定方法
胶体几丁质：称10g几丁质加入100mL浓盐酸中，在40℃搅拌3分钟，使之溶解。然后向溶液中加入1升5℃的冷水，几丁质就作为胶体悬浮液沉淀下来。用粗滤纸过滤，过滤后的胶体沉淀用蒸馏水洗涤至中性；
DNS试剂的配制：（6.3‰（w/v）3,5-二硝基水杨酸；18.2%（w/v）四水酒石酸钾钠；5‰（w/v）苯酚；5‰（w/v）无水亚硫酸钠），添加蒸馏水至1000mL。
几丁质酶活性的测定方法如下：首先将胶体几丁质和稀释好的酶液（根据酶活稀释）在45℃分别进行预热；将预热好的500μL酶液加入10mL玻璃试管，然后再加入500μL胶体几丁质溶液，50℃下反应30分钟后，加入2mLDNS试剂终止反应，于100℃沸水浴10分钟进行显色，冷却后于500rpm转速下离心10分钟，取上清液，在540nm下测定吸光值。
酶活单位的定义为：每分钟生成1μmoL乙酰氨基葡萄糖所用酶的量定义为一个活力单位。
实施例1 几丁质酶ChiPc基因克隆及分析
厚垣普奇尼亚菌作为一种农业生防菌，在农业种植过程中可以预防许多真菌病害的发生，从而提升农作物的品质和产量。研究表明，厚垣普奇尼亚菌的生防机理主要是其分泌的多种酶可以抑制、水解多种病害真菌，这些酶包括蛋白酶、几丁质酶和纤维水解酶等。迄今，关于厚垣普奇尼亚菌的蛋白酶、几丁质酶和纤维水解酶的研究较少，而关于其几丁质酶的详细研究还未有报道。因此对厚垣普奇尼亚菌几丁质酶展开研究具有重要意义，有望获得高效几丁质水解酶，为后期几丁质寡糖制备奠定基础。
本发明首先通过同源RT-PCR技术获得厚垣普奇尼亚菌几丁质酶基因。实验过程如下：（1）提取总RNA，进行反转录获得总cDNA；（2）PCR扩增获得厚垣普奇尼亚菌几丁质酶基因chipc对应的PCR产物；（3）酶切几丁质酶基因chipc对应的PCR产物和载体pPICZαA并进行连接反应；（4）将连接产物进行转化实验，通过筛选以及测序最终获得几丁质酶基因chipc。
提取总RNA，进行反转录获得总cDNA的实验过程如下：（1）将厚垣普奇尼亚菌接入产几丁质酶诱导培养基，200rpm，30℃培养5天后，500rpm转速下离心20分钟，收集菌丝体；（2）用无菌水将收集的菌丝体洗涤2遍后，放入液氮中，进行研磨，提取研磨充分菌丝体的总RNA，总RNA提取过程参照真菌总RNA提取试剂盒（货号DP419，天根生化科技有限公司）进行；（3）以提取的厚垣普奇尼亚菌为模板进行反转录实验，实验过程参照试剂盒反转录试剂盒RNA to cDNA EcoDry Premix（宝日医生物技术有限公司）进行。
PCR扩增获得几丁质酶基因chipc对应PCR产物的实验过程如下：（1）分析美国国家生物信息技术NCBI数据库公布的厚垣普奇尼亚菌基因组序列，获得其几丁质酶基因序列（基因登录号：XM_018280987.1），根据获得的序列设计一对引物chipc-fw（5'-CGAGAATTCATTCCCATCTTAGCACGCGAA-3'）和chipc-rev（5' -ATAGCGGCCGCAGTCATCTTTTTCTTAATAT-3'）用于RT-PCR扩增；（2）以获得的总cDNA为模板，通过引物chipc-fw和chipc-rev，进行PCR扩增，PCR反应体系如表1所示，反应条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性10秒，56℃退火20秒，72℃延伸90秒，33个循环；（3）通过琼脂糖电泳检测PCR扩增效果。
表1 基因扩增反应体系
PCR产物和载体pPICZαA酶切连接反应实验过程如下：（1）将扩增获得的PCR产物进行纯化回收，纯化过程参照胶纯化试剂盒（#DP209-02）进行；（2）用限制性内切酶EcoRI和NotI酶切回收后的PCR产物，反应体系如表2所示，在37℃酶切反应6小时后，参照DNA 产物纯化试剂盒（#DP204）进行纯化；（3）采取相同的方法用限制性内切酶EcoRI和NotI酶切载体pPICZαA并进行纯化回收；（4）将纯化后的PCR产物和载体pPICZαA进行连接反应，连接反应体系如表3所示，在4℃，反应16小时。
表2 酶切反应体系
表3 连接反应体系
转化筛选实验过程如下：（1）将大肠杆菌感受态细胞Top10（深圳辉诺生物技术有限公司）冰上放置20min后，将连接产物全部转入至大肠杆菌感受态细胞Top10；（2）将含有连接产物的大肠杆菌感受态细胞Top10在42℃热激90s后，冰上静置5min；（3）将热激完的大肠杆菌感受态细胞Top10接入500μL LB液体培养基中，37℃，200rpm，培养1h，将培养好的菌液均匀涂布于LBZ平板，静置于37℃培养箱进行培养18h；（4）将37℃培养获得的大肠杆菌转化子分别以单菌落的形式接入LBZ液体培养基，37℃，200rpm，培养1h后进行菌液PCR；（5）以培养好的菌液为模板，通过引物5’AOX-fw（GACTGGTTCCAATTGACA AGC）和3’AOX-rev（GGCACCTGGCATTCTGA CATCC）进行PCR扩增实验，PCR反应体系如表4所示，反应条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性10秒，50℃退火30秒，72℃延伸70秒，33个循环；（6）通过琼脂糖电泳分析PCR扩增产物，扩增产物大小在1700bp，则表明是目标重组转化子，将菌液PCR验证正确的重组转化子送至广州艾基生物技术有限公司进行测序，根据测序结果最终获得几丁质酶基因chipc及其对应的表达载体pPICZαA-chipc。
表4 菌液PCR反应体系
通过分析，获得chipc基因序列，长度为1209bp，编码402个氨基酸，chipc基因和编码的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。通过软件ProtParam预测，chipc基因编码的几丁质酶ChiPc的分子式为C1982H2984N514O605S12，蛋白分子量为44 kDa，其中带负电荷氨基酸（天冬氨酸和谷氨酸）总数为43，带正电荷氨基酸（精氨酸和赖氨酸）总数为38。理论等电点为5.81，理论不稳定系数是31.40，表明几丁质酶ChiPc是一种稳定蛋白。
实施例2 几丁质酶ChiPc重组毕赤酵母的构建及筛选
以毕赤酵母为宿主，重组表达几丁质酶ChiPc。将表达载体pPICZαA-chipc用限制性内切酶SacI线性化，线性化过程如下：（1）将2 μL限制性内切酶SacI（宝日医生物技术（北京）有限公司，货号1078A）加入50μL表达载体pPICZαA-chipc，此外加入限制性内切酶试剂盒自带酶切反应缓冲液6μL和2μL水；（2）37℃，反应5小时；（3）参照实施例1中提供的PCR产物纯化回收方法，回收线性化后产物。
通过电转化方法，转入毕赤酵母X33，转化过程参照赛默飞世尔科技公司提供的毕赤酵母指导手册进行，具体如下：（1）将毕赤酵母感受态细胞，置于冰上放置30min；（2）将线性化后的表达载体pPICZαA-chipc转入毕赤酵母感受态细胞，并在冰上放置10min；（3）将含有线性化表达载体pPICZαA-chipc的酵母感受态细胞，转入电转杯，通过电穿孔仪进行电击转化；（4）将转化后的产物转入2mL离心管中，并加入0.5mL 1M山梨醇溶液，30℃，静置2h后，均匀涂布于YPDZ（zeocin浓度为200μg/mL）平板；（5）将涂布好的平板在30℃，静置培养3至5天。
对静置培养长出的转化子进行筛选实验，实验过程大致如下：（1）将单个转化子分别挑入含有10mL YPD培养基的100mL摇瓶中，30℃，200rpm培养24h，开始进行诱导培养。诱导培养过程中每过24小时按0.75%（体积比，v/v）的比例加入甲醇进行诱导培养，培养72小时后进行几丁质酶活性测定。通过筛选30个转化子，获得一个酶活优势菌命名Pc23。
通过500mL摇瓶进一步扩大培养重组工程菌Pc23，实验过程大致如下：（1）将单个转化子分别挑入含有50mL BMGY培养基的250mL摇瓶，30℃，200rpm培养至OD600为6.0；（2）将培养好的菌液于500rpm转速下离心15分钟，去掉上清，转入含有100mL BMMY培养基的500mL摇瓶中，菌液起始OD600值为1.0，30℃，200rpm培养，培养过程中每隔24小时按0.5%（体积比，v/v）的比例加入甲醇进行诱导培养，同时取样进行几丁质酶活性测定。
重组工程菌Pc23在摇瓶培养条件下，诱导培养120小时后，发酵酶活达到5.5 U/mL。
实施例3 重组几丁质酶ChiPc纯化及特性测定
重组几丁质酶ChiPc纯化过程大致如下：（1）首先将实施例2中500mL摇瓶培养发酵液于500rpm转速下离心20min，收集上清液；（2）用10kDa超滤管将收集的上清发酵液进行浓缩；（3）将浓缩好的重组几丁质酶ChiPc参照Ni-IDA蛋白纯化试剂盒（上海生工）进行纯化；（4）测定纯化后重组几丁质酶ChiPc比酶活。通过纯化以及活性测定，发现重组几丁质酶ChiPc的比酶活为36.8U/mg。
纯化后重组几丁质酶ChiPc酶反应动力学参数测定过程大致如下：（1）首先配置不同浓度胶体几丁质（1mg/mL-10mg/mL）；（2）分别测定纯化后重组几丁质酶ChiPc在不同底物浓度下的酶反应速度；（3）通过软件Graph分析不同酶反应速度从而获得米氏常数Km和最大反应速度Vmax。通过实验测定发现重组几丁质酶ChiPc的米氏常数Km和最大反应速度Vmax分别为0.27mg/mL和43.6 µM/min/mg。
纯化后重组几丁质酶ChiPc的特性测定包括pH特性和温度特性。
pH特性测定包括最适反应pH和pH稳定性。重组几丁质酶ChiPc最适反应pH测定如下：
在45℃条件下测定重组几丁质酶ChiPc在pH4.0-8.0（pH4.0至6.0为0.05M乙酸乙酸钠缓冲液，pH7.0至8.0为0.05M Tris盐酸缓冲液）下的酶活，以测定酶活最高pH下的酶活为100%，计算其他pH下的相对酶活，实验结果如图1A所示。
由图1A可知，重组几丁质酶ChiPc最适反应pH为5.0，并且在pH4至8范围内，相对酶活均大于50.1%。
重组几丁质酶ChiPc的pH稳定性测定如下：用不同pH缓冲液将重组几丁质酶ChiPc稀释80倍（pH3.0至6.0为0.05M乙酸乙酸钠缓冲液，pH7.0至8.0为0.05M Tris盐酸缓冲液，pH9.0至10.0为甘氨酸氢氧化钠缓冲液），在25℃放置6小时后测定剩余酶活，以没有处理的样品酶活设置为100%，计算不同处理pH下的剩余酶活，实验结果如图1B所示。
由图1B可知，重组几丁质酶ChiPc在pH4.0至9.0范围内具有良好的稳定性，在25℃放置6小时后，剩余酶活均大于83%；当处理pH降至3.0时，重组几丁质酶ChiPc稳定性较差，剩余酶活仅为49.2%。
纯化后重组几丁质酶ChiPc的温度特性测定包括最适反应温度和热稳定性。重组几丁质酶ChiPc最适反应温度测定如下：
在pH5.0条件下测定纯化后重组几丁质酶ChiPc在30℃-60℃不同温度下的酶活，以测定酶活最高温度下的酶活为100%，计算其他温度下的相对酶活。实验结果如图2A所示。
由图2A可知，重组几丁质酶ChiPc最适反应温度为45℃，在30℃至50℃范围内，相对酶活均大于80%。
重组几丁质酶ChiPc热稳定性测定如下：用0.05M乙酸乙酸钠缓冲液（pH5.5）将重组几丁质酶ChiPc稀释10倍后，在不同温度（40℃至60℃）热处理60分钟后测定剩余酶活，以没有热处理的样品酶活设置为100%，计算不同处理温度下的剩余酶活，实验结果如图2B所示。
由图2B可知，重组几丁质酶ChiPc在40℃至50℃范围内具有良好的热稳定性，剩余酶活均大于80%。当热处理温度大于50℃，剩余酶活急剧下降，重组几丁质酶ChiPc在55℃和60℃，热处理1小时后，剩余酶活分别仅为36.6%和8.1%。
实施例4 几丁质酶ChiPc同源建模及生物信息学分析
实施例3中重组几丁质酶ChiPc热稳定性结果表明当处理温度大于50℃，其容易变性失活，从而影响其后期产业化应用，因此需要提升重组几丁质酶ChiPc热稳定性，为其规模化应用奠定基础。前期许多研究表明理性设计二硫键和优化蛋白三维构象自由能能够有效提升目标蛋白热稳定性。
本发明拟通过在重组几丁质酶ChiPc蛋白柔性区域定向设计二硫键提升其结构刚性和优化蛋白三维构象自由能，提升其热稳定性。二硫键理性设计及三维构象自由能优化必须基于酶蛋白三维结构进行，因此需要模拟构建重组几丁质酶ChiPc三维构象。
以哈茨木霉几丁质酶Chi42三维结构（PDB登录号：6epb.1）为模板，通过在线软件SWISS-MODEL server（https://swissmodel.expasy.org/interactive）分析建模，获得几丁质酶ChiPc三维构象（图3A）。通过在线软件SAVES v6.0（https://saves.mbi.ucla.edu/）对获得的三维构象进行评估。拉式图结果表明，94.6%的氨基酸位于最优区域，6.4%的氨基酸位于其他允许区域，表明几丁质酶ChiPc三维构象合理，可以用于下一步生物信息学分析。
通过分子动力学模拟软件Gromacs 2019.06（https://www.gromacs.org/）对几丁质酶ChiPc进行分析，模拟过程中，蛋白质使用amber_ff14SB力场，小分子配体使用GAFF力场，GAFF力场中使用RESP电势，其中RESP电势的拟合是使用Multiwfn 3.6软件配合Gaussian 16.0软件完成的。将蛋白质/配体模型置于立方体盒子中，蛋白质距离盒子的最小距离为1.2nm。以TIP3P水填充盒子。使用最速下降法对体系能量最小化，进行50ns的分子动力学模拟，模拟步长为2fs，每10ps贮存1次数据。
通过分析模拟结果，发现几丁质酶ChiPc三维构象存在多个柔性区域，这些区域在高温条件下，结构容易发生变化，从而导致几丁质酶ChiPc变性失活。这些柔性区域如：第14位丙氨酸至第24位苏氨酸区域；第25位天冬酰胺至第45位组氨酸区域；第71位组氨酸至第90位谷氨酰胺区域；第121位丝氨酸至第144位甘氨酸区域；第158位组氨酸至第181位脯氨酸区域；第222位甘氨酸至第235位络氨酸区域，第241脯氨酸至248位苏氨酸区域和第378位甘氨酸至第401位甲硫氨酸等区域。提升几丁质酶ChiPc这些柔性区域的刚性，能够有效提升其热稳定性。
实施例5 二硫键突变体构建及筛选
在蛋白柔性区域理性设计二硫键能够有效提升重组蛋白的热稳定性，根据实施例4模拟分析结果，定向的在几丁质酶ChiPc三维构象的柔性区域设计二硫键提升其刚性，从而提升其热稳定性。分别通过在线二硫键设计软件BRIDGED-Disulfide bond prediction（http://biodev.cea.fr/bridged/results.aspx?jobid=769）和Disulfideby Design（http://cptweb.cpt.wayne.edu/DbD2/index.php）进行二硫键设计分析，最终结合这两个软件设计结果，选择8对二硫键进行实验。这8对二硫键分别为G16C-D381C、A36C-Q90C、S121C-N160C、A130C-A167C、A204C-G259C、Y235C-N247C、Q278C-F286C和P336C-L369C。
根据chipc基因序列分别设计二硫键扩增引物。不同二硫键突变体所对应的表达载体构建过程如下（以突变体G16C-D381C所对应的表达载体以pPICZαA-chipc1为例，其他以此类推）：（1）以pPICZαA-chipc为模板，先用上下游引物G16C-fw和G16C-rev进行PCR扩增，PCR扩增体系如表1所示，PCR扩增程序如下：95℃ 5分钟；95℃ 10秒，52℃ 30秒，72℃60秒，33个循环；琼脂糖电泳检测PCR扩增结果；（2）在扩增成功的PCR产物中加入2μL限制性内切酶DpnI，在37℃酶切反应2小时，去除模板载体pPICZαA-chipc，从而降低转化子的假阳性率；（3）将酶切完的PCR产物纯化回收，纯化回收过程参照实施例1进行，将纯化后的酶切产物转入大肠杆菌Top10中，转化过程参照实施例1提供的大肠杆菌转化方法进行；（4）大肠杆菌转化子的筛选采用菌液PCR 法，首先将重组转化子分别以单菌落的形式挑入LB液体培养基，200rpm，37℃培养4小时后，取2μL菌液作为模板，用引物5’AOX-fw和3’AOX-rev进行PCR扩增，PCR扩增反应体系如表4所示，PCR扩增条件为95℃ 5分钟，94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 60秒，30个循环，将验证正确的产物进行测序，根据测序结果确定突变位点G16C，从而获得突变表达载体pPICZαA-chipc-G16C；（4）以表达载体pPICZαA-chipc-G16C为模板，按照构建突变体G16C所对应表达载体相同的方法，只是将扩增引物换成D381C-fw和D381C-rev，从而获得二硫键突变体表达载体pPICZαA-chipc-G16C-D381C（简称为pPICZαA-chipc1）。
通过实验分别获得8对二硫键所对应的表达载体，分别为：pPICZαA-chipc1（对应突变体G16C-D381C）、pPICZαA-chipc2（对应突变体A36C-Q90C，引物分别为A36C-fw、36C-rev；Q90C-fw、Q90C-rev）、pPICZαA-chipc3（对应突变体S121C-N160C，引物分别为S121C-fw、S121C-rev；N160C-fw、N160C-rev）、pPICZαA-chipc4（对应突变体A130C-A167C，引物分别为A130C-fw、A130C-rev；A167C-fw、A167C-rev）、pPICZαA-chipc5（对应突变体A204C-G259C，引物分别为A204C-fw、A204C-rev；G259C-fw、G259C-rev）、pPICZαA-chipc6（对应突变体Y235C-N247C，引物分别为Y235C-fw、Y235C-rev；N247C-fw、N247C-rev）、pPICZαA-chipc7（对应突变体Q278C-F286C，引物分别为Q278C-F286C-fw、Q278C-F286C-rev）和pPICZαA-chipc8（对应突变体P336C-L369C，引物分别为P336C-fw、P336C-rev；L369C-fw、L369C-rev）。
将构建好的8个二硫键突变体表达载体分别用SacI线性化，参照实施例2的方法，转入毕赤酵母X33。不同二硫键突变体重组酵母工程菌筛选参照实施例2进行。通过筛选测定，8对二硫键突变体所对应重组工程菌最高酶活如表5所示。由表5可知，二硫键突变体S121C-N160C对应重组工程菌发酵酶活最高为6.1 U/mL，其次为A130C-A167C和A36C-Q90C所对应重组工程菌，分别为5.8 U/mL和5.7U/mL。
根据酶活结果，进一步测定酶热稳定性，热稳定性测试方法如下：将8对二硫键突变体发酵酶液用0.05M乙酸乙酸钠缓冲液（pH5.5）稀释10倍后，在55℃水浴保温60分钟后进行剩余酶活测定，以没有热处理的样品作为对照。
8对二硫键突变体初步筛选结果如表5所示，由表5可知，理性设计的8对二硫键中，只有突变体G16C-D381C能够有效提升几丁质酶ChiPc热稳定性，55℃水浴保温60分钟后，剩余酶活为61.2%，是出发模板ChiPc的1.67倍。
表5 不同突变体重组菌发酵酶活
二硫键突变体G16C-D381C纯化参照实施例3进行，通过实验，获得纯化后的二硫键突变体G16C-D381C。
纯化后二硫键突变体G16C-D381C特性表征包括pH特性和温度特性测定。
pH特性测定包括最适反应pH和pH稳定性，测定过程参照实施例4进行。二硫键突变体G16C-D381C的pH特性和出发模板几丁质酶ChiPc几乎一致。二硫键突变体G16C-D381C最适反应pH为5.0，在pH4至8范围内具有良好的活性，剩余酶活均大于50%。二硫键突变体G16C-D381C在pH4.0至10.0范围内具有良好的稳定性，在25℃放置6小时后，剩余酶活均大于85%。
二硫键突变体G16C-D381C温度特性测定包括最适反应温度和热稳定性，测定过程参照实施例4进行。
二硫键突变体G16C-D381C最适反应温度为50℃，在40℃至55℃范围内，相对酶活均大于80%。相比于出发模板几丁质酶ChiPc，二硫键突变体G16C-D381C最适反应温度提升5℃，并且在高温条件下具有更好的酶活性。
相比于出发模板几丁质酶ChiPc，二硫键突变体G16C-D381C具有更好的热稳定性，其在55℃、60℃和65℃，热处理60分钟后，剩余酶活分别为62.5%，33.6%和16.3%。而出发模板几丁质酶ChiPc在相同处理条件下，剩余酶活分别为36.6%、8.1%和2.3%。
实施例6 自由能优化提升热稳定性
以二硫键突变体G16C-D381C为模板，通过三维构象自由能优化进一步提升热稳定性。根据构象自由能优化软件DeepDDG（http://protein.org.cn/ddg.html）预测结果，最终挑选10个预测有效突变体进行验证实验，这10个预测有效突变体及其对应的自由能分别为D37P（-0.91 kcal/mol）、Q42L（-1.16kcal/mol）、D56P（-0.48 kcal/mol）、K95F（-1.03kcal/mol）、K131W（-0.62kcal/mol）、S170I（-1.15 kcal/mol）、N214P（-0.63kcal/mol）、A217I（-0.41kcal/mol）、G365F（-1.26 kcal/mol）、和G378M（-1.26kcal/mol）。
单点突变体表达载体构建过程同实施例5中二硫键突变体构建过程一致，只是将扩增模板换成pPICZαA-chipc1，扩增引物换成每个单点突变体所对应的引物。通过实验最终获得10个单点突变体所对应的表达载体，pPICZαA-chipc1-d37p（引物为D37P-fw、D37P-rev）、pPICZαA-chipc1-q42l（引物为Q42L-fw、Q42L-rev）、pPICZαA-chipc1-d56p（引物为D56P-fw、D56P -rev）、pPICZαA-chipc1-k95f（引物为K95F -fw、K95F -rev）、pPICZαA-chipc1-k131w（引物为K131W -fw、K131W -rev）、pPICZαA-chipc1-s170i（引物为S170I -fw、S170I-rev）、pPICZαA-chipc1-n214p（引物为N214P -fw、N214P-rev）、pPICZαA-chipc1-a217i（引物为A217I-fw、A217I-rev）、pPICZαA -chipc1-g365f（引物为G365F-fw、G365F-rev）和pPICZαA-chipc1-g378m（引物为G378M-fw、G378M-rev）。
分别用限制性内切酶SacI将10个单点突变体所对应的表达载体线性化后，转入毕赤酵母X33，转化子均匀涂布于YPDZ固体平板，30℃，静置培养3至5天后进行筛选实验。重组转化子的筛选实验同实施例2一致。
通过筛选测定，10个单点突变体所对应重组菌的酶活及热稳定性如表6所示。在10个预测有效突变体中，只有Q42L和G378M可进一步提升热稳定性。相比于出发模板G16C-D381C，突变体G16C-D381C-Q42L和G16C-D381C- G378M在55℃水浴保温60分钟后的热稳定性分别提升13.6%和12.1%。
表6 不同单点突变体重组菌发酵酶活及热稳定性
以突变体G16C-D381C-Q42L为模板，将有效突变体进行进一步突变，实验过程同前面突变体构建一致，通过实验最终获得组合突变体G16C-D381C-Q42L- G378M所对应的表达载体pPICZαA-chipc1-q42l-g378m。参照实施例2所提供的方法将表达载体pPICZαA-chipc1-q42l-g378m线性化转化至毕赤酵母。参照实施例2筛选方法筛选组合突变体G16C-D381C-Q42L-G378M所对应的重组转化子。通过热稳定性分析，组合突变体G16C-D381C-Q42L-G378M在55℃水浴保温60分钟后，剩余酶活为76.1%，表明组合突变能够进一步提升热稳定性。将组合突变体G16C-D381C-Q42L-G378M进行三维建模分析，其结构如图3B所示。由图3B可知，二硫键G16C-D381C将蛋白的N端和C端连接起来从而提升蛋白的刚性，此外点突变体Q42L和G378M能够有效降低蛋白表面无规则蜷曲区域自由能，从而具有更好的稳定性。
为了便于书写，将最优突变体G16C-D381C-Q42L-G378M命名为ChiPcM。将最优突变体G16C-D381C-Q42L-G378M所对应的表达载体pPICZαA-chipc1-q42l-g378m命名为pPICZαA-chipcm。
实施例7 突变体ChiPcM高效制备
重组突变体ChiPcM高效制备包括高酶活重组工程菌筛选和高密度发酵两部分。
高酶活重组工程菌筛选实验过程如下：（1）将表达载体pPICZαA-chipcm线性化后转入毕赤酵母，转化方法（即电转化法）参照实施例2进行，将电转后的转化子涂布于高浓度YPDZ平板（大于400 mg/L zeocin）；（2）采用24孔板法挑选96个重组转化子进行初步筛选，筛选方法参照实施例2描述的筛选方法进行；（3）将初步筛选获得的高酶活转化子进行摇瓶培养复筛，培养时间为120小时。
通过筛选，从96个重组转化子获得一个酶活优势菌，命名为Pc1-26。重组工程菌Pc1-26在摇瓶培养条件下，最高发酵酶活为7.5 U/mL。
将摇瓶筛选获得的重组工程菌Pc1-26进行高密度发酵。重组工程菌的高密度发酵在7L发酵罐进行，具体过程大致如下：将单菌落重组酵母工程菌接入含有50mL YPD培养基的250mL三角瓶中，30℃，200rpm振荡培养16小时。再将过夜培养的重组酵母工程菌按1 %（v/v）的接种量接入含有100mL YPD培养基的500mL三角瓶中，30℃，200rpm振荡过夜培养，至OD 600大于10。将二次过夜培养的重组酵母工程菌按10 %（v/v）的接种量接入含有3LBSM培养基的7L发酵罐中。重组酵母工程菌在7L发酵罐的培养条件为：温度为30℃、pH值5.0、搅拌速度为500rpm、空气流量为40L/min。培养初期，以甘油作为碳源供菌体生长。当菌体湿重达到一定的量（180g/L左右），停止流加甘油，待甘油被菌体吸收完后（溶氧迅速上升）开始用甲醇诱导。发酵过程中每隔24小时测定酶活和总蛋白。
重组工程菌Pc1-26发酵过程曲线如图4A所示，当诱导培养至168h，发酵酶活达到最大（162.5U/mL），总蛋白浓度最大为5.23g/L。由图4B可知，不同诱导时间发酵上清液中，主要均为重组二硫键突变体ChiPcM，其大小约为44kDa。
实施例8、突变体ChiPcM纯化及特性表征
突变体ChiPcM纯化参照实施例3进行，通过实验，获得纯化后突变体ChiPcM。
纯化后突变体ChiPcM特性测定包括pH特性测定和温度特性测定。其中pH特性测定包括最适反应pH和pH稳定性，测定过程参照实施例4进行，整个实验过程以出发模板ChiPc为对照。
突变体ChiPcM的pH特性和出发模板几丁质酶ChiPc几乎一致，最适反应pH均为5.0。此外，突变体ChiPcM在pH4.0至9.0范围内具有良好的稳定性，在25℃放置6小时后，剩余酶活均大于82%。
突变体ChiPcM温度特性测定包括最适反应温度和热稳定性，测定过程参照实施例4进行，整个实验过程以出发模板ChiPc为对照。
突变体ChiPcM最适反应温度如图5A所示，由图5A可知，突变体ChiPcM最适反应温度为55℃，相比于出发模板几丁质酶ChiPc，突变体ChiPcM最适反应温度提升10℃。此外，突变体ChiPcM在高温条件下的相对酶活，显著高于出发模板几丁质酶ChiPc。
突变体ChiPcM在不同温度的热稳定性如5B所示。相比于出发模板几丁质酶ChiPc，突变体ChiPcM热稳定性得到有效提升，其在55℃、60℃和65℃，热处理60分钟后，剩余酶活分别为76.2%，41.3%和22.6%。而出发模板几丁质酶ChiPc在相同处理条件下，剩余酶活分别为36.6%、8.1%和2.3%。
实施例9 突变体ChiPcM制备几丁质寡糖
以1%（质量比，w/v）胶体几丁质溶液为底物，进行水解实验，实验过程大致如下：（1）取1%胶体几丁质溶液50mL加入250mL摇瓶， ChiPcM添加量为1U/mL；（2）200rpm，50℃水解反应2小时后终止反应，测定水解率以及分析水解产物组成。
水解率的测定大致如下：（1）首先分别称量不同2mL规格离心管的重量；（2）其次取不同反应时间的水解样品2mL；（3）离心去上清后，将含有沉淀的离心管放入100℃，烘干至恒重；（4）烘干后的重量减去离心管的重量便是没有水解的胶体几丁质；（5）水解率的计算如下：水解率=（理论胶体几丁质重量-没有水解胶体几丁质重量）/理论胶体几丁质重量。
通过测定，反应2小时后，水解率达到82.6%。
通过高效液相色谱（HPLC）测定水解产物中，不同聚合度几丁质寡糖组成。实验过程如下：（1）取10μL不同聚合度几丁质寡糖标准品（产品编号SCNKA，青岛博智汇力生物科技有限公司）进行HPLC，获得标准器液相图，HPLC条件为：所用设备为高效液相色谱仪UltiMate3000（美国赛默飞世尔科技公司），液相所用柱子为Zorbax 糖柱（4.6×250mm, 5µm，购自安捷伦科技(中国)有限公司），流动相为乙氰和水（70:30，v/v），流速为0.8mL/分钟；（2）取10μL水解产物，采取标准品相同的条件进行HPLC分析，获得水解产物液相图；（3）采取内标法，计算获得不同聚合度几丁质寡糖的浓度。
由图6可知，图6中，横坐标为保留时间，根据保留时间确定每种聚合度的寡糖，由此可知，水解产物包括乙酰氨基葡萄糖（单糖）、几丁质二糖、几丁质三糖和几丁质四糖，其中几丁质二糖含量最高。水解产物中乙酰氨基葡萄糖（单糖）、几丁质二糖、几丁质三糖和几丁质四糖的含量分别为0.76mg/mL、6.96 mg/mL、0.39mg/mL和0.16mg/mL。
最后，需要说明的是，上述实施例仅例示性说明本发明的原理、性能及功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (7)
1. 一种几丁质酶突变体ChiPcM，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。
2. 如权利要求1所述的几丁质酶突变体ChiPcM，其特征在于，编码所述突变体的序列为多聚核苷酸序列，所述多聚核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.一种重组表达载体pPICZαA-chipcm，其特征在于，包含权利要求2所述的多聚核苷酸序列。
4.一种重组菌株，其特征在于，包括权利要求3所述的重组表达载体pPICZαA-chipcm。
5.如权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，以毕赤酵母工程菌作为宿主。
6.如权利要求5所述的重组菌株，其特征在于，所述毕赤酵母工程菌包括毕赤酵母X33。
7.一种如权利要求1所述的几丁质酶突变体ChiPcM在制备几丁质寡糖中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310889388.4A CN116790561B (zh) | 2023-07-20 | 2023-07-20 | 一种几丁质酶突变体ChiPcM及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310889388.4A CN116790561B (zh) | 2023-07-20 | 2023-07-20 | 一种几丁质酶突变体ChiPcM及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116790561A CN116790561A (zh) | 2023-09-22 |
| CN116790561B true CN116790561B (zh) | 2023-11-14 |
Family
ID=88043767
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310889388.4A Active CN116790561B (zh) | 2023-07-20 | 2023-07-20 | 一种几丁质酶突变体ChiPcM及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116790561B (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111996205A (zh) * | 2020-08-10 | 2020-11-27 | 深圳润康生态环境股份有限公司 | 几丁质酶基因、几丁质酶及其制备方法和应用 |
| CN113249360A (zh) * | 2021-07-06 | 2021-08-13 | 深圳润康生态环境股份有限公司 | 一种几丁质酶突变体ChiM及应用 |
| CN114736891A (zh) * | 2022-06-15 | 2022-07-12 | 深圳润康生态环境股份有限公司 | 一种几丁质酶突变体ChiM-SS及其应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20220119790A1 (en) * | 2020-10-19 | 2022-04-21 | The Regents Of The University Of California | Mutant Chitinase With Enhanced Expression and Activity |
-
2023
- 2023-07-20 CN CN202310889388.4A patent/CN116790561B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111996205A (zh) * | 2020-08-10 | 2020-11-27 | 深圳润康生态环境股份有限公司 | 几丁质酶基因、几丁质酶及其制备方法和应用 |
| CN113249360A (zh) * | 2021-07-06 | 2021-08-13 | 深圳润康生态环境股份有限公司 | 一种几丁质酶突变体ChiM及应用 |
| CN114736891A (zh) * | 2022-06-15 | 2022-07-12 | 深圳润康生态环境股份有限公司 | 一种几丁质酶突变体ChiM-SS及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Structural Analysis and Construction of a Thermostable Antifungal Chitinase;Dan Kozome et al;ENZYMOLOGY AND PROTEIN ENGINEERING;第88卷(第12期);第1-15页 * |
| 厚垣普奇尼亚菌Pochonia chlamydosporia产生的几丁质酶对南方根结线虫卵孵化的影响;张成敏;武侠;才秀华;;中国农业科学(第10期);第3509-3515页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116790561A (zh) | 2023-09-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20210388336A1 (en) | Mutant of Nitrile Hydratase Derived from Caldalkalibacillus thermarum | |
| CN113088528B (zh) | 一种α-L-鼠李糖苷酶突变酶的应用 | |
| CN115948373B (zh) | 一种褐藻胶裂解酶突变体Pl7AaM及其应用 | |
| CN111662831A (zh) | 黑曲霉Rha-N1及其应用 | |
| CN113862241A (zh) | 一种壳聚糖酶Csncv及其突变体CsnB和应用 | |
| Chen et al. | Characterization and homologous overexpression of an N-acetylglucosaminidase Nag1 from Trichoderma reesei | |
| CN111893125A (zh) | 壳聚糖酶基因、壳聚糖酶及其制备方法和应用 | |
| CN114540330A (zh) | 一种碱性蛋白酶突变体AprBpM及其应用 | |
| CN113637660A (zh) | 一种β-半乳糖苷酶GalNC3-89及其制备方法和应用 | |
| CN116790561B (zh) | 一种几丁质酶突变体ChiPcM及其应用 | |
| CN111117986B (zh) | 一种钙依赖型耐热α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的编码基因、制备技术和应用 | |
| CN110093326B (zh) | 一种胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa及其应用 | |
| CN115896072B (zh) | 一种氨肽酶BmAp、突变体BmApM及其应用 | |
| CN113832129B (zh) | 一种壳聚糖酶突变体CsnBa1及其应用 | |
| CN116121227A (zh) | β-1,3-葡聚糖酶突变体N54W及其基因和应用 | |
| Vu et al. | Improvement of cellulase activity using error-prone rolling circle amplification and site-directed mutagenesis | |
| CN105820966B (zh) | 一株高效壳聚糖酶产生菌及其发酵方法 | |
| CN108165540B (zh) | 一种米黑根毛霉α-淀粉酶及其编码基因与应用 | |
| CN113817758A (zh) | 编码贝莱斯芽孢杆菌的壳聚糖酶基因、壳聚糖酶及其制备方法和应用 | |
| CN117230051B (zh) | 一种褐藻胶裂解酶突变体Pl7MaM及其制备方法与应用 | |
| CN116218819A (zh) | 一种几丁质酶突变体ChiTgM及其应用 | |
| Zhao et al. | Expression of pectate lyase A from Aspergillus nidulans in Bacillus subtilis | |
| CN111647582B (zh) | 吡咯伯克霍尔德氏菌内切葡聚糖酶及其重组表达方法和应用 | |
| CN116144632B (zh) | 一种茶树中性/碱性转化酶CsINV2蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN107988182B (zh) | 一种嗜热毁丝菌外切葡聚糖苷酶突变体及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |