CN110184260A

CN110184260A - 一种经优化的耐热亮氨酸氨肽酶Thelap及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN110184260A
Application number: CN201910582254.1A
Authority: CN
Inventors: 潘力; 林晓彤; 王斌
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2019-06-30
Filing date: 2019-06-30
Publication date: 2019-08-30
Anticipated expiration: 2039-06-30
Also published as: CN110184260B

Abstract

本发明公开了一种经优化的耐热亮氨酸氨肽酶Thelap及其编码基因与应用。所述经优化的耐热亮氨酸氨肽酶Thelap氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述经优化的耐热亮氨酸氨肽酶Thelap的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明构建的耐热亮氨酸氨肽酶Thelap重组菌株可以高产目的耐热亮氨酸氨肽酶。本发明提供的亮氨酸氨肽酶稳定性好，在高温碱性条件下也能从多肽链的N端顺序水解氨基酸，使氨基酸游离出来，对蛋白水解液具有很好的脱苦作用。因此本发明对实现氨肽酶的高效表达甚至工业化生产和食品加工业具有一定的现实意义和应用价值。

Description

一种经优化的耐热亮氨酸氨肽酶Thelap及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种经优化的耐热亮氨酸氨肽酶Thelap及其编码基因与应用。

背景技术

氨肽酶是一类从多肽链的N端顺序水解氨基酸、使氨基酸逐个或者逐两个游离出来的外肽酶。大部分氨肽酶为金属蛋白酶，其活性中心需要一个或两个2价金属离子。一般氨肽酶适合的pH为弱碱性，最适反应温度为50～75℃。氨肽酶的来源非常广泛，存在于动物植物组织和多种微生物体内。Monica Flores等则在猪的肌肉组织中分离纯化得到氨肽酶AlaAP，并发现它能够水解了含有Ala的寡肽链。Laura Gilmartin等人在猪脑组织中提取出了氨肽酶P。一般情况下，动植物组织中的氨肽酶含量比较低，而且提取所需的成本高，而通过微生物发酵的方式获取氨肽酶比较高效。产氨肽酶的微生物的种类有很多，细菌、酵母菌、霉菌中通常都含有一定量的氨肽酶，而氨肽酶产量突出的有：米曲霉（Aspergillusoryzae）、酱油曲霉（Aspergillus sojae）、假单胞菌（Pseudomonas sp.）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）等。

亮氨酸氨肽酶LAP是氨肽酶M1、M17和M28家族的成员，它主要水解以疏水性氨基酸为N末端残基的多肽链，其中对亮氨酸的活性最大，因命名为亮氨酸氨肽酶，这些酶的最适温度、最适pH条件尽不相同，并且它们活性中心必需的二价阳离子也不同。1955年，Spackman等从猪的肠粘膜中分离得到一种亮氨酸氨肽酶IV，并发现2价金属离子Mg²⁺和Mn²⁺对该酶有一定的激活作用。1973年，Tadanobu等首次从米曲霉（Aspergillus oryzae）中提取并纯化得到一种羧肽酶和三种亮氨酸氨肽酶。Blinkovsky等从米曲霉当中克隆并表达米曲霉亮氨酸氨肽酶2，发现其具有较为宽广的特异性，可以水解多种氨基酸残基底物。而且对氨肽酶在脱苦方面的应用也进行了大量研究，Tan等利用来自Lactococcus lactissubsp. cremoris Wg2氨肽酶N对传统的β-酪蛋白水解产物做进一步水解，发现疏水性多肽含量明显减少，伴随着水解产物的苦味值也明显降低。NISHIWAKI等通过研究可食用的担子菌Grifola frondosa氨肽酶进一步水解大豆和酪蛋白初级酶水解产物，发现该酶对对大豆水解产物的脱苦效果更为明显，脱苦之后的产物中，亮氨酸，异亮氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸等疏水性氨基酸的含量明显提高。至于在氨肽酶水解产生功能的方面也有一些研究，Rahulan等使用Streptomyces gedanensis氨肽酶对大豆蛋白，酪蛋白和小麦蛋白进行水解研究，发现该氨肽酶的水解产物的抗氧化性、发泡性和结合水的能力比普通的蛋白酶水解产物明显高。

目前，国内对氨肽酶的研究主要集中在产酶菌株的筛选、酶学特性表征、异源表达、发酵优化等方面。然而，食品、医药等领域对氨肽酶日益增长的需求与氨肽酶产量低下、价格较高的矛盾，是一个亟需解决的问题。

发明内容

为了克服现有技术的上述不足，本发明的目的是提供一种经优化的耐热亮氨酸氨肽酶Thelap及其编码基因与应用。

本发明提供一种经优化的耐热亮氨酸氨肽酶氨基酸序列、经优化的编码上述耐热亮氨酸氨肽酶的基因、包含上述基因的重组表达载体、包含上述基因的重组菌株以及制备上述耐热亮氨酸氨肽酶的基因工程方法。

本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。

本发明提供的一种经优化的耐热亮氨酸氨肽酶Thelap，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，简称为aminopeptidase -PRT（经优化）。

其中，所述经优化的耐热亮氨酸氨肽酶Thelap包括393个氨基酸，N端含信号肽序列，C端含6×His标签。

本发明提供的经优化的耐热亮氨酸氨肽酶Thelap的最适pH为8.5，在pH8.0-9.5范围内反应，酶活力为最高酶活力的60%以上，在pH7.5-9.5稳定性好；最适温度为75℃，在25-80℃范围内反应，仍保持最高酶活力的60%以上，在65-80℃稳定性好。

本发明的耐热亮氨酸氨肽酶原始基因来源于疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)。

本发明提供的经优化的耐热亮氨酸氨肽酶Thelap的编码基因（aminopeptidase-DNA（经优化）），其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，该编码基因可以在黑曲霉中高效表达。

本发明提供的经优化的耐热亮氨酸氨肽酶Thelap结构基因全长为1182bp，N端含信号肽编码序列，C端含6×His标签。

本发明提供的一种重组表达载体，插入了经优化的耐热亮氨酸氨肽酶Thelap的编码基因（该基因如SEQ ID NO.2所示）。

进一步地，所述重组表达载体包含有pMD20-T载体、黑曲霉中性淀粉酶启动子PamyA、黑曲霉tef终止子、构巢曲霉尿嘧啶(U)生物合成的基因pyrG、黑曲霉中性淀粉酶编码基因最后1000bp序列（作为同源臂，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示）以及所述经优化的耐热亮氨酸氨肽酶Thelap的编码基因。

所述重组表达载体使所述耐热亮氨酸氨肽酶编码基因核苷酸序列（如SEQ IDNO.2所示）位于诱导型启动子PamyA的下游并受其调控，而且能通过同源重组的方式整合至黑曲霉的中性淀粉酶位点。所述重组载体为pMD20-PamyA-Thela-Ttef-pyrG-amyA。

重组表达载体pMD20-PamyA-Thela-Ttef-pyrG-amyA是将本发明的亮氨酸氨肽酶基因优化序列插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列与其它表达元件相连接得到的。

本发明提供的一种转基因细胞系，含有上述的重组表达载体。

进一步地，所述的转基因细胞系，宿主细胞为黑曲霉菌；所述转基因细胞系的宿主细胞为黑曲霉。

所述经优化的耐热亮氨酸氨肽酶Thelap的编码基因、所述重组表达载体，能够应用在制备所述经优化的耐热亮氨酸氨肽酶Thelap中。

进一步地，所述制备所述经优化的耐热亮氨酸氨肽酶Thelap的应用，包括以下步骤：

（1）构建重组表达载体；

（2）用步骤（1）构建的重组表达载体转化宿主细胞（黑曲霉菌），得到重组菌株，即所述转基因细胞系；

（3）培养重组菌株，用发酵培养基诱导所述经优化的耐热亮氨酸氨肽酶Thelap的表达；

（4）回收并纯化所述经优化的耐热亮氨酸氨肽酶Thelap。

所述转基因细胞系，能够应用在制备经优化的耐热亮氨酸氨肽酶Thelap中。

本发明构建的重组表达载体含有黑曲霉中性淀粉酶的同源臂，将亮氨酸氨肽酶基因插入到一个构建好的通用表达载体中，同时使用黑曲霉中性淀粉酶启动子，使其可以通过同源重组的方式整合至黑曲霉宿主的中性淀粉酶位点，得到重组菌株。

进一步地，步骤（2）所述重组菌株为转化了所述经优化的耐热亮氨酸氨肽酶Thelap编码基因的菌株。

进一步地，本发明所用的表达宿主为黑曲霉(Aspergillus niger)。本发明构建得到的是含有重组亮氨酸氨肽酶基因的黑曲霉表达菌株。

本发明提供的经优化的耐热亮氨酸氨肽酶Thelap能够应用在制备蛋白水解液的脱苦和深度水解。

本发明提供的经优化的耐热亮氨酸氨肽酶Thelap在食品加工领域能够有效地去除蛋白水解液的苦味，提高产品的适口性，增加营养价值；在饲料生产行业作为添加剂能显著提高饲料利用率，降低养殖成本等，因此对实现亮氨酸氨肽酶的高效表达甚至工业化规模表达具有一定的现实意义和应用价值。

许多食物蛋白被酶解处理后都会产生苦味物质，这些苦味主要是水解产物中末端为疏水性氨基酸低分子量小肽段引起的。亮氨酸氨肽酶最主要的作用在于促进蛋白的水解并一定程度上除去苦味。因此，在通过蛋白酶可以对蛋白质进行有效地分解切割后，变成了多肽和游离氨基酸，再通过亮氨酸肽酶的处理有效提高食物中的风味成分。而且在工业和食品应用中都需要对蛋白质进行水解，如果单纯用内肽酶去水解蛋白蛋质，水解度没有达到很理想的水平。将蛋白酶与亮氨酸氨肽酶复配使用，可以大幅度提高蛋白水解产物的水解度。亮氨酸氨肽酶能从多肽链的N端顺序水解氨基酸，使氨基酸逐个游离出来，在干酪生产、酱油酿造等其它蛋白水解产品的制备过程中，可以提高水解度，提高游离氨基酸的含量，同时增添蛋白质水解产物的风味，因此对实现亮氨酸氨肽酶的高效表达甚至工业化规模表达具有一定的现实意义和应用价值。

已报道的亮氨酸氨肽酶表达基因有很大部分来源于米曲霉、酱油曲霉、假单胞菌、枯草芽孢杆菌等，本发明希望筛选得到一个耐热的亮氨酸氨肽酶基因，而且本发明的表达宿主是黑曲霉，所以本发明将米曲霉的亮氨酸氨肽酶基因LapA通过数据库比对的方法寻找同源性高的序列。最后从疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)中筛选出一个亮氨酸氨肽酶基因，该基因通过序列比对的方式，发现该基因的氨基酸序列与目前被验证的亮氨酸氨肽酶氨基酸序列具有相似的结构序列，预测该基因的产物具有亮氨酸氨肽酶活性，但是未有实验证明该基因的产物具有亮氨酸氨肽酶活性。

根据数据库中的目的基因以及氨基酸序列，对目的基因以及氨基酸序列进行优化，得到的优化后氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。根据优化后的氨基酸序列，对其核苷酸序列进行优化，使其适合于在黑曲霉（Aspergillus niger）中高效表达，体外合成优化的核苷酸序列。设计引物以合成的目的基因核苷酸序列为模板扩增目的基因片段。将扩增到的目的基因片段、黑曲霉amyA启动子片段和线性化的通用表达载体进行连接，构建包含有目的基因片段的表达载体。转化黑曲霉原生质体，并对转化子进行PCR表达框鉴定，挑选阳性克隆，接种液体CD培养，最后接种至发酵培养基中发酵，每天取样测定上清液中的亮氨酸氨肽酶活力，SDS-PAGE检测发酵上清液中重组亮氨酸氨肽酶的表达量，从而确定该基因的产物具有亮氨酸氨肽酶活性，该基因确实是一个亮氨酸氨肽酶编码基因，而且优化后的亮氨酸氨肽酶在黑曲霉中可以高效地表达。

与现有技术相比，本发明有以下优点和有益效果：

（1）本发明得到的重组菌株Aspergillus niger - Thela在100mL发酵培养基中进行摇瓶发酵，第五天的发酵上清液中氨肽酶活力达到1163.12U/ml，经过镍柱亲和层析纯化，从1ml发酵上清液中可以纯化得到0.1mg以上的重组氨肽酶，仅从100ml的摇瓶发酵液就可以回收10mg以上重组氨肽酶，纯化的重组氨肽酶比酶活达到10274.7U/mg；

（2）本发明提供的经优化的耐热亮氨酸氨肽酶Thelap稳定性好，在高温碱性条件下也具有活性，能从多肽链的N端顺序水解氨基酸，使氨基酸游离出来；

（3）本发明提供的经优化的耐热亮氨酸氨肽酶Thelap可对现有蛋白酶水解产物脱苦问题提供了一个切实可行的解决方案，可以提高水解度，提高游离氨基酸的含量，同时增添蛋白质水解产物的风味，因此对实现亮氨酸氨肽酶的高效表达甚至工业化规模表达具有一定的现实意义和应用价值。

附图说明

图1是发酵上清液的经优化的耐热亮氨酸氨肽酶SDS-PAGE结果图，其中泳道1为第一天发酵上清液，泳道2为第二天发酵上清液，泳道3为第三天发酵上清液，泳道4为第四天发酵上清液，泳道5为第五天发酵上清液，泳道6为第六天发酵上清液，泳道M为ThermoScientific Protein Ladders No.26610，泳道C为宿主第五天发酵液上清液；

图2为发酵上清液的氨肽酶Thela活力测定结果图；

图3为经优化的耐热亮氨酸氨肽酶Thela的最适温度折线图；

图4为经优化的耐热亮氨酸氨肽酶Thela的最适pH折线图；

图5为经优化的耐热亮氨酸氨肽酶Thela的温度稳定性折线图；

图6为经优化的耐热亮氨酸氨肽酶Thela的pH稳定性折线图；

图7为经优化的耐热亮氨酸氨肽酶Thela镍柱亲和层析纯化洗脱峰图；

图8为经优化的耐热亮氨酸氨肽酶Thela镍柱亲和层析纯化洗脱峰SDS-PAGE结果图和Western Blot结果图，其中泳道1为第二洗脱峰洗脱液，泳道2为第四天发酵上清液，泳道M为Thermo Scientific Protein Ladders No.26610。

具体实施方式

下面结合实施例以及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程或参数，均是本领域技术人员可参照现有技术理解或实现的。

实施例1、通用表达载体的构建

以黑曲霉基因组为模板，做PCR扩增（Prime STAR premix HS（购自takara 公司）），使用引物Ttef-fw（如SEQ ID NO.8所示）和引物Ttef-rev（如SEQ ID NO.9所示）扩增tef终止子（如SEQ ID NO.3所示），使用引物amyA-fw（如SEQ ID NO.12所示）和引物amyA-rev（如SEQID NO.13所示）扩增中性淀粉酶amyA编码基因的最后1000bp（如SEQ ID NO.5所示），以构巢曲霉基因组为模板使用引物pyrG-fw（如SEQ ID NO.10所示）和引物pyrG-rev（如SEQ IDNO.11所示）扩增pyrG标记（如SEQ ID NO.4所示），得到的PCR产物分别命名为Ttef、amyA 、pyrG（分别如SEQ ID NO.3、如SEQ ID NO.5、如SEQ ID NO.4所示），使用NEBuilder HiFiDNA Assembly Cloning Kit试剂盒，将Ttef 、pyrG、amyA、T载体pMD20-T（如SEQ ID NO.6所示）四个片段连接成为一个环状质粒pMD20-Ttef -pyrG -amyA（具体参考试剂盒说明书）。连接产物转化大肠杆菌Match1T1（购自takara公司）感受态，37℃培养12h后挑取转化子于液体LB+Amp（终浓度100μg/ml）培养基，37℃条件下、摇床转速为200rpm培养12h，做菌液电泳，初步筛选出阳性转化子。菌液电泳筛选到的阳性转化子提质粒、酶切验证，挑选最后质粒大小正确而且酶切验证正确的阳性转化子3个送去测序公司测序。拿到测序结果后与模板序列做比对，挑选测序完全正确的转化子于液体LB+Amp（终浓度100μg/ml）培养基，37℃条件下、摇床转速为200rpm培养12h，提质粒，用限制性内切酶EcoRV酶切4h，同时用去磷酸化酶FastAP做去磷酸化处理，防止载体自连，最后得到线性化的通用表达载体。

实施例2、含目的基因表达载体构建

分别以合成的Thela基因优化核苷酸序列、黑曲霉基因组为模板，以引物The-fw（如SEQID NO.16所示）和引物The-rev（如SEQ ID NO.17所示）扩增得到经优化的耐热亮氨酸氨肽酶Thelap的基因（如SEQ ID NO.2所示），以引物PamyA-fw（如SEQ ID NO.14所示）和引物PamyA -rev（如SEQ ID NO.15所示）扩增得到黑曲霉中性淀粉酶启动子PamyA序列（如SEQID NO.7所示）。将两个PCR扩增得到的PCR片段与线性化通用表达载体做fusion PCR连接。连接产物转化大肠杆菌Match1T1（购自takara公司）感受态，37℃培养12h以后挑取转化子于液体LB+Amp（终浓度100μg/ml）培养基，37℃条件下、摇床转速为200rpm培养12h，做菌液电泳，初步筛选出阳性转化子。菌液电泳筛选到的阳性转化子提质粒、酶切验证，挑选最后质粒大小正确而且酶切验证正确的3个阳性转化子进行测序。拿到测序结果后与模板序列做比对，挑选测序完全正确的转化子，接种100mL液体LB+Amp（终浓度100μg/ml）培养基培养，提质粒，得到表达载体pMD20-PamyA-Thela-Ttef - pyrG-amyA。

实施例3、表达载体pMD20-PamyA-Thela-Ttef- pyrG- amyA质粒在黑曲霉中的转化

按照（Gomi K, Iimura Y, Hara S. Integrative transformation of Aspergillusoryzae with a plasmid containing the Aspergillus nidulans argB gene[J].Agricultural and biological chemistry, 1987, 51(9): 2549-2555.）中提供的步骤制备宿主菌黑曲霉(ΔpyrG)的原生质体，将上述得到的得到表达载体pMD20-PamyA-Thela-Ttef -pyrG- amyA质粒转化入原生质体中，涂布高渗CD培养基(包含1M蔗糖，0.3% (w/v)NaNO₃，0.2% (w/v) KCl，0.05% (w/v) MgSO₄.7H₂O，0.1% (w/v) K₂HPO₄.3H₂O，0.001% (w/v)FeSO₄.7H₂O，2% (w/v) 琼脂粉，pH 5.5，w/v的单位为g/mL)，放入30℃培养箱，5d后观察转化子生长情况。

实施例4、黑曲霉转化子目的基因PCR鉴定

待上述转化子在高渗CD板上长出后，挑至新的普通CD固态板（包含2%(w/v)葡萄糖，0.3% (w/v) NaNO₃，0.2% (w/v) KCl，0.05% (w/v) MgSO₄.7H₂O，0.1% (w/v) K₂HPO₄.3H₂O，0.001% (w/v) FeSO₄.7H₂O，2% (w/v) 琼脂粉，pH 5.5，w/v的单位为g/mL），放入30℃培养箱培养5d至菌落长大，待菌落长大后，挑菌落的一小部分至淀粉固态板上，放入30℃培养箱中培养，待淀粉板上的菌落长大后，将菌体刮下至1.5ml EP管中，加入溶菌缓冲液，用组织研磨器研磨提取基因组。

设计扩增目的基因片段的引物，表达框鉴定引物要求能扩出目的基因的表达框，所以表达框鉴定引物的正向引物Thela-fw（如SEQ ID NO.18所示）设在PamyA（如SEQ IDNO.7所示）上，反向引物Thela-rev（如SEQ ID NO.19所示）设在Ttef上。以转化子的基因组为模板，用引物Thela-fw和引物Thela-rev检测目的基因的表达框，同时以构建的表达载体质粒为模板作为阳性对照，以宿主基因组为模板作为阴性对照，测序筛选表达框鉴定正确的转化子。

实施例5、黑曲霉阳性转化子接种液体CD和发酵培养基

PCR表达框鉴定正确的转化子从固态CD板上刮下，加无菌水用低速组织研磨器研磨后，接种至液体CD（包含2%(w/v)葡萄糖，0.3% (w/v) NaNO₃，0.2% (w/v) KCl，0.05% (w/v)MgSO₄.7H₂O，0.1% (w/v) K₂HPO₄.3H2O，0.001% (w/v) FeSO₄.7H₂O，0.05% (w/v) 琼脂粉，pH5.5，w/v的单位为g/mL）中，30℃培养箱中静置培养5天后，接种至发酵培养基（包含5%淀粉，3%玉米浆，2%豆粕粉，此处百分号表示为质量百分含量），30℃条件，摇床转速为250rpm条件发酵，每隔24h取一次样，测定每天发酵上清液的氨肽酶活力，通过SDS-PAGE检测上清液中的重组氨肽酶含量。

实施例6、发酵上清液氨肽酶活性测定

氨肽酶可以将无色底物L-leucine-4-nitroanilide水解后生成游离的黄色的对硝基苯胺，通过对硝基苯胺在405nm处具有最大吸光值和标准曲线来计算对硝基苯胺的浓度，以此来测定发酵上清液中的氨肽酶活力，即为LNA法。

发酵上清液经镍柱亲和层析分离纯化所述经优化的耐热亮氨酸氨肽酶Thelap。发酵上清液经0.22μm滤膜过滤后，使用的层析柱为HisTrap^TM HP，上样量为30 mL，采用梯度洗脱法（咪唑浓度：0-0.5 mol/L），流速为1.0 mL/min。收集各个洗脱峰的洗脱液，LNA法测定各个洗脱峰的氨肽酶活力，SDS-PAGE检测各个洗脱峰溶液的蛋白条带。

从图1发酵上清液SDS-PAGE结果图和图2发酵上清液的氨肽酶活力测定结果图可以看出，重组菌株Aspergillus niger-Thela在100mL发酵培养基中进行摇瓶发酵，第四天的发酵上清液中氨肽酶活力达到977.17U/ml，目的蛋白条带大小为35kDa左右，在第五天之后蛋白条带不再变化，目的蛋白浓度高。

结合图7的发酵上清液镍柱亲和层析纯化洗脱峰图和图8镍柱亲和层析纯化洗脱峰SDS-PAGE结果图和Western Blot结果图（图8中的左侧小图）可以看出，目的重组氨肽酶为镍柱亲和层析的第三洗脱峰，经过纯化的重组氨肽酶基本去除了其它的杂蛋白，经蛋白浓度测定和洗脱峰氨肽酶活力测定，纯化的重组氨肽酶比酶活达到10274.7U/mg，从1ml发酵上清液中可以纯化得到0.1mg以上目的重组亮氨酸氨肽酶。

从图3的经优化的耐热亮氨酸氨肽酶Thelap的最适温度结果图、图4的经优化的耐热亮氨酸氨肽酶Thelap的最适pH结果、图5为经优化的耐热亮氨酸氨肽酶Thela的温度稳定性结果图、图6为经优化的耐热亮氨酸氨肽酶Thela的pH稳定性结果图可以看出，本发明的经优化的氨肽酶Thela的最适pH为8.5，在pH8.0-9.5范围内反应，酶活力为最高酶活力的60%以上，在pH7.5-9.5稳定性好；最适温度为75℃，在25-80℃范围内反应，仍保持最高酶活力的60%以上，在65-80℃稳定性好。

以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。

序列表

>1

>393

>PRT

>aminopeptidase -PRT（经优化）

>Thermomyces lanuginosus

>疏棉状嗜热丝孢菌

>1

MSFRSLLALSGLVCTGLAASLQAPLASKSGEPEANAGKFLIELAPGETRWVTEKEKWDLKLRRVNFFDVTADANKEVSVQSLKAAAVNYPTAPAFSEAVRELSKGLSKDEMKKNLEQFSSFHTRYYKSETGAQSATWLHELISGIVEKSGATEFGATVEKFEHSWGQPSIIARIPGRSEKTVVLGAHQDSINLRDPANLPAPGADDDGSGTVTIAEVLRTLLQSETIVRGEANNTIEFHWYSAEEAGLLGSQAIFDDYRANGRDVKAMLQQDMTGYAQGTLDAGQEESVGVIVDYVDQPLTEFIKLIIDEYCDIPYVETKCGYACSDHASASRNGYPSAFVIEAEFSLTNQLIHTEDDVIEHLSFDHMLQHAKMTLGFAYELAFAELHHHHHH

>2

>1182

>DNA

> aminopeptidase -DNA（经优化）

>黑曲霉

>Aspergillus niger

>2

atgtcgttccgatctctactcgccctgagcggcctcgtctgcacagggttggcagcttccctgcaggctcccctcgcttccaagtctggtgaacctgaggctaacgccggcaagttcctcatcgagctggctcctggtgaaacccgatgggtcaccgagaaggagaagtgggacctgaagctccgtcgcgtgaacttcttcgacgtcaccgctgatgccaacaaggaagtctccgtgcagagcctgaaggctgctgctgtgaactaccctaccgctcctgctttctctgaggctgtccgagagctgtccaagggtctcagcaaggatgagatgaagaagaacctcgagcagttctccagcttccacacccgctactacaagtctgagaccggcgctcagtctgctacctggctgcatgagctcatctccggtatcgtggagaagagcggtgctaccgagttcggtgctaccgtcgagaagttcgagcactcctggggccagccctctatcatcgctcgaatccctggtcgatctgagaagaccgtggtgctgggtgcccatcaggacagcatcaacctgcgcgatcctgctaatctgcctgctcctggtgctgatgatgatggttccggtaccgtgaccatcgctgaggtcctccgaaccctgctccagagcgagaccatcgtgcgcggtgaggctaacaacaccatcgagttccactggtactctgctgaggaagccggtctgctgggtagccaggctatcttcgacgattaccgcgccaacggccgcgacgtcaaggctatgctgcagcaggatatgaccggttatgctcagggtaccctggatgctggtcaggaagagtctgtcggtgtgatcgtcgactacgtggatcagccgctgaccgagttcatcaagctcatcatcgacgagtactgcgatatcccctacgtcgagaccaagtgcggctatgcttgctctgaccatgcttctgctagccgcaacggttacccgtccgctttcgtgatcgaggccgagttcagcctgaccaaccagctcatccacaccgaggacgatgtcatcgagcatctgtccttcgatcacatgctccagcatgccaagatgaccctcggcttcgcttacgagctggctttcgccgagctccatcatcatcatcatcactga

>3

>489

>DNA

>Ttef

>黑曲霉

>Aspergillus niger

>3

gcggacattcgatttatgccgttatgacttccttaaaaaagcctttacgaatgaaagaaatggaattagacttgttatgtagttgattctacaatggattatgattcctgaacttcaaatccgctgttcattattaatctcagctcttcccgtaaagccaatgttgaaactattcgtaaatgtacctcgttttgcgtgtaccttgcttatcacgtgatattacatgacctggacagagttctgcgcgaaagtcataacgtaaatcccgggcggtaggtgcgtcccgggcggaaggtagttttctcgtccaccccaacgcgtttatcaacctcaactttcaacaaccatcatgccaccaaaagcgcgtaaaacaaagcgagatttgattgagcaagagggcaggatccaatgcgcgattcaagacattaaaaatggaaaatttcaaaaaattgcgcccgcagcgcgtgcatacaaaattcatcccaatac

>4

>1398

>DNA

>pyrG

>构巢曲霉

>Aspergillus nidulans

>4

gcaacttcctcgagaacgcgccgcagacaatgctctctatcctggtggcaggcgtcaagtacccagaggcagcagcgggcttaggagcggcctgggttgttctccgcaccctctacatgctgggctatatttatagcgacaagccgaacggcaccggcaggtacaatggttcgctgtacttgcttgcgcaagcgggtctttggggattgagcgcatttggtgttgcaaaggatttgatgtaaatgtagtcgacatcttagcacagaggggagagttgataaaatgtggtctgtttgaatgatagtcgggttcgtgacctatattcgtgatagtggagataggtctgcgcctatcttatcgggccggagcaaaaattccaccgcagcggggtgagttttcgttatacagccatcccacttccagcttcaaattgtcagtttaatccagcccaattcaatcattggagaaccgccatcatgtcttcgaagtcccacctcccctacgcaattcgcgcaaccaaccatcccaaccctttaacatctaaactcttctccatcgccgaggagaagaaaaccaacgtcaccgtctccgcagacgttactacttccgccgagctcctcgatcttgctgaccgtacatcctgcaccaatgcccctccaggataacaaatagctgatgcgtagtgagtacaggcctaggcccctatatcgcagttctgaaaacccacatcgacatcctcaccgatctcaccccgtcgaccctttcctcgctccaatccctcgcgacaaagcacaacttcctcatctttgaggaccgcaagttcatcgacatcggcaacaccgtgcaaaagcagtaccacggtggcgctctccgcatctccgaatgggcacacatcatcaactgcgccatcctgccgggcgaagggatcgtcgaggccctcgcacagacaaccaagtctcctgactttaaagacgcgaatcaacgaggtctcctgattcttgccgagatgacgagtaagggatctcttgcgacaggggagtacacggcacgctcggttgagtacgcgcggaagtataaggggtttgtgatgggattcgtgagtacaagggcgttgagtgaggtgctgcccgaacagaaagaggagagcgaggattttgtcgtctttacgactggggtgaatctgtcggataagggggataagctggggcagcagtatcagacacctgggtcggcggttgggcgaggtgcggactttatcattgcgggtaggggcatctataaggcggacgatccagtcgaggcggttcagaggtaccgggaggaaggctggaaagcttacgagaaaagagttggactttgagtgtgagtggaaatgtgtaacggtattgactaaaaggg

>5

>1000

>DNA

>amyA

>黑曲霉

>Aspergillus niger

>5

acaaagccgcaggcgtgtactgtatcggcgaggtgctcgacggtgatccggcctacacttgtccctaccagaacgtcatggacggcgtactgaactatcccatgtatggttcctccaaccatgagccttcttgcaagtctcatctcctaacgaaacggctaaaaccagttactatccactcctcaacgccttcaagtcaacctccggcagcatggacgacctctacaacatgatcaacaccgtcaaatccgactgtccagactcaacactcctgggcacattcgtcgagaaccacgacaacccacggttcgcttcgtaagtcttcccttttattttccgttcccaatttccacacagaaccccacctaacaagagcaaagttacaccaacgacatagccctcgccaagaacgtcgcagcattcatcatcctcaacgacggaatccccatcatctacgccggccaagaacagcactacgccggcggaaacgaccccgcgaaccgcgaagcaacctggctctcgggctacccgaccgacagcgagctgtacaagttaattgcctccgcgaacgcaatccggaactatgccattagcaaagatacaggattcgtgacctacaaggtaagcacaacctctaagcataccctaatggcctatcttcagagtatctgacacaagagactaatcactggcaatacagaactggcccatctacaaagacgacacaacgatcgccatgcgcaagggcacagatgggtcgcagatcgtgactatcttgtccaacaagggtgcttcgggtgattcgtataccctctccttgagtggtgcgggttacacagccggccagcaattgacggaggtcattggctgcacgaccgtgacggttggttcggatggaaatgtgcctgttcctatggcaggtgggctacctagggtattgtatccgactgagaagttggcaggtagcaagatctgtagtagctcgtgaagggtggagagt

>6

>2737

>DNA

>从Takara购买（人工合成）

>pMD20-T

>6

atcggatccccgggtaccgagctcgaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggccctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatagtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagctatttaggtgacactataggggaaagcttgcatgcctgcaggtcgactctagaggatctactagtcatatggatt

>7

>616

>DNA

>PamyA

> 黑曲霉

>Asperguillus niger

>7

aattcatggtgttttgatcattttaaatttttatatggcgggtggtgggcaactcgcttgcgcgggcaactcgcttaccgattacgttagggctgatatttacgtaaaaatcgtcaagggatgcaagaccaaaccgttaaatttccggagtcaacagcatccaagcccaagtccttcacggagaaaccccagcgtccacatcacgagcgaaggaccacctctaggcatcggacgcaccatccaattagaagcagcaaagcgaaacagcccaagaaaaaggtcggcccgtcggccttttctgcaacgctgatcacgggcagcgatccaaccaacaccctccagagtgactaggggcggaaatttatcgggattaatttccactcaaccacaaatcacagtcgtccccggtattgtcctgcagacggcaatttaacggcttctgcgaatcgcttggattccccgcccctggccgtagagcttaaagtatgtcccttgtcgatgcgatgtatcacaacatataaatactggcaagggatgccatgcttggagtttccaactcaatttacctctatccacacttctcttccttcctcaatcctctatatacacaactggg

>8

>55

>DNA

>Ttef-fw primer

>人工合成

>8

atctactagtcatatggattgggcccgatatcgcggacattcgatttatgccgtt

>9

>45

>DNA

> Ttef-rev primer

>人工合成

>9

cgcgttctcgaggaagttgcgtattgggatgaattttgtatgcac

>10

>21

>DNA

>pyrG-fw primer

>人工合成

>10

gcaacttcctcgagaacgcgc

>11

>24

>DNA

> pyrG-rev primer

>人工合成

>11

cccttttagtcaataccgttacac

>12

>42

>DNA

>amyA-fw primer

>人工合成

>12

aacggtattgactaaaagggacaaagccgcaggcgtgtactg

>13

>54

>DNA

> amyA-rev primer

>人工合成

>13

tcggtacccggggatccgattctagagggcccactctccacccttcacgagcta

>14

>61

>DNA

>PamyA-fw primer

>人工合成

>14

atctactagtcatatggattgggcccgatatcaattcatggtgttttgatcattttaaat

>15

>44

>DNA

> PamyA -rev primer

>人工合成

>15

agtagagatcggaacgacatcccagttgtgtatatagaggattg

>16

>74

>DNA

>The-fw primer

>人工合成

>16

Atgtcgttccgatctctactcgccctgagcggcctcgtctgcacagg

>17

>62

>DNA

> The-rev primer

>人工合成

>17

ggcataaatcgaatgtccgctcagtgatgatgatgatgatggagctcggcgaaagccagctc

>18

>20

>DNA

> Thela-fw primer

>人工合成

>18

atccaaccaacaccctccag

>19

>20

>DNA

> Thela-rev primer

>人工合成

>19

Tgccctcttgctcaatcaaatct。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 一种经优化的耐热亮氨酸氨肽酶Thelap及其编码基因与应用

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 393

<212> PRT

<213> 疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)

<400> 1

Met Ser Phe Arg Ser Leu Leu Ala Leu Ser Gly Leu Val Cys Thr Gly

1 5 10 15

Leu Ala Ala Ser Leu Gln Ala Pro Leu Ala Ser Lys Ser Gly Glu Pro

20 25 30

Glu Ala Asn Ala Gly Lys Phe Leu Ile Glu Leu Ala Pro Gly Glu Thr

35 40 45

Arg Trp Val Thr Glu Lys Glu Lys Trp Asp Leu Lys Leu Arg Arg Val

50 55 60

Asn Phe Phe Asp Val Thr Ala Asp Ala Asn Lys Glu Val Ser Val Gln

65 70 75 80

Ser Leu Lys Ala Ala Ala Val Asn Tyr Pro Thr Ala Pro Ala Phe Ser

85 90 95

Glu Ala Val Arg Glu Leu Ser Lys Gly Leu Ser Lys Asp Glu Met Lys

100 105 110

Lys Asn Leu Glu Gln Phe Ser Ser Phe His Thr Arg Tyr Tyr Lys Ser

115 120 125

Glu Thr Gly Ala Gln Ser Ala Thr Trp Leu His Glu Leu Ile Ser Gly

130 135 140

Ile Val Glu Lys Ser Gly Ala Thr Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Lys

145 150 155 160

Phe Glu His Ser Trp Gly Gln Pro Ser Ile Ile Ala Arg Ile Pro Gly

165 170 175

Arg Ser Glu Lys Thr Val Val Leu Gly Ala His Gln Asp Ser Ile Asn

180 185 190

Leu Arg Asp Pro Ala Asn Leu Pro Ala Pro Gly Ala Asp Asp Asp Gly

195 200 205

Ser Gly Thr Val Thr Ile Ala Glu Val Leu Arg Thr Leu Leu Gln Ser

210 215 220

Glu Thr Ile Val Arg Gly Glu Ala Asn Asn Thr Ile Glu Phe His Trp

225 230 235 240

Tyr Ser Ala Glu Glu Ala Gly Leu Leu Gly Ser Gln Ala Ile Phe Asp

245 250 255

Asp Tyr Arg Ala Asn Gly Arg Asp Val Lys Ala Met Leu Gln Gln Asp

260 265 270

Met Thr Gly Tyr Ala Gln Gly Thr Leu Asp Ala Gly Gln Glu Glu Ser

275 280 285

Val Gly Val Ile Val Asp Tyr Val Asp Gln Pro Leu Thr Glu Phe Ile

290 295 300

Lys Leu Ile Ile Asp Glu Tyr Cys Asp Ile Pro Tyr Val Glu Thr Lys

305 310 315 320

Cys Gly Tyr Ala Cys Ser Asp His Ala Ser Ala Ser Arg Asn Gly Tyr

325 330 335

Pro Ser Ala Phe Val Ile Glu Ala Glu Phe Ser Leu Thr Asn Gln Leu

340 345 350

Ile His Thr Glu Asp Asp Val Ile Glu His Leu Ser Phe Asp His Met

355 360 365

Leu Gln His Ala Lys Met Thr Leu Gly Phe Ala Tyr Glu Leu Ala Phe

370 375 380

Ala Glu Leu His His His His His His

385 390

<210> 2

<211> 1182

<212> DNA

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 2

atgtcgttcc gatctctact cgccctgagc ggcctcgtct gcacagggtt ggcagcttcc 60

ctgcaggctc ccctcgcttc caagtctggt gaacctgagg ctaacgccgg caagttcctc 120

atcgagctgg ctcctggtga aacccgatgg gtcaccgaga aggagaagtg ggacctgaag 180

ctccgtcgcg tgaacttctt cgacgtcacc gctgatgcca acaaggaagt ctccgtgcag 240

agcctgaagg ctgctgctgt gaactaccct accgctcctg ctttctctga ggctgtccga 300

gagctgtcca agggtctcag caaggatgag atgaagaaga acctcgagca gttctccagc 360

ttccacaccc gctactacaa gtctgagacc ggcgctcagt ctgctacctg gctgcatgag 420

ctcatctccg gtatcgtgga gaagagcggt gctaccgagt tcggtgctac cgtcgagaag 480

ttcgagcact cctggggcca gccctctatc atcgctcgaa tccctggtcg atctgagaag 540

accgtggtgc tgggtgccca tcaggacagc atcaacctgc gcgatcctgc taatctgcct 600

gctcctggtg ctgatgatga tggttccggt accgtgacca tcgctgaggt cctccgaacc 660

ctgctccaga gcgagaccat cgtgcgcggt gaggctaaca acaccatcga gttccactgg 720

tactctgctg aggaagccgg tctgctgggt agccaggcta tcttcgacga ttaccgcgcc 780

aacggccgcg acgtcaaggc tatgctgcag caggatatga ccggttatgc tcagggtacc 840

ctggatgctg gtcaggaaga gtctgtcggt gtgatcgtcg actacgtgga tcagccgctg 900

accgagttca tcaagctcat catcgacgag tactgcgata tcccctacgt cgagaccaag 960

tgcggctatg cttgctctga ccatgcttct gctagccgca acggttaccc gtccgctttc 1020

gtgatcgagg ccgagttcag cctgaccaac cagctcatcc acaccgagga cgatgtcatc 1080

gagcatctgt ccttcgatca catgctccag catgccaaga tgaccctcgg cttcgcttac 1140

gagctggctt tcgccgagct ccatcatcat catcatcact ga 1182

<210> 3

<211> 489

<212> DNA

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 3

gcggacattc gatttatgcc gttatgactt ccttaaaaaa gcctttacga atgaaagaaa 60

tggaattaga cttgttatgt agttgattct acaatggatt atgattcctg aacttcaaat 120

ccgctgttca ttattaatct cagctcttcc cgtaaagcca atgttgaaac tattcgtaaa 180

tgtacctcgt tttgcgtgta ccttgcttat cacgtgatat tacatgacct ggacagagtt 240

ctgcgcgaaa gtcataacgt aaatcccggg cggtaggtgc gtcccgggcg gaaggtagtt 300

ttctcgtcca ccccaacgcg tttatcaacc tcaactttca acaaccatca tgccaccaaa 360

agcgcgtaaa acaaagcgag atttgattga gcaagagggc aggatccaat gcgcgattca 420

agacattaaa aatggaaaat ttcaaaaaat tgcgcccgca gcgcgtgcat acaaaattca 480

tcccaatac 489

<210> 4

<211> 1398

<212> DNA

<213> 构巢曲霉(Aspergillus nidulans)

<400> 4

gcaacttcct cgagaacgcg ccgcagacaa tgctctctat cctggtggca ggcgtcaagt 60

acccagaggc agcagcgggc ttaggagcgg cctgggttgt tctccgcacc ctctacatgc 120

tgggctatat ttatagcgac aagccgaacg gcaccggcag gtacaatggt tcgctgtact 180

tgcttgcgca agcgggtctt tggggattga gcgcatttgg tgttgcaaag gatttgatgt 240

aaatgtagtc gacatcttag cacagagggg agagttgata aaatgtggtc tgtttgaatg 300

atagtcgggt tcgtgaccta tattcgtgat agtggagata ggtctgcgcc tatcttatcg 360

ggccggagca aaaattccac cgcagcgggg tgagttttcg ttatacagcc atcccacttc 420

cagcttcaaa ttgtcagttt aatccagccc aattcaatca ttggagaacc gccatcatgt 480

cttcgaagtc ccacctcccc tacgcaattc gcgcaaccaa ccatcccaac cctttaacat 540

ctaaactctt ctccatcgcc gaggagaaga aaaccaacgt caccgtctcc gcagacgtta 600

ctacttccgc cgagctcctc gatcttgctg accgtacatc ctgcaccaat gcccctccag 660

gataacaaat agctgatgcg tagtgagtac aggcctaggc ccctatatcg cagttctgaa 720

aacccacatc gacatcctca ccgatctcac cccgtcgacc ctttcctcgc tccaatccct 780

cgcgacaaag cacaacttcc tcatctttga ggaccgcaag ttcatcgaca tcggcaacac 840

cgtgcaaaag cagtaccacg gtggcgctct ccgcatctcc gaatgggcac acatcatcaa 900

ctgcgccatc ctgccgggcg aagggatcgt cgaggccctc gcacagacaa ccaagtctcc 960

tgactttaaa gacgcgaatc aacgaggtct cctgattctt gccgagatga cgagtaaggg 1020

atctcttgcg acaggggagt acacggcacg ctcggttgag tacgcgcgga agtataaggg 1080

gtttgtgatg ggattcgtga gtacaagggc gttgagtgag gtgctgcccg aacagaaaga 1140

ggagagcgag gattttgtcg tctttacgac tggggtgaat ctgtcggata agggggataa 1200

gctggggcag cagtatcaga cacctgggtc ggcggttggg cgaggtgcgg actttatcat 1260

tgcgggtagg ggcatctata aggcggacga tccagtcgag gcggttcaga ggtaccggga 1320

ggaaggctgg aaagcttacg agaaaagagt tggactttga gtgtgagtgg aaatgtgtaa 1380

cggtattgac taaaaggg 1398

<210> 5

<211> 1000

<212> DNA

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 5

acaaagccgc aggcgtgtac tgtatcggcg aggtgctcga cggtgatccg gcctacactt 60

gtccctacca gaacgtcatg gacggcgtac tgaactatcc catgtatggt tcctccaacc 120

atgagccttc ttgcaagtct catctcctaa cgaaacggct aaaaccagtt actatccact 180

cctcaacgcc ttcaagtcaa cctccggcag catggacgac ctctacaaca tgatcaacac 240

cgtcaaatcc gactgtccag actcaacact cctgggcaca ttcgtcgaga accacgacaa 300

cccacggttc gcttcgtaag tcttcccttt tattttccgt tcccaatttc cacacagaac 360

cccacctaac aagagcaaag ttacaccaac gacatagccc tcgccaagaa cgtcgcagca 420

ttcatcatcc tcaacgacgg aatccccatc atctacgccg gccaagaaca gcactacgcc 480

ggcggaaacg accccgcgaa ccgcgaagca acctggctct cgggctaccc gaccgacagc 540

gagctgtaca agttaattgc ctccgcgaac gcaatccgga actatgccat tagcaaagat 600

acaggattcg tgacctacaa ggtaagcaca acctctaagc ataccctaat ggcctatctt 660

cagagtatct gacacaagag actaatcact ggcaatacag aactggccca tctacaaaga 720

cgacacaacg atcgccatgc gcaagggcac agatgggtcg cagatcgtga ctatcttgtc 780

caacaagggt gcttcgggtg attcgtatac cctctccttg agtggtgcgg gttacacagc 840

cggccagcaa ttgacggagg tcattggctg cacgaccgtg acggttggtt cggatggaaa 900

tgtgcctgtt cctatggcag gtgggctacc tagggtattg tatccgactg agaagttggc 960

aggtagcaag atctgtagta gctcgtgaag ggtggagagt 1000

<210> 6

<211> 2737

<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

<400> 6

atcggatccc cgggtaccga gctcgaattc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg 60

ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg 120

gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg 180

cgaatggccc tgatgcggta ttttctcctt acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata 240

tagtgcactc tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt taagccagcc ccgacacccg 300

ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa 360

gctgtgaccg tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc 420

gcgagacgaa agggcctcgt gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg 480

gtttcttaga cgtcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta 540

tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt 600

caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc 660

ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa 720

gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct caacagcggt 780

aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt 840

ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtatt gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc 900

atacactatt ctcagaatga cttggttgag tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg 960

gatggcatga cagtaagaga attatgcagt gctgccataa ccatgagtga taacactgcg 1020

gccaacttac ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac 1080

atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg agctgaatga agccatacca 1140

aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta 1200

actggcgaac tacttactct agcttcccgg caacaattaa tagactggat ggaggcggat 1260

aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg gctggtttat tgctgataaa 1320

tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag cactggggcc agatggtaag 1380

ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat 1440

agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt 1500

tactcatata tactttagat tgatttaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg 1560

aagatccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga 1620

gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta 1680

atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa 1740

gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact 1800

gttcttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca 1860

tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt 1920

accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg 1980

ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag 2040

cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta 2100

agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat 2160

ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg 2220

tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc 2280

ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac 2340

cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc 2400

gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt 2460

tggccgattc attaatgcag ctggcacgac aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag 2520

cgcaacgcaa ttaatgtgag ttagctcact cattaggcac cccaggcttt acactttatg 2580

cttccggctc gtatgttgtg tggaattgtg agcggataac aatttcacac aggaaacagc 2640

tatgaccatg attacgccaa gctatttagg tgacactata ggggaaagct tgcatgcctg 2700

caggtcgact ctagaggatc tactagtcat atggatt 2737

<210> 7

<211> 616

<212> DNA

<213> 黑曲霉(Asperguillus niger)

<400> 7

aattcatggt gttttgatca ttttaaattt ttatatggcg ggtggtgggc aactcgcttg 60

cgcgggcaac tcgcttaccg attacgttag ggctgatatt tacgtaaaaa tcgtcaaggg 120

atgcaagacc aaaccgttaa atttccggag tcaacagcat ccaagcccaa gtccttcacg 180

gagaaacccc agcgtccaca tcacgagcga aggaccacct ctaggcatcg gacgcaccat 240

ccaattagaa gcagcaaagc gaaacagccc aagaaaaagg tcggcccgtc ggccttttct 300

gcaacgctga tcacgggcag cgatccaacc aacaccctcc agagtgacta ggggcggaaa 360

tttatcggga ttaatttcca ctcaaccaca aatcacagtc gtccccggta ttgtcctgca 420

gacggcaatt taacggcttc tgcgaatcgc ttggattccc cgcccctggc cgtagagctt 480

aaagtatgtc ccttgtcgat gcgatgtatc acaacatata aatactggca agggatgcca 540

tgcttggagt ttccaactca atttacctct atccacactt ctcttccttc ctcaatcctc 600

tatatacaca actggg 616

<210> 8

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

<400> 8

atctactagt catatggatt gggcccgata tcgcggacat tcgatttatg ccgtt 55

<210> 9

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

<400> 9

cgcgttctcg aggaagttgc gtattgggat gaattttgta tgcac 45

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

<400> 10

gcaacttcct cgagaacgcg c 21

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

<400> 11

cccttttagt caataccgtt acac 24

<210> 12

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

<400> 12

aacggtattg actaaaaggg acaaagccgc aggcgtgtac tg 42

<210> 13

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

<400> 13

tcggtacccg gggatccgat tctagagggc ccactctcca cccttcacga gcta 54

<210> 14

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

<400> 14

atctactagt catatggatt gggcccgata tcaattcatg gtgttttgat cattttaaat 60

<210> 15

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

<400> 15

agtagagatc ggaacgacat cccagttgtg tatatagagg attg 44

<210> 16

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

<400> 16

atgtcgttcc gatctctact cgccctgagc ggcctcgtct gcacagg 47

<210> 17

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

<400> 17

ggcataaatc gaatgtccgc tcagtgatga tgatgatgat ggagctcggc gaaagccagc 60

tc 62

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

<400> 18

atccaaccaa caccctccag 20

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成(人工序列)

<400> 19

tgccctcttg ctcaatcaaa tct 23

Claims

1.一种经优化的耐热亮氨酸氨肽酶Thelap，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种权利要求1所述经优化的耐热亮氨酸氨肽酶Thelap的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种重组表达载体，其特征在于，插入了如权利要求2中SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，包含有pMD20-T载体、黑曲霉中性淀粉酶启动子PamyA、黑曲霉tef终止子、构巢曲霉尿嘧啶生物合成的基因pyrG、黑曲霉中性淀粉酶编码基因最后1000bp序列以及所述经优化的耐热亮氨酸氨肽酶Thelap的编码基因。

5.一种转基因细胞系，其特征在于，含有权利要求3所述的重组表达载体。

6.根据权利要求5所述的转基因细胞系，其特征在于，所述转基因细胞系的宿主细胞为黑曲霉。

7.权利要求2所述经优化的耐热亮氨酸氨肽酶Thelap的编码基因、权利要求3所述重组表达载体的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

（1）构建重组表达载体；

（2）用步骤（1）构建的重组表达载体转化宿主细胞，得到重组菌株，即所述转基因细胞系；

（4）回收并纯化所述经优化的耐热亮氨酸氨肽酶Thelap。

9.权利要求5所述转基因细胞系在制备权利要求1所述经优化的耐热亮氨酸氨肽酶Thelap的应用。

10.权利要求1所述的经优化的耐热亮氨酸氨肽酶Thelap在制备蛋白水解液中的应用。