CN101748108A - 一种嗜酸β-葡聚糖酶GLU7A及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种嗜酸β-葡聚糖酶GLU7A及其基因和应用。本发明提供了一种来源于嗜酸双孢菌属Bispora sp.的葡聚糖酶GLU7A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且本发明提供了编码上述葡聚糖酶的基因组和cDNA编码基因glu7A。本发明获得一种嗜酸葡聚糖酶，其最适pH值为1.5-5.0，同时在酸性环境中均保持有高的酶活性，其抗蛋白酶水解。且该酶不仅水解β-1，3-1，4-葡聚糖，还能水解纤维素。这些性质使其能应用于食品、饲料和啤酒工业中。

Description

一种嗜酸β-葡聚糖酶GLU7A及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种嗜酸β-葡聚糖酶GLU7A及其基因、包含该基因的重组载体和应用。

背景技术

β-葡聚糖是禾本科高等植物细胞壁中的结构性非淀粉多糖，在谷物(大麦、燕麦、高粱、大米和小麦)的胚乳细胞壁中含量尤其丰富。

β-葡聚糖是由D型β构象葡萄糖连接的多糖聚合物，具有线型的空间结构。依据糖苷键连接的不同，β-葡聚糖可以分为1，4-β-葡聚糖，1，3-β-葡聚糖，1，6-β-葡聚糖，1，3-1，6-β-葡聚糖，1，3-1，4-β-葡聚糖等。其中1，3-1，4-β-葡聚糖是由β-1，3和β-1，4混合的糖苷键连接，通常是由β-1，4糖苷键连接葡萄糖形成纤维三糖或纤维四糖，再由β-1，3键相互连接成直链多聚体形式。在大麦和燕麦等淀粉胚乳的细胞壁中含量在70％左右。

当含有β-葡聚糖的谷物用作饲料原料时，β-葡聚糖是重要的抗营养因子。β-葡聚糖包括水溶性和非水溶性两类，单胃动物肠道中不能分泌相关的酶消化分解β-葡聚糖。并且，水溶性葡聚糖可以增大食糜的粘性，减少动物消化酶与营养物质的接触，降低消化养分的吸收；食糜粘性增加还造成畜禽粪便含水量和粘稠度增加，影响畜禽舍周围环境；β-葡聚糖可以结合、吸附金属离子、有机质等营养物质，造成其代谢受阻；还能降低其他消化酶的活力，影响脂肪和蛋白质的消化吸收。

β-葡聚糖酶是能分解β-糖苷键链成葡萄糖聚合物的一类酶的总称。按作用方式不同，β-葡聚糖酶可分为内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶两类。其中内切β-1，3-1，4-葡聚糖酶(酶学分类号E.C.3.2.1.73)可以水解β-1，3-1，4-葡聚糖，专一作用于与β-1，3键相连的β-1，4糖苷键，使其降解为低分子量片段，失去亲水性和粘性。从而改变单胃动物肠道内容物的特性，提高内源性消化酶活性，改变肠道微生物环境，利于动物对营养物质的消化和吸收，提高生长性能和饲料的转化率(Mathlouthi N et al.Amin Res，2002，51：395-406.)，在食品和饲料工业等方面有广阔的应用前景。

植物和微生物都能产生β-1，3-1，4-葡聚糖酶，在植物种子发芽过程中可以由糊粉层和盾片分泌β-1，3-1，4-葡聚糖酶以分解胚乳细胞壁中的β-葡聚糖。生产中应用较多的是微生物所产的β-1，3-1，4-葡聚糖酶，包括细菌(主要为芽孢杆菌)、真菌和瘤胃微生物。目前已经有多种不同来源的β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因被克隆和表达。包括芽孢杆菌Bacillus sublitis(Hinchliff E et al.Curr Genet，1995，8：471-475.)、B.amyloliquefaciens、B.circulans(Kim JY et al.Biotechnol Lett，2003，25：1445-1449.)、B.licheniformis(Lloberas J et al.Eur J Biochem，1991，197：337-343.)、B.brevis、类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa(Gosalbes MJ et al.J Bacteriol，1991，173(23)：7705-7710.)、P.macerans(Borris R et al.Mol Gen Genet，1990，222：278-283.)。它们所产的β-1，3-1，4-葡聚糖酶都具有相似的核苷酸和氨基酸序列，并且都有一个保守的氨基酸序列EIDIEF，其中的两个谷氨酸残基参与酶的水解(Hahn M et al.J Biol Chem，1995，270：3081-3088.)。在一些非芽孢杆菌的细菌中也克隆到β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因，例如热纤梭菌Clostridium thermocellum(Schimming S et al.Biochem Biophys Res Commun，1991，177：447-452.)、牛链球菌Streptococcus bovis(Ekinci MS et al.Appl EnvironMicrobiol.1997，63：3752-3756.)、产琥珀酸丝状杆菌Fibrobacter succinogenes(Chen JLet al.J Biol Chem，2001，276：17895-17901.)，在厌氧真菌Orpinomyces中分离的β-1，3-1，4-葡聚糖酶序列与芽孢杆菌也很相似(Chen H et al.Journal of Bacteriology1997，179：6028-6034.)。

不同来源的基因可以在不同的载体和寄主系统中得到表达，包括大肠杆菌(Escherichia coli)，芽孢杆菌，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)以及转基因大麦和烟草等，但不同表达系统的葡聚糖酶活性有较大的差异。

然而，获得新型具有优良特性葡聚糖酶的研究仍具有重大意义。克隆和分离具有高比活、良好稳定性和底物特异性的葡聚糖酶可以更好的应用于饲料和啤酒工业，而较高的表达量可以降低生产成本，都是葡聚糖酶应用于工业必需的。

发明内容

本发明的目的是提供一种能高效应用的嗜酸葡聚糖酶。

本发明的再一目的是提供编码上述嗜酸葡聚糖酶的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供一种制备上述嗜酸葡聚糖酶的基因工程方法。

本发明的另一目的提供上述嗜酸葡聚糖酶的应用。

本发明提供了一种嗜酸葡聚糖酶GLU7A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供了编码上述嗜酸葡聚糖酶的基因glu7A。具体地，该基因的基因组序列如SEQ ID NO.2所示。其cDNA序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了包含上述嗜酸葡聚糖酶基因glu7A的重组载体，优选为pPIC-glu 7A。

本发明还提供了包含上述嗜酸葡聚糖酶基因glu7A的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。

本发明还提供了一种制备嗜酸葡聚糖酶GLU7A的方法，包括以下步骤：

1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组葡聚糖酶表达；以及

3)回收并纯化所表达的葡聚糖酶GLU7A。

本发明还提供了上述嗜酸葡聚糖酶GLU7A的应用。

本发明获得一种嗜酸葡聚糖酶GLU7A，其最适pH值为1.5-5.0，同时在酸性的范围内均具有高的酶活稳定性。该酶具有较好的底物适应性，不仅可以水解β-1，3-1，4-葡聚糖，还能水解纤维素、木聚糖等。这些性质符合动物消化生理特点、pH适应范围提高饲料消化能和代谢能，降低配方成本，减少环境污染；提高谷物加工副产品的营养价值，提升饲料产品品质。本葡聚糖酶可应用于酿酒工业，降低物料粘度，可以有利于淀粉酶作用于淀粉层，提高淀粉利用率，增加酒精的产率。

附图说明

图1在毕赤酵母菌中表达的重组葡聚糖酶的SDS-PAGE分析，其中，1：低分子量蛋白质Marker；2：含有葡聚糖酶基因的毕赤酵母菌培养上清液浓缩液；3：含有葡聚糖酶的膜包浓缩的上清液4：纯化的重组葡聚糖酶。

图2重组葡聚糖酶的最适pH。

图3重组葡聚糖酶的pH稳定性。

图4重组葡聚糖酶的最适温度。

图5重组葡聚糖酶的热稳定性。

图6重组葡聚糖酶的蛋白酶抗性。

嗜酸真菌Bispora sp.MEY-1，于2008年5月19日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCC No.2500。

具体实施方式

实验条件：

1、菌株及载体：

嗜酸真菌Bispora sp.MEY-1，于2008年5月19日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCC No.2500。

2、酶类及其他生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。底物购自Sigma公司，其它都为国产试剂。

3.培养基：Bispora sp.MEY-1培养基为马铃薯汁培养基：1000mL马铃薯汁，10g葡萄糖，25g琼脂，pH2.5。

本发明中所用到重组遗传学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中未作详细介绍的技术，均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分来进行，包括：Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(第3版.2001)；Kriegler，Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual(1990)；和Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel等人编，1994)。

实施例1嗜酸真菌Bispora sp.MEY-1及其产酶特性

将来源于江西某矿的铀矿废水样品经马铃薯汁培养基培养后，涂布于产酶培养基((NH₄)₂SO₄ 5g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，CaCl₂ 0.2g/L，葡聚糖1％，1.5％琼脂糖，pH 2.5)平板上，30℃培养5～6d，在产酶培养基平板可见透明圈产生。证明其具有葡聚糖酶活性。

嗜酸真菌Bispora sp.MEY-1，于2008年5月19日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCC No.2500。

实施例2嗜酸真菌Bispora sp.MEY-1葡聚糖酶编码基因glu7A的克隆

提取嗜酸真菌Bispora sp.MEY-1基因组DNA：

将液体培养3天的菌丝体用无菌滤纸过滤放入研钵中，加入2mL提取液，研磨5min，然后将研磨液置于50mL离心管中，65℃水浴锅裂解20min，每隔10min混匀一次，在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下10000rpm离心10min。弃上清，沉淀用70％的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20℃备用。

根据葡聚糖酶基因的保守序列设计合成了简并引物P1：5′-ggYTACTgYgAYgCNCARTg-3′；和P2：5′-TAgggRTTgAANCCRCANCC-3′。以嗜酸真菌Bispora sp.MEY-1总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性3min；然后94℃变性30sec，46℃退火30sec，72℃延伸1min，32个循环后72℃保温10min。得到一约280bp片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体相连测序。

根据测序得到的核甘酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物：设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在sp1的内侧，sp3位于sp2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般22～30nt，退火温度在60～65℃。并将它们分别命名为usp1，usp2，usp3(上游特异性引物)，dsp1，dsp2，dsp3(下游特异性引物)见表1。

表1.葡聚糖酶编码基因glu7A TAIL-PCR特异性引物

通过TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。结果获得全长1341bp的基因。

实施例3葡聚糖酶基因的RT-PCR分析

提取Bispora sp.MEY-1的总RNA，利用反转录酶得到cDNA的一条链，然后设计恰当的引物(glu7AF：5′-ATGGCAGTGTTCACTCTGACCGTGG-3′，glu7AR：5′-CTAATTCCAACCGCCAGAGCC-3′)扩增该单链cDNA，获得编码葡聚糖酶的cDNA序列，扩增得到产物回收后测序。

通过比较葡聚糖酶glu7A的基因组序列和cDNA序列后发现该基因有1个60bp内含子，cDNA全长1281bp，编码427氨基酸，N端前19个氨基酸为可能的信号肽序列。BLAST比对结果表明，其与Aspergillus oryzae来源的endo-1，4-beta-glucanase的序列相似性最高。氨基酸最高相似性为58％；核苷酸最高相似性为60.3％。证明从Bispora sp.MEY-1中分离克隆得到的编码葡聚糖酶的基因为新基因。

实施例4重组葡聚糖酶的制备。

将表达载体pPIC9进行双酶切(EcoRI+NotI)，同时将编码葡聚糖酶的基因glu7A双酶切(EcoRI+NotI)，切出编码成熟葡聚糖酶的基因片段与表达载体pPIC9连接，获得含有Bispora sp.MEY-1葡聚糖酶基因glu7A的重组质粒pPIC-glu7A并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/glu7A。

取含有重组质粒的GS115菌株，接种于400mL BMGY培养液中，30℃250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于200mL BMMY培养基重悬，30℃250rpm振荡培养。诱导48h后，离心收集上清。测定葡聚糖酶的活力。重组葡聚糖酶的表达量为95U/mL。SDS-PAGE结果(图1)表明，重组葡聚糖酶在毕赤酵母中得到了表达。

将培养液10000rpm离心10分钟除去菌体，取上清液作为粗酶液，将粗酶液置于冰浴中，边搅拌边缓慢加入硫酸铵至80％，13000rpm离心20min，取沉淀，用缓冲液重新溶解，得到浓缩酶液，进一步用HPLC(

FPLC，Pharmacia公司)纯化。经硫酸铵沉淀后上HiTrap_Q_Sepharose_XL(Amersham Pharmacia Biotech预装柱)阴离子柱。加样2mL，先用pH8.0，0.02mol/L的Tris-HCl缓冲溶液洗脱平衡柱子，然后用相同缓冲液配制的0～0.6mol/LNaCl梯度洗脱10个柱床(约50mL)，流速为5mL/min，分部收集，每管1mL。然后对收集管中的溶液测酶活及蛋白电泳分析。图1显示得到了电泳纯β-葡聚糖酶。所表达的葡聚糖酶经过纯化之后，其蛋白质的含量达到总蛋白的90％以上。

实施例5β-葡聚糖酶的酶活性测定

酶学测定采用国际通用的DNS(3，5-二硝基水杨酸)法，将0.45ml 1％的可溶性地衣多糖(Sigma公司)或其他底物溶液加入试管，放入60℃水浴中预热3min。再将0.05ml已经稀释好的酶液加入到试管中，继续在60℃水浴中反应10min，向试管中加入2ml DNS试剂终止反应，将试管在沸水中加热5min，立即用流水冷却到室温，显色，室温下放置10min，540nm处测吸光值。对照为先将0.05ml酶液加入到0.2ml柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，在100℃沸水中煮20分钟灭活，再加入同体积的底物保温。

β-葡聚糖酶活性单位定义：在一定条件下，每分钟分解葡聚糖生成1μmol还原糖所需的酶量为1个活性单位(U)。

实施例6重组β-葡聚糖酶的酶学性质分析

将实施例4所纯化的β-葡聚糖酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为pH1.0-3.5的HCl-Gly缓冲液，pH2.2～8.0的柠檬酸-磷酸氢二钠系列缓冲液及pH8.0～10.0Tris-HCl系列缓冲液。纯化的β-葡聚糖酶在不同pH的缓冲体系，37℃下测定的pH适性结果(图2)表明：GLU7A的最适pH为1.5和5.0。将酶液在不同pH值的缓冲液中于37℃下处理30min，再测定酶活性以研究酶的pH稳定性。结果表明(图3)，在pH1.0～8.0之间保持最适pH下酶活的80％以上，这说明此酶具有较好的pH稳定性。

最适温度的测定在柠檬酸-磷酸氢二钠(pH5.0)缓冲体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为在不同温度下处理30min，再进行酶活测定。酶反应最适温度测定结果(图4)表明，GLU7A最适温度为60℃。酶的热稳定性试验表明(图5)，在60℃下保温45min，活性没有损失。在70℃下保温2min，剩余酶活性为80％左右。说明此酶具有较好的耐热性。

在β-葡聚糖酶溶液中加入0.05mL胰蛋白酶(0.1mg/mL，用pH7.0、Tris-HCl缓冲液配制)，和胃蛋白酶(0.1mg/mL，用pH2.0、甘氨酸-HCl缓冲液配制)于37℃处理60min，稀释后再测定酶活性。用蛋白酶分别处理60min后，剩余100％的酶活性(图6)。说明β-葡聚糖酶具有较好的抗蛋白酶水解的能力。

实施例7本发明β-葡聚糖酶的底物特异性

将不同的底物用柠檬酸-磷酸氢二钠(pH6.5)缓冲液溶解浓度为0.5％。在酶反应最适温度和最适pH值下，测定本发明β-葡聚糖酶对不同底物的作用。结果表明，本发明β-葡聚糖酶可作用于由β-1，3-1，4葡萄糖苷键连接的大麦葡聚糖、地衣多糖，和β-1，4葡萄糖苷键连接的甲基纤维素，且对β-1，3葡萄糖苷键连接的昆布多糖和木聚糖也具有水解能力。说明该酶具有多功能活性。

表2本发明β-葡聚糖酶的底物特异性

序列表

<110>中国农业科学院饲料研究所

<120>一种嗜酸β-葡聚糖酶GLU7A及其基因和应用

<160>3

<210>1

<211>426

<212>PRT

<213>嗜酸真菌(Bispora sp.MEY-1)

<400>1

MAVFTLTVAI ITIIRFASSQ QIGRIPEVHP RLTTQTCTKH GCTTQQTSLVLDALSHPIDD            60

IHTNESCETS SGGVNTTICP TVEVCAENCA LEGVNYASHG VYTNGDSVTLRQYLNIDGTE           120

EEVSPRVYLL DPSGRDYEIL KLLNQEISFT VDVSNLPCGM NGALYLTSMDASGGRSQLNP           180

AGATYGTGYC DAQCNAPAWI NGVANLKGLG ACCSEMDLWE ANSEATQLTPHACNVTGFYE           240

CSGAACGSNG VCDKDGCGFN PYGLGDHSFY GPSVTDTIDT KKPFTVVTQFLTSDGTSTGT           300

LSQIRRLYLQ NGKVIQNAKV DFDNSTLDSI TPAYCEATAA TFEAEGGFPQMGKALEMGMV           360

LIFSIWNDPS AFMNWLDSGT AGPCNSTQGN PALIEAENPG TSVTFSNIKWGDIGTTYSGS           420

GSGGWN           426

<210>2

<211>1341

<212>DNA

<213>嗜酸真菌(Bispora sp.MEY-1)

<400>2

atggcagtgt tcactctgac cgtggctatt ataacgatca tccggtttgc ctcttctcag     60

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actagtgtta ccttctcaaa tatcaagtgg ggagatattg gaacaaccta ctctggctct   1320

ggctctggcg gttggaatta g                                             1341

<210>3

<211>1281

<212>DNA

<213>嗜酸真菌(Bispora sp.MEY-1)

<400>3

atggcagtgt tcactctgac cgtggctatt ataacgatca tccggtttgc ctcttctcag     60

cagattggtc gcataccaga agttcatcca aggctcacca cacagacgtg caccaagcac    120

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actagtgtta ccttctcaaa tatcaagtgg ggagatattg gaacaaccta ctctggctct   1260

ggctctggcg gttggaatta g                                             1281

Claims (10)

1.一种嗜酸β-葡聚糖酶GLU7A，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种嗜酸β-葡聚糖酶基因glu7A，其特征在于，编码权利要求1所述的嗜酸β-葡聚糖酶GLU7A。

3.如权利要求2所述的嗜酸β-葡聚糖酶基因glu7A，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

4.如权利要求2所述的嗜酸β-葡聚糖酶基因GLU7A，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.3所示。

5.包含权利要求2、3或4所述嗜酸β-葡聚糖酶基因glu7A的重组载体。

6.包含权利要求2、3或4所述嗜酸β-葡聚糖酶基因glu7A的重组载体pPIC-glu7A。

7.包含权利要求2、3或4所述嗜酸β-葡聚糖酶基因glu7A的重组菌株。

8.如权利要求7的重组菌株，其特征在于，所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。

9.一种制备嗜酸β-葡聚糖酶GLU7A的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用权利要求5的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组葡聚糖酶表达；以及

3)回收并纯化所表达的β-葡聚糖酶GLU7A。

10.权利要求1所述嗜酸β-葡聚糖酶GLU7A的应用。

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