CN102477438A - 含重组基因的酸性β-葡聚糖酶及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明揭示了一种来源于芽孢杆菌属细菌Bacillus sp.013的酸性β-葡聚糖酶编码基因bgl013，其核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO：1。利用基因bgl013构建的重组微生物表达产生的重组β-葡聚糖酶，其氨基酸序列为序列表中的SEQ ID NO：2。利用本发明获得的酸性β-葡聚糖酶编码基因构建重组微生物，可实现酸性β-葡聚糖酶的高效率生产，该酸性β-葡聚糖酶在生产啤酒的麦汁糖化过程中具有降低麦汁粘度的功效。
Description
技术领域
本发明涉及一种含重组基因的酸性β-葡聚糖酶及其用途，属于微生物、酶工程技术领域。
背景技术
我国2009年啤酒产量达4236万吨，据世界第一。由于规模大，啤酒行业的节能减排对我国整体二氧化碳减排和环境保护具有重要意义。啤酒行业由于本身的特点是一个能耗较大的行业，因此啤酒生产节能减排技术具有特别重要的意义，而β-葡聚糖酶的应用对啤酒生产中糖化液过滤过程的节能减排具有很大作用。大麦胚乳细胞壁的主要成分为半纤维素和大麦胶(由β-葡聚糖组成，约占大麦的5～8％)。传统的麦汁制备工艺主要利用麦芽本身含有的β-葡聚糖酶来降解细胞壁，但是这种内源性β-葡聚糖酶活性低而且不稳定，利用传统工艺进行麦汁糖化时大量残留的β-葡聚糖会使麦汁粘度上升，增加糖化液及啤酒过滤过程中的能量消耗、降低原料利用率并增加啤酒厂的废物排放。近年来社会和企业对节能和减排日趋重视，一些啤酒厂开始利用外源添加β-葡聚糖酶的方式来改善麦汁的过滤性能，以达到节能减排的目标。生产实践证明，如在制麦过程中添加足够量的β-葡聚糖酶处理麦汁，糖化液过滤过程中的能量消耗和废物排放可以减少近一半。目前，β-葡聚糖酶的生产均采用微生物发酵法，菌种主要有绿色木霉、解淀粉芽孢杆菌和多粘芽孢杆菌。其中以绿色木霉为代表的真菌产生的β-葡聚糖酶耐酸性能比较好，但由于真菌基因表达调控比较复杂，因此产酶水平的提高有一定的困难，目前市场上真菌来源的β-葡聚糖酶的价格较高。芽孢杆菌来源的β-葡聚糖酶在耐酸性方面不如真菌来源的产品，但开发芽孢杆菌来源的β-葡聚糖酶基因资源具有重要的意义，一个重要原因是这一类基因易于在芽孢杆菌宿主菌中实现高效分泌表达。芽孢杆菌的多个种，如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等长期以来被用于酶制剂的生产，是一类被公认为食品安全的微生物，同时许多用于酶制剂生产的芽孢杆菌中控制酶基因表达的启动子和信号肽被成功用于外源基因分泌表达系统的构建，并已获得了多个有效的表达系统。由于芽孢杆菌是一种原核生物其基因调控相比于真菌来讲要简单得多，因此利用芽孢杆菌表达系统实现基因的高效分泌表达比较容易实现。在啤酒生产中β-葡聚糖酶主要应用于麦汁糖化过程，这一工艺中麦汁的pH值一般控制在4.5左右，而目前芽孢杆菌来源的β-葡聚糖酶的最适pH一般均接近中性，很难适应麦汁糖化工艺的要求，因此开发来源于芽孢杆菌的耐酸性β-葡聚糖酶具有重要的应用价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：利用基因重组技术从酸性β-葡聚糖酶产生菌基因组DNA中克隆β-葡聚糖酶编码基因并确认其功能，从而提供一种来源于芽孢杆菌的酸性β-葡聚糖酶编码基因，并且利用基因重组技术生产出含有该重组基因的酸性β-葡聚糖酶，使之用于啤酒生产过程中的麦汁糖化。
本发明的技术解决方案是，一种含重组基因的酸性β-葡聚糖酶，其特征在于：该酸性β-葡聚糖酶包含来源于芽孢杆菌的酸性β-葡聚糖酶编码基因，所述芽孢杆菌是芽孢杆菌属细菌Bacillus sp.013，所述酸性β-葡聚糖酶编码基因是bgl013，其核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO：1，所述酸性β-葡聚糖酶的氨基酸序列为序列表中的SEQ ID NO：2。
进一步地，上述酸性β-葡聚糖酶编码基因bgl013与克隆载体pMD18-TSimple组成的重组质粒pMD-bgl013的大肠杆菌转化子是JM109/pMD-bgl013。
上述含重组基因的酸性β-葡聚糖酶的用途是，在啤酒生产过程中用于麦汁的糖化，糖化时pH为4.5，温度为60℃。
本发明的有益效果是：利用本发明获得的酸性β-葡聚糖酶编码基因构建重组微生物，可实现酸性β-葡聚糖酶的高效率生产，该酸性β-葡聚糖酶可应用于啤酒生产的麦汁糖化工艺，有利于降低麦汁粘度并使麦汁澄清。
具体实施方式
本发明从自然界中筛选到一株具有β-葡聚糖降解能力的芽孢杆菌，其编号为Bacillus sp.013，利用基因工程技术从Bacillus sp.013基因组DNA中克隆出一条β-葡聚糖酶编码基因，命名为bgl013，其核苷酸序列为序列表中的SEQ IDNO：1，其编码的酸性β-葡聚糖酶原酶的氨基酸序列为序列表中的SEQ ID NO：2，基因bgl013与克隆载体pMD18-T Simple组成的重组质粒pMD-bgl013的大肠杆菌转化子，分类命名为JM109/pMD-bgl013。所述酸性β-葡聚糖酶已经经过功能鉴定证实，它在最适作用温度为60℃、最适作用pH为4.5环境下的性能，适合于麦汁糖化工艺的要求。
所述酸性β-葡聚糖酶编码基因bgl013的获得方法如下：
(1)从自然界筛选产酸性β-葡聚糖酶的芽孢杆菌：从自然界采集土样，采用高温处理杀死营养体细胞，富集芽孢杆菌。在以β-葡聚糖为唯一碳源的培养基上富集产β-葡聚糖酶细菌。进一步通过摇瓶培养和β-葡聚糖酶酶活检测筛选产β-葡聚糖酶的细菌。用16s rDNA基因序列分析确认所筛选微生物属于芽孢杆菌属。此轮工作选定芽孢杆菌Bacillus sp.013为β-葡聚糖酶基因克隆研究的出发菌。
(2)Bacillus sp.013β-葡聚糖酶基因的克隆：
第一步：获得Bacillus sp.013β-葡聚糖酶基因部分核苷酸序列
根据细菌β-葡聚糖酶基因保守区设计一对简并引物，以Bacillus sp.013染色体DNA为模板进行PCR扩增获得Bacillus sp.013β-葡聚糖酶基因部分DNA片段。测序获得Bacillus sp.013β-葡聚糖酶基因部分片段的序列，并根据所获DNA序列设计一对反向PCR引物。
第二步：利用反向PCR技术获得Bacillus sp.013β-葡聚糖酶编码基因的完整序列
利用上一步设计的一对反向PCR引物，通过PCR获得普β-葡聚糖酶编码基因编码区完整DNA片段，该片段与克隆载体pMD18-T Simple连接，转化大肠杆菌JM109，在含氨苄青霉素的LB平板上筛选转化子。从获得的转化子中提取质粒测序，并将所获序列与已经获得序列的片段比对，获得β-葡聚糖酶编码基因的完整序列，即SEQ ID NO：1。
第三步：获得Bacillus sp.013β-葡聚糖酶编码基因
根据SEQ ID NO：1再设计一对引物以扩增Bacillus sp.013β-葡聚糖酶编码区完整基因，以Bacillus sp.013染色体DNA为模板，PCR扩增获得一0.8kb左右的DNA片段，扩增片段纯化后与克隆载体pMD18-T Simple连接，转化大肠杆菌JM109，在含氨苄青霉素的LB平板上筛选转化子。从获得的转化子中提取质粒测序，获得β-葡聚糖酶编码基因编码区完整序列，该基因命名为bgl013，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1，其编码的β-葡聚糖酶原酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。基因bgl013与克隆载体pMD18-T Simple组成的重组质粒pMD-bgl013的大肠杆菌转化子，其分类命名为JM109/pMD-bgl013。
(3)β-葡聚糖酶基因的表达及重组酶功能分析
以含有bgl013基因的重组质粒pMD-bgl013为模板，设计一对引物扩增bgl013基因的成熟肽编码区，扩增产物与大肠杆菌表达载体pET28a连接，重组质粒命名为pET-bgl013。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-bgl013。重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-bgl013在IPTG诱导下表达出有活性的β-葡聚糖酶。重组酶最适pH为4.5，最适作用温度为60℃，是一种酸性β-葡聚糖酶。含pET28a空质粒的转化子破碎液没有淀粉酶酶活，可见上述克隆得到的基因确实为β-葡聚糖酶编码基因。
基因bgl013的应用
β-葡聚糖酶编码基因bgl013能用于在不同宿主细胞中进行异源表达，表达产物用于β-葡聚糖的降解，重组酶适合在啤酒生产中用于麦汁糖化工艺，有利于降低麦汁粘度并使麦汁澄清。
下面通过具体实施例，对本发明技术方案作进一步的详细描述。
(一)产酸性β-葡聚糖酶芽孢杆菌Bacillus sp.013的获得
从自然界筛选产β-葡聚糖酶的芽孢杆菌：从无锡市大浮茶场附近采集pH 4左右的酸性土样，在保鲜袋中常温保存。在实验室中，将上述土样放入烧杯中，加5倍双蒸水，混匀后在100℃保温1小时。取少量上述混合液涂布以β-葡聚糖为唯一碳源的固体培养基平板，37℃培养三天，共获得372个菌落，显微镜观察确定其中86株为杆状细菌。将上述杆状细菌的菌落分别划线分离后以单菌落接种发酵培养基，摇瓶培养2天后取上清液检测β-葡聚糖酶酶活，其中3株菌培养液中检测到明显的β-葡聚糖酶活性。分别进行细菌的16s rDNA基因序列分析，其中编号为013的细菌的16s rDNA基因部分序列为SEQ IDNO：3，利用BLAST软件将SEQ ID NO：3与美国国家生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov，简称NCBI)收录的基因序列进行比对，结果显示SEQ ID NO：3与Bacillus cereus strain S09053的16s rDNA基因序列(NCBI登录号：HQ224510)最为接近，相似性为81％。根据以上实验结果，013细菌应属于芽孢杆菌属，命名为Bacillus sp.013。Bacillus sp.013被用于下一步实验。
(二)Bacillus sp.013β-葡聚糖酶基因的克隆：
第一步：获得Bacillus sp.013β-葡聚糖酶基因部分核苷酸序列
根据细菌β-葡聚糖酶基因保守区设计一对简并引物：
5’-AACTC(ATGC)GG(TG)TT(TC)TGG-3’(SEQ ID NO：4)
5’-CCA(AG)TC(AG)AA(ATGC)GC(AG)TA-3’(SEQ ID NO：5)
以Bacillus sp.013染色体DNA为模板进行PCR扩增获得一0.4kb左右的扩增片段。将扩增产物纯化后与克隆载体pMD18-T Simple连接，获得的重组质粒进行序列分析，结果显示所获PCR产物全长405bp，其核苷酸序列与Bacillus amyloliquefaciens来源的β-葡聚糖酶基因的部分序列相似性高达71％，这一结果显示，上述PCR获得的片段是β-葡聚糖酶编码基因的一部分。
第二步：获得Bacillus sp.013β-葡聚糖酶编码基因的完整序列
根据第一步所获Bacillus sp.013β-葡聚糖酶编码基因部分片段核苷酸序列设计一对反向PCR引物：
5’-ACGAGAAGATTGTAGATGC-3’(SEQ ID NO：6)
5’-TGATGAAAATACGGATACG-3’(SEQ ID NO：7)
然后利用反向PCR技术克隆Bacillus sp.013普鲁兰酶基因完整编码区。
取Bacillus sp.013染色体DNA约10μg，溶于100μL双蒸水中。在上述DNA溶液中加入11μL酶切缓冲液和1μL限制性内切酶Hind III，37℃酶切2小时后用柱式DNA片段回收试剂盒回收经酶切的DNA片段。取上述回收的含DNA片段的溶液44μL，加入连接反应缓冲液5μL，连接酶1μL，16℃连接过夜。以上述连接产物为模板，利用反向PCR引物进行PCR扩增，电泳结果显示，反向PCR获得一2.2kb左右的扩增片段，将上述扩增片段分离后与克隆载体pMD-18T Simple连接，重组质粒进行序列分析，并将所获序列与已经获得序列的片段比对，获得β-葡聚糖酶编码基因的完整序列，即SEQ ID NO：1。
第三步：获得Bacillus sp.013β-葡聚糖酶编码基因
根据SEQ ID NO：1序列再设计一对引物以扩增Bacillus sp.013β-葡聚糖酶编码区完整基因，引物序列如下：
5’-ATGTTCTATCGTAAACGAAT-3’(SEQ ID NO：8)
5’-TTATTTTTTAATATAGCGTAG-3’(SEQ ID NO：9)
以Bacillus sp.013染色体DNA为模板，PCR扩增获得一0.8kb左右的DNA片段，扩增片段纯化后与克隆载体pMD18-T Simple连接，转化大肠杆菌JM109，在含氨苄青霉素的LB平板上筛选转化子。从获得的转化子中提取质粒测序，获得β-葡聚糖酶编码基因编码区完整序列。将上述β-葡聚糖酶编码区基因序列提交美国国家生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov，简称NCBI)，利用blast软件进行序列比对，结果显示，该基因核苷酸序列与Bacillus amyloliquefaciens strain TB2来源的β-葡聚糖酶基因编码区序列(NCBI登录号：EU368224)相似性最高，相似性为高达65％，这一结果显示，上述PCR获得的片段是β-葡聚糖酶编码基因的一部分该基因命名为bgl013，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1，其编码的β-葡聚糖酶原酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。基因bgl013与克隆载体pMD18-T Simple组成的重组质粒pMD-bgl013的大肠杆菌转化子，其分类命名为JM109/pMD-bgl013。
(三)β-葡聚糖酶基因的表达及重组酶功能分析
以含有bgl013基因的重组质粒pMD-bgl013为模板，用引物：
5’-AATGAATTCTCTGCTGCATCAGCTCAGAC-3’(SEQ ID NO：10)
5’-AATAAGCTTTTATTTTTTAATATAGCGTAG-3’(SEQ ID NO：11)
进行PCR扩增，获得bgl013基因的成熟肽编码区，用限制性核酸内切酶EcoR I和Hind III酶切后与经相同酶切的大肠杆菌表达载体pET28a连接，连接物转化大肠杆菌JM109，在含50μg/mL卡那霉素的LB平板上筛选转化子。任选4个转化子，提取质粒后用EcoR I和Hind III酶切质粒并电泳鉴定，结果显示，4个质粒酶切后均产生两条带，一条为5.2kb与pET28a载体大小相当，另一条为0.7kb与PCR获得的Bacillus sp.013β-葡聚糖酶基因相当，可见均为pET28a与所获β-葡聚糖酶基因的重组质粒。重组质粒命名为pET-bgl013。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-bgl013。重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-bgl013在LB液体培养基中摇瓶培养至培养液浑浊度为OD600＝0.8时加入IPTG至终浓度为0.5mg/mL，继续培养4小时后培养液用超声波处理破碎细胞。作为对照，用空质粒pET28a转化大肠杆菌BL21(DE3)获得的重组菌BL21(DE3)/pET28a也同样培养并进行细胞破碎。对细胞破碎液检测β-葡聚糖酶酶活力，结果显示重组菌BL21(DE3)/pET-bgl013的细胞破碎液有明显的β-葡聚糖酶活力，酶活约为120U/mL。而重组菌BL21(DE3)/pET28a的细胞破碎液β-葡聚糖酶活力为0。可见，基因bgl013成熟肽编码基因的表达产物具有β-葡聚糖降解活性。
(四)基因bgl013的应用
β-葡聚糖酶编码基因bgl013能用于在不同宿主细胞中进行异源表达，表达产物用于β-葡聚糖的降解，有利于啤酒生产中麦汁粘度的降低。β-葡聚糖酶最适作用温度为60℃，最适作用pH为4.5，性能适合于麦汁糖化工艺的要求。
材料和方法
普通分子生物学方法：
除非提及，DNA操作和转化按照标准的分子生物学方法进行(Sambrook等1989分子克隆实验手册)。
除非另外提及，PCR操作使用标准方法和PCR反应数据进行，可参见(Sambrook等1989分子克隆实验手册)。
DNA操作所使用的酶根据供应商的说明书使用。
引物均为本专利发明人设计并由上海生工生物工程有限公司合成。
反向PCR技术参照文献进行[Ochman H，Gerber AS and Hartl DL(1988)Genetic applications of an inverse polymerase chain reaction.Genetics 120：621-623]。
克隆载体pMD18-T Simple为大连宝生物工程有限公司产品，产品编号为D506A。
大肠杆菌JM109为大连宝生物工程有限公司产品，大肠杆菌表达载体pET28a为Novagen公司产品。
DNA操作使用的酶和试剂盒
除非另外提及，所有DNA操作使用的酶，例如限制性内切酶，连接酶等均为大连宝生物工程有限公司产品。PCR反应使用的DNA聚合酶为大连宝生物工程有限公司产品Ex Taq，产品编号为DRR006A。所有DNA操作使用的酶在反应时所使用的缓冲液均为购买酶时附赠，缓冲液浓度均为反应所需浓度的10倍。柱式DNA片段回收试剂盒以及从电泳凝胶中回收DNA片段的试剂盒均为大连宝生物工程有限公司产品，产品编号分别为DV807A和DV805A，DNA纯化以及从琼脂糖凝胶中回收DNA的方法均按上述试剂盒说明书操作。细菌基因组DNA小量提取试剂盒为上海华舜生物工程有限公司产品，细菌基因组DNA提取方法按上述试剂盒说明书进行。
其它试剂
β-葡聚糖为爱尔兰Megazyme公司产品(产品编号为P-BGBH)，酵母氮基为Difco公司O/O型酵母氮基，该产品不含碳源和氨基酸。酶活检测用的葡聚糖溶液均采用10mM的磷酸缓冲液配制，磷酸缓冲液使用双蒸水配制，不同pH的磷酸缓冲液按文献(诸葛健王正祥编著：工业微生物实验技术手册.北京：中国轻工业出版社，1994：682～683.)介绍的方法配制。诱导大肠杆菌基因表达使用的IPTG为宝生物工程有限公司产品，产品编号为D9030A。
培养基
LB在“Sambrook等1989分子克隆实验手册”中描述。以葡聚糖为唯一碳源的固体培养基：酵母氮基1g/L，葡聚糖0.5g/L，琼脂粉15g/L，用双蒸水配制。
细菌的16s rDNA基因序列分析
按文献进行[陈源源，牛丹丹，王正祥.一种快速鉴定细菌的方法.食品与发酵工业，2007，33(5)：29-31]。
β-葡聚糖酶酶活力测定
按文献[姜锡瑞等.新编酶制剂实用技术手册.2002，北京：轻工业出版社]介绍的方法进行。
Claims (3)
1.含重组基因的酸性β-葡聚糖酶，其特征在于：该酸性β-葡聚糖酶包含来源于芽孢杆菌的酸性β-葡聚糖酶编码基因，所述芽孢杆菌是芽孢杆菌属细菌Bacillus sp.013，所述酸性β-葡聚糖酶编码基因是bgl013，其核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO：1，所述酸性β-葡聚糖酶的氨基酸序列为序列表中的SEQID NO：2。
2.根据权利要求1所述的含重组基因的酸性β-葡聚糖酶，其特征在于：所述酸性β-葡聚糖酶编码基因bgl013与克隆载体pMD18-T Simple组成的重组质粒pMD-bgl013的大肠杆菌转化子是JM109/pMD-bgl013。
3.权利要求1所述的含重组基因的酸性β-葡聚糖酶的用途，其特征在于：所述酸性β-葡聚糖酶在啤酒生产中用于麦汁的糖化，糖化时pH为4.5，温度为60℃。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120530 |