CN109321586B

CN109321586B - 黑曲霉葡萄糖氧化酶优化基因及其表达载体和应用

Info

Publication number: CN109321586B
Application number: CN201811304241.XA
Authority: CN
Inventors: 张宇宏; 张伟; 张艳丽
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2018-11-03
Filing date: 2018-11-03
Publication date: 2022-02-25
Anticipated expiration: 2038-11-03
Also published as: CN109321586A

Abstract

本发明公开了葡萄糖氧化酶优化基因及其表达载体和应用。本发明将黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶基因在不改变蛋白质氨基酸序列的前提下，采用包括密码子使用频率，不同基因区域GC含量的分布，密码子适应指数CAI，mRNA结构优化，5’mRNA自由能优化，不稳定序列的删除等多策略方式进行优化；毕赤酵母表达结果发现，优化后的AGOD‑m3以及AGOD‑m5这两条基因能够提高酶蛋白在毕赤酵母中的分泌表达量，其中，AGOD‑m3在毕赤酵母中的分泌表达量提高尤为显著、酶活力也最强。本发明进一步提供了含有所述优化基因的重组表达载体及其在制备葡萄糖氧化酶中的应用。本发明为葡萄糖氧化酶的大规模工业化生产奠定了基础。

Description

黑曲霉葡萄糖氧化酶优化基因及其表达载体和应用

技术领域

本发明涉及优化的葡萄糖氧化酶基因以及含有所述黑曲霉葡萄糖氧化酶优化基因的重组表达载体和重组宿主细胞，本发明进一步涉及该黑曲霉葡萄糖氧化酶优化基因在制备葡萄糖氧化酶中的应用，属于葡萄糖氧化酶基因工程领域。

背景技术

葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase，简称GOD，EC 1.1.3.4)在有氧条件下，能够专一性地将β-D-葡萄糖氧化为葡萄糖酸內酯和过氧化氢。GOD能够除氧、产酸、杀菌、去除葡萄糖，因而在食品、医药、饲料、化学等行业具有广泛应用。

GOD在医药领域主要作为血糖检测器中的工具酶，其用于新型生物传感器使血糖、尿糖测定更加快速、简便，这对于糖尿病的早期诊断和血糖日常监测控制具有重大意义。

在饲料行业，GOD在禽类饲料、猪用饲料、牛羊饲料中均得到了良好的应用，鸡用配合饲料中添加GOD提高了肉鸡的存活率、采食量，调控了蛋鸡的产蛋性能，能够预防大肠杆菌引发的腹泻。在猪用配合饲料中添加GOD可减少母猪围产期综合征，提高断奶仔猪日增重。牛羊配合饲料中添加GOD可消除奶牛围产期食欲减退、促进对饲料的消化吸收。

在食品领域，GOD能将葡萄糖氧化生成葡萄糖酸和H₂O₂，后者可氧化面筋蛋白中的巯基生成二硫键，从而大大改善面筋的组织结构，能够替代对人体有毒害作用的面粉添加剂溴酸钾。同时，GOD能够消耗残留的葡萄糖和氧气，防止了美拉德反应，生成的过氧化氢还具有杀菌作用，从而延长了食品的货架期。

在纺织行业，通过GOD催化上游脱浆和生物脱胶过程产生的葡萄糖生成过氧化氢用于漂白是目前最有应用前景的方法，与标准漂白工艺相当。

在工业生产领域，葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶共催化法制备葡萄糖酸转化效率高，成本低，工业催化开始大规模应用。葡萄糖酸进一步还可以生成葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钙等，在建筑、化工、食品、医药等行业具有广泛的用途。

目前文献报道的大部分GOD是由真菌微生物产生的，尤其是曲霉属和黑曲霉属。天然霉菌菌株生产GOD产量低，并且常常伴有纤维素酶等杂蛋白的产生，这使得后期分离纯化困难，大大增加了工业生产的成本。

随着基因工程技术的迅猛发展，重组菌株表达GOD成为了科研人员的研究热点。在过去的20多年中，毕赤酵母已经发展成为使用最多、最广泛、最具有发展前景的异源蛋白表达系统之一，该表达系统具有很多优点：其含有甲醇诱导的强启动子AOX1；操作技术简单、遗传稳定；具有将外源蛋白分泌到胞外的信号肽，方便了后期的分离纯化；作为真核生物，具有许多真核蛋白翻译后修饰的能力；发酵培养基成本低廉、设备简单、适合高密度生长。

然而，毕赤酵母能否高效表达外源蛋白有很多影响因素，除了常见的启动子、信号肽等影响因素外，外源蛋白的表达量在很大程度上仍取决于基因本身的特性。通常提高外源基因在毕赤酵母中的分泌表达的策略有密码子优化、GC含量调整等策略。其中，优化外源基因的密码子是主要的手段(聂东宋，梁宋平.外源蛋白在巴氏毕赤酵母中高效表达的策略，吉首大学学报.2001，22，(3)，40-44)。研究发现物种具有密码子偏爱性，即不同物种对密码子的使用频率是不同的，有些密码子甚至从来不使用，那些不经常使用甚至从不使用的密码子称为稀有密码子或非偏爱型密码子。非偏爱型密码子形成的原因主要是细胞内缺乏识别这些密码子的tRNA。对于不同的表达系统如毕赤酵母和大肠杆菌，其密码子偏好性是不同的。若外源基因含有较多的宿主菌非偏爱型密码子，尤其是连续出现的话，将会严重影响其在宿主菌中的表达量。为了消除稀有密码子对蛋白表达量的影响，可采用对异源基因的密码子进行优化来实现，即在不改变外源基因氨基酸序列的情况下，将外源基因中的稀有密码子替换为宿主常用的密码子。不同来源的酶蛋白外源基因经密码子优化后其在毕赤酵母中的表达量提高程度差别很大，例如：Yang J等通过密码子优化使得黑曲霉来源脂肪酶基因在毕赤酵母中得到高效表达，相比原始基因，酶活提高了11.6倍，蛋白表达量提高了5.3倍(Yang J.,Liu L.Codon optimization through a two-step gene synthesisleads to a high-level expression of Aspergillus niger lip2gene in Pichiapastoris[J].Journal of Molecular Catalysis B Enzymatic.2010,63(3):164-169.)。Teng等通过优化β-1,3-1,4葡聚糖酶的密码子组成，使其在毕赤酵母中的表达量提高10倍(Teng D,et al.，Codon optimization of Bacillus licheniformis beta-1,3-1,4-glucanase gene and its expression in Pichia pastoris.Appl MicrobiolBiotechnol,2007,74:1074-1083)。但事实上仍然存在很多相反的情况，基因经密码子优化后其表达水平可能会下降，只是这种研究案例通常难以公开发表。也有研究人员对密码子与表达水平的关系持有不同意见(Henry Ian,et al.,Predicting gene expressionlevel from codon usage bias[J].Mol Biol Evol,2007,24(1):10-12.)，甚至有研究表明并非所有的稀有密码子都会降低表达水平(Chinnathambi T.et al.,Rare codonpriority and its position specificity at the 5'of the gene modulatesheterologous protein expression in Escherichia coli[J].Biochem Biophys ResCommun,2008,376(4):647-652.)。因此，简单将稀有密码子优化替换为常用密码子并不能总是提高表达水平，还须辅以其他多种技术手段进行综合考量，如GC含量在不同基因区域的分布比例,密码子适应指数(codon adaptation index，CAI)，mRNA结构尤其是5’端mRNA自由能等，并进行大批量的验证，才能得到高效表达的突变基因。

目前已知文献报道的葡萄糖氧化酶基因在酵母中的分泌表达量最高仅为1972U/ml(Gu L.,et al.,Multivariate modular engineering of the protein secretorypathway for production of heterologous glucose oxidase in Pichia pastoris[J].Enzyme Microb Technol,2015,68(68):33-42.)；因此，现有的葡萄糖氧化酶基因存在分泌表达效率低、生产成本高等缺陷，不能满足工业大规模生产应用的需求，亟待改进。

发明内容

本发明目的之一是对葡萄糖氧化酶基因的序列进行优化，优化后的葡萄糖氧化酶基因在酵母中分泌表达量有显著提高；

本发明目的之二是提供含有上述葡萄糖氧化酶优化基因的重组表达载体以及该重组表达载体的重组宿主细胞；

本发明目的之三是将所述葡萄糖氧化酶的优化基因以及含有该优化基因的重组表达载体和重组宿主细胞应用于生产葡萄糖氧化酶。

本发明为达到以上目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明将黑曲霉(Aspergillus niger)来源的葡萄糖氧化酶基因AGOD(SEQ IDNO.1)在不改变其蛋白质氨基酸序列(SEQ ID NO.6)的前提下，综合考虑多种因素，包括不限于密码子使用频率，不同基因区域GC含量的分布，密码子适应指数CAI，mRNA结构优化，5’mRNA自由能优化，不稳定序列的删除等，对葡萄糖氧化酶基因序列进行多种策略的优化，得到4个葡萄糖氧化酶突变基因AGOD-m2、AGOD-m3、AGOD-m4和AGOD-m5，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

本发明进一步提供了含有葡萄糖氧化酶突变基因的重组表达载体以及含有该重组表达载体的宿主细胞；其中，优选的，所述重组表达载体是重组真核表达载体，更优选为重组毕赤酵母表达载体；优选的，所述的宿主细胞优选为酵母细胞，更优选为毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞。

本发明将黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶经多种策略的基因序列优化后得到的多个优化基因转入到毕赤酵母中进行表达，表达结果发现：AGOD-m3(SEQ ID NO.3)能够显著提高该酶蛋白在毕赤酵母中的分泌表达量，AGOD-m5(SEQ ID NO.5)的酶蛋白在毕赤酵母中的分泌表达也有明显的上升，优化后的AGOD-m2不能提高表达水平，AGOD-m4的表达量相比野生型基因甚至下降：

本发明将4个葡萄糖氧化酶突变基因(SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示)及葡萄糖氧化酶野生型基因(SEQ ID NO.1)按照同样的方法构建载体并分别转入到毕赤酵母中进行表达，筛选出转葡萄糖氧化酶原始基因(AGOD)和优化基因(AGOD-m2、AGOD-m3、AGOD-m4和AGOD-m5)的酵母转化子192株中，各转化子的阳性率均在55％-60％之间；其中，挑选出转AGOD的酶活最高的菌株，其在摇瓶分泌表达的葡萄糖氧化酶酶活性为22.4U/mL，而转AGOD-m2的菌株最高酶活为25.3U/mL，转AGOD-m3的菌株最高酶活为144.6U/mL，转AGOD-m4的菌株最高酶活为20.6U/mL，转AGOD-m5的菌株最高酶活为73.2U/mL。试验结果表明：转AGOD-m3的菌株的酶活显著高于转AGOD、AGOD-m2、AGOD-m4、AGOD-m5的菌株。

本发明进一步将上述5株表达水平最佳的毕赤酵母重组菌株在3L发酵罐水平诱导产酶发酵，转原基因的酵母转化子AGOD在甲醇诱导120h后葡萄糖氧化酶的活性为537.5U/mL，转AGOD-m2的酶活诱导120h后则达到了632.6U/mL，比野生型的提高了17％。而转AGOD-m3的酶活诱导120h后则达到了5200.2U/mL，达到了野生型的9.6倍。但突变基因AGOD-m4发酵水平仅为458.7U/mL，低于野生型菌株水平；AGOD-m5的发酵水平为2243.6U/mL，是野生型的4.2倍。

本发明还提供了一种制备葡萄糖氧化酶的方法，包括：将SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示的葡萄糖氧化酶优化基因可操作性的与表达载体连接得到重组表达载体；将所述重组表达载体转化宿主细胞，得到重组菌株；培养重组菌株，诱导重组葡萄糖氧化酶的表达，回收并纯化所表达的葡萄糖氧化酶，即得；

其中，所述重组表达载体是重组真核表达载体，优选为重组毕赤酵母表达载体；所述的宿主细胞优选为酵母细胞，优选为毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞。

本发明技术方案与现有技术相比具有以下有益效果：

本发明将黑曲霉(Aspergillus niger)来源的葡萄糖氧化酶基因AGOD(SEQ IDNO.1)在不改变其蛋白质氨基酸序列(SEQ ID NO.6)的前提下，综合考虑多种因素，进行多种策略的优化，包括不限于密码子使用频率，不同基因区域GC含量的分布，密码子适应指数CAI，mRNA结构优化，5’mRNA自由能优化，不稳定序列的删除等；优化后的基因在毕赤酵母中的分泌表达量显著提高，葡萄糖氧化酶生产成本有效降低，为葡萄糖氧化酶大规模的工业化应用奠定了良好的基础。

本发明所涉及的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

术语“重组宿主细胞”或“宿主细胞”意指包括外源性多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其他方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,Mol Cell.Probes8:91-98(1994))。

术语“表达”指外源基因在宿主细胞中的转录和/或翻译。

术语“转化”指将外源基因引入到宿主细胞中的方法。

术语“外源基因”指对特定的宿主细胞而言，该基因序列是属于外来的来源，或是来自相同的来源但其原始序列进行了修饰或改造。

附图说明

图1葡萄糖氧化酶原始基因AGOD密码子的使用频率。

图2优化后葡萄糖氧化酶基因AGOD-m2密码子的使用频率。

图3优化后葡萄糖氧化酶基因AGOD-m3密码子的使用频率。

图4优化后葡萄糖氧化酶基因AGOD-m4密码子的使用频率。

图5优化后葡萄糖氧化酶基因AGOD-m5密码子的使用频率。

图6葡萄糖氧化酶原始基因AGOD的mRNA 5’二级结构图。

图7优化后葡萄糖氧化酶基因AGOD-m2的mRNA 5’二级结构图。

图8优化后葡萄糖氧化酶基因AGOD-m3的mRNA 5’二级结构图。

图9优化后葡萄糖氧化酶基因AGOD-m4的mRNA 5’二级结构图。

图10优化后葡萄糖氧化酶基因AGOD-m5的mRNA 5’二级结构图。

图11酵母重组表达质粒构建示意图。

图12酵母菌株3L发酵罐中葡萄糖氧化酶酶活结果。

图13发酵液中重组葡萄糖氧化酶蛋白SDS-PAGE电泳图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

说明：

以下具体实施例中所用到重组遗传学技术均为本领域中的常规技术。在以下试验例中未作详细介绍的技术，均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分来进行，包括：Sambrook et al，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(第3版.2001)；Kriegler，Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual(1990)；Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel et al，1994)。

实施例1葡萄糖氧化酶基因的优化设计及合成

1、试验方法

1.1菌株和质粒

黑曲霉(Aspergillus niger)，由发明人本实验室保存；

大肠杆菌(Escherichia coli)菌株Trans1-T1购自北京全式金生物技术有限公司；

基因片段由南京金斯瑞生物科技公司合成。

1.2葡萄糖氧化酶基因的优化设计

根据黑曲霉中克隆获得的葡萄糖氧化酶原始基因的序列，对基因序列进行优化，此过程中主要根据以下原则：

1)不改变葡萄糖氧化酶基因AGOD所编码的氨基酸序列(SEQ ID NO.6)；

2)减少基因序列对应的mRNA的二级结构中可能存在的稳定结构区域(如发夹环)，特别是降低5’端mRNA的自由能；

3)参考密码子使用数据库(http://www.kazusa.or.jp/codon/)中的Pichiapastoris的密码子使用频率分布表，分析葡萄糖氧化酶密码子使用情况，将P.pastoris中使用频率小于15％的定义为稀有密码子，将葡萄糖氧化酶中的稀有密码子全部或部分替换为使用频率较高的密码子，并且在不同位置对某些关键氨基酸密码子的使用频率进行多种策略的变化，例如丝氨酸和精氨酸；

4)平衡葡萄糖氧化酶基因中局部AT含量，防止出现连续的高A-T含量的序列(如ATTTA、AATAAA)从而引起转录的提前终止，也防止出现连续的高G-C含量的序列；

2、试验结果

通过优化，得到4个葡萄糖氧化酶突变基因AGOD-m2、AGOD-m3、AGOD-m4和AGOD-m5，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

葡萄糖氧化酶基因序列优化前后GC含量变化如表1所示。野生型基因序列和优化序列相互之间的核苷酸序列相似性见如表2所示。野生型基因序列和优化序列对应mRNA 5’端的自由能如表3所示。野生型基因序列和优化序列的密码子适应指数如表4所示。葡萄糖氧化酶基因优化前后的密码子使用情况如图1、2、3、4、5所示。

表1葡萄糖氧化酶基因序列优化前后GC含量的变化

表2各个葡萄糖氧化酶基因之间序列相似性比较

表3野生型基因序列和优化序列对应mRNA 5’端的自由能

表4野生型基因序列和优化序列的密码子适应指数

密码子优化在提高蛋白的表达水平上有很多理论来解释，稀有密码子被替换为常用密码子是最经常使用的手段，但并非都能提高蛋白表达量，甚至还有可能降低表达量。其中一个可能的原因是优化后的基因在mRNA二级结构上发生了变化，mRNA二级结构的稳定性和复杂程度与核糖体对其的阅读速率有很大关系，且mRNA的二级结构,尤其是5’端的二级结构越简单(自由能ΔG绝对值越低)，核糖体越容易结合，蛋白的翻译越容易进行。因此仅仅关注DNA方面的密码子优化对于提高蛋白表达量仍然不够，还需要对序列优化后的mRNA二级结构和自由能进行调整。本例对野生型基因，优化基因的mRNA 5’端二级结构进行预测，结果见图6、图7、图8、图9、图10，其中AGOD-m3(SEQ ID NO.3)的mRNA二级结构自由能绝对值最低，达到-32.20kcal/mol(图8)。

实施例2葡萄糖氧化酶重组毕赤酵母菌株的构建和筛选

1、试验方法

1.1菌株和质粒

Trans1-T1大肠杆菌感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；

表达载体pPIC9和毕赤酵母受体菌株GS115为Invitrogen公司产品；

葡萄糖氧化酶原始基因序列，是以黑曲霉(Aspergillus niger)菌株基因组DNA为模板，通过PCR扩增并测序获得。

带有原始葡萄糖氧化酶基因的质粒pUC19-simple-AGOD，带有优化后葡萄糖氧化酶基因的质粒pUC19-simple-AGOD-m2、pUC19-simple-AGOD-m3、pUC19-simple-AGOD-m4和pUC19-simple-AGOD-m5由南京金斯瑞生物科技公司合成。

1.2培养基及其他溶液

YPD培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，无需调pH，115℃下高压灭菌30min；

10×酵母无氨基氮源(YNB)：134g/L YNB，0.22μm滤膜过滤灭菌；

500×生物素：0.2g/L生物素，0.22μm滤膜过滤灭菌；

MD固体培养基：琼脂糖20g/L，葡萄糖氧化酶20g/L，121℃下高压灭菌20min；待温度下降至60℃以下，加入10×YNB(0.22μm滤膜过滤灭菌)和500×生物素(0.22μm滤膜过滤灭菌)；

BM母液：酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L，121℃下高压灭菌20min；

BMGY培养基：蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，K₂HPO₄ 3g/L，KH₂PO₄11.8g/L，甘油1g/L，121℃下高压灭菌20min；待温度下降至60℃以下，加入10×YNB(0.22μm滤膜过滤灭菌)、500×生物素(0.22μm滤膜过滤灭菌)；

BMMY培养基：蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，K₂HPO₄ 3g/L，KH₂PO₄11.8g/L，121℃下高压灭菌20min；待温度下降至60℃以下，加入10×YNB(0.22μm滤膜过滤灭菌)、500×生物素(0.22μm滤膜过滤灭菌)和1％甲醇(V/V)；

1mol/L山梨醇：将182.1g D-山梨醇溶于1000mL水中，过滤灭菌，4℃保存。

1.3葡萄糖氧化酶酵母重组表达载体的构建

分别提取pUC19-simple-AGOD、pUC19-AGOD-m2、pUC19-AGOD-m3、pUC19-AGOD-m4、pUC19-AGOD-m5和pPIC9质粒，并分别用EcoR I和Not I对这6个质粒进行双酶切处理，分别将未改造的葡萄糖氧化酶基因AGOD及经优化改造的4个突变基因及表达载体pPIC9酶切产物进行回收并连接，通过酶切和测序对阳性克隆进行鉴定，由此分别构建了酵母重组表达载体pPIC9-AGOD，pPIC9-AGOD-m2、pPIC9-AGOD-m3、pPIC9-AGOD-m4和pPIC9-AGOD-m5(图11)。

1.4重组质粒毕赤酵母转化及阳性转化子筛选

将重组质粒分别用SacⅠ酶切后线性化，用异丙醇沉淀回收，取8μg线性化重组质粒通过电击法转化毕赤酵母GS115菌株，电击转化的感受态细胞涂布MD固体平板于28℃恒温培养箱倒置培养至转化子长出。将转化子同时挑取于贴有96格纸的MD培养基上，于28℃恒温培养箱中倒置培养36h，MD平板用于保存菌株。

1.5阳性转化子BMGY/BMMY高通量初筛及摇瓶水平复筛

阳性转化子首先通过BMGY/BMMY高通量初筛得到酶活力较高的转化子：挑取阳性单菌落接种于对应编号的含有500μL BMGY培养基的48平板的孔中，28℃200r/min培养36h；离心去除上清收集菌体，用500μL BMMY培养基重悬菌体，28℃200r/min培养72h，每隔24h补加甲醇使得终浓度为1％；诱导结束后离心收集上清酶液测定酶活。

选取初筛酶活较高的菌株进行摇瓶水平复筛，挑取转化子接种于对应编号的含有10mL BMGY培养基的40mL的离心管中，28℃200r/min培养36h；离心去除上清收集菌体，用5mL BMMY培养基重悬菌体，28℃200r/min培养72h，每隔24h补加甲醇使得终浓度为1％；诱导结束后离心收集上清酶液测定酶活。

1.6葡萄糖氧化酶重组毕赤酵母的发酵

以原始的葡萄糖氧化酶重组毕赤酵母菌为对照菌株，分别将上述5株表达水平最佳的毕赤酵母重组菌株进行实验室3L发酵罐水平诱导产酶发酵。挑取YPD固体平板活化好的重组菌株和对照菌株的单个菌落接种在50mL YPD液体培养基中，28℃恒温摇床200r/min培养36h；将其全部转入含有200mL YPD液体培养基中，28℃恒温摇床200r/min培养24h；然后将其全部接入3L发酵罐中发酵培养，初始培养基装液量为2000mL。

发酵罐参数设置为pH 5.0，温度30℃，转速1000r/min，通风比为2:1。培养约16h后，待葡萄糖耗尽，溶氧迅速上升，开始流加碳源(400mL 25％葡萄糖)约8h左右待菌体湿重达到160g/L时，开始进行混饲培养(100mL的25％甘油+12.5mL甲醇)，混饲4h后，开始流加甲醇，进入诱导产酶阶段。开始诱导后，每隔12h取发酵样品测定葡萄糖氧化酶活力，酶活力随着诱导时间的延长而增加，当酶活开始下降时，停止发酵，将发酵液离心(8000r/min，20min，4℃)，收集上清酶液。

2、试验结果

分别筛选了转葡萄糖氧化酶原始基因(AGOD)和优化基因(AGOD-m2、AGOD-m3、AGOD-m4和AGOD-m5)的酵母转化子各192株，各转化子的阳性率均在55％-60％之间。其中，挑选出转AGOD的酶活最高的菌株，其在摇瓶分泌表达的葡萄糖氧化酶酶活性为22.4U/mL，而转AGOD-m2的菌株最高酶活为25.3U/mL，转AGOD-m3的菌株最高酶活为144.6U/mL，转AGOD-m4的菌株最高酶活为20.6U/mL，转AGOD-m5的菌株最高酶活为73.2U/mL。转AGOD-m3的菌株的酶活显著高于转AGOD、AGOD-m2、AGOD-m4、AGOD-m5的菌株。

从3L水平发酵结果可以看出，转原基因的酵母转化子AGOD在甲醇诱导120h后葡萄糖氧化酶的活性为537.5U/mL，转AGOD-m2的酶活诱导120h后则达到了632.6U/mL，比野生型的提高了17％，与野生型无显著差异。而转AGOD-m3的酶活诱导120h后则达到了5200.2U/mL，达到了野生型的9.6倍。但突变基因AGOD-m4发酵水平仅为458.7U/mL，较野生型低；AGOD-m5的发酵水平为2243.6U/mL，是野生型的4.2倍。

综上所述，黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶经多种策略的基因序列优化后，仅AGOD-m3(SEQ ID NO.3)能够显著提高该酶蛋白在毕赤酵母中的分泌表达量，AGOD-m5(SEQ IDNO.5)的酶蛋白在毕赤酵母中的分泌表达也有一定的上升，优化基因AGOD-m2不能提高表达水平，优化基因AGOD-m4相比野生型基因，其表达水平甚至略有下降。与国内外已知研究比较，本实验得到的AGOD-m3葡萄糖氧化酶优化基因在毕赤酵母中的分泌表达量达到较高表达水平，为进一步大规模工业化生产奠定了良好的基础。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 黑曲霉葡萄糖氧化酶优化基因及其表达载体和应用

<130> BJ-2002-181023A

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1752

<212> DNA

<213> Aspergillus niger

<400> 1

agcaatggca tcgaagccag cctcctgact gaccccaagg aggttgccgg ccgcactgtc 60

gactacatca tcgctggtgg aggtctgact ggactcacca ctgctgcccg tctgacggag 120

aaccccgata tcactgtgct tgtcatcgaa agtggctcct acgagtctga cagaggtcct 180

atcattgagg acctgaacgc ttacggtgac atttttggca gcagtgtgga ccacgcctac 240

gagactgtcg agctcgccac caacaatcag actgcgctga tccgctccgg aaatggtctc 300

ggtggctcta ccctcgtcaa cggtggcacc tggactcgcc cccacaaggc acaagttgac 360

tcatgggaga ccgtcttcgg aaatgagggc tggaactggg acagcgtggc cgcctactcc 420

ctccaggctg agcgtgctcg cgcaccaaat gccaaacaga ttgctgctgg ccactacttt 480

aatgcatcct gccatggtat caatggtact gtccacgccg gaccccgcga taccggtgat 540

gactactccc ccatcgtcaa ggctctcatg agcgctgtcg aagacagggg cgttcccacc 600

aagaaggact tgggatgcgg tgacccccat ggtgtgtcca tgttccccaa caccttgcac 660

gaagaccaag tgcgctctga tgccgctcgc gaatggctcc tccccaacta ccagcgtccc 720

aacctgcaag tcctcactgg acagtatgtt ggaaaggtcc tgctcagcca gaacgctacc 780

acacctcgtg ccattggcgt ggaattcggc acccacaagg gcaacaccca caacgtctac 840

gctaagcacg aggtcctcct ggccgctgga tccgctgtct ctcccaccat cctcgaatat 900

tccggtatcg gaatgaagtc cattctagag cctcttggaa ttgacaccgt cgttgacctg 960

cccgttggtc tcaaccttca ggaccagacc acctctaccg tccgctcacg cattacctcc 1020

gccggtgccg gacagggaca ggccgcttgg ttcgctacct tcaacgagac ctttggcgac 1080

tacgccgaaa aggctcacga gctgctcaac accaagctgg agcagtgggc cgaagaggcc 1140

gtcgcccgtg gcggattcca caacaccacc gctttgctca tccagtacga gaactaccgc 1200

gactggatcg tcaaggacaa tgtcgcatac tcggaactct tcctcgacac ggccggagtg 1260

gccagtttcg atgtgtggga tcttctgccc ttcactagag gatacgtaca catcctcgac 1320

aaggacccct acctccgcca tttcgcatac gaccctcagt actttctcaa cgagcttgac 1380

ctgctcggcc aggctgccgc cactcagctg gcccgcaaca tctccaactc cggtgccatg 1440

caaacttatt tcgctggaga gactattccc ggtgacaacc tcgcgtatga tgccgacttg 1500

agcgcctggg ttgagtatat cccgtacaac ttccgcccta actaccatgg tgtgggtact 1560

tgctccatga tgccgaagga gatgggcggt gttgtcgaca atgctgcccg tgtgtatggt 1620

gtgcagggac tgcgagtcat cgatggttct attcccccta cgcaaatgtc gtcccatgtt 1680

atgacggtat tttatgccat ggccttgaag attgcggatg ccatcttggc ggattacgct 1740

tctatgcagt ga 1752

<210> 2

<211> 1752

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 2

tctaatggta ttgaggcttc tttgttgact gacccaaagg aggttgctgg tagaactgtt 60

gactacatta ttgctggtgg tggtttgact ggtttgacta ctgctgctag attgactgag 120

aacccagaca ttactgtttt ggttattgag tctggttctt acgagtctga cagaggtcca 180

attattgagg acttgaacgc ttacggtgac attttcggtt cttctgttga ccacgcttac 240

gagactgttg agttggctac taacaatcag actgctttga ttagatctgg taatggtttg 300

ggtggttcta ctttggttaa cggtggtact tggactagac cacacaaggc tcaagttgac 360

tcttgggaga ctgttttcgg taatgagggt tggaactggg actctgttgc tgcttactct 420

ttgcaggctg agagagctag agctccaaat gctaagcaga ttgctgctgg tcactacttc 480

aatgcttctt gccacggtat taatggtact gttcacgctg gtccaagaga cactggtgac 540

gactactctc caattgttaa ggctttgatg tctgctgttg aggacagagg tgttccaact 600

aagaaggact tgggttgcgg tgacccacac ggtgtttcta tgttcccaaa cactttgcac 660

gaggaccaag ttagatctga cgctgctaga gagtggttgt tgccaaacta ccagagacca 720

aacttgcaag ttttgactgg tcagtacgtt ggtaaggttt tgttgtctca gaacgctact 780

actccaagag ctattggtgt tgagttcggt actcacaagg gtaacactca caacgtttac 840

gctaagcacg aggttttgtt ggctgctggt tctgctgttt ctccaactat tttggagtac 900

tctggtattg gtatgaagtc tattttggag ccattgggta ttgacactgt tgttgacttg 960

ccagttggtt tgaacttgca ggaccagact acttctactg ttagatctag aattacttct 1020

gctggtgctg gtcagggtca ggctgcttgg ttcgctactt tcaacgagac tttcggtgac 1080

tacgctgaga aggctcacga gttgttgaac actaagttgg agcagtgggc tgaggaggct 1140

gttgctagag gtggtttcca caacactact gctttgttga ttcagtacga gaactacaga 1200

gactggattg ttaaggacaa tgttgcttac tctgagttgt tcttggacac tgctggtgtt 1260

gcttctttcg acgtttggga cttgttgcca ttcactagag gttacgttca cattttggac 1320

aaggacccat acttgagaca cttcgcttac gacccacagt acttcttgaa cgagttggac 1380

ttgttgggtc aggctgctgc tactcagttg gctagaaaca tttctaactc tggtgctatg 1440

caaacttact tcgctggtga gactattcca ggtgacaact tggcttacga cgctgacttg 1500

tctgcttggg ttgagtacat tccatacaac ttcagaccaa actaccacgg tgttggtact 1560

tgctctatga tgccaaagga gatgggtggt gttgttgaca atgctgctag agtttacggt 1620

gttcagggtt tgagagttat tgacggttct attccaccaa ctcaaatgtc ttctcacgtt 1680

atgactgttt tctacgctat ggctttgaag attgctgacg ctattttggc tgactacgct 1740

tctatgcagt ga 1752

<210> 3

<211> 1752

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 3

tccaatggaa tcgaagcttc attgcttaca gatcctaaag aggttgccgg tagaaccgtc 60

gactacatta tcgcaggtgg aggtttgact ggacttacta cagctgccag attgacagaa 120

aacccagata ttaccgtttt ggtcatcgaa tctggatcct atgagtctga cagaggtcct 180

attatcgagg atttgaatgc ctacggtgac attttcggat cttccgttga tcacgcttat 240

gaaactgtcg agttggccac aaacaatcag accgcactta ttagaagtgg aaacggtttg 300

ggaggttcta cacttgttaa tggaggtacc tggactagac cacataaagc tcaagttgat 360

tcctgggaaa ccgtcttcgg taacgaggga tggaattggg actccgttgc agcttactca 420

ttgcaggcag aaagagccag agcacctaac gctaagcaaa ttgccgcagg tcattatttt 480

aacgcttctt gtcacggtat caatggaact gttcatgccg gaccaagaga tacaggagat 540

gactactccc ctattgttaa agctttgatg tcagccgttg aagacagagg tgtcccaacc 600

aagaaagatt tgggatgcgg tgacccacac ggagtttcaa tgttccctaa cactttgcat 660

gaagatcaag tcagatccga cgctgccaga gagtggttgc ttccaaacta ccaaagacct 720

aatttgcagg ttcttactgg tcaatatgtt ggaaaggtct tgctttctca aaatgcaacc 780

actccaagag ctattggtgt tgaatttgga acccataagg gtaacactca caatgtttac 840

gcaaaacatg aggtcttgct tgcagctggt tctgctgttt cccctactat cttggaatac 900

agtggaatcg gtatgaagtc tatcttggag ccacttggaa tcgatacagt tgtcgacttg 960

cctgttggtt tgaaccttca agatcagaca acctcaactg tcagaagtag aattacatct 1020

gctggagccg gtcaaggaca ggccgcatgg tttgctactt tcaacgaaac atttggagat 1080

tacgccgaaa aggcacacga gttgcttaat actaaattgg agcagtgggc tgaagaggca 1140

gttgctagag gaggtttcca taatactaca gctttgctta tccaatacga aaactacaga 1200

gattggatcg ttaaggacaa tgtcgcttat agtgagttgt ttcttgatac tgctggagtt 1260

gcctcctttg atgtctggga cttgcttcct ttcacaagag gttacgttca cattttggat 1320

aaagacccat atcttagaca ttttgcttac gatcctcagt atttcttgaa cgaacttgac 1380

ttgcttggtc aggctgccgc aactcaattg gctagaaaca tttcaaatag tggtgctatg 1440

caaacctact ttgccggaga aactatccca ggagataatt tggcatatga tgctgacctt 1500

tccgcttggg ttgagtacat tccatataac ttcagaccta attaccacgg tgtcggaact 1560

tgttcaatga tgcctaagga aatgggaggt gttgtcgata atgctgccag agtttatggt 1620

gtccagggat tgagagttat tgacggttct atcccaccta cccaaatgtc aagtcatgtt 1680

atgactgtct tttacgctat ggctcttaaa atcgcagacg ctatccttgc tgactacgcc 1740

tcaatgcagt aa 1752

<210> 4

<211> 1752

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 4

tctaatggta ttgaggcttc tttgttgact gacccaaagg aggttgccgg tagaaccgtc 60

gactacatta tcgcaggtgg aggtttgact ggacttacta cagctgccag attgacagaa 120

aacccagata ttaccgtttt ggtcatcgaa tctggatcct atgagtctga cagaggtcct 180

attatcgagg atttgaatgc ctacggtgac attttcggat cttccgttga tcacgcttat 240

gaaactgtcg agttggccac aaacaatcag accgcactta ttagaagtgg aaacggtttg 300

ggaggttcta cacttgttaa tggaggtacc tggactagac cacataaagc tcaagttgat 360

tcctgggaaa ccgtcttcgg taacgaggga tggaattggg actctgttgc tgcttactct 420

ttgcaggctg agagagctag agctccaaat gctaagcaga ttgctgctgg tcactacttc 480

aatgcttctt gccacggtat taatggtact gttcacgctg gtccaagaga cactggtgac 540

gactactctc caattgttaa ggctttgatg tctgctgttg aggacagagg tgttccaact 600

aagaaggact tgggttgcgg tgacccacac ggtgtttcta tgttcccaaa cactttgcac 660

gaggaccaag ttagatctga cgctgctaga gagtggttgt tgccaaacta ccagagacca 720

aacttgcaag ttttgactgg tcagtacgtt ggtaaggttt tgctttctca aaatgcaacc 780

actccaagag ctattggtgt tgaatttgga acccataagg gtaacactca caatgtttac 840

gcaaaacatg aggtcttgct tgcagctggt tctgctgttt cccctactat cttggaatac 900

agtggaatcg gtatgaagtc tatcttggag ccacttggaa tcgatacagt tgtcgacttg 960

cctgttggtt tgaaccttca agatcagaca acctcaactg tcagaagtag aattacatct 1020

gctggagccg gtcaaggaca ggccgcatgg tttgctactt tcaacgaaac atttggagat 1080

tacgccgaaa aggcacacga gttgcttaat actaaattgg agcagtgggc tgaggaggct 1140

gttgctagag gtggtttcca caacactact gctttgttga ttcagtacga gaactacaga 1200

gactggattg ttaaggacaa tgttgcttac tctgagttgt tcttggacac tgctggtgtt 1260

gcttctttcg acgtttggga cttgttgcca ttcactagag gttacgttca cattttggac 1320

aaggacccat acttgagaca cttcgcttac gacccacagt acttcttgaa cgagttggac 1380

ttgttgggtc aggctgctgc tactcagttg gctagaaaca tttctaactc tggtgctatg 1440

caaacttact tcgctggtga gactattcca ggtgacaact tggcatatga tgctgacctt 1500

tccgcttggg ttgagtacat tccatataac ttcagaccta attaccacgg tgtcggaact 1560

tgttcaatga tgcctaagga aatgggaggt gttgtcgata atgctgccag agtttatggt 1620

gtccagggat tgagagttat tgacggttct atcccaccta cccaaatgtc aagtcatgtt 1680

atgactgtct tttacgctat ggctcttaaa atcgcagacg ctatccttgc tgactacgcc 1740

tcaatgcagt aa 1752

<210> 5

<211> 1752

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 5

tccaatggaa tcgaagcttc attgcttaca gatcctaaag aggttgctgg tagaactgtt 60

gactacatta ttgctggtgg tggtttgact ggtttgacta ctgctgctag attgactgag 120

aacccagaca ttaccgtttt ggtcatcgaa tctggatcct atgagtctga cagaggtcct 180

attatcgagg atttgaatgc ctacggtgac attttcggat cttctgttga ccacgcttac 240

gagactgttg agttggctac taacaatcag actgctttga ttagatctgg taatggtttg 300

ggtggttcta ctcttgttaa tggaggtacc tggactagac cacataaagc tcaagttgat 360

tcctgggaaa ccgtcttcgg taacgaggga tggaattggg actctgttgc tgcttactct 420

ttgcaggctg agagagctag agctccaaat gctaagcaga ttgctgctgg tcactacttc 480

aatgcttctt gccacggtat caatggaact gttcatgccg gaccaagaga tacaggagat 540

gactactccc ctattgttaa agctttgatg tcagccgttg aagacagagg tgttccaact 600

aagaaggact tgggttgcgg tgacccacac ggtgtttcta tgttcccaaa cactttgcac 660

gaggaccaag ttagatccga cgctgccaga gagtggttgc ttccaaacta ccaaagacct 720

aatttgcagg ttcttactgg tcaatatgtt ggaaaggtct tgttgtctca gaacgctact 780

actccaagag ctattggtgt tgagttcggt actcacaagg gtaacactca caacgtttac 840

gctaagcacg aggtcttgct tgcagctggt tctgctgttt cccctactat cttggaatac 900

agtggaatcg gtatgaagtc tatcttggag ccacttggaa tcgacactgt tgttgacttg 960

ccagttggtt tgaacttgca ggaccagact acttctactg ttagatctag aattacttct 1020

gctggtgctg gtcaaggaca ggccgcatgg tttgctactt tcaacgaaac atttggagat 1080

tacgccgaaa aggcacacga gttgcttaat actaaattgg agcagtgggc tgaggaggct 1140

gttgctagag gtggtttcca caacactact gctttgttga ttcagtacga gaactacaga 1200

gactggattg ttaaggacaa tgtcgcttat agtgagttgt ttcttgatac tgctggagtt 1260

gcctcctttg atgtctggga cttgcttcct ttcacaagag gttacgttca cattttggac 1320

aaggacccat acttgagaca cttcgcttac gacccacagt acttcttgaa cgagttggac 1380

ttgttgggtc aggctgccgc aactcaattg gctagaaaca tttcaaatag tggtgctatg 1440

caaacctact ttgccggaga aactatccca ggagataatt tggcttacga cgctgacttg 1500

tctgcttggg ttgagtacat tccatacaac ttcagaccaa actaccacgg tgttggtact 1560

tgctctatga tgcctaagga aatgggaggt gttgtcgata atgctgccag agtttatggt 1620

gtccagggat tgagagttat tgacggttct atcccaccta cccaaatgtc ttctcacgtt 1680

atgactgttt tctacgctat ggctttgaag attgctgacg ctattttggc tgactacgct 1740

tctatgcagt ga 1752

<210> 6

<211> 583

<212> PRT

<213> Aspergillus niger

<400> 6

Ser Asn Gly Ile Glu Ala Ser Leu Leu Thr Asp Pro Lys Glu Val Ala

1 5 10 15

Gly Arg Thr Val Asp Tyr Ile Ile Ala Gly Gly Gly Leu Thr Gly Leu

20 25 30

Thr Thr Ala Ala Arg Leu Thr Glu Asn Pro Asp Ile Thr Val Leu Val

35 40 45

Ile Glu Ser Gly Ser Tyr Glu Ser Asp Arg Gly Pro Ile Ile Glu Asp

50 55 60

Leu Asn Ala Tyr Gly Asp Ile Phe Gly Ser Ser Val Asp His Ala Tyr

65 70 75 80

Glu Thr Val Glu Leu Ala Thr Asn Asn Gln Thr Ala Leu Ile Arg Ser

85 90 95

Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Val Asn Gly Gly Thr Trp Thr

100 105 110

Arg Pro His Lys Ala Gln Val Asp Ser Trp Glu Thr Val Phe Gly Asn

115 120 125

Glu Gly Trp Asn Trp Asp Ser Val Ala Ala Tyr Ser Leu Gln Ala Glu

130 135 140

Arg Ala Arg Ala Pro Asn Ala Lys Gln Ile Ala Ala Gly His Tyr Phe

145 150 155 160

Asn Ala Ser Cys His Gly Ile Asn Gly Thr Val His Ala Gly Pro Arg

165 170 175

Asp Thr Gly Asp Asp Tyr Ser Pro Ile Val Lys Ala Leu Met Ser Ala

180 185 190

Val Glu Asp Arg Gly Val Pro Thr Lys Lys Asp Leu Gly Cys Gly Asp

195 200 205

Pro His Gly Val Ser Met Phe Pro Asn Thr Leu His Glu Asp Gln Val

210 215 220

Arg Ser Asp Ala Ala Arg Glu Trp Leu Leu Pro Asn Tyr Gln Arg Pro

225 230 235 240

Asn Leu Gln Val Leu Thr Gly Gln Tyr Val Gly Lys Val Leu Leu Ser

245 250 255

Gln Asn Ala Thr Thr Pro Arg Ala Ile Gly Val Glu Phe Gly Thr His

260 265 270

Lys Gly Asn Thr His Asn Val Tyr Ala Lys His Glu Val Leu Leu Ala

275 280 285

Ala Gly Ser Ala Val Ser Pro Thr Ile Leu Glu Tyr Ser Gly Ile Gly

290 295 300

Met Lys Ser Ile Leu Glu Pro Leu Gly Ile Asp Thr Val Val Asp Leu

305 310 315 320

Pro Val Gly Leu Asn Leu Gln Asp Gln Thr Thr Ser Thr Val Arg Ser

325 330 335

Arg Ile Thr Ser Ala Gly Ala Gly Gln Gly Gln Ala Ala Trp Phe Ala

340 345 350

Thr Phe Asn Glu Thr Phe Gly Asp Tyr Ala Glu Lys Ala His Glu Leu

355 360 365

Leu Asn Thr Lys Leu Glu Gln Trp Ala Glu Glu Ala Val Ala Arg Gly

370 375 380

Gly Phe His Asn Thr Thr Ala Leu Leu Ile Gln Tyr Glu Asn Tyr Arg

385 390 395 400

Asp Trp Ile Val Lys Asp Asn Val Ala Tyr Ser Glu Leu Phe Leu Asp

405 410 415

Thr Ala Gly Val Ala Ser Phe Asp Val Trp Asp Leu Leu Pro Phe Thr

420 425 430

Arg Gly Tyr Val His Ile Leu Asp Lys Asp Pro Tyr Leu Arg His Phe

435 440 445

Ala Tyr Asp Pro Gln Tyr Phe Leu Asn Glu Leu Asp Leu Leu Gly Gln

450 455 460

Ala Ala Ala Thr Gln Leu Ala Arg Asn Ile Ser Asn Ser Gly Ala Met

465 470 475 480

Gln Thr Tyr Phe Ala Gly Glu Thr Ile Pro Gly Asp Asn Leu Ala Tyr

485 490 495

Asp Ala Asp Leu Ser Ala Trp Val Glu Tyr Ile Pro Tyr Asn Phe Arg

500 505 510

Pro Asn Tyr His Gly Val Gly Thr Cys Ser Met Met Pro Lys Glu Met

515 520 525

Gly Gly Val Val Asp Asn Ala Ala Arg Val Tyr Gly Val Gln Gly Leu

530 535 540

Arg Val Ile Asp Gly Ser Ile Pro Pro Thr Gln Met Ser Ser His Val

545 550 555 560

Met Thr Val Phe Tyr Ala Met Ala Leu Lys Ile Ala Asp Ala Ile Leu

565 570 575

Ala Asp Tyr Ala Ser Met Gln

580

Claims

1.葡萄糖氧化酶优化基因在制备葡萄糖氧化酶中的应用，包括：将葡萄糖氧化酶优化基因可操作的与表达载体相连接得到重组表达载体；将所述重组表达载体转化宿主细胞，得到重组菌株；培养重组菌株，诱导重组葡萄糖氧化酶的表达，回收并纯化所表达的葡萄糖氧化酶；所述葡萄糖氧化酶优化基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。

2.按照权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的重组表达载体为重组真核表达载体；所述的宿主细胞为酵母细胞。

3.按照权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的重组真核表达载体为毕赤酵母表达载体；所述的酵母细胞为毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)。