CN101255401B - 一种黑曲霉菌株及其用于生产的甘草酸 - Google Patents
一种黑曲霉菌株及其用于生产的甘草酸 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101255401B CN101255401B CN200810072809XA CN200810072809A CN101255401B CN 101255401 B CN101255401 B CN 101255401B CN 200810072809X A CN200810072809X A CN 200810072809XA CN 200810072809 A CN200810072809 A CN 200810072809A CN 101255401 B CN101255401 B CN 101255401B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- culture
- potenlini
- aspergillus niger
- glycyrrhizic acid
- strain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种植物内生菌发酵的黑曲霉(Aspergillus niger)CGMCC.No.2289及其生产的甘草酸。该菌株产甘草酸的培养条件为PDA液体培养基，培养在需氧条件下进行，温度为25℃-30℃，装液量为20mL/100mL，200r/m下培养7天可以产甘草酸，通过常规提取技术甘草酸产量为0.22mg/L。用该菌株发酵产生甘草酸有易培养、易控制、生产成本低、生长快等优点，并可通过诱变育种等手段来提高菌种性能，容易实现大规模生产，既可以减少人们对野生甘草资源的破坏，保护了生态环境，又能够满足医药工业应用。
Description
发明领域
本发明涉及一种植物内生菌发酵生产甘草酸的技术领域，具体地说，涉及一种黑曲霉菌株及其用于产甘草酸的领域。
背景技术
甘草酸(Glycyrrhizic Acid)属于三萜皂甙化合物类，为白色或淡黄色结晶型粉末，熔点220℃，有特殊甜味，其分子式为C 42H62O16，相对分子量822.92。是传统中药甘草根部的提取物，也是其主要的药用有效成分之一。甘草酸不仅具有增甜、增香和增加风味的作用，而且还具有肾上腺皮质激素样作用和抗炎、抗变态反应、解毒、镇咳、抗肿瘤、影响脂质代谢、抑制艾滋病毒等作用，甘草酸已被广泛地应用于食品和药品领域。
目前由于中药的一些无序开发，资源枯竭，生物多样性锐减，多数药用植物的天然资源稀缺，甘草已成为渐危植物，且情况日益严重。而另一方面国内外对其有效成分甘草酸的需求越来越大。在这种供求矛盾的情况下，对甘草资源的保护性利用及寻找新的甘草酸来源非常有必要。人工栽培由于生长期长，受外界环境因素影响大，难以满足社会需求，为寻找新的甘草酸来源，增加甘草酸的产量，国内外均有人曾试图通过甘草细胞培养技术大量生产甘草的主要成分甘草酸，但该法培养周期长，工业化生产比较困难。基于甘草酸的生产和需求现状，可以通过植物内生菌发酵生产甘草酸。
发明内容
针对目前国内外曾试图通过甘草细胞培养技术大量生产甘草的主要成分甘草酸，但该法培养周期长，工业化生产比较困难，没有报道植物内生菌发酵生产甘草酸的现状。本发明提供了从新疆库尔勒地区的紫泥泉甘草自然保护区中筛选出的产生甘草酸的黑曲霉菌株及由此产生的甘草酸。
本发明通过对从新疆库尔勒地区的紫泥泉甘草自然保护区中样本进行微生物菌种的培养、分离，获得一批微生物，并从中分离筛选出一株甘草酸产生菌，编号为B60，从而提供了一株具有生产甘草酸优良特性的产生菌。根据《真菌鉴定手册》，对编号为B60菌株的形态学鉴定、生理生化检测分析确定编号为B60菌株为黑曲霉(Aspergillus niger)。
同时，本发明还提供了一种甘草酸，通过利用本发明的菌株经过发酵而获得。
本发明具体提供了一种黑曲霉菌株，命名为编号B60，其能够产生甘草酸。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏日期是2007年12月13日，保藏号是CGMCC No.2289。该菌株的菌落在查氏琼脂上生长迅速，25℃7天直径50-70毫米，中间稍有凸起，有规则的辐射状沟纹；质地丝绒状，分生孢子结构大量，表明呈暗褐黑色至炭黑色；菌落反面无色。分生孢子头初为球形，直径150-500μm；分生孢子梗发生于基质，孢梗茎1500-3500μm ×9-20μm，无色透明，壁平滑；顶囊球形或近球形，直径40-70μm，老时带褐色；产孢结构双层；瓶梗8-12×2-3μm；分生孢子球形、近球形，直径3-4.8μm。根据以上的形态特征初步确定菌株编号B60属于黑曲霉属。通过BLAST同源比对，将B60确定为黑曲霉(Aspergillus niger)，该菌种简称为A.niger B60。
本发明建立了菌种筛选、鉴定、保藏、复壮及选育的系统工艺流程技术：
本发明人从新疆库尔勒地区的紫泥泉甘草自然保护区采集甘草植株，将甘草的根、茎、叶，分别用自来水冲洗干净，滤纸吸去水分，用75％的酒精处理，无菌水冲洗，再用0.525％NaOCl处理，无菌水冲洗。消毒滤纸吸干水分，用无菌刀把根、茎、叶片切成小块，把它们置入PDA，LB等固体通用培养基表面，28℃恒温培养，待其切口边缘长出菌后，挑取真菌尖端菌丝转到新的培养基中纯化，细菌菌落进行稀释纯化培养，PDA(真菌)和牛肉膏蛋白胨培养基(细菌)斜面4℃保存。另外把根、茎、叶、树皮用无菌刀切成小块按上面方法处理之后，把无菌水置入PDA等固体培养基表面，28℃恒温培养，以此作为对照。将表面灭菌的根、茎、叶分别剪碎于无菌研钵中，加入无菌水研碎。取0.2mL梯度稀释，涂PDA等培养基平板，恒温28℃培养，PDA(真菌)和LB培养基(细菌)斜面4℃保存。将分离纯化的菌株进行发酵实验，用TLC及HPLC进行检测筛选得到一株可以产甘草酸的菌株-黑曲霉，学名为Aspergillus niger。
根据《真菌鉴定手册》对菌株A.niger B60的形状、大小、生理生化反应进行检测，本发明的甘草酸产生菌A.niger B60的生物学特性，B60确定为黑曲霉菌(Aspergillus niger)，该菌种简称为A.nigerB60。
该菌株产甘草酸的培养条件为PDA液体培养基，培养在需氧条件下进行，温度为28℃，装液量为20mL/100mL，200r/m下培养7天。
本发明建立了菌种的分离、筛选、鉴定及保藏等方法：
本发明人从新疆库尔勒地区的紫泥泉甘草自然保护区采集甘草植株，将甘草的根、茎、叶，分别用自来水冲洗干净，滤纸吸去水分，用75％的酒精处理，无菌水冲洗，再用0.525％NaOCl处理，无菌水冲洗。消毒滤纸吸干水分，用无菌刀把根、茎、叶片切成小块，把它们置入PDA，LB等固体通用培养基表面，28℃恒温培养，待其切口边缘长出菌后，挑取真菌尖端菌丝转到新的培养基中纯化，细菌菌落进行稀释纯化培养，PDA(真菌)和牛肉膏蛋白胨培养基(细菌)斜面4℃保存。另外把根、茎、叶、树皮用无菌刀切成小块按上面方法处理之后，把无菌水置入PDA等固体培养基表面，28℃恒温培养，以此作为对照。将表面灭菌的根、茎、叶分别剪碎于无菌研钵中，加入无菌水研碎。取0.2mL梯度稀释，涂PDA等培养基平板，恒温28℃培养，PDA(真菌)和LB培养基(细菌)斜面4℃保存。
将分离纯化所得的菌株分别接入装液量为20mL的100mL锥形瓶中，用200r/min的转速在28℃下摇床培养，细菌用LB培养3天，真菌用PDA培养7天。然后将发酵液10,000r/m离心10min，取上清，97℃-98℃加热浓缩12小时，用氨水调pH值为碱性，取发酵液点样于硅胶GF254平板上，在展开剂中展开，展开剂按照正丁醇∶冰乙酸∶水按4∶1∶2(v/v)比例准备好之后在紫外灯(λ＝254)下显色。挑选与标准品相同迁移率的斑点所对应的菌体，进一步用HPLC进行检测，筛选得到一株可以产甘草酸的黑曲霉菌株，学名为Aspergillus niger。
根据《真菌鉴定手册》对菌株A.niger B60的形状、大小、生理生化反应进行检测，本发明的甘草酸产生菌A.nigerB60的生物学特性，B60确定为黑曲霉菌(Aspergillus niger)，该菌种简称为A.nigerB60。
该菌株产甘草酸的培养条件为PDA液体培养基，培养在需氧条件下进行，温度为28℃，装液量为20mL/100mL，200r/m下培养7天。
该菌种保藏为真空冷冻干燥或石蜡油保存等常规保存。
通过实施本发明具体的技术指标，实现本发明内容，可以达到以下有益效果。
筛选得到了一株可以产甘草酸的黑曲霉，其产量为0.22mg/L。用该菌株发酵产生甘草酸有易培养、易控制、生产成本低、生长快等优点，并可通过诱变育种等手段来提高菌种性能，容易实现大规模生产，既可以减少人们对野生甘草资源的破坏，保护了生态环境，又能够满足医药工业应用。
附图说明
图1中a显示为本发明的菌株的菌落形态正面；b显示为本发明的菌株的菌落形态的反面。
图2显示为本发明的菌株的分生孢子头。
图3显示为本发明的菌株的分生孢子。
图4显示为本发明的菌株发酵液的TLC图，图中A为标准品，B为甘草浸汁，C为对照，D为样品。
图5中a显示为标准品的HPLC图；b显示为菌株发酵液的HPLC图。
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。另外，在下述的说明中，如无特别说明，则％皆指重量写。
具体实施方式
实施例1：从甘草样品分离纯化甘草内生菌
我们从新疆库尔勒地区的紫泥泉甘草自然保护区采集甘草植株，将甘草的根、茎、叶，分别用自来水冲洗干净，滤纸吸去水分，用75％的酒精处理5min，无菌水冲洗4次，再用0.525％NaOCl处理7min，无菌水冲洗5次。消毒滤纸吸干水分，用无菌刀把根、茎和树皮切成0.5cm长的小块，把叶片切成0.5×0.5的薄片，把它们置入PDA，LB，稀释的LB及加入甘草汁的LB等固体培养基表面，28℃恒温培养，待其切口边缘长出菌后，挑取真菌尖端菌丝转到新的培养基中纯化，细菌菌落进行划线纯化培养，PDA(真菌)和LB(细菌)斜面4℃保存。另外把根、茎、叶、树皮用无菌刀切成小块按上面方法处理之后，把无菌水置入PDA等固体培养基表面，28℃恒温培养，以此作为对照。将表面灭菌的根、茎、叶分别剪碎于无菌研钵中，加入9mL无菌水研碎。取0.2mL梯度稀释，涂PDA等培养基平板，恒温28℃培养，PDA培养基(真菌)和LB培养基(细菌)斜面4℃保存。
实施例2：筛选产甘草酸的微生物
按实施例1所分离纯化的菌株分别接入装液量为20mL的100mL锥形瓶中，用200r/min的转速在28℃下摇床培养，细菌用LB培养基发酵培养3天，真菌用PDA培养基发酵培养7天，然后将发酵液10,000r/m离心10min，取上清，97℃-98℃加热浓缩12小时，用氨水调pH值为碱性，取发酵液点样于硅胶GF254平板上，在展开剂中(正丁醇∶冰乙酸∶水＝4∶1∶2v/v)展开，之后在紫外灯(λ＝254)下观察。挑选与标准品相同迁移率的斑点所对应的菌体，参见附图4，进一步用HPLC确定，HPLC采用Waters 1525泵系列高效液相色谱仪，色谱柱为waters sunfire C18柱(150mm×4.6mm，5μm)；流动相为0.2M乙酸铵∶甲醇＝65∶35；流量：1.0mL/mi n；检测波长：λ＝255nm，参见附图5，得到一株可以产甘草酸的菌株。
实施例3：产物的分离和纯化
将实施例2所得的菌株接种于PDA液体培养基中，在需氧条件下进行培养，温度为28℃，装液量为20mL/100mL，200r/m下培养7天。将所得发酵液离心分离，收集发酵上清液，在室温下，用稀氨水调节所得发酵液的pH值为9，然后97℃温度烘干浓缩，将浓缩液全部点样于硅胶板上，薄层层析后，将目的条带用小刀轻轻刮下，用水溶解，离心，取上清，然后用等量的冰乙酸结晶，结晶即为甘草酸。
实施例4：产甘草酸的菌株的鉴定
按实施例2所得到产紫杉醇的菌株在PDA培养基平板上分离纯化三代(25℃，7天)之后，得到菌株B60菌株。B60菌株在查氏琼脂上生长迅速，25℃7天菌落直径50-70毫米，中间稍有凸起，有规则的辐射状沟纹；质地丝绒状，分生孢子结构大量，表明呈暗褐黑色至炭黑色；菌落反面无色，参见附图1。分生孢子头初为球形，直径150-500μm；分生孢子梗发生于基质，孢梗茎1500-3500μm×9-20μm，无色透明，壁平滑；顶囊球形或近球形，直径40-70μm，老时带褐色；产孢结构双层；瓶梗8-12×2-3μm，参见附图2；分生孢子球形、近球形，直径3-4.8μm，参见附图3。根据这些特征，依据真菌的形态分类学，将这个菌株鉴定为黑曲霉(Aspergillus niger)，编号为B60，菌种保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏日期是2007年12月13日，保藏号是CGMCC No.2289。
Claims (3)
1.一种可以产甘草酸的黑曲霉(Aspergillus niger)，其保藏号为CGMCC.No.2289。
2.如权利要求1所述的产甘草酸的黑曲霉，其特征在于，该菌种活化培养后的菌落在查氏琼脂上生长迅速，25℃7天直径50-70毫米，中间稍有凸起，有规则的辐射状沟纹；质地丝绒状，分生孢子结构大量，表明呈暗褐黑色至炭黑色；菌落反面无色；分生孢子头初为球形，直径150-500μm；分生孢子梗发生于基质，孢梗茎1500-3500μm×9-20μm，无色透明，壁平滑；顶囊球形或近球形，直径40-70μm，老时带褐色；产孢结构双层；瓶梗8-12×2-3μm；分生孢子球形、近球形，直径3-4.8μm。
3.如权利要求1所述的产甘草酸的黑曲霉，其特征在于，在发酵培养步骤中，该菌株产甘草酸的培养条件为PDA液体培养基，培养在需氧条件下进行，温度为25℃-30℃，装液量为20mL/100mL，200r/m下培养7天。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200810072809XA CN101255401B (zh) | 2008-01-18 | 2008-01-18 | 一种黑曲霉菌株及其用于生产的甘草酸 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200810072809XA CN101255401B (zh) | 2008-01-18 | 2008-01-18 | 一种黑曲霉菌株及其用于生产的甘草酸 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101255401A CN101255401A (zh) | 2008-09-03 |
| CN101255401B true CN101255401B (zh) | 2010-06-09 |
Family
ID=39890512
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN200810072809XA Expired - Fee Related CN101255401B (zh) | 2008-01-18 | 2008-01-18 | 一种黑曲霉菌株及其用于生产的甘草酸 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101255401B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105153265B (zh) * | 2015-10-19 | 2017-01-25 | 宁波绿之健药业有限公司 | 一种甘草酸的生物提取方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101067146A (zh) * | 2007-04-25 | 2007-11-07 | 重庆立克生物技术有限公司 | 甘草中主要化学成分的生物提取方法 |
-
2008
- 2008-01-18 CN CN200810072809XA patent/CN101255401B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101067146A (zh) * | 2007-04-25 | 2007-11-07 | 重庆立克生物技术有限公司 | 甘草中主要化学成分的生物提取方法 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| 宋素琴，等.新疆胀果甘草内生菌的分离和鉴定.微生物学通报34 5.2007,34(5),867-870. |
| 宋素琴,等.新疆胀果甘草内生菌的分离和鉴定.微生物学通报34 5.2007,34(5),867-870. * |
| 杨帅才，等.甘草中甘草酸的含量测定.黑龙江医药17 4.2004,17(4),251-252. |
| 杨帅才,等.甘草中甘草酸的含量测定.黑龙江医药17 4.2004,17(4),251-252. * |
| 陈永强,等.微生物发酵转化甘草提高其药效的研究.四川大学学报(自然科学版)44 5.2007,44(5),1147-1150. |
| 陈永强,等.微生物发酵转化甘草提高其药效的研究.四川大学学报(自然科学版)44 5.2007,44(5),1147-1150. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101255401A (zh) | 2008-09-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102168022B (zh) | 一株来自植物窝儿七的内生真菌斯氏青霉及其应用 | |
| CN104893983B (zh) | 液态发酵低桔霉素、高色价红曲红色素的制备方法及制品 | |
| CN106978350A (zh) | 一株黑曲霉及其在普洱茶素类化合物的制备中的应用 | |
| CN104871821A (zh) | 一种桑黄菌种及其培养方法 | |
| CN102599004A (zh) | 添加火麻仁培养虫草菌丝体的方法 | |
| CN103483040A (zh) | 冬虫夏草规模化液体深层发酵用培养基及其发酵生产方法 | |
| CN106047713A (zh) | 一株嗜松篮状菌菌株Li‑93及其应用 | |
| CN102674929A (zh) | 一种桦褐孔菌的深层发酵培养基及其深层发酵方法 | |
| CN107312720B (zh) | 一株高效转化人参皂苷Rb1为Rd木豆内生真菌及应用 | |
| CN105766377B (zh) | 一种提高黑木耳黄酮含量和种类的培养方法 | |
| CN101575576B (zh) | 一株烟曲霉及其应用 | |
| CN101603011B (zh) | 制备表鬼臼毒素双葡萄糖苷的方法及其专用菌株 | |
| CN108277180B (zh) | 一株产环糊精葡萄糖基转移酶的罗汉果内生菌菌株及其筛选方法和应用 | |
| CN101255401B (zh) | 一种黑曲霉菌株及其用于生产的甘草酸 | |
| CN100543128C (zh) | 一种生产β-胡萝卜素的粘性红圆酵母、β-胡萝卜素及其生产方法 | |
| CN103146614B (zh) | 一株产喜树碱的喜树内生细菌-ly214及其用途 | |
| CN104278070A (zh) | 一种提高桑黄液体发酵产物中麦角甾醇含量的方法 | |
| CN101265459B (zh) | 一种蜡状芽孢杆菌cpu0029菌株及用它制备石斛类生物碱的方法 | |
| CN110511876B (zh) | 一种朝鲜淫羊藿内生菌、培养方法及其代谢产物 | |
| CN102584615A (zh) | 一种生物碱化合物及其制备方法和应用 | |
| CN103820329B (zh) | 一株赤霉菌及其在制备芦丁和槲皮素中的应用 | |
| CN101701193B (zh) | 一种制备鬼臼毒素和/或黄芪苷的方法及其专用菌株 | |
| CN102172175A (zh) | 利用油茶枝粉液体培养制备茶薪菇营养菌粉的方法 | |
| CN104862238A (zh) | 一株酿酒酵母及其应用 | |
| CN104232727A (zh) | 一种富锗桑黄发酵产物的制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20100609 Termination date: 20180118 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |