CN103820329B - 一株赤霉菌及其在制备芦丁和槲皮素中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株赤霉菌及其在制备芦丁和槲皮素中的应用。赤霉菌(Gibberolla intermedia)TG1，它的保藏编号为CGMCC NO.8572。本发明还保护赤霉菌TG1在制备芦丁和/或槲皮素中的应用。本发明还保护一种制备芦丁和/或槲皮素的方法，包括如下步骤：发酵培养赤霉菌TG1，得到芦丁和/或槲皮素。本发明提供的内生赤霉菌可通过发酵制备芦丁和槲皮素，操作简单、成本低廉、生产周期短，具有工业化规模生产的应用潜力。本发明为芦丁和槲皮素的资源开发提供了新途径，并且对保护植物生态多样性具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一株赤霉菌及其在制备芦丁和槲皮素中的应用。
背景技术
芦丁,又称为芸香苷，是槲皮素的主要存在形式之一，是一类来源很广的黄酮类化合物，主要存在于豆科植物槐(Sophora japonica L.)的花蕾(槐米)、果实(槐角),芸香科植物芸香(Ruta graveolenslens L.)全草，金丝桃科植物红旱莲(Hypericumascyron L.)全草及蓼科植物荞麦(Fagopyrum esculentum Moench)的籽苗中。
芦丁具有广泛的利用价值，主要体现在其作为治疗药物以及保健品上。芦丁具有维生素P样作用，能降低毛细血管通透性和脆性，促进细胞增生和防止血细胞凝聚，以及抗炎、抗过敏、利尿、解痉、镇咳、降血脂等方面的作用。而国内外医药行业以芦丁作为原料，开发了多种药物，如芦丁片、维脑路通(羟乙芦丁)、芦丁镁铬盐、多维葡萄糖羟丁芦丁、槲皮素等心血管药物。此外，芦丁还可作为抗氧化剂和天然食用色素。
目前，我国芦丁生产主要以槐米为原料进行提取，而槐米因资源不足，不能充分满足市场需求，因此探索芦丁的新来源以缓解供应紧张，具有十分重要的意义。传统的芦丁提取法主要有(热)碱提取酸沉淀法、大孔吸附树脂纯化法、超声波辐射提取多次重结晶法、连续回流提取法等，这些传统方法虽然可以成功提取芦丁，但是都存在着各种各样的弊端，如产率低、水解副产物较多、工艺复杂、成本较高等。
发明内容
本发明的目的是提供一株赤霉菌及其在制备芦丁和槲皮素中的应用。
本发明提供的赤霉菌(Gibberolla intermedia)TG1，简称赤霉菌TG1，已于2013年12月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏登记号为CGMCC NO.8572。
本发明还保护赤霉菌TG1在制备芦丁和/或槲皮素中的应用。
本发明还保护一种制备芦丁和/或槲皮素的方法，包括如下步骤：发酵培养赤霉菌TG1，得到芦丁和/或槲皮素。
所述发酵培养采用的培养基具体可为马铃薯葡萄糖培养基。
所述发酵培养的条件具体可为：26-30℃、100-150rpm振荡培养5-9天。所述发酵培养的条件更加具体可为：28℃、120rpm振荡培养7天。
所述方法中还可包括将发酵液进行萃取的步骤。所述萃取采用的萃取剂具体可为氯仿。
本发明提供的内生赤霉菌可通过发酵制备芦丁和槲皮素，操作简单、成本低廉、生产周期短，具有工业化规模生产的应用潜力。本发明为芦丁和槲皮素的资源开发提供了新途径，并且对保护植物生态多样性具有重要意义。
附图说明
图1为赤霉菌TG1的菌落形态。
图2为显微镜下观察赤霉菌TG1的照片。
图3为芦丁标准品和槲皮素标准品的高效液相色谱图。
图4为粗提物的高效液相色谱图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。芦丁标准品（结构式见式Ⅰ）和槲皮素标准品（结构式见式Ⅱ）均购自中国药品生物制品检定所。实施例中用抽滤器分离时采用杭州特种纸业有限公司的定性滤纸（中速：102）。
实施例1、赤霉菌TG1的分离和鉴定
一、菌株的分离
将自甘肃省兰州市兴隆山（海拔2300m）采集的桃儿七属（Sinopodophyllum）植物桃儿七（Sinopodophyllum hexandrum(Royle)Ying）的根及根状茎分别用自来水洗净，在超净工作台中用75%（体积百分含量）乙醇水溶液处理5min，然后无菌水冲洗3-5次；而后再用2.5%（质量百分含量）次氯酸钠水溶液处理10min，再无菌水冲洗3-5次；用灭菌的镊子和刀片将桃儿七的根的外皮剥去，再切成0.5cm×0.5cm大小的小片种植于PDA固体培养基上，28℃培养3-7天；同时将同样灭菌处理过的桃儿七的根不做剥皮及切割，在PDA培养基上滚动一周后，同条件培养作为对照观察。
培养几天后发现在桃儿七的根的切口处有菌丝长出，取切口处新长出的菌丝，转接到新鲜的PDA培养基上培养，待菌落出现后，根据菌落的形态、颜色的差异及菌落长出时间的不同，分别挑取培养基边缘的菌丝接种于新的PDA培养基上进行分离培养，直至筛选出单一的菌落。
将一株纯培养的菌株命名为菌株TG1。
二、菌株的鉴定
菌株TG1的形态特征：在PDA培养基上菌落生长迅速，24小时后出现白色菌落，边缘呈放射状，28小时时菌落中心开始出现浅粉色，随着培养时间的延长，菌落直径不断增大，中心颜色也逐渐加深成紫红色，并且紫红色区域不断扩大，到培养结束时，菌落呈毡状，中心紫红边缘白色，培养基也呈现出紫色，且颜色深于菌落颜色，直径达到75mm（具体的菌落形态如图1所示）；扁平或具有绒毛状气生菌丝并边缘略微呈毛缘状；菌丝有隔膜，分枝生长，分生孢子有大小两种（大型孢子呈镰刀形或船形，小型孢子呈球状），链状着生，菌落气生菌丝呈绒状，呈一定程度的束状结合，光学显微镜下结合处可见有液滴（见图2）。
提取菌株TG1的基因组DNA，PCR扩增ITS序列（PCR引物：ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC）并测序，如序列表的序列1所示。将测序结果在NCBI中进行比对，结果表明，菌株TG1属于赤霉菌(Gibberollaintermedia)，因此被称为赤霉菌TG1。
赤霉菌(Gibberolla intermedia)TG1已于2013年12月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏登记号为CGMCC NO.8572。
实施例2、利用赤霉菌TG1制备芦丁和槲皮素
一、培养赤霉菌TG1
马铃薯葡萄糖液体培养基的组成为：去皮马铃薯200g、葡萄糖20g，加水定容至1000mL。马铃薯葡萄糖液体培养基的制备方法：将马铃薯去皮，切成约2cm2的小块，放入烧杯中煮沸30min，然后用双层纱布过滤，取滤液加入葡萄糖，再补足水，pH自然。将100ml马铃薯葡萄糖液体培养基装于250ml三角瓶中，灭菌备用。
将赤霉菌TG1的单菌落接种至100ml马铃薯葡萄糖液体培养基，28℃、120r/min振荡培养7天。
二、制备粗提物
1、取步骤一得到的发酵体系，采用抽滤器分离并收集发酵上清。
2、取步骤1得到的发酵上清，用氯仿萃取三次（每次均加入与发酵上清等体积的氯仿），合并有机相，减压蒸馏，得到浸膏（又称粗提物）。
三、高效液相色谱检测
取步骤二得到的粗提物，用甲醇溶解，然后用0.45μm微孔滤膜过滤并收集滤液，采用外标法进行高效液相色谱分析。同时以芦丁标准品和槲皮素标准品作为对照。
具体的检测方法如下：
高效液相色谱仪：Aglient1100型；
色谱柱：Aglient1100Eclipse XDB-C18（5μm，4.6×150mm）；
检测器：紫外检测器；检测波长：254nm；
色谱条件：流动相：甲醇：水=60：40（体积比，ml/ml）；
流速：0.5ml/min；
进样量：5μl；
柱温：室温。
芦丁标准品的谱图见图3A（峰值对应的保留时间为5.129分钟）。
槲皮素标准品的谱图见图3B（峰值对应的保留时间为10.608分钟）。
芦丁标准品和槲皮素标准品的混合物的谱图见图3C。
粗提物的的谱图见图4。可以观察到，在保留时间为5.176分钟处具有峰值（该峰值与芦丁标准品的峰值在仪器允许误差范围内，两者为同一物质），在保留时间为10.579分钟处具有峰值（该峰值与槲皮素标准品的峰值在仪器允许误差范围内，两者为同一物质）。结果表明，粗提物中含有芦丁和槲皮素。
Claims (3)
1.赤霉菌(Gibberella intermedia)TG1，它的保藏编号为CGMCC NO.8572。
2.权利要求1所述赤霉菌在制备芦丁和/或槲皮素中的应用。
3.一种制备芦丁和/或槲皮素的方法，包括如下步骤：发酵培养权利要求1所述赤霉菌，得到芦丁和/或槲皮素。
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