CN102559517B - 一株来自桃儿七植物的内生真菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株来自桃儿七植物的内生真菌及其应用。本发明提供的镰孢(Fusarium sp.)TG-9，其保藏号为CGMCC No.5528。上述镰孢(Fusarium sp.)TG-9CGMCC No.5528在制备鬼臼毒素中的应用也是本发明保护的范围。本发明的实验证明，本发明提供了一株菌株，其可以用于制备鬼臼毒素。本发明的制备鬼臼毒素的方法具有操作简单、成本低廉、易操作、生产周期短的优点。本发明方法为制备鬼臼毒素提供了新途径，避免了现有技术中其它各种制备方法的局限性，具有很强的可操作性，适合于工业化大规模生产，同时又对保护植物生态多样性具有重要意义。

Description

一株来自桃儿七植物的内生真菌及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一株来自桃儿七植物的内生真菌及其应用。

背景技术

鬼臼毒素是重要的芳基四氢萘内酯类木脂素，具有广泛生物学活性的天然化合物，有拟雌激素样、抗雌激素样、抗癌、抗病毒、抗免疫、抑菌杀虫、治疗牛皮癣、疟疾、类风湿性关节炎、多发性硬化、抑制植物生长、抗氧化等作用，是近年来合成抗癌药物VP-16(etoposide)和VM-26(teniposide)等的前体物质。VP-16和VM-26对小细胞肺癌、淋巴癌等多种肿瘤疾病均有很好的疗效，已开发成为抗癌药物应用于临床。

目前鬼臼毒素主要是从野生鬼臼类植物的根茎中提取，而这类植物在全世界仅有4属15种，我国有3属12种，主要生长在秦岭、西藏等高海拔地区。野生鬼臼类植物生长缓慢，且其中鬼臼毒素类物质的含量较低。随着医学和农林防治方面对鬼臼毒素类物质需求量日益增加，随着对野生鬼臼类植物原料的采集的加剧，其资源遭到严重破坏，造成了生物多样性和生态环境的不可逆损失；由于鬼臼毒素类物质化学结构复杂，对其进行化学全合成的难度较大；基因工程学手段构建工程菌也由于参与形成该类物质的酶数量过多而无法进行。因此需要寻找有效可行的制备鬼臼毒素类物质的方法。

近年来，已有学者从鬼臼类植物(包括八角莲属、桃儿七属、足叶草(鬼臼)属和山荷叶属)中分离到产鬼臼毒素类似物内生真菌，其培养物经TLC检测和HPLC检测，与鬼臼毒素标准品有相同的Rf值和保留时间(川八角莲内生真菌产鬼臼毒素类似物的初步研究，郭仕平、蒋斌等，生物技术，2004.14(2)：55-56；鬼臼类植物产鬼臼毒素内生菌的筛选，杨显志，郭仕平等，2003.15(5)：419-422；从南方山荷叶分离出一株产鬼臼毒素类似物的内生真菌，曾松荣，邵华等，微生物学杂志，2004，24(4)：1-2.)。因此，利用内生菌具有产生和宿主相同或相似的生物活性物质的性质，可能是一种解决鬼臼毒素的来源问题的有效方法。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种镰孢(Fusarium sp.)TG-9。

本发明提供的镰孢(Fusarium sp.)TG-9，其保藏号为CGMCC No.5528。

上述镰孢(Fusarium sp.)TG-9 CGMCC No.5528在制备鬼臼毒素中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的另一个目的是提供一种制备鬼臼毒素的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：发酵上述的镰孢(Fusarium sp.)TG-9CGMCC No.5528，收集发酵产物，即得到鬼臼毒素。

上述方法中，所述发酵的温度为26℃-30℃，所述发酵的转速为100rpm-150rpm，所述发酵的旋转半径为2cm，所述发酵的时间为5天-9天。

上述方法中，所述发酵的温度具体为27℃，所述发酵的转速具体为120r/min，所述发酵的时间具体为8天。

上述发酵采用的培养基为马铃薯葡萄糖液体培养基，是按照如下方法配制的：称取马铃薯200g(去皮、切成约2cm²的小块)，放入水中煮沸30min，然后用双层纱布过滤，取其滤液加20g葡萄糖，再补足水至1000mL，自然pH。

上述方法中，在所述发酵后，还包括如下步骤：

1)将所述发酵产物抽滤，收集滤液；

2)将步骤1)得到的滤液加入氯仿萃取，收集有机相，得到鬼臼毒素。

上述方法中，所述滤液和所述氯仿的体积比为1∶1。

上述提到的菌株TG-9于2011年12月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.5528，其分类命名为镰孢(Fusarium sp.)。

本发明的实验证明，本发明提供了一株菌株，其可以用于制备鬼臼毒素。本发明的制备鬼臼毒素的方法具有操作简单、成本低廉、易操作、生产周期短的优点，为制备鬼臼毒素提供了新途径，避免了现有技术中其它各种制备方法的局限性，具有很强的可操作性，适合于工业化大规模生产，同时又对保护植物生态多样性具有重要意义。

附图说明

图1为镰刀菌属真菌的菌落

图2为镰刀菌属真菌的菌丝体和孢子形态

图3为混标与样品TG-9提取物在HPLC-MS检测中HPLC图谱

图4为混标与样品TG-9提取物的EIC图谱

图5为标准品鬼臼毒素与样品TG-9提取物在保留时间14min时的MS图谱

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、菌株TG-9的分离与鉴定

一、分离

从甘肃省兰州市兴隆山(海拔2300m)采集新鲜植物桃儿七(Sinopodophyllumhexandrum(Royle)Ying)。将采集的植物材料进行粗处理，选取健康的为霉烂货干枯的植物组织，并将所需部分(主要是根或根状茎以及茎)用清水洗去泥沙及其它杂质，然后用滤纸洗去植物组织表面残留的水分。在超净工作台中，用75％乙醇处理1min，无菌水冲洗5次，而后用10％次氯酸钠处理6min，再用无菌水冲洗5次，每次1min，最后再用75％酒精漂洗30s，无菌水漂洗5次，每次1min。用灭菌的镊子和刀片将材料外皮剥去，再切成0.5cm×1cm大小的小片种植于PDA固体培养基上，28℃培养10天。同时将同样灭菌处理过的材料不做剥皮及切割，在PDA培养基上滚动一周，同条件培养，作为对照观察，以排除表面微生物。

培养几天后发现在材料切口处有菌丝长出，取切口处新长出的菌丝，及时转接到新鲜PDA培养基上培养，待菌落出现后，根据菌落形态，颜色的差异及长出时间的不同，分别挑取各培养基上的菌落边缘的菌丝接于新的培养基上进行分离培养，直至培养为单一菌株，将此菌株命名为TG-9。

二、鉴定

将上述菌株TG-9进行如下生理生化、菌形态的鉴定：

(1)菌落特征：

菌株TG-9的菌落形态如图1所示，可以看出，菌落直径不断增大，中央颜色也不断加深，并随菌落直径增大而扩大，至培养结束，菌落直径79mm，毡状，厚，呈橙黄色，中央略凹陷，颜色稍浅，边缘白色，反面中央呈褐色或橙色，边缘白色，似无结实。

(2)菌丝形态特征：

菌株TG-9的孢子头和孢子形态如图2所示，A为菌丝体形态，B为孢子形态，可以看出，菌丝分枝生长，有隔膜，呈暗橘黄色；产生大型孢子，呈长柱形，未见小型孢子，有厚垣孢子，菌落呈絮状，生长状态下，菌丝呈束状结合。

综合上述特征，依据《真菌鉴定手册》、《中国真菌志》，本发明菌株TG-9为镰刀菌属真菌(Fusarium)，其分类属是属于半知菌类的真菌，归属于丛梗孢目，瘤座孢科，镰刀菌属。

上述提到的菌株TG-9于2011年12月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.5528，其分类命名为镰孢(Fusarium sp.)。

实施例2、菌株TG-9制备鬼臼毒素

一、发酵液的获得

将100ml制备好的马铃薯葡萄糖液体培养基装于250ml三角瓶中，灭菌，挑镰孢(Fusarium sp.)TG-9CGMCC No.5528菌丝(也可以是孢子)接种于三角瓶中，28℃，120r/min(旋转半径2cm)摇床培养7天，得到发酵产物。

马铃薯葡萄糖液体培养基是按照如下方法配制的：称取马铃薯200g(去皮、切成约2cm²的小块)，放入水中煮沸30min，然后用双层纱布过滤，取其滤液加20g葡萄糖，再补足水至1000mL，自然pH。

二、发酵液的氯仿提取物的获得

用抽滤器将上述一得到的发酵产物抽滤两次，分别收集菌丝体与发酵液(滤液)；将上述发酵液用等体积的氯仿萃取，收集有机相，即为氯仿萃取液。随时取萃取液于紫外检测仪下检测，直至萃取液在紫外检测器下无荧光，收集萃取液，减压蒸馏回收浓缩，得到氯仿提取物。

三、氯仿提取物的检测

下述实验均重复三次，结果取平均值。

下述实验用的标准品为混标或鬼臼毒素标准品，为将鬼臼毒素标准品、鬼臼毒素单葡萄糖苷、表鬼臼毒素双葡萄糖苷溶于无水甲醇，得到混标，鬼臼毒素标准品在混标中的浓度为2.0mg/ml，鬼臼毒素单葡萄糖苷在混标中的浓度为1.3mg/ml，表鬼臼毒素双葡萄糖苷在混标中的浓度为1.0mg/ml。

鬼臼毒素标准品P购买于中国药品生物制品鉴定所，其分子结构式如下式I：

鬼臼毒素单葡萄糖苷(PG)，其结构式式如下式II所示；

表鬼臼毒素双葡萄糖苷(P2G)，其可以按照Changqi ZHAO，Akito NAGATSU，Keiichiro HATANO，Naohiro SHIRAI，Setsuko KATO，and Yukio OGIHARA，NewLignan Glycosides from Chinese Medicinal Plant：Sinopodophillum emodi，Chem.Pharm.Bull.51(3)：55-261(2003)中所述方法制备并采用核磁共振(NMR)、质谱(MS)等方法进行分子结构鉴定，其分子结构式如下式III所示；

(1)产物的薄层层析(TLC)检测

将上述二得到的氯仿提取物进行薄层层析(TLC)检测，选用氯仿/甲醇＝99/1(体积比)的混合溶剂为展开剂，紫外检测仪的检测波长为254和365nm。以上述鬼臼毒素标准品P为阳性对照。

检测结果为：在上述条件下，鬼臼毒素标准品P的Rf值为0.37，在254nm下显黄色荧光但在365nm下无蓝色荧光；在用H₂SO₄/EtOH为15/85(体积比)的显色剂进行显色时，鬼臼毒素斑点显暗紫红色(由于浓度不同可能略有差异)。

上述二得到的氯仿提取物中有斑点的Rf值也为0.37，并且在254nm下有黄色荧光但在365nm下无蓝色荧光，显色为暗紫红色或相近颜色，认为上述二得到的氯仿提取物可能含有鬼臼毒素。

(2)高效液相(HPLC)检测

将上述二得到的氯仿提取物进一步进行HPLC检测，具体如下：

检测前，将混标和上述镰孢(Fusarium sp.)TG-9CGMCC No.5528发酵液的氯仿提取物用甲醇充分溶解，0.45μm微孔滤膜过滤，采用外标法对上述发酵液进行HPLC分析。

仪器：Aglient 1200型高效液相色谱仪；

色谱柱：COSMOSIL 5C₁₈-MS-II，4.6×150mm；

检测器：紫外检测器；检测波长：254nm；

色谱条件：

流动相：甲醇∶水＝55∶45(体积比)

流速：0.5ml/min

进样量：10μl

柱温：室温

混标的色谱图如图3-A所示，A为混标，其中鬼臼毒素P的保留时间为12.381分钟。提取物样品的色谱图如图3-B所示，B为样品TG-9提取物；提取物的保留时间为12.463分钟。

将提取物的检测图谱与标准品的图谱进行对照，氯仿提取物与混标中的鬼臼毒素P具有保留时间相同的峰，表明氯仿提取物中含有鬼臼毒素。

(3)氯仿提取物的高效液相色谱质谱联用检测(HPLC-MS)检测

在TLC和HPLC检测后，对上述二得到的氯仿提取物进一步进行HPLC-MS检测。HPLC条件与上述HPLC初步检测所使用的条件基本一致。

结果如图4所示，为混标与样品TG-9的氯仿提取物的EIC图谱，A为混标，B为样品TG-9的氯仿提取物；上述二得到的氯仿提取物在保留时间为13.8min时的峰与混标中鬼臼毒素P的保留时间一致。

图5是鬼臼毒素标准品P和样品TG-9C氯仿提取物在14min时的ESIMS图谱，两者ESIMS中的碎片离子基本一致；A为标准品P，B为样品TG-9氯仿提取物。将主要的碎片峰进行了归属，结果如下，m/z437.1为[M+Na]+，m/z397.1为[M-OH]+，m/z366.1为[M-OH-CH₃O]+，m/z351.1为[M-OH-CH₂O₂]+，m/z313.1为[M-OH-C₄H₄O₂]+，m/z298.1为[M-OH-C₄H₄O₂-C H₃]+，m/z 282.1为[M-OH-C₄H₄O₂-CH₃O]+，m/z247.1/为[M-C₆H₂(OCH₃)₃]+，m/z229.0为[M-OH-C₆H₂(OCH₃)₃]+。通过与文献进行比对，其符合鬼臼毒素的质谱数据。

实验研究证明：镰孢(Fusarium sp.)TG-9CGMCC NO.5528具有产生鬼臼毒素的能力。

Claims (7)

1.镰孢(Fusarium sp.)TG-9，其保藏号为CGMCC NO.5528。 

2.权利要求1所述的镰孢(Fusarium sp.)TG-9CGMCC NO.5528在制备鬼臼毒素中的应用。 

3.一种制备鬼臼毒素的方法，包括如下步骤：发酵权利要求1所述的镰孢(Fusarium sp.)TG-9CGMCC No.5528，收集发酵产物，即得到鬼臼毒素。 

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述发酵的温度为26℃-30℃，所述发酵的转速为100rpm-150rpm，所述发酵的旋转半径2cm，所述发酵的时间为5天-9天。 

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述发酵的温度为28℃，所述发酵的转速为120 rpm，所述发酵的时间为7天。 

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：在所述发酵后，还包括如下步骤： 

1）将所述发酵产物抽滤，收集滤液； 

2）将步骤1）得到的滤液加入氯仿萃取，收集有机相，得到鬼臼毒素。 

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述滤液和所述氯仿的体积比为1:1。 

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