CN103820330B - 一株变色曲霉及其在制备鬼臼毒素单葡萄糖苷和鬼臼毒素中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株变色曲霉及其在制备鬼臼毒素单葡萄糖苷和鬼臼毒素中的应用。变色曲霉(Aspergillus?versicolor)W1,它的保藏编号为CGMCC?NO.8571。本发明还保护变色曲霉W1在制备鬼臼毒素单葡萄糖苷和/或鬼臼毒素中的应用。本发明还保护一种制备鬼臼毒素单葡萄糖苷和/或鬼臼毒素的方法,包括如下步骤:发酵培养变色曲霉W1,得到鬼臼毒素单葡萄糖苷和/或鬼臼毒素。本发明公开了一株变色曲霉,发酵培养后可以得到鬼臼毒素单葡萄糖苷和鬼臼毒素,操作简单、成本低廉、生产周期短,具有工业化规模生产的应用潜力。本发明为鬼臼毒素类物质的资源开发提供了新途径,对保护植物生态多样性具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一株变色曲霉及其在制备鬼臼毒素单葡萄糖苷和鬼臼毒素中的应用。
背景技术
鬼臼毒素(podophyllotoxin)及其衍生物鬼臼毒素单糖苷(podophyllotoxin7′-O-β-D-glucopyranoside)具有广泛的生物学活性,尤其是其抗肿瘤活性。鬼臼类植物提取物作为天然药物在1820年就被收录在美国药典中,而其中主要的活性成分就是鬼臼毒素。目前广泛运用于临床的广谱抗肿瘤药物,依托泊甙(etoposide),替尼泊甙(teniposide),依托泊苷磷酸酯(etoposidephosphate)均是鬼臼毒素糖苷类衍生物。
鬼臼毒素是从盾叶鬼臼树脂中分离得到的一种木脂素。目前,鬼臼毒素主要还是来源于野生鬼臼类植物,如美洲八角莲(PodophyllumpeltatumL)、桃儿七(Sinopodophyllumemodi)、山荷叶(Diphylleiagrayi)等。
由于鬼臼毒素类药物的良好抗肿瘤活性,对鬼臼毒素的需求也日益增加,其资源问题也就日益突出,鬼臼类植物普遍存在生长缓慢、对环境要求苛刻、分布零散、野生资源有限、鬼臼毒素含量低等问题。所以,靠采挖野生植物来提取鬼臼毒素无法满足生产的需求,并且对生物多样性和生态环境造成了极大破坏。因此,解决鬼臼毒素来源的问题具有重要意义。
国内外对鬼臼毒素的来源进行了大量研究,然而,始终没有找到合适的途径来替代野生鬼臼植物的采挖。全合成和半合成的方法可以成功得到鬼臼毒素类药物,但是全合成经历的步骤太多,得到的鬼臼毒素各类异构物太多,所以很不经济,而半合成本省就需要天然的鬼臼毒素作为原料。
发明内容
本发明的目的是提供一株变色曲霉及其在制备鬼臼毒素单葡萄糖苷和鬼臼毒素中的应用。
本发明提供的变色曲霉(Aspergillusversicolor)W1,简称变色曲霉W1,已于2013年12月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所),保藏登记号为CGMCCNO.8571。
本发明还保护变色曲霉W1在制备鬼臼毒素单葡萄糖苷和/或鬼臼毒素中的应用。
本发明还保护一种制备鬼臼毒素单葡萄糖苷和/或鬼臼毒素的方法,包括如下步骤:发酵培养变色曲霉W1,得到鬼臼毒素单葡萄糖苷和/或鬼臼毒素。
所述发酵培养采用的培养基具体可为马铃薯葡萄糖培养基。
所述发酵培养的条件具体可为:26-30℃、100-150rpm振荡培养5-9天。所述发酵培养的条件更加具体可为:28℃、120rpm振荡培养7天。
所述方法中还可包括如下步骤:从完成所述发酵的体系中分离菌丝体,超声破碎并用有机溶剂进行浸提。所述有机溶剂具体可为甲醇。所述超声破碎的参数具体可为:功率150W,工作20s停10s,循环3-4次。
本发明公开了一株变色曲霉,发酵培养后可以得到鬼臼毒素单葡萄糖苷和鬼臼毒素,操作简单、成本低廉、生产周期短,具有工业化规模生产的应用潜力。本发明为鬼臼毒素类物质的资源开发提供了新途径,对保护植物生态多样性具有重要意义。
附图说明
图1为鬼臼毒素单葡萄糖苷标准品和鬼臼毒素标准品的高效液相色谱图。
图2为粗提物的高效液相色谱图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。实施例中用抽滤器分离时采用杭州特种纸业有限公司的定性滤纸(中速:102)。
鬼臼毒素单葡萄糖苷(鬼臼毒素7’-O-葡萄糖苷)标准品和鬼臼毒素标准品:ChangqiZHAO,AkitoNAGATSU,KeiichiroHATANO,NaohiroSHIRAI,SetsukoKATO,andYukioOGIHARA,NewLignanGlycosidesfromChineseMedicinalPlant:Sinopodophillumemodi,Chem.Pharm.Bull.51(3):255-261(2003)。
鬼臼毒素单葡萄糖苷(4-demethyl-picropodophyllotoxin7'-O-β-D-glucopyranoside)的结构式如下:
鬼臼毒素标准品的结构式如下:
实施例1、菌株的分离和鉴定
一、菌株的分离
将自陕西省眉县红河谷(海拔1560m)采集的植物窝儿七(DiphyllriasinensisL.)的根及根状茎分别用自来水洗净,在超净工作台中用75%(体积百分含量)乙醇水溶液处理5min,然后无菌水冲洗3-5次;而后再用2.5%(质量百分含量)次氯酸钠水溶液处理10min,再无菌水冲洗3-5次;用灭菌的镊子和刀片将窝儿七的根的外皮剥去,再切成0.5cm×0.5cm大小的小片种植于PDA固体培养基上,28℃培养3-7天;同时将同样灭菌处理过的窝儿七的根不做剥皮及切割,在PDA培养基上滚动一周后,同条件培养作为对照观察。
培养几天后发现在窝儿七的根的切口处有菌丝长出,取切口处新长出的菌丝,转接到新鲜的PDA培养基上培养,待菌落出现后,根据菌落的形态、颜色的差异及菌落长出时间的不同,分别挑取培养基边缘的菌丝接种于新的PDA培养基上进行分离培养,直至筛选出单一的菌落。
将一株纯培养的菌株命名为菌株W1。
二、菌株的鉴定
菌株W1的形态特征:菌落绒状或絮状,生长局限形,颜色变化广,不同的菌系可能在局部有淡绿、灰绿、浅黄甚至粉红色,反面无色至黄橙色。分生孢子穗疏松放射状;分生孢子梗无色或略带黄色,光滑;顶囊半球形,产孢结构双层;分生孢子球形。
提取菌株W1的基因组DNA,PCR扩增ITS序列(PCR引物:ITS1:TCCGTAGGTGAACCTGCGG;ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC)并测序,如序列表的序列1所示。将测序结果在NCBI中进行比对,结果表明,菌株W1属于变色曲霉(Aspergillusversicolor),因此被称为变色曲霉W1。
变色曲霉(Aspergillusversicolor)W1已于2013年12月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所),保藏登记号为CGMCCNO.8571。
实施例2、利用变色曲霉W1制备鬼臼毒素单葡萄糖苷和鬼臼毒素
一、培养变色曲霉W1
马铃薯葡萄糖液体培养基的组成为:去皮马铃薯200g、葡萄糖20g,加水定容至1000mL。马铃薯葡萄糖液体培养基的制备方法:将马铃薯去皮,切成约2cm2的小块,放入烧杯中煮沸30min,然后用双层纱布过滤,取滤液加入葡萄糖,再补足水,pH自然。将100ml马铃薯葡萄糖液体培养基装于250ml三角瓶中,灭菌备用。
将变色曲霉W1的单菌落接种至100ml马铃薯葡萄糖液体培养基,28℃、120r/min振荡培养7天。
二、制备粗提物
1、取步骤一得到的发酵体系,采用抽滤器分离并收集菌丝体。
2、取步骤1得到的菌丝体,用100ml的甲醇悬浮,然后进行超声破碎(功率150W,工作20s停10s,循环3-4次),然后室温静置1小时,然后用抽滤器进行抽滤,分别收集滤液和破碎菌丝体。
3、取步骤2得到的破碎菌丝体,加入100毫升甲醇,然后室温静置1小时,然后用抽滤器进行抽滤,分别收集滤液和破碎菌丝体。
4、取步骤3得到的破碎菌丝体,加入100毫升甲醇,然后室温静置1小时,然后用抽滤器进行抽滤,分别收集滤液和破碎菌丝体。
5、取步骤4得到的破碎菌丝体,加入100毫升甲醇,然后室温静置1小时,然后用抽滤器进行抽滤,分别收集滤液和破碎菌丝体。
6、取步骤5得到的破碎菌丝体,加入100毫升甲醇,然后室温静置1小时,然后用抽滤器进行抽滤,收集滤液。
7、将步骤2得到的滤液、步骤3得到的滤液、步骤4得到的滤液、步骤5得到的滤液和步骤6得到的滤液合并,减压蒸馏,得到浸膏(又称粗提物)。
三、HPLC分析
取步骤二得到的粗提物,用甲醇溶解,然后用0.45μm微孔滤膜过滤并收集滤液,采用外标法进行高效液相色谱分析。分别以鬼臼毒素单葡萄糖苷标准品和鬼臼毒素标准品作为对照。
具体的参数如下:
高效液相色谱仪:Aglient1100型;
色谱柱:Aglient1100EclipseXDB-C18(5μm,4.6×150mm);
检测器:紫外检测器;检测波长:254nm;
色谱条件:流动相:甲醇:水=60:40(体积比;ml/ml);
流速:0.5ml/min;
进样量:5μl;
柱温:室温。
鬼臼毒素单葡萄糖苷标准品和鬼臼毒素标准品的图谱见图1(PG:鬼臼毒素单葡萄糖苷标准品;P:鬼臼毒素标准品)。鬼臼毒素单葡萄糖苷标准品的峰值对应的保留时间为8.594分钟。鬼臼毒素标准品的峰值对应的保留时间为13.097分钟。
粗提物的的谱图见图2。可以观察到,在保留时间为8.537分钟处具有峰值(该峰值与鬼臼毒素单葡萄糖苷标准品的峰值在仪器允许误差范围内,两者为同一物质),在保留时间为12.978分钟处具有峰值(该峰值与鬼臼毒素标准品的峰值在仪器允许误差范围内,两者为同一物质)。结果表明,粗提物中含有鬼臼毒素单葡萄糖苷和鬼臼毒素。
Claims (3)
1.变色曲霉(Aspergillusversicolor)W1,它的保藏编号为CGMCCNO.8571。
2.权利要求1所述变色曲霉在制备鬼臼毒素单葡萄糖苷和/或鬼臼毒素中的应用。
3.一种制备鬼臼毒素单葡萄糖苷和/或鬼臼毒素的方法,包括如下步骤:发酵培养权利要求1所述变色曲霉,得到鬼臼毒素单葡萄糖苷和/或鬼臼毒素。
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CN109504647B (zh) * | 2019-01-04 | 2020-08-18 | 湖南农业大学 | 一种杂色曲霉hy12菌株的培养方法 |
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Also Published As
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