CN102907252A

CN102907252A - 荷叶离褶伞菌丝体中试发酵工艺

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Publication number: CN102907252A
Application number: CN2011102252075A
Authority: CN
Inventors: 魏生龙
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-08-05
Filing date: 2011-08-05
Publication date: 2013-02-06

Abstract

本发明公开一种荷叶离褶伞菌丝体中试发酵工艺。在荷叶离褶伞菌丝体摇瓶发酵条件研究结果的基础上，采用均匀设计，在200L发酵罐中，对荷叶离褶伞菌丝体中试发酵条件与培养基配方进行了优化研究，结果表明荷叶离褶伞中试发酵的最佳条件为：搅拌转速160r/min、罐压0.2MPa、通气量80L/h、pH 6.5、温度20℃、接种量10％；最佳培养基配方为：玉米面5％、大豆0.5％、；麸皮5％、0.025％ZnSO₄、0.05％MgSO₄、0.05％KH₂PO₄。发酵至第8d菌丝体生物量达到10.578g/L，第9d胞外多糖(Exopolysaccharides，EPS)产量1.212g/L。

Description

荷叶离褶伞菌丝体中试发酵工艺

技术领域

本发明涉及一种食用菌菌丝体工厂化发酵生产工艺。

背景技术

荷叶离褶伞Lyophyllum decastes(Fr.)Singer是一种珍稀野生食用菌，分布在甘肃祁连山国家级自然保护区海拔2300-3200m的金露梅potenlilla fruticosa灌木丛和青海云杉林地中；经测定，荷叶离褶伞菌丝体中必需氨基酸是氨基酸总量的35.3％，高于香菇和金针菇(参见菌物学报，席亚丽等2010)；化学评分为73.4，高于子实体和金针菇；氨基酸比值系数分分别是荷叶离褶伞子实体、香菇和金针菇的1.18、1.59、和1.23倍，说明菌丝体中蛋白质的均衡性优于子实体、金针菇和香菇，营养价值比子实体高，极具生产和食用价值。如何规模化发酵生产荷叶离褶伞菌丝体，开发荷叶离褶伞菌丝体，是一项急迫而有价值的工作。

发明内容

鉴于上述，本发明的目的是提供一种荷叶离褶伞菌丝体中试发酵工艺，既在中试条件下生产荷叶离褶伞菌丝体，为工厂化生产提供依据。对培养基配方和培养条件进行了优化，对发酵周期进行了测定。

本发明的目的是通过以下措施来达到：

一种荷叶离褶伞菌丝体中试发酵工艺，其步骤是

a.供试菌种

荷叶离褶伞菌种由河西学院食用菌研究所提供，菌种保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，菌种保藏号CGMCC No.1518，菌株号ZY48-1，专利号：ZL200510096405.0

b.液体菌种培养基的制备

将玉米面加水调制成悬液，加入0.1％淀粉酶，于70℃水浴锅中酶解5h；大豆先用水浸泡24h，用豆浆机打浆，加入0.1％蛋白酶，于55℃水浴锅中酶解5h；麸皮加水调制成悬液，加入0.1％蛋白酶，于55℃水浴锅中水解5h，然后用300目筛过滤，滤液中加入白糖，加水定容；

c.液体菌种培养

将供试试管菌种置于22℃恒温箱内活化24h，接入100mL/250mL三角瓶中，置于22℃、转速120r/min的恒温摇床上，连续培养7d，将该菌种接入20L液体菌种培养罐中，接种量10％，恒温22℃、通气量20L/h，连续培养7d获得液体菌种；

d.荷叶离褶伞菌丝生产

将上述玉米面、大豆、麸皮的水解过滤液加入200L发酵罐，加水定容至150L，然后加入ZnSO₄、MgSO₄、KH₂PO₄和PPE聚醚消泡剂，121℃灭菌1h，冷却至25℃，接入10％的液体菌种，搅拌，转速为160r/min、罐压0.2MPa、通气量80L/h、pH 6.5、温度20℃的培养条件，连续培养，于接菌后第2天开始，每天测定菌丝体菌丝体生物量(g/L)和胞外多糖产量(g/L)，直第8d。

本发明的优点和产生的有效效果是：

菌丝体发酵生产所需原料以农产品玉米和大豆为主，具有来源广泛，价格低廉，取材容易，安全可靠之优点；发酵条件易于满足；发酵技术易于掌握；本工艺使空气搅拌和机械搅拌相结合，使用的菌种和本发明技术方案相结合；缩短了发酵周期，提高了生产效率；可满足工厂化生产的需要。发酵至第8d菌丝体生物量可达10.578g/L，第9d胞外多糖产量可达1.212g/L。

附图说明：

图1为本发明培养时间对荷叶离褶伞菌丝体生物量及粗多糖产量的影响。

具体实施方式

本发明使用的仪器与试剂

淀粉酶、中性蛋白酶(北京奥博星生物技术有限公司)；PPE聚醚消泡剂(杭州肯明精细化工有限公司)；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂，型号：RE52CS-1)；冷冻干燥机(北京松源华兴科技发展有限公司，型号：LGJ-18)；恒温摇床(上海智城分析仪器有限公司，型号：ZHWY-200B)；20L、200L发酵罐(北京中蕈农业发展有限公司)。

荷叶离褶伞菌丝体发酵条件优化

以荷叶离褶伞菌丝体摇瓶发酵条件(席亚丽等2011)为依据，在200L发酵罐中，加入150L液体菌种培养液，以转速、罐压、通气量、初始pH值、温度、接种量6个因素的不同水平，做均匀设计U₁₀(10⁶)，组成10种发酵培养条件组合(见表1)。在不同发酵条件组合下连续培养，于第8d取样，每次取样3个重复，每个重复取样量为500mL，用300目筛过滤，经真空冷冻(-70℃12h)干燥后称重，得菌丝体生物量(g/L)；滤液分别用4000r/min离心机离心10min，取上清液50mL，用旋转蒸发仪浓缩至25mL以下，然后加水定容到25mL，加入等体积95％酒精，在2-4℃冰箱中保藏24h，之后离心(4000r/min)10min，将沉淀置于鼓风干燥箱中(35℃)烘干，称重，得到胞外多糖产量(g/L)。

表1.发酵条件优化的均匀设计试验方案及实验结果

采用DPSv3.01统计软件对表1数据进行逐步回归分析，得到菌丝体干重(Y)和各因素关系的方程：Y＝-5.9429+0.0222*A+0.1142*C-0.1070*E+0.6004*F

经检验，回归方程显著(p＝0.0203)，复相关系数R＝0.9314，剩余标准差S＝0.9098，Durbin-Watson统计量d＝1.5998，结果表明：不同水平pH值和罐压对荷叶离褶伞菌丝体产量无显著影响(p)0.10)，以搅拌转速180r/min，罐压0.2MPa，通气量80L/h，pH值6.5，温度20℃，接种量10％为培养条件，菌丝体生物量最高。但搅拌转速为180r/min时，菌丝细碎，发酵液粘稠，难过滤。在其他条件不变的情况下，转速降至160r/min，过滤难度明显降低，菌丝体生物量95％的置信区间为[8.8259，12.3923]，经过最佳培养条件培养验证，其菌丝体生物量为9.5432g/L，在预测范围内，且均大于上述10组的测量值，故，此培养条件可作为工厂化发酵的最佳培养条件。

荷叶离褶伞菌丝体中试发酵的最佳培养条件为：

搅拌转速160r/min、罐压0.2MPa、通气量80L/h、pH 6.5、温度20℃、接种量10％。

荷叶离褶伞菌丝体培养基优化

以荷叶离褶伞菌丝体摇瓶培养研究得到的最适碳源、氮源、矿质营养及最适培养基配方为优化设计参考，以玉米面、大豆、白糖和麸皮为重点考察对象，利用

v12.50高级版的试验设计功能，以中心化偏差为均匀性度量指标，经过计算机多次运行寻优获得4因素8水平的均匀设计方案(见表2)，组成8种培养基配方，玉米面、大豆和麸皮液体菌种培养基的制备方法见前所述。

表2.培养基优化的均匀设计试验方案及实验结果

采用DPSv3.01统计软件对表2数据进行逐步回归分析，得到菌丝体干重和各因素关系的方程：

Y＝-0.6152+1.2875*A+12.1146*B

经检验，回归方程极显著(p＝0.0002)，复相关系数R＝0.9818，剩余标准差S＝0.7131，Durbin-Watson统计量d＝1.5220，该方程显示，在该实验中白糖和麸皮的不同水平对荷叶离褶伞菌丝体的产量影响较小(p＞0.1)。由该模型得到的最佳培养基配方(重量百分比)是：玉米面5％、大豆0.50％、ZnSO40.025％、MgSO4 0.05％、KH2PO40.05％。在此培养基上菌丝体生物量95％的置信区间是[10.4819，13.2773]，经过最佳培养验证，其菌丝体产量为10.5780g/L，在预测范围内，且均大于上述8组的测量值，因此，此培养基配方可作为最佳培养基应用于工厂化生产中。

荷叶离褶伞菌丝体中试发酵的最佳培养基配方(重量百分比)为：

玉米面5％、大豆0.50％、ZnSO₄0.025kg、MgSO₄ 0.05kg、KH₂PO₄ 0.05kg；PPE聚醚消泡剂，0.001kg。

荷叶离褶伞菌丝体发酵周期测定

在200L发酵罐中，加入150L优化后的最佳培养基，以搅拌转速160r/min，罐压0.2MPa，通气量80L/h，pH值6.5，温度20℃，接种量10％为培养条件，接菌后，每隔24h取样，每次取样3次重复，每个重复取样量为500mL。观察培养液颜色、菌球形状、测定pH值、菌丝体生物量(g/L)和胞外多糖产量(g/L)，测定方法同上。绘制培养时间与菌丝体生物量和胞外多糖产量关系图，得到荷叶离褶伞菌丝体发酵周期

荷叶离褶伞菌丝体发酵周期研究

图1表明：发酵开始后的前8d内，菌丝体生物量和胞外多糖产量都在增加，8d以后，菌丝体产量增幅减少。方差分析结果表明：发酵第8d的菌丝体生物量(10.578g/L)与第9d(10.853g/L)、10d(11.024g/L)的差异不显著(p＞0.05)，与其他各天的菌丝体产量差异显著。胞外多糖产量在第9d(1.212g/L)达到最高，与其他各天的胞外多糖产量相比均达到显著差异(p＜0.05)。整个发酵过程中pH值变化不显著。为此从经济角度考虑，第8d收获菌丝体和胞外多糖较为适宜。

发酵周期为

荷叶离褶伞菌丝体发酵至第8天以后，其生物量增加不显著，胞外多糖产量第9d后开始下降，从经济角度计，第8d收获菌丝体较为适宜。发酵条件优化的均匀设计试验方案及实验结果见表3。

表3.发酵条件优化的均匀设计试验方案及实验结果

采用DPSv3.01统计软件对表3数据进行逐步回归分析，得到菌丝体干重(Y)和各因素关系的方程：Y＝-5.9429+0.0222*A+0.1142*C-0.1070*E+0.6004*F

经检验，回归方程显著(p＝0.0203)，复相关系数R＝0.9314，剩余标准差S＝0.9098，Durbin-Watson统计量d＝1.5998，结果表明：不同水平pH值和罐压对荷叶离褶伞菌丝体产量无显著影响(p)0.10)，以搅拌转速180r/min，罐压0.2MPa，通气量80L/h，pH值6.5，温度20℃，接种量10％为培养条件，菌丝体生物量最高。但搅拌转速为180r/min时，菌丝细碎，发酵液粘稠，难过滤。在其他条件不变的情况下，转速降至160r/min，过滤难度明显降低，菌丝体生物量95％的置信区间为[8.8259，12.3923]，经过最佳培养条件培养验证，其菌丝体生物量为9.5432g/L，在预测范围内，且均大于上述10组的测量值，故，此培养条件可作为工厂化发酵的最佳培养条件。培养基优化的均匀设计试验方案及实验结果见表4。

表4.培养基优化的均匀设计试验方案及实验结果

采用DPSv3.01统计软件对表4数据进行逐步回归分析，得到菌丝体干重和各因素关系的方程：

Y＝-0.6152+1.2875*A+12.1146*B

经检验，回归方程极显著(p＝0.0002)，复相关系数R＝0.9818，剩余标准差S＝0.7131，Durbin-Watson统计量d＝1.5220，该方程显示，在该实验中白糖和麸皮的不同水平对荷叶离褶伞菌丝体的产量影响较小(p＞0.1)。由该模型得到的最佳培养基配方是：玉米面5％、大豆0.50％、ZnSO4 0.025kg、MgSO40.05kg、KH2PO40.05kg和PPE聚醚消泡剂，0.001kg，在此培养基上菌丝体生物量95％的置信区间是[10.4819，13.2773]，经过最佳培养验证，其菌丝体产量为10.5780g/L，在预测范围内，且均大于上述8组的测量值，因此，此培养基配方可作为最佳培养基应用于工厂化生产中。

一种荷叶离褶伞菌丝体中试发酵工艺，其步骤是

a.供试菌种

b.液体菌种培养基制备

将5kg玉米面加100kg水调制成悬液，加入0.1％淀粉酶，于70℃水浴锅中酶解5h；0.50kg大豆先在100kg水中浸泡24h，用豆浆机打浆，加入0.1％蛋白酶，于55℃水浴锅中酶解5h；然后将玉米面、大豆混合液，过300目筛，加水定容；

c.液体菌种培养

将供试试管菌种置于22℃恒温箱内活化24h，接入三角瓶(100mL/250mL)中，置于22℃、转速120r/min的恒温摇床上，连续培养7d，将该菌种接入20L液体菌种培养罐中，接种量10％，恒温22℃、通气量20L/h，连续培养7d获得液体菌种；

d.荷叶离褶伞菌丝生产

将上述玉米面、大豆的水解过滤液加入200L发酵罐，加水定容至150L，然后加入0.025kgZnSO₄、0.05kgMgSO₄、0.05kgKH₂PO₄和0.001kg PPE聚醚消泡剂，121℃灭菌1h，冷却至25℃，接入10％的液体菌种，给予搅拌转速160r/min、罐压0.2MPa、通气量80L/h、pH 6.5、温度20℃的培养条件，连续培养，于接菌后第2天开始，每天测定菌丝体菌丝体生物量(g/L)和胞外多糖产量(g/L)，直第8d。第8d，菌丝体菌丝体生物量为10.578g/L。

Claims

1.一种荷叶离褶伞菌丝体中试发酵工艺，其步骤是：

a.供试菌种

荷叶离褶伞菌种由河西学院食用菌研究所提供，菌种保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，菌种保藏号CGMCC No.1518，菌株号ZY48-1，专利号：ZL200510096405.0；

b.液体菌种培养基的制备

将玉米面加水调制成悬液，加入0.1％淀粉酶，于70℃水浴锅中酶解5h；大豆先用水浸泡24h，用豆浆机打浆，加入0.1％蛋白酶，于55℃水浴锅中酶解5h；然后将玉米面、大豆混合液，过300目筛，加水定容；

c.液体菌种培养

d.荷叶离褶伞菌丝生产

将b步骤玉米面、大豆、麸皮的水解过滤液加入200L发酵罐，加水定容至150L，然后加入ZnSO₄、MgSO₄、KH₂PO₄和PPE聚醚消泡剂，121℃灭菌1h，冷却至25℃，接入10％的液体菌种，搅拌，转速为160r/min、罐压0.2MPa、通气量80L/h、pH 6.5、温度20℃的培养条件，连续培养，于接菌后第2天开始，每天测定菌丝体菌丝体生物量(g/L)和胞外多糖产量(g/L)，直第8d。