CN108707556B - 一种横梗霉菌菌株及其在生产纤维素酶中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种横梗霉菌菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2018230。相对于其他产纤维素酶的丝状真菌，本发明所述的横梗霉菌菌株具有生长繁殖速度快和所产纤维素酶活力高的特点，具备更加高效地分解纤维素的能力。

Description

一种横梗霉菌菌株及其在生产纤维素酶中的应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，尤其是涉及一种横梗霉菌菌株及其在生产纤维素酶中的应用。

背景技术

纤维素中的碳元素含量很高，而碳元素是粮食和燃料中的主要物质。鉴于全球纤维素含量惊人，若人们能够有效利用纤维素则可以对粮食和能源危机有所缓解。但是，纤维素不能直接作为粮食和燃料使用，其需要被纤维素酶水解生成葡萄糖，以葡萄糖的形式或葡萄糖经过进一步反应生成的含碳物质的形式加以利用。因此，若想利用纤维素，首先需要生产大量纤维素酶。

经过观察人们发现，丝状真菌只需植物细胞壁作为能源物质就可以进行大量繁殖，而植物细胞壁的主要成分为纤维素，可见，丝状真菌能够生成纤维素酶，以水解植物细胞壁中的纤维素获得营养物质。

相比于其他产纤维素酶的微生物，丝状真菌具有以下优点：一、产生的纤维素酶为胞外酶，便于分离和提取；二、产酶效率高，且产生的纤维素酶酶系结构较为合理。从工业化制备及应用纤维素酶的角度出发，研究和采用丝状真菌产酶具有重大意义。目前，关于产纤维素酶的丝状真菌，研究较多的有红褐肉座菌、粗糙脉胞菌、草酸青霉菌、康氏木霉菌、里氏木霉菌、黑曲霉菌、芽孢杆菌、横梗霉菌等。

发明内容

基于此，本发明的一个目的在于，提供一种新的丝状真菌，其属于横梗霉菌属。

本发明采用的技术方案如下：

一种横梗霉菌菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2018230。

相对于其他产纤维素酶的丝状真菌，本发明所述的横梗霉菌菌株具有生长繁殖速度快和所产纤维素酶活力高的特点，具备更加高效地分解纤维素的能力。

本发明的另一个目的在于提供所述的横梗霉菌菌株在纤维素酶生产中的应用。

进一步地，所述的横梗霉菌株的培养方法包括以下步骤：

S1接种：所述横梗霉菌株以1.0×10⁵～5.0×10⁶个/ml接种浓度、0.5％～8％菌液与培养基体积比接种量接种于培养基中；

S2培养：将接种有所述横梗霉菌株的培养基，于28℃，恒温培养12～72小时。

进一步地，所述培养基包括以下重量份的原料：马铃薯20份、葡萄糖2份、琼脂12份、MgSO₄ 3份、KH₂PO₄ 1.5份、维生素B₁ 0.008份、无菌水1000份。

进一步地，步骤S1中的接种浓度为2.5×10⁶个/ml。

进一步地，步骤S1中的菌液与培养基体积比接种量为1％。

进一步地，步骤S2中的培养时长为60小时。

进一步地，步骤S2中，于28℃培养时，以150～220rpm速度摇动。

进一步地，所述纤维素酶的生产包括以下步骤：

S1接种：所述横梗霉菌株以1.0×10⁵～5.0×10⁶个/ml接种浓度、0.5％～8％菌液与培养基体积比接种量接种于培养基中；

S2培养：将接种有所述横梗霉菌株的培养基，于28℃、150～220rpm，恒温培养12～72小时；

S3离心：培养结束后，离心去除沉淀，留取上清液。所述上清液为含有本发明所述的横梗霉菌菌株所产纤维素酶的液体。

相对于现有技术，本发明所述横梗霉菌菌株所产的纤维素酶具有更加宽泛的pH适应范围和温度适应范围，有利于适应工业操作。

为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。

附图说明

图1为本发明所述的横梗霉菌菌株的菌落形态图；其中，a图为培养24小时的菌落形态图，b图为培养48小时后的菌落形态图。

图2为本发明所述的横梗霉菌菌株ITS序列的PCR扩增核酸电泳图；

图3为基于本发明所述的横梗霉菌菌株与相似菌种的ITS序列条形码构建的进化树；

图4为本发明所述的横梗霉菌菌株与横梗霉属菌株Lichtheimia Ramosa strainM8(KP132382)的ITS序列比对图；

图5为本发明所述的横梗霉菌菌株培养48小时后的纤维素酶定性试验结果图；

图6为本发明所述的横梗霉菌菌株培养48小时后的纤维素酶定性试验数据分析图；

图7为不同接种量培养本发明所述的横梗霉菌菌株与所得纤维素酶的酶活关系图；

图8为不同时长培养本发明所述的横梗霉菌菌株与所得纤维素酶的酶活关系图；

图9为本发明所述的横梗霉菌菌株所产纤维素酶的最适pH图；

图10为本发明所述的横梗霉菌菌株所产纤维素酶的最适温度图；

具体实施方式

本发明所述的横梗霉菌菌株，命名为Lichtheimia Ramosa XWLR1，于2018年4月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国湖北省武汉市武汉大学校内中国典型培养物保藏中心)，保藏编号为CCTCC NO:M 2018230。

实施例一：分离纯化方法

本发明所述的横梗霉菌菌株的分离纯化方法，步骤如下：

S1：称取10g的土壤样品，所述土壤样品来自广州徐闻农垦丰收农场；然后，于超净工作台中，向土壤样品中添加90ml无菌水，置于振荡器上振荡60min，使土样均匀地分散在稀释液中成为土壤悬液；待土壤分散后，吸取100ul土壤悬液到900ul无菌水中得到10倍稀释液，然后依次稀释10倍，得到100倍和1000倍稀释液，整个过程在超净工作台中进行。

S2：取100ul的10倍稀释液、100倍稀释液和1000倍稀释液分别涂布于三个PDA固体培养板，然后将培养板置于培养箱28℃恒温培养2～3天，培养板上长出菌斑。

S3：培养结束后，根据菌落生长情况从适当稀释梯度平板一一挑取形状、颜色、大小等不同的单菌斑进行平板划线，分离出本发明所述的横梗霉菌菌株。本发明所述的横梗霉菌菌株在PDA固体培养板上的形态如图1所示，划线24小时后，白色菌丝絮状散发性生长，菌丝长大约1.0～1.5cm(见图1a)；48小时后，白色菌丝大量散发状生长，布满整个平板(见图1b)。

S4：从PDA平板上挑取已纯化培养的菌株，接种于内含200ml PDA液体培养基的500ml锥形瓶中，在28℃，180rpm恒温摇床培养条件下培养72h，制得种子液；

S5：将种子液用400目纱布过滤除去滤液，获得菌丝体，使用无菌研钵对菌丝体进行研磨释放孢子，用适量无菌水冲洗过滤获得孢子悬浮液。

所述PDA固体培养基配方为：马铃薯200份、葡萄糖20份、琼脂12份、MgSO₄ 3份、KH₂PO₄1.5份、维生素B₁0.008份、无菌水1000份；配制方法为：准确称取200份马铃薯，切成小块，放入自来水中煮沸20min，经冷却后用400目纱布过滤获得马铃薯汁，再准确添加各组分，最后用自来水定容，分装至锥形瓶，置于灭菌锅内121℃、101KPa高压蒸汽灭菌20min，待灭菌锅温度降至70℃以下，压力恢复至0KPa时取出，于超净台上倒入培养皿中，每个培养皿约倒入10ml培养基，冷却凝固后，将固体培养板于4℃保存。

所述PDA液体培养基配方为：马铃薯200份、葡萄糖20份、NaCl 3份、KH₂PO₄ 1.5份、维生素B1 0.008份、无菌水1000份；制作方法为：准确称取200份马铃薯，切成小块，放入水中煮沸20min后，冷却后用400目纱布过滤获得马铃薯汁，再准确添加各组分，最后定容，分装至锥形瓶，置于灭菌锅内121℃、101KPa高压蒸汽灭菌20min，待灭菌锅温度降至70℃以下，压力恢复至0KPa时取出，保存备用。

实施例二：培养方法

S1接种：将实施例一所得的孢子悬浮液以1.0×10⁶个/ml接种浓度、2％菌液与培养基体积比接种量接种于内含300ml PDA液体培养基的1000ml锥形瓶中；

S2培养：将接种有所述横梗霉菌株的培养基，于28℃、180rpm恒温摇床条件下培养72h，制得本发明所述的横梗霉菌菌液。

由于本发明所述的横梗霉菌在生长过程中，能够分泌纤维素酶到细胞外部，即分泌纤维素酶到培养液中。因此，S3中所得的横梗霉菌菌液离心沉淀掉菌体，留取的上清液即为含有纤维素酶的液体，简称粗酶液。可见，对本发明所述横梗霉菌菌液的培养方法，加上离心留上清操作，即为利用本发明所述横梗霉菌生产纤维素酶的方法。

所述PDA液体培养基配方为：马铃薯200份、葡萄糖20份、NaCl 3份、KH₂PO₄ 1.5份、维生素B1 0.008份、无菌水1000份；制作方法为：准确称取200份马铃薯，切成小块，放入水中煮沸20min后，冷却后用400目纱布过滤获得马铃薯汁，再准确添加各组分，最后定容，分装至锥形瓶，置于灭菌锅内121℃、101KPa高压蒸汽灭菌20min，待灭菌锅温度降至70℃以下，压力恢复至0KPa时取出，保存备用。

实施例三：PCR扩增ITS序列并测序

S1：取基因组DNA

首先，取实施例一中所述的孢子悬浮液200ul于无菌的1.5ml离心管中，12000rpm离心2min，弃上清保留沉淀；然后，用2％CTAB缓冲液重悬沉淀，并加入20ul蛋白酶K(20mg/ml)，置于振荡器上振荡20～30s，55℃水浴4h以上或过夜(间隔半小时振荡一次)；接着，将经蛋白酶K消化后的抽提液从水浴锅中取出，室温下冷却，加入600ul氯仿，振荡混匀后12000rpm离心10min，获得上清液；接下来，将上清液倒入新的1.5ml离心管中，加入300ul室温保存的100％异戊醇溶液混匀，上下颠倒混匀后置于4℃冰箱保存一个小时以上，12000rpm离心10min，弃上清，获得DNA沉淀；最后，DNA沉淀用70％乙醇300ul洗涤1～2次，然后将离心管倒置，让其自然晾干，用30ul～50ul ddH2O溶解DNA沉淀,得到基因组DNA，4℃冰箱中保存过夜后，-20℃保存备用。

S2：PCR扩增ITS序列

以步骤S1所得基因组DNA为模板，ITS1和ITS4为引物进行PCR扩增，PCR反应体系(50ul)如下：

PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s、55℃复性30s、72℃延伸1min，变性、复性和延伸的过程反复循环30次；72℃再延伸10min，4℃保存PCR扩增产物。

所述上游引物ITS1的序列为：tccgtaggtgaacctgcgg

所述下游引物ITS4的序列为：tcctccgcttattgatatgc

S3：PCR产物进行核酸电泳

取5ul步骤S2所得的PCR产物点样后于120V电压下进行核酸电泳30min。电泳结果如附图2所示，以本发明所述的横梗霉菌菌株的基因组DNA为模板扩增出的ITS片段条带单一且亮度高，且ITS序列长度约为800bp。

S4：ITS序列进行测序

步骤S2所得的PCR产物经纯化回收后，取5ul纯化产物送广州擎科生物技术有限公司进行序列双向测通测定，测序结果显示本发明所述横梗霉菌菌株的ITS序列长度为787bp，具体序列如下所示：

实施例四：构建系统进化树

将实施例三所得的本发明所述横梗霉菌菌株的ITS序列输入NCBI中，进行BLAST比对，并基于条形码ITS区段序列构建NJ系统进化树。如附图3所示，根据系统进化树本发明所得的菌株，与横梗霉属菌株的ITS条形码数据库中大部分序列高度相似但不存在完全重合，也没有唯一邻近的物种序列。因此可知，本发明所得的菌株在分类上属于横梗霉属Lichtheimia，且为一个新种。

实施例五：近源物种比对

将实施例三所得的本发明所述横梗霉菌菌株的ITS序列输入NCBI中，与横梗霉属菌株Lichtheimia ramosa strain M8(KP132382)的ITS序列进行比对，比对结果如附图4所示，本发明所述横梗霉菌菌株的ITS序列与Lichtheimia ramosa strain M8(KP132382)的ITS序列同源性很高达到99.12％但并不完全相同，两者之间存在6个碱基的差异。进一步看出，本发明所得的菌株在分类上属于横梗霉属Lichtheimia，且为横梗霉属的一个新的菌种，暂时命名为Lichtheimia ramose XWLR1。

实施例六：纤维素酶定性试验

S1：取实施例一所得的孢子悬浮液以2.15×106个/ml接种浓度、2％菌液与培养基体积比接种量分别接种于内含300ml PDA液体培养基的1000ml锥形瓶中，在28℃、180rpm恒温摇床条件下培养48h，制得本发明所述的横梗霉菌菌液。

S2：分别取菌液的上清液，12000rpm离心2min获得粗酶液，将粗酶液经0.22um滤膜过滤获得无菌酶液。

S3：取无菌培养皿数个，每个培养皿倒入30ml纤维素酶定性培养基，待其自然冷却，进行打孔，每个培养皿中打四个孔。

S4：取步骤S2获得的无菌酶液和1mg/ml的标准纤维素酶液进行点样，每个孔的上样量均为20ul，其中，三个孔点入无菌酶液，一个孔点入标准纤维素酶液。

S5：点样后将定性培养皿置于恒温培养箱中37℃恒温培养48h。

S6：恒温培养结束后，先向定性培养皿中加入3ml 0.2％刚果红溶液，静置30min后倒出，再加入3ml 1M NaCl溶液，洗脱15min后倒出，最后再加入3ml 5％乙酸钠溶液固定10min。观察此时定性培养皿上的透明圈大小并计算出酶活力大小。

其中，所述纤维素酶定性培养基组分及制作方法如下：蛋白胨5g、酵母粉0.5g、KH2PO41.5g、MgSO4 0.2g、NaCl 5g、CMC-Na 10g、琼脂12g，加水定容至1000ml。分装后121℃高温灭菌20min，取出备用。

如图5所示，点入无菌酶液的三个孔与点入标准纤维素酶液的一个孔均对侵蚀了孔周围的培养基，说明所述无菌酶液即本发明所述的横梗霉菌菌液与标准纤维素酶液一样含有可以水解羧甲基纤维素钠(CMC-Na)的成分——纤维素酶，可见，本发明所述的横梗霉菌菌株具有纤维素酶活性，能够分泌纤维素酶。

如图6所示，计算点入无菌酶液孔的透明圈直径与点入标准纤维素酶液孔的透明圈直径的比值，参照纤维素酶标准品的纤维素酶活，可得出本发明所述的横梗霉菌菌株的纤维素酶活约为21.85U/ml。而现有已知的产纤维素酶的丝状真菌，如里氏木霉菌野生菌株(TreeseiQM6a)的纤维素酶活约为16.20U/ml，棘孢木霉(T.asperellum T-1)的纤维素酶活约为15.10U/ml。可见，本发明所述的横梗霉菌菌株的纤维素酶活相较于现有已知的丝状真菌的纤维素酶活有明显提升，说明本发明所述的横梗霉菌菌株相较于现有已知的丝状真菌能够生产更多的纤维素酶，具备更加高效地分解纤维素的能力。

实施例七：生产纤维素酶的方法

S1接种：将实施例一所得的孢子悬浮液以1.0×106个/ml接种浓度、2％菌液与培养基体积比接种量接种于内含300ml PDA液体培养基的1000ml锥形瓶中；

S2培养：将接种有所述横梗霉菌株的培养基，于28℃、180rpm恒温摇床条件下培养72h，制得本发明所述的横梗霉菌菌液。

S3离心：培养结束后，离心去除沉淀，留取上清液。所述上清液即为含有本发明所述的横梗霉菌菌株所产的纤维素酶的液体，简称粗酶液。

其中，所述PDA液体培养基的配方和配制方式见实施例一。

实施例八：筛选产最佳酶活状态纤维素酶的菌株培养条件

筛选最优接种量

S1：取实施例一所得的菌株孢子悬液以2.15×106个/ml接种浓度，分别以0.5％、1％、2％、4％、8％菌液与培养基体积比接种量接种于内含300ml PDA液体培养基的1000ml锥形瓶中，在28℃、180rpm摇床条件下恒温振荡培养60小时后，吸取10ml菌液，12000rpm离心2min获得粗酶液；

S2：采用DNS法以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为底物，检测不同接种量所得的粗酶液的纤维素酶酶活。

其中，DNS法具体步骤如下：

1)羧甲基纤维素钠溶液制备：准确称取2g羧甲基纤维素钠于烧杯中(精确至1mg)，缓慢加入200mL磷酸缓冲液(pH＝6.7)，边加热边搅拌至80～90℃，直至溶液澄清透明，加入磷酸缓冲液至接近300mL，缓慢滴加2mol/L的盐酸或氢氧化钠溶液调节pH值至7.0±0.05，容量瓶定容至300mL，4℃保存备用。

2)DNS试剂制备：600mL的蒸馏水溶解10.00±0.10g 3,5-二硝基水杨酸，边搅拌边加入10g NaCl，边搅拌边加热至50℃，缓慢加入酒石酸钾钠200g，重蒸苯酚2g和无水亚硫酸钠5g，搅拌直到溶解完全(溶液澄清)，冷却至室温，蒸馏水定容至1000mL，棕色瓶室温条件下暗处保存7d后使用。

3)于5mL离心管中加入2mL羧甲基纤维素钠溶液作为底物，然后加入0.5mL制备的粗酶液，每个样做三个实验平行组，同时另取一组不加粗酶液作为空白对照，振荡均匀；

4)将步骤3)获得的混合样品放入40℃的水浴锅内恒温反应30min；准确反应30min后，立即取0.5mL粗酶液加入恒温反应30min的空白对照组，混匀；

5)分别取实验组反应液及空白组反应液0.5mL加入1.5mL DNS试剂，振荡均匀，沸水显色10min，取出放入冰水中迅速冷却，紫外可见分光光度计570nm处测定吸光度值。得到吸光度值根据葡萄糖标准曲线得到对应的还原糖浓度，从而计算出纤维素酶的酶活力。

酶活计算公式如下所示：

U：纤维素酶酶活力；

W：对照葡萄糖标准曲线得到的葡萄糖浓度；

N：酶液稀释总倍数(8)；

T：反应时间(min)；

1000：mg-μg。

检测结果如附图7所示，当菌液与培养基体积比接种量为1％时，本发明所述的横梗霉菌菌株生产的纤维素酶的酶活最高，达到36.801U/mL；当菌液与培养基体积比接种量小于1％时，纤维素酶酶活明显降低；当菌液与培养基体积比接种量大于1％时，纤维素酶酶活力有所降低。故菌液与培养基体积比接种量为1％是本发明所述的横梗霉菌菌株酶解纤维素能力最佳的接种量。

筛选最优培养时长

S1：取实施例一所得的菌株孢子悬液以2.15×106个/ml接种浓度、2％菌液与培养基体积比接种量接种于内含300ml PDA液体培养基的1000ml锥形瓶中，在28℃，180rpm摇床条件下恒温振荡培养，分别于12h、24h、36h、48h、60h、72h吸取10ml菌液，置于4℃冰箱保存；

S2：从4℃冰箱中取出各时间段的菌液，12000rpm离心2min获得粗酶液，采用如前所述的DNS法以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为底物，检测不同培养时间所得的粗酶液的纤维素酶酶活。

检测结果如附图8所示，本发明所述的横梗霉菌菌株具有明显的产纤维素酶能力，且其产酶能力与菌株的培养时间呈正相关，随着培养时间的增加，其所产纤维素酶的酶活明显提高。当培养时间为60h时，酶活达到峰值，为36.405U/mL，相比纤维素酶标准品(阳性对照)，酶活还要高出21.307U/mL。故培养时间60h为是本发明所述的横梗霉菌菌株酶解纤维素能力最佳的培养时间。

实施例九：筛选本发明所述的横梗霉菌菌株所产纤维素酶的最适条件

(1)最适pH

S1：取实施例一所得的孢子悬液以2.15×106个/ml接种浓度、1％菌液与培养基体积比接种量接种于300ml PDA液体培养基中，于28℃、180rpm摇床条件下恒温振荡培养60h后，吸取10ml菌液，12000rpm离心2min获得粗酶液；

S2：调节S1所得的粗酶液的pH分别为3、5、7、9、10，如前所述的DNS法以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为底物，检测本发明所述的横梗霉菌菌株所产的纤维素酶在不同pH条件下的酶活。

检测结果如附图9所示，本发明所述的横梗霉菌菌株所产的纤维素酶在pH为7.0条件下具有最高酶活，达到36.273U/mL，说明本发明所述的横梗霉菌菌株所生成的纤维素酶酶为中性纤维素酶。另外可以看到，本发明所述的横梗霉菌菌株所生成的纤维素酶的pH值适应范围较广，在pH在3～10的范围内，均具有较高的酶活。而具有较宽的pH适应范围有助于本发明所述的横梗霉菌菌株所生成的纤维素酶更适应工业化生产，因为，在工业化生产中，培养液的pH会不断改变，具有较宽的pH适应范围，能够使其在较宽的pH范围内仍能够有效分解纤维素，从而大大增加了应用范围。

(2)最适温度

S1：取实施例一所得的孢子悬液以2.15×106个/ml接种浓度、1％菌液与培养基体积比接种量接种于300ml PDA液体培养基中，于28℃、180rpm摇床条件下恒温振荡培养60h后，吸取10ml菌液，12000rpm离心2min获得粗酶液；

S2：将S1所得的粗酶液分别置于4℃、20℃、40℃、60℃和80℃下，如前所述的DNS法以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为底物，检测本发明所述的横梗霉菌菌株所产的纤维素酶在不同温度条件下的酶活。

检测结果如附图10所示，本发明所述的横梗霉菌菌株所产的纤维素酶在40℃条件下具有最高酶活，达到37.334U/mL。温度4℃到40℃之间，随温度升高，酶活升高；温度高于40℃后，酶活逐渐下降。但是温度升至80℃时，酶活虽下降，但仍保持22.73U/mL的较高活性，可见，本发明所述的横梗霉菌菌株所产的纤维素酶是一种耐热的纤维素酶，且其最适温度为40℃，适用于工业化生产中的高温环境。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

序 列 表

<110> 华南农业大学

<120> 一种横梗霉菌菌株及其在生产纤维素酶中的应用

<160> 13

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 787

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 本发明所述的横梗霉菌菌株的ITS序列

<400> 1

atctcagttg atttcagatc tagatgtgag tttgtttaag agaagaccca agttagatcc 60

tctcgctagt ccgtaaagat taagacctag ttcaagaaga gactgattga cttggaatta 120

tgaactcact aaccaagtcg ttgctcctca ggcactctag agtctacatc cggcaaatga 180

ctaaagccaa ttgcctagga ctaaatgtat ttaaggccat gacagcaact gaatgccatc 240

aacacaagcc catttccagc tcgcttaggt tcaaagaacc aagttgaact gattggtagt 300

tgcagatact gaaacaactg tgcctagtag attgactact aggcgcaaga tgcgttcgag 360

aactcgatga ttcgctatga atgcaagtcg caataattat cgcactttgc tacgctcttc 420

atcgatgcga gaaccaagag atccattgcc aagagttgtt ttttaagtta acaactaact 480

ttttcgtaca tcatggttta cacgagaaga ataaacacct ttggggatag ttagtactag 540

agccccaaag gcttgccttg cttgctttga ctcgagacat aggtctcctg aaagaagggt 600

ccatacgtct cttttcaagc agcctagatc ttagtagtgg cacaagtctc ctaaaaggag 660

ggtctctatg ccaacaacca gatctacagc acaaggcaga gccaaccaag ttgacccgac 720

tttgcacaaa actgtgagga actactagag gggaagagac ccccaactag tgtttgactc 780

gcagtac 787

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 上游引物ITS1

<400> 2

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 下游引物ITS4

<400> 3

tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (9)

1.一种横梗霉菌菌株(Lichtheimia Ramosa XWLR1)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2018230。

2.权利要求1所述的横梗霉菌菌株在纤维素酶生产中的应用。

3.如权利要求2所述的横梗霉菌菌株在纤维素酶生产中的应用，其特征在于，所述的横梗霉菌株的培养方法包括以下步骤：

S1接种：所述横梗霉菌株以1.0×10⁵～5.0×10⁶个/ml接种浓度、0.5％～8％菌液与培养基体积比接种量接种于培养基中；

S2培养：将接种有所述横梗霉菌株的培养基，于28℃，恒温培养12～72小时。

4.如权利要求3所述的横梗霉菌菌株在纤维素酶生产中的应用，其特征在于，所述培养基包括以下重量份的原料：马铃薯20份、葡萄糖2份、琼脂12份、MgSO₄ 3份、KH₂PO₄1.5份、维生素B₁ 0.008份、无菌水1000份。

5.如权利要求3所述的横梗霉菌菌株在纤维素酶生产中的应用，其特征在于：步骤S1中的接种浓度为2.5×10⁶个/ml。

6.如权利要求3所述的横梗霉菌菌株在纤维素酶生产中的应用，其特征在于：步骤S1中的菌液与培养基体积比接种量为1％。

7.如权利要求3所述的横梗霉菌菌株在纤维素酶生产中的应用，其特征在于：步骤S2中的培养时长为60小时。

8.如权利要求3所述的横梗霉菌菌株在纤维素酶生产中的应用，其特征在于：步骤S2中，于28℃培养时，以150～220rpm速度摇动。

9.如权利要求2所述的横梗霉菌菌株在纤维素酶生产中的应用，其特征在于：所述纤维素酶的生产包括以下步骤：

S1接种：所述横梗霉菌株以1.0×10⁵～5.0×10⁶个/ml接种浓度、0.5％～8％菌液与培养基体积比接种量接种于培养基中；

S2培养：将接种有所述横梗霉菌株的培养基，于28℃、150～220rpm，恒温培养12～72小时；

S3离心：培养结束后，离心去除沉淀，留取上清液，所述上清液为含有本发明所述的横梗霉菌菌株所产纤维素酶的液体。