CN107904178B - 一种莫勒菌的原生质体制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种莫勒菌的原生质体的制备方法,接PDA菌体培养基上健壮菌丝体于PDB液体培养基中，在150rpm，28℃摇床培养36‑54h,再将菌丝用四层无菌纱布过滤后，用无菌的研钵对菌丝进行研磨。将研磨好的菌丝放入PDB培养基中于100rpm，28℃摇床培养16h。再用四层无菌纱布过滤出菌丝，再用无菌药匙将菌丝转入无菌的三角瓶中，并用10mL 0‑0.08%β‑巯基乙醇预处理菌丝体30分钟,采用20‑26.6mg真菌溶壁酶（酶液pH5.6‑6.2），在24‑30℃酶解2.4‑3.3h,用0.4‑0.7mol/L某溶液做渗透压稳定剂时,原生质体数量达到2.2‑3.2×107个/mL,再生率达15%‑45%。

Description

一种莫勒菌的原生质体制备方法
技术领域
本发明属于生物工程中微生物育种的方法,特别涉及一种莫勒菌的原生质体制备方法。
背景技术
莫勒菌系虫生真菌重要成员之一，是粉虱和介壳虫的主要病原真菌，多发生于拉丁美洲和东南亚,我国南方部分省市柑桔区亦有流行。近年来，利用原生质体转化技术把外源抗虫基因转入莫勒菌，有望增加该真菌的致病能力，缩短其作用时间，增强防效和稳定性。
本文从菌丝出发对莫勒菌原生质体的制备的关键因素进行了探索性研究，为利用原生质体高效遗传转化技术和原生质体融合技术培育多功能新型菌株奠定基础。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是:提供一种莫勒菌的原生质体的制备方法,使其原生质体的制备率达到2.2-3.2×107个/mL,再生率达15%-45%。
本发明的技术方案是:
（1）接PDA菌体培养基上健壮莫勒菌菌丝体于PDB液体培养基中，在150rpm，28℃摇床培养36-54h，再将菌丝用四层无菌纱布过滤后，用无菌的研钵对菌丝进行研磨，将研磨好的菌丝放入PDB培养基中于100rpm，28℃摇床培养16h；
（2）再用四层无菌纱布过滤出菌丝，再用无菌药匙将菌丝转入无菌的三角瓶中，并用10mL 0-0.08%β-巯基乙醇处理菌丝体30分钟， 用pH5.6-6.2的磷酸盐缓冲液配制0.4-1.0mol/L的NaCl、KCl、甘露醇或葡萄糖溶液，并用此溶液配制20-26.6mg/mL真菌溶壁酶，在24-30℃酶解2.4-3.3h，用0.4-0.7mol/LNaCl、KCl、甘露醇或葡萄糖溶液做渗透压稳定剂，原生质体数量达到2.2-3.2×107个/mL，再生率达15%-45%。
所述的莫勒菌的原生质体制备方法,最佳工艺参数是:
（1）接PDA菌体培养基上健壮莫勒菌菌丝体于PDB液体培养基中，在150rpm，28℃摇床培养54h,再将菌丝用四层无菌纱布过滤后，用无菌的研钵对菌丝进行研磨，将研磨好的菌丝放入PDB培养基中于100rpm，28℃摇床培养16h；
（2）再用四层无菌纱布过滤出菌丝，再用无菌药匙将菌丝转入无菌的三角瓶中，用10mL 0.01%β-巯基乙醇处理菌丝体30分钟，用pH6.0的磷酸盐缓冲液配制0.7mol/L的NaCl溶液，并用此溶液配制24.2mg/mL真菌溶壁酶，在30℃酶解2.7h，用0.7mol/L NaCl溶液做渗透压稳定剂，原生质体数量达到3.2×107个/mL,再生率达45%。
本发明效果是:
本莫勒菌的原生质体制备方法，
1．制备工艺简单,易操作。
2．原生质体的制备率达到3.2×107个/mL，再生率达45%。
具体实施方式
一种莫勒菌的原生质体制备方法提供了适合制备高莫勒菌原生质体数量的方法。
实施例1-3所用的莫勒菌为赭色小莫勒菌（邱君志等，赭色小莫勒菌在中国的发现. 菌物学报，2009.28(1):148-150）。
实施例1：
（1）接PDA菌体培养基上健壮莫勒菌菌丝体于12瓶PDB液体培养基中，编号为A1、A2、A3，B1、B2、B3，C1、C2、C3，D1、D2、D3，在150rpm，28℃摇床培养54h，再将菌丝用四层无菌的纱布过滤后，用无菌的研钵分别对菌丝进行研磨。将研磨好的菌丝放入各自对应编号的12瓶PDB培养基中于100rpm，28℃摇床培养16h。
（2）用四层无菌的纱布过滤出12瓶培养基中的菌丝，A1、A2、A3分别用0.4mol/L、0.7 mol/L、1.0 mol/L的pH6.0NaCl溶液（由pH6.0的磷酸盐缓冲液配制，下同）冲洗，B1、B2、B3分别用0.4mol/L、0.7 mol/L、1.0 mol/L的pH6.0KCl溶液冲洗，C1、C2、C3分别用0.4mol/L、0.7 mol/L、1.0 mol/L的pH6.0甘露醇溶液冲洗，D1、D2、D3分别用0.4mol/L、0.7 mol/L、1.0 mol/L的pH6.0葡萄糖溶液冲洗，直到洗脱液无颜色为止。用无菌药匙将菌丝收集后转入对应编号的无菌三角瓶中，分别用10mL 0.01%的β-巯基乙醇预处理菌丝体30分钟，再将菌丝用四层无菌纱布过滤，再用上述不同浓度的溶液分别配制24.2mg/mL真菌溶壁酶,对相对应的编号的菌丝在30℃下酶解菌丝2.7h。
（3）将12瓶酶解液分别用四层无菌的擦镜纸过滤到12个50mL的离心管中，4000rpm，4℃离心十分钟。倒掉上清液后,用5mL渗透压稳定剂轻轻悬浮沉淀，再重复上述操作一次。再在4000rpm，4℃的条件下离心10分钟，用1mL渗透压稳定剂轻轻悬浮沉淀并用显微镜、红血球计数板观察及计数，结果见表1。
表1 原生质体获得时最适渗透压稳定剂筛选
Figure 149212DEST_PATH_IMAGE001
由表1可得，最适渗透压稳定剂为0.7mol/L的NaCl溶液。
实施例2：
（1）接PDA菌体培养基上健壮莫勒菌菌丝体于16瓶PDB液体培养基中，编号为1、2、3、4，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16在150rpm，28℃摇床培养（相应组合及培养时间见表2），再将菌丝用四层无菌的纱布过滤后，用无菌的研钵分别对菌丝进行研磨。将研磨好的菌丝放入各自对应编号的20瓶PDB培养基中于100rpm，28℃摇床培养16h。
（2）用四层无菌纱布过滤出20瓶培养基中的菌丝，用无菌双蒸水配0.7mol/L的NaCl溶液作为渗透压稳定剂，用此渗透压稳定剂冲洗直到洗脱液无颜色为止。用无菌药匙将菌丝收集后转入无菌的三角瓶中，分别用10mL 0.01%的β-巯基乙醇处理菌丝体30分钟，再用四层无菌纱布过滤出菌丝，并转入对应编号的无菌三角瓶中。用不同pH的磷酸盐缓冲液分别配0.7mol/L的NaCl溶液，并用此溶液配制20mg/mL、22mg/mL、24.2mg/mL、26.6 mg/mL真菌溶壁酶,酶解菌丝酶解（相应处理组合方式见表2）。
（3）将20瓶酶解液分别用四层无菌的擦镜纸过滤到20个50mL的离心管中，4000rpm，4℃离心十分钟。倒掉上清液后,用5mL渗透压稳定剂轻轻悬浮沉淀（处理方式见表2），再重复上述操作一次。再在4000rpm，4℃的条件下离心10分钟，用1mL渗透压稳定剂轻轻悬浮沉淀（处理方式见表2）并用显微镜、红血球计数板观察及计数。由此进行正交优化，结果见表2。
表2座壳孢原生质体制备5因子4水平（45）正交实验设计实验结果
Figure 722145DEST_PATH_IMAGE002
注 : Ⅰj为各因素水平j的所有酶活力之和，Ⅱj为各因素水平j的所有酶活力之和，Ⅲj为各因素水平j的所有酶活力之和，Ⅳj为各因素水平j的所有酶活力之和，极差的数字代表酶活力3 次重复的平均值 (mean)± 标准差 (S.D)。
表3原生质体制备优化实验验证
Figure 33040DEST_PATH_IMAGE003
正交实验表明：最优组合为A3B2C4D3E4，即用0.7mol/L的NaCl溶液作为渗透压稳定剂，酶浓度为24.2mg/mL，酶解时间为2.7h，酶解温度为30℃，酶液pH6.0，且结果与验证试验相符合。表2变化因子的极差值R分别为A（75.63），B（69.39），C（54.78），D（49.88），E（58.72）表明酶浓度、酶解时间、酶解温度、pH值、培养时间都与原生质体制备有关，而对其影响最大的是酶浓度，影响相对较小的是酶液pH。
实施例3：
（1）接PDA菌体培养基上健壮莫勒菌菌丝体于五瓶PDB液体培养基中，在150rpm，28℃摇床培养54h,再将菌丝用四层无菌的纱布过滤后，用无菌的研钵分别对菌丝进行研磨。将研磨好的菌丝放入五瓶PDB培养基中于100rpm，28℃摇床培养16h。
（2）用四层无菌纱布过滤出五瓶培养基中的菌丝，编号为A、B、C、D、E用0.7mol/L的NaCl（pH6.0的磷酸盐缓冲液配制，下同）溶液冲洗直至洗脱液为无色为止，用无菌药匙将菌丝收集后转入无菌的三角瓶中，分别用10mL 无菌水、0.01%、0.02%、0.04%、0.08%的β-巯基乙醇预处理菌丝体30分钟，再用四层无菌纱布过滤出菌丝，并转入对应编号的无菌三角瓶中。用pH6.0、 0.7mol/mL的NaCl溶液配制24.2mg/mL真菌溶壁酶,在30℃酶解菌丝2.7h。
（3）将五瓶酶解液分别用四层无菌的擦镜纸过滤到5个50mL的离心管中，4000rpm，4℃离心十分钟。倒掉上清液后,用5mL pH6.0、0.7mol/L的NaCl溶液轻轻悬浮沉淀，再在4000rpm，4℃的条件下离心10分钟，用1mL 0.7mol/L的NaCl溶液轻轻悬浮沉淀并用显微镜、红血球计数板观察及计数。
（4）将A、B、C、D、E四组的原生质体分别分为2组即A1、A2，B1、B2，C1、C2，D1、D2，E1、E2将每组的原生质体稀释至1000个/mL。将从A1、B1、C1、D1、E1吸取100μL用无菌双蒸水做低渗处理涂布于TB3培养基上，从 A2、B2、C2、D2、E2吸取100μL涂布于TB3培养基上。3-4天后记录菌落数，并计算再生率，结果见表4。
表4不同浓度的β-巯基乙醇处理所得原生质体量及菌落数
Figure 349621DEST_PATH_IMAGE004
由表4可知用0.01%的β-巯基乙醇溶液处理菌丝时原生质体的量较大且再生率高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (1)

1.一种莫勒菌原生质体制备的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）接PDA菌体培养基上健壮莫勒菌菌丝体于PDB液体培养基中，在150rpm，28℃摇床培养54h,再将菌丝用四层无菌纱布过滤后，用无菌的研钵对菌丝进行研磨，将研磨好的菌丝放入PDB培养基中于100rpm，28℃摇床培养16h；
（2）再用四层无菌纱布过滤出菌丝，再用无菌药匙将菌丝转入无菌的三角瓶中，用10mL0.01%β-巯基乙醇处理菌丝体30分钟，用pH6.0的磷酸盐缓冲液配制0.7mol/L的NaCl溶液，并用此溶液配制24.2mg/mL真菌溶壁酶，在30℃酶解2.7h，用0.7mol/L NaCl溶液做渗透压稳定剂，原生质体数量达到3.2×107个/mL,再生率达45%。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101712932A (zh) * 2009-11-18 2010-05-26 天津市畜牧兽医研究所 一种白腐真菌的原生质体制备方法
CN102746997A (zh) * 2012-07-31 2012-10-24 福建农林大学 一种扁座壳孢菌菌丝快速生长培养基
CN103451110A (zh) * 2013-08-21 2013-12-18 江西省农业科学院蔬菜花卉研究所 一种芦笋茎枯病菌原生质体制备与再生方法
CN103756917A (zh) * 2014-01-14 2014-04-30 上海交通大学 楸树内生真菌的原生质体的制备方法
WO2015100431A2 (en) * 2013-12-24 2015-07-02 Symbiota, Inc. Plants containing beneficial endophytes
CN109706081A (zh) * 2017-10-25 2019-05-03 国家海洋局第三海洋研究所 一种小球藻原生质体制备方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101712932A (zh) * 2009-11-18 2010-05-26 天津市畜牧兽医研究所 一种白腐真菌的原生质体制备方法
CN102746997A (zh) * 2012-07-31 2012-10-24 福建农林大学 一种扁座壳孢菌菌丝快速生长培养基
CN103451110A (zh) * 2013-08-21 2013-12-18 江西省农业科学院蔬菜花卉研究所 一种芦笋茎枯病菌原生质体制备与再生方法
WO2015100431A2 (en) * 2013-12-24 2015-07-02 Symbiota, Inc. Plants containing beneficial endophytes
CN103756917A (zh) * 2014-01-14 2014-04-30 上海交通大学 楸树内生真菌的原生质体的制备方法
CN109706081A (zh) * 2017-10-25 2019-05-03 国家海洋局第三海洋研究所 一种小球藻原生质体制备方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
一种新型的工具酶——溶壁酶;廖汉泉;《生物工程学报》;19850515;第1卷;第72-73页 *
真菌细胞溶壁酶的分离纯化及其酶学性质研究;尹海滨等;《广州化工》;20100715;第38卷(第7期);第77-78页 *
赭色小莫勒菌在中国的发现(英文);邱君志等;《菌物学报》;20090115;第28卷(第1期);第148-150页 *

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