CN115894726B

CN115894726B - 一种利用微生物酶解法提取杭白菊多糖的方法

Info

Publication number: CN115894726B
Application number: CN202211069240.8A
Authority: CN
Inventors: 梅建凤; 冯浩南; 吴涛; 应国清; 易喻
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Filing date: 2022-09-02
Publication date: 2024-06-07
Anticipated expiration: 2042-09-02

Abstract

本发明公开了一种利用微生物酶解法提取杭白菊多糖的方法，土曲霉(Aspergillus terreus)HBJ5‑32经产酶培养，获得的发酵液过滤，收集的滤液即为粗酶液；将粗酶液与杭白菊粉混合，于35–40℃条件下酶解6–8h，得杭白菊酶解物；酶解物经热水超声提取，滤液浓缩后，获得杭白菊水提浓缩物；再将浓缩物加乙醇使多糖沉淀，沉淀物经乙醇洗涤和干燥后，获得杭白菊多糖；本发明在杭白菊热水超声提取多糖前，增加了微生物发酵制备的粗酶液酶解，较不采用微生物酶解的常规方法相比，杭白菊多糖的提取得率可以提高55.3％。

Description

一种利用微生物酶解法提取杭白菊多糖的方法

(一)技术领域

本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种微生物酶解技术在提取杭白菊多糖中的应用。

(二)背景技术

杭白菊，也称小白菊，是菊科植物菊(Chrysanthemum morifolium Ramat.)的头状花序。杭白菊泡茶饮用，香气浓郁，口感清甜，具有散风清热、平肝明目、清热解毒等功效。明朝杭州府把质量上乘的桐乡产小白菊列为贡品，杭白菊因此而得名，又称“杭白贡菊”，与“龙井茶”齐名。杭白菊性微寒，味苦、甘，归肺、肝经，用于治疗风热感冒、头痛眩晕、目赤肿痛、眼目昏花、疮痈肿毒等。杭白菊的有效成分主要包括黄酮类、多糖、挥发油、三萜类、甾体类、酚类及微量元素等，其中多糖是杭白菊的主要活性成分之一，具有增强免疫、抗氧化、抗肿瘤、降血糖、降血脂等多种功效，因此开发与应用杭白菊多糖有较高的经济和社会价值。

目前，有较多关于菊花多糖提取方法的研究报道，基本的方法都是热水提取乙醇沉淀法(简称为“水提醇沉法”)，在此基础之上，有用微波、超声波、高压和酶解等辅助提取。不同提取方法有各自的优缺点，如常规的水提醇沉法操作简单，但存在提取得率低、耗时长等缺点；微波辅助提取法提取时间短、效率高，但多糖的活性有所下降；超声辅助提取法设备要求低，不会显著增加提取成本，但对提高提取得率的效果不够显著；酶解辅助提取法能够显著提高提取得率，而且条件温和，提取的多糖活性好，缺点是增加了酶的使用成本，提取过程耗时长。

近年来，酶解技术在植物活性成分的提取中有广泛应用，它是用纤维素酶、果胶酶或蛋白酶等，在适宜的条件下水解植物原料，植物的细胞壁被水解，从而有利于胞内活性成分在提取时溶出。酶解技术应用于杭白菊多糖的提取也有报道，如陈云等利用纤维素酶辅助水提法提取杭白菊多糖，得率为13.66％，较常规水提法的11.74％提高了16.4％[陈云,李文治,罗其昌,等.菊花多糖不同提取工艺研究.粮食与油脂,2014,27(7):28-32]。目前应用在植物活性成分提取中最多的酶是纤维素酶，植物的细胞壁构成包括纤维素、半纤维素、木质素、果胶和蛋白质等物质，单一使用纤维素酶，对提高产物提取得率非常有限。为了提高酶解提取的效果，许多研究采用复合酶法，就是同时使用纤维素酶、果胶酶和蛋白酶等2种及2种以上的酶。如敬思群用纤维素酶和碱性蛋白酶辅助水提法提取高寒香菊花多糖，提取得率为9.83％[敬思群,张晓鸣.复合酶法超声辅助提取高寒香菊花多糖.食品与发酵工业,2012,38(1):214-217]。使用复合酶虽然可以有效地提高产物提取得率，但多种酶的使用，无疑增加了提取成本。

微生物产生酶的能力非常强大，尤其是一些放线菌和霉菌，可以产生多种分解植物组织的水解酶，包括纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶、果胶酶和蛋白酶等。因此，如果利用某种微生物在合适的条件下培养，发酵液中就含有大量的水解酶，利用发酵液(粗酶液)直接水解植物原料，这些酶能协同分解细胞壁成分，从而有利于有效成分的释放，能显著提高提取率；而且，使用未经分离纯化的粗酶液，降低了酶的成本。

为了提高杭白菊多糖的提取得率，本发明用微生物发酵制备的粗酶液酶解杭白菊，可使杭白菊多糖的提取得率大幅度提高。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种利用微生物酶解法提取杭白菊多糖的方法，特别是将微生物酶解技术应于杭白菊多糖的提取中，从而显著提高杭白菊多糖提取得率的方法。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种利用微生物酶解法提取杭白菊多糖的方法，所述方法为：微生物菌株土曲霉(Aspergillus terreus)HBJ5-32经产酶培养，获得的发酵液过滤，收集的滤液即为粗酶液；将粗酶液与杭白菊粉混合，于35–40℃条件下酶解6–8h，得杭白菊酶解物；酶解物经热水超声提取，滤液浓缩后，获得杭白菊水提浓缩物；再将浓缩物加乙醇使多糖沉淀，沉淀物经乙醇洗涤和干燥后，获得杭白菊多糖；所述的土曲霉(Aspergillus terreus)HBJ5-32，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:62493，保藏日期2022年5月18日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。

进一步，所述由土曲霉发酵制备粗酶液的方法为：将土曲霉HBJ5-32孢子接种于产酶培养基中，于30℃、200–250r/min振荡培养60–72h，发酵液过滤，滤液即为粗酶液；所述的产酶培养基终浓度组成为：小麦麸皮30–40g/L，(NH₄)₂SO₄ 5–6g/L，KH₂PO₄ 3–5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5–1.0g/L，CaCl₂ 0.3–0.5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.1–0.2g/L，溶剂为自来水，pH 6.0-6.5。

进一步，优选所述的产酶培养基组成为：小麦麸皮40g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，KH₂PO₄3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，CaCl₂ 0.5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.1g/L，溶剂为自来水，pH6.0。

本发明所述的土曲霉HBJ5-32在产酶培养前，需要先经平板培养基培养产生孢子，然后将孢子悬浮于生理盐水中，获得土曲霉HBJ5-32孢子液，按体积分数6％–8％的量接入产酶培养基进行培养，具体产酶培养方法为：

(1)孢子液制备：将土曲霉HBJ5-32接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板培养基，于28–30℃培养48–60h，获得平板培养物；平板培养物中加入无菌生理盐水，用接种环搅动使孢子悬浮，获得土曲霉HBJ5-32孢子液；所述的PDA平板培养基终浓度组成为：马铃薯200g/L(切成小块，加水煮沸20min，去渣留汁)、葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，溶剂为自来水，pH自然(实测6.5)。

(2)产酶培养：用步骤(1)活化培养后土曲霉HBJ5-32孢子液按体积分数6％–8％的接种量，接入产酶培养基，于30℃、200–250r/min振荡培养60–72h，获得干菌体浓度为4.26–4.73g/L、β-葡萄糖苷酶活力为33.1–37.5U/mL的发酵液。

进一步，所述的粗酶液体积用量以杭白菊粉质量计为6–10mL/g(即料酶比为1:6–1:10)，所述的杭白菊粉是将杭白菊85℃烘干并粉碎过20目筛。

进一步，所述杭白菊水提浓缩物的制备方法为：杭白菊酶解物中补充去离子水，搅拌均匀后于80–90℃保温2–3h，然后转入水温80–90℃的超声波清洗机中，100–200W超声提取40–60min，布氏漏斗抽滤，滤液于60℃、–0.1MPa条件下减压浓缩至原体积的1/10–1/5，获得杭白菊水提浓缩物；所述杭白菊酶解物中补充去离子水的体积以原料杭白菊粉质量计为15–20mL/g，使提取体系的料液比为1:25–1:28g/mL。

进一步，所述杭白菊多糖的制备方法为：向杭白菊水提浓缩物中加入体积分数为95％的乙醇(以下简称“95％乙醇”)，使溶液的乙醇体积分数达到70％–75％，4℃条件下静置10–12h后，5000r/min离心5–10min，弃去上清液，加入原料杭白菊粉质量计2–5mL/g的无水乙醇洗涤一次，再次离心，沉淀物于50℃、–0.1Mpa真空干燥至恒重，得杭白菊多糖提取物。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明在杭白菊热水超声提取多糖前，增加了微生物发酵制备的粗酶液酶解。所用的产酶微生物土曲霉HBJ5-32，是针对能够水解杭白菊植物组织而有目的筛选得到，经产酶培养的发酵液中含有多种水解酶，能够协同水解杭白菊中的纤维素和果胶等物质，使细胞壁破碎，有助于杭白菊可溶性多糖在超声水提时溶出，从而能够显著提高多糖的提取得率。较不采用微生物酶解的常规方法相比，杭白菊多糖的提取得率可以提高55.3％。

(四)附图说明

图1为土曲霉HBJ5-32的菌落照片。

图2为苯酚-硫酸法测定多糖的标准曲线。

图3为分光光度法测定硝基苯酚浓度的标准曲线。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

本发明所述的杭白菊是菊科植物菊(Chrysanthemum morifolium Ramat.)的头状花序，直径2.5-4.0cm，产地浙江省桐乡市。杭白菊粉是将杭白菊经85℃烘干2h后粉碎，过20目筛的细粉。

实施例1：发酵杭白菊微生物菌株的分离和筛选

发酵产酶酶解杭白菊的微生物菌种，按如下步骤分离和筛选获得：

(1)250-mL三角烧瓶中加入10g的杭白菊粉，加入15mL无菌生理盐水搅拌均匀，于28℃培养72h。将长满霉菌的富集培养物用无菌生理盐水分别稀释1×10^-5、1×10^-6、1×10^-7倍后，分别吸取0.1mL稀释液涂布于马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基(PDA)上，于28℃培养48h，挑取颜色和形态不同的霉菌菌落转接新鲜PDA平板培养基，于28℃培养60h，得纯培养菌株6株，各菌株的编号见表1。

(2)6个菌株的新鲜平板培养物中，分别加入10mL无菌生理盐水，用接种环搅动使得孢子悬浮，得各菌株的孢子液。

(3)取步骤(2)制备各菌株的孢子液3mL接入50mL产酶培养基中(接种量为6％的体积分数)，于30℃、200r/min振荡条件下产酶培养72h后，全部发酵液用布氏漏斗抽滤，收集的滤液即为粗酶液。

(4)6只50-mL离心管中分别加入1g杭白菊粉，加入步骤(3)制备的各菌株粗酶液10mL(即料酶比为1:10)，搅拌均匀后于35℃水浴中酶解8h，得杭白菊酶解物。

(5)步骤(4)经各个菌株粗酶液酶解的全部杭白菊酶解物中，分别补充15mL去离子水(提取体系含水25mL，料液比为1g:25mL)，振荡均匀于80℃保温浸提3h，然后转入80℃的超声波清洗机中，100W超声提取60min，布氏漏斗抽滤。取1mL滤液于试管中，再加入3mL的95％乙醇(溶液的乙醇体积分数为71.3％)，充分振荡后于4℃条件下静置10h后，5000r/min离心5min，弃去上清液，加入5mL无水乙醇洗涤一次后再次离心，沉淀物用5mL去离子水溶解，采用苯酚-硫酸法测定溶液中可溶性多糖含量。

同样条件下，用10mL未接种微生物的产酶培养基代替粗酶液做未酶解对照；用10mL活力为2000U/mL纤维素酶磷酸盐缓冲液(pH 6.0，0.2mol/L)代替粗酶液做纤维素酶酶解对照。经不同菌株发酵制备的粗酶液酶解的杭白菊及对照的多糖提取得率见表1。

表1经不同菌株发酵制备的粗酶液酶解的杭白菊及对照的多糖提取得率

由表1数据可以看出，杭白菊经HBJ5菌株发酵制备的粗酶液酶解后，多糖得率为8.28％，较未经酶解的对照6.83％相比，多糖提取得率提高了21.2％。用纤维素酶处理杭白菊，也能显著提高多糖的提取得率，较未经酶解的对照提高了10.8％，但远不如HBJ5菌株发酵制备的粗酶液。杭白菊经过有些微生物菌株的粗酶液酶解后，多糖的提取得率并未提高，甚至有所下降。以上结果说明用于酶解杭白菊以提高多糖提取得率的微生物菌株有选择性，不仅要求能产酶水解杭白菊细胞壁成分，还要求不能产酶降解多糖。本发明选定HBJ5菌株作为提高杭白菊多糖提取得率的产酶菌种。

所述的PDA平板培养基，按如下组成和方法配制：马铃薯洗净去皮切成边长约为1cm的小方块，称取200g，加自来水1000mL，煮沸20min，4层纱布过滤去渣，滤液补足到1000mL，加入20g葡萄糖和20g琼脂，pH自然(实测6.5左右)，加热至琼脂溶化后分装于三角烧瓶中，经高压蒸汽121℃灭菌20min，凝固前倒入直径9cm的无菌培养皿，每皿15–20mL。

所述的产酶培养基终浓度组成和配制方法为：小麦麸皮40g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，KH₂PO₄ 3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，CaCl₂ 0.5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.1g/L，溶剂为自来水，pH6.0。250-mL三角烧瓶装50mL产酶培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。

所述的杭白菊多糖含量采用苯酚-硫酸法测定，具体方法为：杭白菊多糖提取液用去离子水做适当倍数稀释(测定的A₄₉₀在0.2–0.8之间)，作为待测样品溶液；若多糖提取物为固体多糖样品则用去离子水配制成浓度0.1mg/mL的水溶液，作为待测样品溶液。吸取待测样品溶液1mL于试管中，加1mL的体积分数5％苯酚水溶液，摇匀后迅速加入5mL浓硫酸(质量浓度98％)，摇匀后室温放置10min，沸水浴中加热15min，流水冷却至室温。以1mL去离子水作为空白对照的相同处理为参比，测定490nm波长下的吸光度(A₄₉₀)。以相同方法测定不同葡萄糖浓度样品的A₄₉₀，绘制葡萄糖浓度—A₄₉₀标准曲线(图2)，得回归方程，由回归方程计算测定多糖样品中多糖含量。

所述的杭白菊多糖提取得率按以下公式计算：

实施例2：发酵菌株HBJ5的诱变选育

对菌株HBJ5进行诱变育种，筛选发酵性能优良的菌株，具体方法为：

(1)孢子液的制备：菌株HBJ5经PDA平板培养基28℃活化培养48h后，加5mL无菌生理盐水，用接种环搅动使孢子悬浮后。移取1mL孢子液到装有50mL无菌生理盐水的三角烧瓶中(加有20–30粒玻璃珠)，室温振荡15min。孢子液经过滤除去菌丝(三角漏斗底部塞一小团脱脂棉)，在显微镜下用血球计数板对液中的孢子计数，用无菌生理盐水做适当倍数稀释，调整孢子数量为1.14×10⁷个/mL。

(2)诱变：在红光照明下，分别取1.0mL上述孢子液和一枚无菌回形针于5只直径6cm的培养皿中，培养皿分别于磁力搅拌器上，在预热30min的15W紫外灯距离30cm处，分别照射1、2、3、4、5min。取0.5mL上述照射处理后的孢子液，作适当倍数稀释后，分别移取0.1mL涂布PDA平板培养基。以同样操作，做未经紫外线照射的孢子液稀释涂平板作为对照，以计算致死率。接种后的PDA平板用黑布包裹，倒置于28℃培养36h，对平板上的菌落进行计数，计算致死率。

(3)筛选：挑取致死率在90％以上PDA平板上的菌落转接新鲜PDA平板培养基上，获得45个菌株。各个菌株经30℃培养60h的新鲜平板培养物中，分别加入10mL无菌生理盐水，用接种环搅动使得孢子悬浮，得各菌株的孢子液。取各菌株的孢子液3mL，接入50mL产酶培养基中，于30℃、200r/min振荡培养72h后，发酵液用布氏漏斗抽滤，收集滤液，测定各菌株发酵滤液的β-葡萄糖苷酶活力。选择酶活较野生菌株提高幅度相对较高的菌株15株，按实施例1方法，用这15个菌株发酵的粗酶液酶解杭白菊，乙醇超声提取多糖，经复筛突变菌株发酵制备的粗酶液酶解杭白菊后的多糖提取得率见表2。

表2经复筛突变菌株发酵制备的粗酶液酶解杭白菊后的多糖提取得率

从表2数据可以看出，在复筛的15个菌株中，编号为HBJ5-32的菌株，发酵产β-葡萄糖苷酶的活力为35.6U/mL，较野生菌株HBJ5的24.2U/mL提高了47.1％，用该菌株发酵制备的粗酶液酶解杭白菊后，多糖提取得率为9.67％，较野生菌株HBJ5的8.28％提高了16.8％，较未经酶解的对照6.83％提高了41.6％。所以，本发明选定HBJ5-32菌株作为提高杭白菊多糖提取得率的产酶菌株。

所述的β-葡萄糖苷酶活力测定方法为：试管中依次加入粗酶液0.8mL、5mmol/L的对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)溶液0.2mL(pH 6.0、0.2mol/L的磷酸缓冲液配制)，于35℃下反应15min后，加入2mL的1mol/L Na₂CO₃水溶液摇匀以终止反应。以煮沸灭活的粗酶液相同处理为参比，于分光光度计测定400nm波长下的吸光度(A₄₀₀)。由对硝基苯酚(pNP)浓度—A₄₀₀标准曲线(图3)计算出反应体系中pNP浓度。

β-葡萄糖苷酶活力单位(U)的定义：35℃下、pH 6.0缓冲体系中，l min内水解pNPG生成1μmol pNP的酶量为1个酶活单位。

酶活按以下公式(1)计算。

式(1)中，V₁：反应体系总体积；V₂：粗酶液体积；C₁：pNP浓度；T：反应时间。

对硝基苯酚浓度—A₄₀₀标准曲线的制作：用蒸馏水配制浓度为1mmol/L的pNP标准溶液。分别吸取标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL至l0 mL容量瓶中，用l mol/L Na₂CO₃水溶液定容后混匀，使各样品中对硝基苯酚的浓度为10、20、30、40、50μmol/L。以蒸馏水为空白，于分光光度计测定400nm波长下的吸光度(A₄₀₀)，以对硝基苯酚浓度为横坐标，A₄₀₀为纵坐标，绘制对硝基苯酚浓度—A₄₀₀标准曲线。

实施例3：菌株HBJ5-32的分类鉴定

菌株HBJ5-32划线接种在PDA平板培养基上，28℃培养24h，沿接种线两侧长出放射状灰黄色菌丝；培养48h后，菌落较薄，呈土黄色，表面粉状孢子较多；分生孢子梗较短，顶囊半球形，小梗双层，梗基密集，覆盖顶囊的上三分之二，在光学显微镜中观察时呈现扇形外观；分生孢子球形至近球形，壁光滑，直径约2.0–2.5μm。土曲霉HBJ5-32在PDA平板培养基上28℃培养2d的菌落照片见图1。

测得菌株HBJ5-32的核糖体DNA内转录间隔区(Ribosomal DNA internaltranscribed spacer，rDNA-ITS)核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，该序列在NCBI(NationalCenter for Biotechnology Information,https://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行BLAST比对，与土曲霉(Aspergillus terreus)典型菌株ATCC1012的rDNA-ITS序列有100％的同源性。根据菌株HBJ5-32菌落形态特征和rDNA-ITS核苷酸序列比对结果，可以确定菌株HBJ5-32的生物学分类位置为(参考Mycobank，http://www.mycobank.org)：真菌界(Fungi)，子囊菌门(Ascomycota)，子囊菌亚门(Pezizomycotina)，散囊菌纲(Eurotiomycetes)，散囊菌亚纲(Eurotiomycetidae)，散囊菌目(Eurotiales)，曲霉科(Aspergillaceae)，曲霉属(Aspergillus)，土曲霉(Aspergillus terreus)。

所述的ITS区rDNA序列为：

CCACCTCCCACCCGTGACTATTGTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCAGCGTTGCTGGCCGCCGGGGGGCGACTCGCCCCCGGGCCCGTGCCCGCCGGAGACCCCAACATGAACCCTGTTCTGAAAGCTTGCAGTCTGAGTGTGATTCTTTGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGCCCTCGTCCCCCGGCTCCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTCGTCTTCCGCTCCGTAGGCCCGGCCGGCGCCCGCCGACGCATTTATTTGCAACTTGTTTTTTTCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAA。

综上，从杭白菊粉的微生物富集物中分离到菌株HBJ5，经紫外线诱变后，筛选获得了菌株HBJ5-32，即土曲霉(Aspergillus terreus)HBJ5-32，该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:62493，保藏日期2022年5月18日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。

实施例4：利用土曲霉HBJ5-32酶解法提取杭白菊多糖

利用土曲霉HBJ5-32酶解法提取杭白菊多糖，可以按以下步骤操作：

(1)冻干管保存的土曲霉HBJ5-32孢子粉，接种于新鲜PDA平板培养基，于30℃培养60h，加10mL的无菌生理盐水于平板培养物中，用接种环搅动使孢子悬浮，得土曲霉HBJ5-32的孢子液。所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1。

(2)用步骤(1)制备的孢子液3mL接种50mL产酶培养基(接种量为6％的体积分数)，于30℃、200r/min振荡条件下培养72h，得干菌体浓度为4.58g/L的发酵液。全部发酵液用布氏漏斗抽滤，收集的滤液即为粗酶液，滤液的β-葡萄糖苷酶活力为34.4U/mL。所述的产酶培养基终浓度组成和配制方法同实施例1。

(3)5g杭白菊粉于250-mL三角烧瓶中，加入步骤(2)制备的粗酶液50mL(料酶比为1:10)，搅拌均匀后于35℃水浴中酶解8h，得杭白菊酶解物。

(4)步骤(3)全部杭白菊酶解物中，补充75mL去离子水(提取体系含水125mL，料液比为1g:25mL)，摇匀后于80℃水浴中浸提3h，然后转入80℃的超声波清洗机中，功率100W超声提取60min，布氏漏斗抽滤，将全部的滤液于60℃、–0.1MPa条件下减压浓缩至25mL(原体积的1/5)，获得水提浓缩液。

(5)向步骤(4)获得的全部浓缩液中，加入75mL的95％乙醇(乙醇体积分数为71.3％)充分振荡后，于4℃条件下静置10h后，5000r/min离心5min，弃去上清液，加入20mL无水乙醇振荡后，再次离心，沉淀物于50℃、–0.1Mpa真空干燥至恒重，研磨成细粉，得杭白菊多糖提取物。

按上述步骤，得杭白菊多糖提取物1.09g，多糖含量为44.5％，即得到多糖0.485g，提取得率为9.70％。

对比例1：未经酶解的杭白菊多糖提取(与实施例4对比)

(1)5g杭白菊粉于500-mL三角烧瓶中，加入125mL去离子水(料液比为1g:25mL)，摇匀后于80℃水浴中浸提3h，然后转入80℃的超声波清洗机中，功率100W超声提取60min，布氏漏斗抽滤，将全部的滤液于60℃、–0.1MPa条件下减压浓缩至25mL(原体积的1/5)，获得水提浓缩液。

(2)向步骤(1)获得的全部浓缩液中，加入75mL的95％乙醇(乙醇体积分数为71.3％)充分振荡后，于4℃条件下静置10h后，5000r/min离心5min，弃去上清液，加入20mL无水乙醇振荡后，再次离心，沉淀物于50℃、–0.1Mpa真空干燥至恒重，研磨成细粉，得杭白菊多糖提取物。

按上述步骤，得杭白菊多糖提取物0.857g，多糖含量为40.4％，即得到多糖0.346g，提取得率为6.92％。

比较实施例4和对比例1的结果可以看出：在提取杭白菊多糖前，增加了土曲霉HBJ5-32发酵制备的粗酶液酶解，多糖的提取得率由6.92％提高到9.70％，提高了40.2％。

实施例5：利用土曲霉HBJ5-32酶解法提取杭白菊多糖

(1)4℃保存的土曲霉HBJ5-32 PDA菌落孢子，接种于新鲜PDA平板培养基，于30℃培养54h，加10mL的无菌生理盐水于平板培养物中，用接种环搅动使孢子悬浮，得土曲霉HBJ5-32的孢子液。所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1。

(2)用步骤(1)制备的孢子液7mL接种100mL产酶培养基(接种量为7％的体积分数)，于30℃、220r/min振荡条件下培养66h，得干菌体浓度为4.73g/L的发酵液。全部发酵液用布氏漏斗抽滤，收集的滤液即为粗酶液，滤液的β-葡萄糖苷酶活力为37.5U/mL。所述的产酶培养基终浓度组成同实施例1，250-mL三角烧瓶装100mL产酶培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。

(3)10g杭白菊粉于500-mL三角烧瓶中，加入步骤(2)制备的粗酶液80mL(料酶比为1:8)，搅拌均匀后于40℃水浴中酶解7h，得杭白菊酶解物。

(4)步骤(3)全部杭白菊酶解物中，补充200mL去离子水(提取体系含水280mL，料液比为1g:28mL)，摇匀后于85℃水浴中浸提2.5h，然后转入85℃的超声波清洗机中，功率150W超声提取50min，布氏漏斗抽滤，将全部的滤液于60℃、–0.1MPa条件下减压浓缩至35mL(原体积的1/8)，获得水提浓缩液。

(5)向步骤(4)获得的全部浓缩液中，加入120mL的95％乙醇(乙醇体积分数为73.5％)充分振荡后，于4℃条件下静置12h后，5000r/min离心10min，弃去上清液，加入40mL无水乙醇振荡后，再次离心，沉淀物于50℃、–0.1Mpa真空干燥至恒重，研磨成细粉，得杭白菊多糖提取物。

按上述步骤，得杭白菊多糖提取物2.39g，多糖含量为45.7％，即得到多糖1.09g，提取得率为10.9％。

对比例2：未经酶解的杭白菊多糖提取(与实施例5对比)

(1)10g杭白菊粉于500-mL三角烧瓶中，加入280mL去离子水(料液比为1g:28mL)，摇匀后于85℃水浴中浸提2.5h，然后转入85℃的超声波清洗机中，功率150W超声提取50min，布氏漏斗抽滤，将全部的滤液于60℃、–0.1MPa条件下减压浓缩至35mL(原体积的1/8)，获得水提浓缩液。

(2)向步骤(1)获得的全部浓缩液中，加入120mL的95％乙醇(乙醇体积分数为73.5％)充分振荡后，于4℃条件下静置12h后，5000r/min离心10min，弃去上清液，加入40mL无水乙醇振荡后，再次离心，沉淀物于50℃、–0.1Mpa真空干燥至恒重，研磨成细粉，得杭白菊多糖提取物。

按上述步骤，得杭白菊多糖提取物1.79g，多糖含量为39.2％，即得到多糖0.702g，提取得率为7.02％。

比较实施例5和对比例2的结果可以看出：在提取杭白菊多糖前，增加了土曲霉HBJ5-32发酵制备的粗酶液酶解，多糖的提取得率由7.02％提高到10.9％，提高了55.3％。

实施例6：利用土曲霉HBJ5-32酶解法提取杭白菊多糖

(1)4℃保存的土曲霉HBJ5-32 PDA菌落孢子，接种于新鲜PDA平板培养基，于30℃培养48h，加10mL的无菌生理盐水于平板培养物中，用接种环搅动使孢子悬浮，得土曲霉HBJ5-32的孢子液。所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1。

(2)用步骤(1)制备的孢子液12mL接种150mL产酶培养基(接种量为8％的体积分数)，于30℃、250r/min振荡条件下培养60h，得干菌体浓度为4.26g/L的发酵液。全部发酵液用布氏漏斗抽滤，收集的滤液即为粗酶液，滤液的β-葡萄糖苷酶活力为33.1U/mL。所述的产酶培养基终浓度组成同实施例1，500-mL三角烧瓶装150mL产酶培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。

(3)20g杭白菊粉于500-mL三角烧瓶中，加入步骤(2)制备的粗酶液120mL(料酶比为1:6)，搅拌均匀后于40℃水浴中酶解6h，得杭白菊酶解物。

(4)步骤(3)全部杭白菊酶解物中，补充400mL去离子水(提取体系含水520mL，料液比为1g:26mL)，摇匀后于90℃水浴中浸提2h，然后转入90℃的超声波清洗机中，功率200W超声提取40min，布氏漏斗抽滤，将全部的滤液于60℃、–0.1MPa条件下减压浓缩至52mL(原体积的1/10)，获得水提浓缩液。

(5)向步骤(4)获得的全部浓缩液中，加入200mL的95％乙醇(乙醇体积分数为75.4％)充分振荡后，于4℃条件下静置12h后，5000r/min离心10min，弃去上清液，加入40mL无水乙醇振荡后，再次离心，沉淀物于50℃、–0.1Mpa真空干燥至恒重，研磨成细粉，得杭白菊多糖提取物。

按上述步骤，得杭白菊多糖提取物4.76g，多糖含量为41.3％，即得到多糖1.97g，提取得率为9.85％。

对比例3：未经酶解的杭白菊多糖提取(与实施例6对比)

(1)20g杭白菊粉于500-mL三角烧瓶中，加入520mL去离子水(料液比为1g:26mL)，摇匀后于90℃水浴中浸提2h，然后转入90℃的超声波清洗机中，功率200W超声提取40min，布氏漏斗抽滤，将全部的滤液于60℃、–0.1MPa条件下减压浓缩至52mL(原体积的1/10)，获得水提浓缩液。

(2)向步骤(1)获得的全部浓缩液中，加入200mL的95％乙醇(乙醇体积分数为75.4％)充分振荡后，于4℃条件下静置12h后，5000r/min离心10min，弃去上清液，加入40mL无水乙醇振荡后，再次离心，沉淀物于50℃、–0.1Mpa真空干燥至恒重，研磨成细粉，得杭白菊多糖提取物。

按上述步骤，得杭白菊多糖提取物3.65g，多糖含量为38.7％，即得到多糖1.41g，提取得率为7.05％。

比较实施例6和对比例3的结果可以看出：在提取杭白菊多糖前，增加了土曲霉HBJ5-32发酵制备的粗酶液酶解，多糖的提取得率由7.05％提高到9.85％，提高了39.7％。

Claims

1.一种利用微生物酶解法提取杭白菊多糖的方法，其特征在于，所述方法为：土曲霉(Aspergillus terreus)HBJ5-32孢子接种于产酶培养基中，于30℃、200–250r/min振荡培养60–72h，获得的发酵液过滤，收集的滤液即为粗酶液；将粗酶液与杭白菊粉混合，于35–40℃条件下酶解6–8h，得杭白菊酶解物；将杭白菊酶解物中补充去离子水，搅拌均匀后于80–90℃保温2–3h，然后转入水温80–90℃的超声波清洗机中，100–200W超声提取40–60min，滤液浓缩后，获得杭白菊水提浓缩物；再将浓缩物加乙醇使多糖沉淀，沉淀物经乙醇洗涤和干燥后，获得杭白菊多糖；所述的土曲霉HBJ5-32保藏编号：GDMCCNo:62493；所述的粗酶液体积用量以杭白菊粉质量计为6–10mL/g；所述杭白菊酶解物中补充去离子水的体积以原料杭白菊粉质量计为15–20mL/g；

所述的产酶培养基终浓度组成为：小麦麸皮30–40g/L，(NH₄)₂SO₄ 5–6g/L，KH₂PO₄3–5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5–1.0g/L，CaCl₂ 0.3–0.5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.1–0.2g/L，溶剂为自来水，pH 6.0-6.5。

2.如权利要求1所述的利用微生物酶解法提取杭白菊多糖的方法，其特征在于，所述的产酶培养基组成为：小麦麸皮40g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，KH₂PO₄ 3g/L，MgSO₄·7H₂O0.5g/L，CaCl₂ 0.5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.1g/L，溶剂为自来水，pH 6.0。

3.如权利要求1所述的利用微生物酶解法提取杭白菊多糖的方法，其特征在于，所述的土曲霉HBJ5-32在产酶培养前，先经平板培养基培养产生孢子，然后将孢子悬浮于生理盐水中，获得土曲霉HBJ5-32孢子液，按体积分数6％–8％的量接入产酶培养基进行培养，所述土曲霉HBJ5-32孢子培养方法为：将土曲霉HBJ5-32接种于PDA平板培养基，于28–30℃培养48–60h，获得平板培养物；平板培养物中加入无菌生理盐水，用接种环搅动使孢子悬浮，获得土曲霉HBJ5-32孢子液；所述的PDA平板培养基终浓度组成为：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，溶剂为自来水，pH自然。

4.如权利要求1所述的利用微生物酶解法提取杭白菊多糖的方法，其特征在于，所述的杭白菊粉是将杭白菊85℃烘干并粉碎过20目筛。

5.如权利要求1所述的利用微生物酶解法提取杭白菊多糖的方法，其特征在于，所述超声提取后，滤液浓缩的条件为：滤液于60℃、–0.1MPa条件下减压浓缩至原体积的1/10–1/5，获得杭白菊水提浓缩物。

6.如权利要求1所述的利用微生物酶解法提取杭白菊多糖的方法，其特征在于，所述杭白菊多糖的制备方法为：向杭白菊水提浓缩物中加入体积分数为95％的乙醇，4℃条件下静置10–12h后，5000r/min离心5–10min，弃去上清液，无水乙醇洗涤，再次离心，沉淀物于50℃、–0.1Mpa真空干燥至恒重，得杭白菊多糖提取物。

7.如权利要求6所述的利用微生物酶解法提取杭白菊多糖的方法，其特征在于，95％乙醇的加入使溶液的乙醇体积分数达到70％–75％。