CN115960725A - 土曲霉hbj5-32及其在提取杭白菊总黄酮中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种土曲霉(Aspergillus terreus)HBJ5‑32及其在提取杭白菊总黄酮中的应用，将土曲霉HBJ5‑32培养获得的发酵液过滤，收集的滤液即为粗酶液；将粗酶液与杭白菊粉混合，于35–40℃条件酶解4–6h，再往酶解体系中加入无水乙醇后进行超声提取，抽滤，得总黄酮提取液；总黄酮提取液经减压蒸干，无水乙醇溶解，浓缩和真空干燥，得总黄酮提取物。本发明提供的杭白菊微生物酶解方法，较直接采用乙醇超声提取法相比，从杭白菊中提取总黄酮的得率可以提高26.8％。

Description

土曲霉HBJ5-32及其在提取杭白菊总黄酮中的应用

(一)技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一株土曲霉HBJ5-32及其在杭白菊总黄酮提取中的应用。

(二)背景技术

杭白菊，也称小白菊，是菊科植物菊(Chrysanthemum morifolium Ramat.)的头状花序。杭白菊泡茶饮用，香气浓郁，口感清甜，具有散风清热、平肝明目、清热解毒等功效。明朝杭州府把质量上乘的桐乡产小白菊列为贡品，杭白菊因此而得名，又称“杭白贡菊”，与“龙井名茶”齐名。杭白菊性微寒，味苦、甘，归肺、肝经，用于治疗风热感冒、头痛眩晕、目赤肿痛、眼目昏花、疮痈肿毒等。杭白菊的有效成分主要包括黄酮类、多糖、挥发油、三萜类、甾体类、酚类及微量元素等，其中黄酮类物质是杭白菊的主要生物活性成分之一，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、降血脂、抗肿瘤等功效，在辅助药物、保健食品和果蔬保鲜等领域有着广阔的应用前景。

目前，关于菊花总黄酮提取方法的研究有较多报道，方法主要有热水提取法、碱水提取法、有机溶剂提取法和CO₂超临界提取法等，在前3种方法的基础上，有辅以超声波、微波、加压和酶解等强化提取的方法。不同提取方法有各自的优缺点，总黄酮得率也差异较大。如热水提取法成本低，但总黄酮得率较低，提取物中含有大量的多糖和蛋白质；有机溶剂提取法常用乙醇提取，优点是提取得率较高，但需要乙醇的消耗量较大；超声或微波辅助提取法在水提或乙醇提取法的基础上，增加超声或微波处理，促进总黄酮溶出，提取得率有一定的提高；CO₂超临界萃取法提取的总黄酮纯度较高，但提取得率往往不高，而且设备要求比较高；酶辅助提取法的提取条件温和、活性物质不易失活，但对提高提取得率的效果往往不是很理想，且商品化的纯酶成本较高。上述杭白菊总黄酮的提取方法，相比之下，超声辅助乙醇提取有一定的优势，提取得率和产品纯度较高，乙醇可以回收重复利用，超声波的使用成本也较低。

将酶解技术应用于杭白菊总黄酮的提取也要不少文献报道，都能显著提高总黄酮的提取得率，如田秀兰用纤维素酶辅助乙醇提取杭白菊总黄酮，得率提高了12％[田秀兰.纤维素酶在杭白菊总黄酮提取中的应用.齐齐哈尔医学院学报,2005,26(5):542]；项雷文用纤维素酶辅助热水提取总黄酮，得率提高了19.2％[项雷文,陈文韬.纤维素酶法提取杭白菊中总黄酮工艺优化.化学工程与装备,2009,(5):26-29]。植物的细胞壁构成包括纤维素、半纤维素、木质素、果胶和蛋白质等物质，单一使用纤维素酶，往往难以取得非常理想的效果，为了提高酶解提取的效果，许多研究采用复合酶法，就是同时使用纤维素酶、果胶酶和蛋白酶等2种及2种以上的酶，虽然可以显著提高产物提取得率，但多种酶的使用，无疑增加了提取成本。

微生物产生酶的能力非常强大，尤其是一些放线菌和霉菌，可以产生多种分解植物组织的水解酶，包括纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶、果胶酶和蛋白酶等。因此，如果利用某种微生物在合适的条件下培养，发酵液中就含有大量的水解酶，利用发酵液(粗酶液)直接水解植物原料，这些酶能协同分解细胞壁成分，从而有利于有效成分的释放，能显著提高提取率；而且，使用未经分离纯化的粗酶液，降低了酶的成本。

为了提高杭白菊总黄酮的提取得率，本发明用微生物发酵制备的粗酶液酶解杭白菊，可使杭白菊总黄酮的提取得率大幅度提高。

(三)发明内容

本发明目的是提供一株新的微生物菌株—土曲霉(Aspergillus terreus)HBJ5-32，及其在提取杭白菊总黄酮中的应用。杭白菊经该菌株发酵制备的粗酶液酶解后，总黄酮的提取得率可以大幅度提高。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一株新的微生物菌株—土曲霉(Aspergillus terreus)HBJ5-32，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:62493，保藏日期2022年5月18日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。

本发明所述的土曲霉HBJ5-32，是从杭白菊的微生物富集培养物中分离，经过筛选和诱变选育获得的优良菌株。所述土曲霉HBJ5-32的菌落形态特征如下：在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板培养基上，28℃培养24h，沿接种线两侧长出放射状灰黄色菌丝；培养48h后，菌落较薄，呈土黄色，表面粉状孢子较多；分生孢子梗较短，顶囊半球形，小梗双层，梗基密集，覆盖顶囊的上三分之二，在光学显微镜中观察时呈现扇形外观；分生孢子球形至近球形，壁光滑，直径约2.0–2.5μm。土曲霉HBJ5-32在PDA平板培养基上28℃培养2d的菌落照片见图1。

所述土曲霉HBJ5-32的核糖体DNA内转录间隔区(Ribosomal DNA internaltranscribed spacer，rDNA-ITS)核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供一种所述土曲霉HBJ5-32在提取杭白菊总黄酮中的应用，所述应用的方法为：(1)将土曲霉HBJ5-32培养获得的发酵液过滤，收集的滤液即为粗酶液；(2)将粗酶液与杭白菊粉混合，于35–40℃条件酶解4–6h，再往酶解体系中加入无水乙醇后进行超声提取，抽滤，得总黄酮提取液；(3)总黄酮提取液经减压蒸干，无水乙醇溶解，浓缩和真空干燥，得总黄酮提取物。

进一步，步骤(1)所述粗酶液制备方法为：将土曲霉HBJ5-32孢子接种于产酶培养基中，于30℃、200–250r/min振荡培养60–72h，发酵液过滤，滤液即为粗酶液；所述产酶培养基终浓度组成为：小麦麸皮30–40g/L，(NH₄)₂SO₄ 5–6g/L，KH₂PO₄ 3–5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5–1.0g/L，CaCl₂ 0.3–0.5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.1–0.2g/L，溶剂为自来水，pH 6.0-6.5。

进一步，优选所述产酶培养基组成为：小麦麸皮40g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，KH₂PO₄3g/L，MgSO₄·7H₂O0.5 g/L，CaCl₂ 0.5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.1g/L，溶剂为自来水，pH 6.0。

本发明所述土曲霉HBJ5-32在产酶培养前，需要先经平板培养基培养产生孢子，然后将孢子悬浮于生理盐水中，获得土曲霉HBJ5-32孢子液，按体积分数6％–8％的量接入产酶培养基进行培养，具体产酶培养方法为：

①孢子液制备：将土曲霉HBJ5-32接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板培养基，于28–30℃培养48–60h，获得平板培养物；平板培养物中加入无菌生理盐水，用接种环搅动使孢子悬浮，获得土曲霉HBJ5-32孢子液；所述的PDA平板培养基终浓度组成为：马铃薯200g/L(切成小块，加水煮沸20min，去渣留汁)、葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，溶剂为自来水，pH自然(实测6.5)。

②产酶培养：用活化培养后土曲霉HBJ5-32孢子液按体积分数6％–8％的接种量，接入产酶培养基，于30℃、200–250r/min振荡培养60–72h，获得干菌体浓度为4.34–4.79g/L、β-葡萄糖苷酶活力为35.6–38.8U/mL的发酵液。

进一步，步骤(2)所述粗酶液体积用量以杭白菊粉质量计为4–8mL/g(即料酶比为1:4–1:8)，所述杭白菊粉是将杭白菊经85℃烘干2h后粉碎，过20目筛的细粉。无水乙醇体积用量为粗酶液体积的3-4倍。

进一步，步骤(2)所述总黄酮提取液的制备方法为：所述的杭白菊酶解结束后，往酶解体系中加入粗酶液体积3–4倍的无水乙醇，搅拌均匀后置于50–60℃水浴中浸提2–3h再转入50–60℃、100–200W的超声波清洗机中提取30–60min；超声醇提结束后，趁热抽滤，得总黄酮提取液。

进一步，步骤(3)从总黄酮提取液中回收总黄酮的方法为：总黄酮提取液于45℃、–0.1MPa条件下蒸馏至无液体流出，加入体积为原料杭白菊质量计5–10mL/g的无水乙醇，充分振荡后于5000–8000r/min离心5–10min，上清液于45℃、–0.1MPa条件蒸馏至原乙醇体积的1/10，转入到一洁净培养皿中，50℃、–0.1MPa真空干燥，得总黄酮提取物。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：在杭白菊乙醇超声提取总黄酮前，增加了微生物发酵制备的粗酶液酶解。所用的产酶微生物土曲霉HBJ5-32，是针对能够水解杭白菊植物组织而有目的筛选得到，经产酶培养的发酵液中含有多种水解酶，能够协同水解杭白菊中的纤维素和果胶等物质，使细胞壁破碎，有助于黄酮类物质溶出，总黄酮的提取得率显著提高。本发明提供的杭白菊微生物酶解酶解方法，较直接采用乙醇超声提取法相比，从杭白菊中提取总黄酮的得率可以提高26.8％。

(四)附图说明

图1为土曲霉HBJ5-32在PDA上28℃培养48h的菌落照片。

图2为分光光度法测定总黄酮的标准曲线。

图3为分光光度法测定硝基苯酚的标准曲线。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明所述的杭白菊是菊科植物菊(Chrysanthemum morifolium Ramat.)的头状花序，直径2.5-4.0cm，产地浙江省桐乡市。杭白菊粉是杭白菊经85℃烘干2h后粉碎，过20目筛的细粉。

实施例1：发酵菌株的分离和筛选

发酵产酶酶解杭白菊的微生物菌种，按如下步骤分离和筛选获得：

(1)250-mL三角烧瓶中加入10g的杭白菊粉，加入15mL无菌生理盐水搅拌均匀，于28℃培养72h。将长满霉菌的富集培养物用无菌生理盐水分别稀释1×10^-5、1×10^-6、1×10^-7倍后，分别吸取0.1mL稀释液涂布于马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基(PDA)上，于28℃培养48h，挑取颜色和形态不同的霉菌菌落转接新鲜PDA平板培养基，于28℃培养60h，得纯培养菌株6株，各菌株的编号见表1。

(2)6个菌株的新鲜平板培养物中，分别加入10mL无菌生理盐水，用接种环搅动使得孢子悬浮，得各菌株的孢子液。

(3)取步骤(2)制备各菌株的孢子液3mL接入50mL产酶培养基中(接种量为6％的体积分数)，于30℃、200r/min振荡条件下产酶培养72h后，全部发酵液用布氏漏斗抽滤，收集的滤液即为粗酶液。

(4)6只50-mL离心管中分别加入0.5g杭白菊粉，加入步骤(3)制备的各菌株粗酶液4mL(料酶比为1:8)，搅拌均匀后于35℃酶解6h，得杭白菊酶解物。

(5)步骤(4)经各个菌株粗酶液酶解的全部杭白菊酶解物中，分别加入12mL的无水乙醇(3倍粗酶液体积，体系乙醇体积浓度为75％)，摇匀后置于50℃水浴中浸提2h，然后转入50℃的超声波清洗机中，100W超声提取60min，趁热布氏漏斗抽滤，收集滤液，分光光度法测定其中的总黄酮含量。

同样条件下，用4mL未接种微生物的产酶培养基代替粗酶液做未酶解对照；用4mL活力为2000U/mL纤维素酶磷酸盐缓冲液(pH 6.0，0.2mol/L)代替粗酶液做纤维素酶酶解对照。不同菌株发酵制备的粗酶液酶解杭白菊及对照的总黄酮提取得率见表1。

表1不同菌株发酵制备的粗酶液酶解杭白菊及对照的总黄酮提取得率

由表1数据可以看出，杭白菊经HBJ5菌株发酵制备的粗酶液酶解后，总黄酮提取得率为7.47％，较未经酶解的对照6.65％相比，总黄酮提取得率提高了12.3％。用纤维素酶处理杭白菊，也能提高总黄酮的提取得率，较未经酶解的对照提高了5.71％，但远不如HBJ5菌株发酵制备的粗酶液。杭白菊经过有些微生物菌株的粗酶液酶解后，总黄酮的提取得率并未提高，甚至有所下降。以上结果说明用于酶解杭白菊以提高总黄酮提取得率的微生物菌株有选择性，不仅要求能产酶水解杭白菊细胞壁成分，还要求不能产酶降解黄酮。本发明选定HBJ5菌株作为提高杭白菊总黄酮提取得率的产酶菌种。

所述的PDA平板培养基，按如下组成和方法配制：马铃薯洗净去皮切成边长约为1cm的小方块，称取200g，加自来水1000mL，煮沸20min，4层纱布过滤去渣，滤液补足到1000mL，加入20g葡萄糖和20g琼脂，pH自然(实测6.5左右)，加热至琼脂溶化后分装于三角烧瓶中，经高压蒸汽121℃灭菌20min，凝固前倒入直径9cm无菌培养皿，每皿15–20mL。

所述的产酶培养基终浓度组成和配制方法为：小麦麸皮40g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，KH₂PO₄ 3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，CaCl₂ 0.5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.1g/L，溶剂为自来水，pH6.0。250-mL三角烧瓶装50mL产酶培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。

所述的总黄酮含量采用分光光度法测定，具体方法为：2.5mL总黄酮提取液(视样品中总黄酮浓度高低适当调整取样量，控制测定A₅₁₀＝0.2–0.8之间，固体总黄酮粗提物用60％乙醇水溶液溶解)，于10-mL刻度试管中，加入质量浓度5％亚硝酸钠(NaNO₂)水溶液0.4mL，静置6min，加质量浓度10％硝酸铝[Al(NO₃)₃]水溶液0.6mL，静置6min，加质量浓度20％氢氧化钠(NaOH)水溶液2mL，再用体积浓度60％乙醇水溶液定容至10mL，摇匀，放置15min，于分光光度计测定波长510nm处的吸光度(A₅₁₀)，由芦丁标准曲线计算得样品中总黄酮浓度，再由浓度乘以测定样品的体积得总黄酮质量。

芦丁标准曲线的绘制：用体积浓度60％乙醇水溶液配制浓度为0.25g/L的芦丁标准品溶液。分别取芦丁标准品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL于10-mL刻度试管中，用体积浓度60％乙醇水溶液补充至2.5mL，加入质量浓度5％亚硝酸钠水溶液0.4mL，静置6min，加质量浓度10％硝酸铝水溶液0.6mL，静置6min，加质量浓度20％氢氧化钠水溶液2mL，再用体积浓度60％乙醇水溶液定容至10FeSO₄mL，摇匀，放置15min，于分光光度计测定波长510nm处的吸光度(A₅₁₀)。以芦丁浓度为横坐标，A₅₁₀为纵坐标绘制标准曲线(图2)。

所述的从杭白菊中提取总黄酮得率按以下公式计算：

实施例2：发酵菌株HBJ5的诱变选育

对菌株HBJ5进行诱变育种，筛选发酵性能优良的菌株，具体方法为：

(1)孢子液的制备：菌株HBJ5经PDA平板培养基28℃活化培养48h后，加5mL无菌生理盐水，用接种环搅动使孢子悬浮后。移取1mL孢子液到装有50mL无菌生理盐水的三角烧瓶中(加有20–30粒玻璃珠)，室温振荡15min。孢子液经过滤除去菌丝(三角漏斗底部塞一小团脱脂棉)，在显微镜下用血球计数板对液中的孢子计数，用无菌生理盐水做适当倍数稀释，调整孢子数量为1.14×10⁷个/mL。

(2)诱变：在红光照明下，分别取1.5mL上述孢子液和一枚无菌回形针于5只直径6cm的培养皿中，培养皿分别置于磁力搅拌器上，在预热30min的15W紫外灯距离30cm处，分别照射1、2、3、4、5min。取0.5mL上述照射处理后的孢子液，作适当倍数稀释后，分别移取0.1mL涂布PDA平板培养基。以同样操作，做未经紫外线照射的孢子液稀释涂平板作为对照，以计算致死率。接种后的PDA平板用黑布包裹，倒置于28℃培养36h，对平板上的菌落进行计数，计算致死率。

(3)筛选：挑取致死率在90％以上PDA平板上的菌落转接新鲜PDA平板培养基上，获得45个菌株。各个菌株经30℃培养60h的新鲜平板培养物中，分别加入10mL无菌生理盐水，用接种环搅动使得孢子悬浮，得各菌株的孢子液。取各菌株的孢子液3mL，接入50mL产酶培养基中，于30℃、200r/min振荡培养72h后，发酵液用布氏漏斗抽滤，收集滤液，测定各菌株发酵滤液的β-葡萄糖苷酶活力。选择酶活较野生菌株提高幅度相对较高的菌株15株，按实施例1方法，用这15个菌株发酵的粗酶液酶解杭白菊，乙醇超声提取总黄酮，复筛突变菌株发酵制备的粗酶液酶解杭白菊后的总黄酮提取得率见表2。

表2复筛突变菌株发酵制备的粗酶液酶解杭白菊后的总黄酮提取得率

从表2数据可以看出，在复筛的15个菌株中，编号为HBJ5-32的菌株，发酵产β-葡萄糖苷酶的活力为35.6U/mL，较野生菌株HBJ5的24.2U/mL提高了47.1％，用该菌株发酵制备的粗酶液酶解杭白菊后，总黄酮提取得率为8.36％，较野生菌株HBJ5的7.47％提高了11.9％，较未经酶解的对照6.65％提高了25.7％。所以，本发明选定HBJ5-32菌株作为提高杭白菊总黄酮提取得率的产酶菌株。

所述的β-葡萄糖苷酶活力测定方法为：试管中依次加入粗酶液0.8mL、5mmol/L的对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)溶液0.2mL(pH 6.0、0.2mol/L的磷酸缓冲液配制)，于35℃下反应15min后，加入2mL的1mol/L Na₂CO₃水溶液摇匀以终止反应。以煮沸灭活的粗酶液相同处理为参比，于分光光度计测定400nm波长下的吸光度(A₄₀₀)。由对硝基苯酚(pNP)浓度—A₄₀₀标准曲线(图3)计算出反应体系中pNP浓度。

β-葡萄糖苷酶活力单位(U)的定义：35℃下、pH 6.0缓冲体系中，l min内水解pNPG生成1μmol pNP的酶量为1个酶活单位。

酶活按以下公式(1)计算。

式(1)中，V₁：反应体系总体积；V₂：粗酶液体积；C₁：pNP浓度；T：反应时间。

对硝基苯酚浓度—A₄₀₀标准曲线的制作：用蒸馏水配制浓度为1mmol/L的pNP标准溶液。分别吸取标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL至l0 mL容量瓶中，用l mol/L Na₂CO₃水溶液定容后混匀，使各样品中对硝基苯酚的浓度为10、20、30、40、50μmol/L。以蒸馏水为空白，于分光光度计测定400nm波长下的吸光度(A₄₀₀)，以对硝基苯酚浓度为横坐标，A₄₀₀为纵坐标，绘制对硝基苯酚浓度—A₄₀₀标准曲线。

实施例3：菌株HBJ5-32的分类鉴定

菌株HBJ5-32划线接种在PDA平板培养基上，28℃培养24h，沿接种线两侧长出放射状灰黄色菌丝；培养48h后，菌落较薄，呈土黄色，表面粉状孢子较多；分生孢子梗较短，顶囊半球形，小梗双层，梗基密集，覆盖顶囊的上三分之二，在光学显微镜中观察时呈现扇形外观；分生孢子球形至近球形，壁光滑，直径约2.0–2.5μm。土曲霉HBJ5-32在PDA平板培养基上28℃培养2d的菌落照片见图1。

测得菌株HBJ5-32的rDNA-ITS核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，该序列在NCBI(National Center for Biotechnology Information,https://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行BLAST比对，与土曲霉(Aspergillus terreus)典型菌株ATCC1012的rDNA-ITS序列有100％的同源性。根据菌株HBJ5-32菌落形态特征和rDNA-ITS核苷酸序列比对结果，可以确定菌株HBJ5-32的生物学分类位置为(参考Mycobank，http://www.mycobank.org)：真菌界(Fungi)，子囊菌门(Ascomycota)，子囊菌亚门(Pezizomycotina)，散囊菌纲(Eurotiomycetes)，散囊菌亚纲(Eurotiomycetidae)，散囊菌目(Eurotiales)，曲霉科(Aspergillaceae)，曲霉属(Aspergillus)，土曲霉(Aspergillus terreus)。

所述的ITS区rDNA序列为：

CCACCTCCCACCCGTGACTATTGTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCAGCGTTGCTGGCCGCCGGGGGGCGACTCGCCCCCGGGCCCGTGCCCGCCGGAGACCCCAACATGAACCCTGTTCTGAAAGCTTGCAGTCTGAGTGTGATTCTTTGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGCCCTCGTCCCCCGGCTCCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTCGTCTTCCGCTCCGTAGGCCCGGCCGGCGCCCGCCGACGCATTTATTTGCAACTTGTTTTTTTCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAA。

综上，从杭白菊粉微生物富集物中分离到菌株HBJ5，经紫外线诱变后，筛选获得了菌株HBJ5-32，即土曲霉(Aspergillus terreus)HBJ5-32，该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:62493，保藏日期2022年5月18日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。

实施例4：利用土曲霉HBJ5-32酶解法提取杭白菊中的总黄酮

利用土曲霉HBJ5-32酶解法提取杭白菊中的总黄酮，可以按以下步骤操作：

(1)冻干管保存的土曲霉HBJ5-32孢子粉，接种于新鲜PDA平板培养基，于30℃培养60h，加10mL无菌生理盐水于平板培养物中，用接种环搅动使孢子悬浮，得土曲霉HBJ5-32的孢子液。所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1。

(2)用步骤(1)制备的孢子液3mL接种50mL产酶培养基(接种量为6％的体积分数)，于30℃、200r/min振荡条件下培养72h，得干菌体浓度为4.79g/L的发酵液。全部发酵液用布氏漏斗抽滤，收集的滤液即为粗酶液，滤液的β-葡萄糖苷酶活力为36.7U/mL。所述的产酶培养基终浓度组成和配制方法同实施例1。

(3)5g杭白菊粉于250-mL三角烧瓶中，加入步骤(2)制备的粗酶液40mL(料酶比为1:8)，搅拌均匀后于35℃酶解6h，得杭白菊酶解物。

(4)步骤(3)全部杭白菊酶解物中，加入120mL无水乙醇(3倍粗酶液体积，体系乙醇体积浓度为75％)，摇匀后置于50℃水浴中浸提2h，然后转入50℃的超声波清洗机中，功率100W超声提取60min，布氏漏斗抽滤，得总黄酮提取液。

(5)步骤(4)制备的总黄酮提取液于45℃、–0.1MPa减压蒸馏至无液体流出，加50mL无水乙醇(按原料杭白菊粉质量计的10mL/g)，充分振荡后转入离心管中，于8000r/min离心5min，上清液于45℃、–0.1MPa条件蒸馏至约5mL，转入到一洁净培养皿中，50℃、–0.1MPa真空干燥，得总黄酮提取物。

按上述步骤，得总黄酮提取物0.731g，总黄酮含量为51.5％，即得到总黄酮0.376g，提取得率为7.52％。

对比例1：未经酶解的杭白菊总黄酮提取(与实施例4对比)

(1)5g杭白菊粉于250-mL三角烧瓶中，加入160mL的75％乙醇水溶液，摇匀后置于50℃水浴中浸提2h，然后转入50℃的超声波清洗机中，功率100W超声提取60min，布氏漏斗抽滤，得总黄酮提取液。

(2)步骤(1)制备的总黄酮提取液于45℃、–0.1MPa减压蒸馏至无液体流出，加50mL无水乙醇(按原料杭白菊粉质量计的10mL/g)，充分振荡后转入离心管中，于8000r/min离心5min，上清液于45℃、–0.1MPa条件蒸馏至约5mL，转入到一洁净培养皿中，50℃、–0.1MPa真空干燥，得总黄酮提取物。

按上述步骤，得总黄酮提取物0.626g，总黄酮含量为48.7％，即得到总黄酮0.305g，提取得率为6.10％。

比较实施例1和对比例1的结果可以看出：在提取杭白菊总黄酮前，增加了土曲霉HBJ5-32发酵制备的粗酶液酶解，总黄酮的提取得率由6.10％提高到7.52％，提高了23.3％。

实施例5：利用土曲霉HBJ5-32酶解法提取杭白菊中的总黄酮

利用土曲霉HBJ5-32酶解提取杭白菊中的总黄酮，可以按以下步骤操作：

(1)4℃保存的土曲霉HBJ5-32 PDA菌落孢子，接种于新鲜PDA平板培养基，于30℃培养54h，加10mL无菌生理盐水于平板培养物中，用接种环搅动使孢子悬浮，得土曲霉HBJ5-32的孢子液。所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1。

(2)用步骤(1)制备的孢子液7mL接种100mL产酶培养基(接种量为7％的体积分数)，于30℃、220r/min振荡条件下培养66h，得干菌体浓度为4.67g/L的发酵液。全部发酵液用布氏漏斗抽滤，收集的滤液即为粗酶液，滤液的β-葡萄糖苷酶活力为38.1U/mL。所述的产酶培养基终浓度组成同实施例1，250-mL三角烧瓶装100mL产酶培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。

(3)10g杭白菊粉于500-mL三角烧瓶中，加入步骤(2)制备的粗酶液60mL(料酶比为1:6)，搅拌均匀后于40℃酶解5h，得杭白菊酶解物。

(4)步骤(3)全部杭白菊酶解物中，加入240mL无水乙醇(4倍粗酶液体积，体系乙醇体积浓度80％)，摇匀后置于55℃水浴中浸提2.5h，然后转入55℃的超声波清洗机中，功率150W超声提取45min，布氏漏斗抽滤，得总黄酮提取液。

(5)步骤(4)制备的总黄酮提取液于45℃、–0.1MPa减压蒸馏至无液体流出，加75mL无水乙醇(按原料杭白菊粉质量计的7.5mL/g)，充分振荡后转入离心管中，于8000r/min离心5min，上清液于45℃、–0.1MPa条件蒸馏至约7.5mL，转入到一洁净培养皿中，50℃、–0.1MPa真空干燥，得总黄酮提取物。

按上述步骤，得总黄酮提取物1.46g，总黄酮含量为53.8％，即得到总黄酮0.785g，提取得率为7.85％。

对比例2：未经酶解的杭白菊总黄酮提取(与实施例5对比)

(1)10g杭白菊粉于500-mL三角烧瓶中，加入300mL的80％乙醇水溶液，摇匀后置于55℃水浴中浸提2.5h，然后转入55℃的超声波清洗机中，功率150W超声提取45min，布氏漏斗抽滤，得总黄酮提取液。

(2)步骤(1)制备的总黄酮提取液于45℃、–0.1MPa减压蒸馏至无液体流出，加75mL无水乙醇(按原料杭白菊粉质量计的7.5mL/g)，充分振荡后转入离心管中，于8000r/min离心5min，上清液于45℃、–0.1MPa条件蒸馏至约7.5mL，转入到一洁净培养皿中，50℃、–0.1MPa真空干燥，得总黄酮提取物。

按上述步骤，得总黄酮提取物1.23g，总黄酮含量为50.3％，即得到总黄酮0.619g，提取得率为6.19％。

比较实施例5和对比例2的结果可以看出：在提取杭白菊总黄酮前，增加了土曲霉HBJ5-32发酵制备的粗酶液酶解，总黄酮提取得率由6.19％提高到7.85％，提高了26.8％。

实施例6：利用土曲霉HBJ5-32酶解法提取杭白菊中的总黄酮

利用土曲霉HBJ5-32酶解提取杭白菊中的总黄酮，可以按以下步骤操作：

(1)4℃保存的土曲霉HBJ5-32 PDA菌落孢子，接种于新鲜PDA平板培养基，于30℃培养48h，加10mL无菌生理盐水于平板培养物中，用接种环搅动使孢子悬浮，得土曲霉HBJ5-32的孢子液。所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1。

(2)用步骤(1)制备的孢子液12mL接种150mL产酶培养基(接种量为8％的体积分数)，于30℃、250r/min振荡条件下培养60h，得干菌体浓度为4.34g/L的发酵液。全部发酵液用布氏漏斗抽滤，收集的滤液即为粗酶液，滤液的β-葡萄糖苷酶活力为38.8U/mL。所述的产酶培养基终浓度组成同实施例1，500-mL三角烧瓶装150mL产酶培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。

(3)25g杭白菊粉于1-L三角烧瓶中，加入步骤(2)制备的粗酶液100mL(料酶比为1:4)，搅拌均匀后于40℃酶解4h，得杭白菊酶解物。

(4)步骤(3)全部杭白菊酶解物中，加入400mL无水乙醇(4倍粗酶液体积，体系乙醇体积浓度80％)，摇匀后置于60℃水浴中浸提3h，然后转入60℃的超声波清洗机中，功率200W超声提取30min，布氏漏斗抽滤，得总黄酮提取液。

(5)步骤(4)制备的总黄酮提取液于45℃、–0.1MPa减压蒸馏至无液体流出，加125mL无水乙醇(按原料杭白菊粉质量计的5mL/g)，充分振荡后转入离心管中，于5000r/min离心10min，上清液于45℃、–0.1MPa条件蒸馏至约12.5mL，转入到一洁净培养皿中，50℃、–0.1MPa真空干燥，得总黄酮提取物。

按上述步骤，得总黄酮提取物3.52g，总黄酮含量为54.3％，即得到总黄酮1.91g，提取得率为7.64％。

对比例3：未经酶解的杭白菊总黄酮提取(与实施例6对比)

(1)25g杭白菊粉于1-L三角烧瓶中，加入500mL的80％乙醇水溶液，摇匀后置于60℃水浴中浸提3h，然后转入60℃的超声波清洗机中，功率200W超声提取30min，布氏漏斗抽滤，得总黄酮提取液。

(2)步骤(1)制备的总黄酮提取液于45℃、–0.1MPa减压蒸馏至无液体流出，加125mL无水乙醇(按原料杭白菊粉质量计的5mL/g)，充分振荡后转入离心管中，于5000r/min离心10min，上清液于45℃、–0.1MPa条件蒸馏至约12.5mL，转入到一洁净培养皿中，50℃、–0.1MPa真空干燥，得总黄酮提取物。

按上述步骤，得总黄酮提取物2.92g，总黄酮含量为52.8％，即得到总黄酮1.54g，提取得率为6.16％。

比较实施例6和对比例3的结果可以看出：在提取杭白菊总黄酮前，增加了土曲霉HBJ5-32发酵制备的粗酶液酶解，总黄酮提取得率由6.16％提高到7.64％，提高了24.0％。

Claims (10)

1.土曲霉(Aspergillus terreus)HBJ5-32，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:62493，保藏日期2022年5月18日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。

2.一种权利要求1所述土曲霉HBJ5-32在提取杭白菊总黄酮中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用的方法为：(1)将土曲霉HBJ5-32培养获得的发酵液过滤，收集的滤液即为粗酶液；(2)将粗酶液与杭白菊粉混合，于35–40℃条件酶解4–6h，再往酶解体系中加入无水乙醇后进行超声提取，抽滤，得总黄酮提取液；(3)总黄酮提取液经减压蒸干，无水乙醇溶解，浓缩和真空干燥，得总黄酮提取物。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述粗酶液制备方法为：将土曲霉HBJ5-32孢子接种于产酶培养基中，于30℃、200–250r/min振荡培养60–72h，发酵液过滤，滤液即为粗酶液；所述产酶培养基终浓度组成为：小麦麸皮30–40g/L，(NH₄)₂SO₄5–6g/L，KH₂PO₄3–5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5–1.0g/L，CaCl₂ 0.3–0.5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.1–0.2g/L，溶剂为自来水，pH 6.0-6.5。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述土曲霉HBJ5-32在产酶培养前，先经平板培养基培养产生孢子，然后将孢子悬浮于生理盐水中，获得土曲霉HBJ5-32孢子液，按体积分数6％–8％的量接入产酶培养基进行培养，所述土曲霉HBJ5-32孢子培养方法为：将土曲霉HBJ5-32接种于PDA平板培养基，于28–30℃培养48–60h，获得平板培养物；平板培养物中加入无菌生理盐水，用接种环搅动使孢子悬浮，获得土曲霉HBJ5-32孢子液；所述PDA平板培养基终浓度组成为：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，溶剂为自来水，pH自然。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述粗酶液体积用量以杭白菊粉质量计为4–8mL/g。

7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述杭白菊粉是将杭白菊经85℃烘干2h后粉碎，过20目筛的细粉。

8.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(2)无水乙醇体积用量为粗酶液体积的3-4倍。

9.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述总黄酮提取液的制备方法为：往酶解体系中加入无水乙醇，搅拌均匀后置于50–60℃水浴中浸提2–3h再转入50–60℃、100–200W的超声波清洗机中提取30–60min；超声醇提结束后，趁热抽滤，得总黄酮提取液。

10.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(3)从总黄酮提取液中回收总黄酮提取物的方法为：总黄酮提取液于45℃、–0.1MPa条件下蒸馏至无液体流出，加入无水乙醇，充分振荡后于5000–8000r/min离心5–10min，上清液于45℃、–0.1MPa条件蒸馏至原乙醇体积的1/10，转入到一洁净培养皿中，50℃、–0.1MPa真空干燥，得总黄酮提取物；所述无水乙醇体积用量以原料杭白菊粉质量计为5–10mL/g。

Images