CN102329816B - 一种农杆菌介导的纵切幼苗上胚轴顶端转化大豆的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种农杆菌介导的纵切幼苗上胚轴顶端转化大豆的转基因方法，包括（a）浸泡大豆，光照保湿条件下培养至下胚轴长2～3cm；（b）将含有目的基因的农杆菌用渗透培养基悬浮，所述渗透培养基含有细胞分裂素KT、植物生长素2,4-D、抗氧化剂DTT和L-Cysteine；（c）在渗透培养基中，用薄刀刃在大豆的上胚轴顶端纵切，制造伤口；（d）致伤处理后的大豆幼苗浸没在渗透培养基中培养；（e）农杆菌侵染后的大豆幼苗在吸水纸上吸干水分，种入土中。该方法是一种无需经过组织培养阶段的农杆菌介导的大豆转化方法，具有比较高的实际应用价值和推广前景。

Description

一种农杆菌介导的纵切幼苗上胚轴顶端转化大豆的方法

技术领域

本发明涉及一种农杆菌介导的利用纵切幼苗上胚轴顶端转化大豆的方法。

背景技术

大豆是重要的的食用和油料作物。大豆含丰富的植物蛋白，营养价值极高。大豆油中不饱和脂肪酸和维生素E含量丰富，是世界上最重要的植物油。随着世界人口的增长及人们生活水平的提高，人们对大豆的需求量越来越大。常规育种已不能满足人们对大豆品种和品质的要求。随着现代分子生物学的发展和进步，利用转基因技术培育大豆新品种已经成为一种趋势。

将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术。目前用于大豆育种的转基因技术主要包括两大类，第一类是不需要经过组织培养的转基因技术，目前研究比较多的是花粉管通道法；另一类是需要经过组织培养的转基因技术，比较常用的有基因枪法和农杆菌介导法。

（一）花粉管通道法

花粉管通道法是在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液,利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道,将外源DNA导入受精卵细胞,并进一步地被整合到受体细胞的基因组中,随着受精卵的发育而成为携带转基因的新个体。花粉管通道法不需要组织培养和仪器转化设备，简便易行,但需要育种工作者摸索具体的外源DNA导入时间与方法。

（二）基因枪法

基因枪法是将直径很小的钨粉或金粉粒子微粒浸泡在供体DNA中,使外源基因吸附在表面,然后用基因枪以很高的速度将金属微粒射入受体植物细胞内实施转化。该方法的主要优点是不受受体植物范围的限制,其载体质粒的构建也相对简单,因此也是目前转基因研究中应用较为广泛的一种方法。但是基因枪法需要经过组织培养阶段，受到组织培养条件的限制，转基因周期长，成本比较高。另一方面由于基因枪法的随机性，外源基因进入宿主基因组的整合位点相对不固定，拷贝数往往较多，这样转基因后代容易出现突变、外源基因容易丢失，容易引起基因沉默等现象的发生，不利于外源基因在宿主植物的稳定表达。而且基因枪价格昂贵、运转费用高。这些都限制了基因枪作为产业化转基因技术的广泛使用。

（三）农杆菌介导法

农杆菌介导法是现代转基因领域广泛使用的一种技术，其优点是手段相对简单,可靠性强,效率高。但在只有外植体能再生的双子叶植物中才能采用。目前，农杆菌介导法应用于大豆转化主要是以大豆的子叶、子叶节等为外植体，利用农杆菌侵染，然后经过组织培养再生器官，获得转基因苗。大豆转化的效率受到农杆菌菌株感染转化能力、大豆基因型、组织培养条件、T-DNA的转移效率和转化后的筛选模式的影响，很难大面积推广。

本发明提供了一种全新的、无需经过组织培养阶段的农杆菌介导的大豆转化方法，具有比较高的实际应用价值和推广前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种农杆菌介导的纵切幼苗上胚轴顶端转化大豆的转基因方法，包括以下步骤：

（a）、浸泡大豆，光照保湿条件下培养至下胚轴长2～3cm。

（b）、将含有目的基因的农杆菌用渗透培养基悬浮，所述渗透培养基含有细胞分裂素KT、植物生长素2,4-D、抗氧化剂DTT和L-Cysteine。

（c）、在渗透培养基中，用薄刀刃在大豆的上胚轴顶端纵切，制造伤口。

（d）、致伤处理后的大豆幼苗浸没在渗透培养基中培养。

（e）、农杆菌侵染后的大豆幼苗在吸水纸上吸干水分，种入土中。

使用纵切幼苗上胚轴顶端转化大豆时，会导致大部分植株发生褐变腐烂死亡的现象，严重影响了植株生长及结实率与转化率。这种外植体的褐化可能是植物对受伤和病原体侵害的一种防御反应。我们在渗透培养基里添加了DTT和L-Cysteine，这两种抗氧化剂可以有效的减少外植体的褐化现象，提高农杆菌的感染率。本发明还首次在渗透培养基里添加了生长素2,4-D和激动素(KT)，这两种添加剂能够显著提高大豆的转化效率。

本发明中，上述渗透培养基中2,4-D的最佳浓度为0.5-5mg/L、KT的最佳浓度为0.1-4mg/L、DTT的最佳浓度为0.5-5mM/L、L-Cysteine的最佳浓度为100～400mg/L。

本发明中用薄刀刃在大豆的上胚轴顶端纵切，制造伤口，具体为：顺大豆两子叶夹缝，划伤上胚轴顶端外侧，使夹缝向胚轴方向延长，优选延长4～6mm。致伤后的大豆在渗透培养基中28℃、24hr黑暗、130～170rpm培养15～30min。

本发明含有目的基因的农杆菌的获得，是将目的基因插入表达载体，再将该载体导入农杆菌中。常用的表达载体包括但不限于：pBin系列载体、pBI系列载体、Gateway系列载体、pCAMBIA系列载体；常用的农杆菌菌株包括但不限于：AGL0、AGL1、GV3101、EHA105、LBA4404等。

本发明的方法与其它大豆转基因方法的显著区别在于采用大豆上胚轴顶端作为农杆菌介导的外植体，而不是胚性愈伤或悬浮细胞，避免了组织培养和植株再生的过程，克服了由于大豆基因型对转化后植株再生的局限，同时极大简化了大豆转基因操作的流程，具有比较高的实际应用价值和推广前景。

下面结合具体实施例进一步阐述本发明，而不构成对发明范围的限制。

附图说明

图1为T0代转基因大豆草胺磷涂抹实验筛选结果示图，其中A图为野生型，B图为转基因阳性植株。红色圆圈为草胺磷涂抹的叶片部位。

图2为T1代转基因大豆草胺磷喷洒实验筛选结果示图，其中A图为野生型，B图为转基因阳性植株。

图3为T1代转基因大豆的PCR检测结果，其中泳道M为marker，+是以质粒为模板的正对照，-为野生型负对照，1～10为检测的10个转基因大豆。

图4为T1代转基因大豆的southern检测结果，其中泳道1～5为转基因大豆，+为质粒的正对照。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《MolecularCloning:A Laboratory Manual》（Sambrook，J.，Russell,David W.，Molecular Cloning:ALaboratory Manual，3^rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor）。所用引物及DNA序列均由上海英骏生物技术有限公司合成。

实施例一、纵切上胚轴顶端转化大豆

1.实验材料：

质粒：含有bar基因，带有潮霉素筛选标记基因的pcambia1300-bar载体，具有抗草铵磷除草剂。PCR扩增bar基因连接到pcambia1300（购自Invitrogen公司）载体上得到pcambia1300-bar载体。

农杆菌菌株：AGL0。

供转化的大豆品种：黑农37号，华疆4号。

2.农杆菌的培养

挑取甘油冻存的含有目的基因的农杆菌，于YEB平板上画线，28℃黑暗培养箱培养2天。挑取单菌落接种于40ml抗性YEB液体培养基中，28℃黑暗摇床200rpm摇过夜，至OD₆₀₀≈1。吸取上述培养物250～300μl涂布于平板直径为15cm的YEB固体培养基上，28℃黑暗培养箱培养2天后，此备用的新鲜平板当天使用，约20℃室温黑暗待用，不要继续存留于28℃黑暗培养箱或转存于4℃冰箱。

3.渗透培养基的制备

首先按照下述配方配制AA培养基。

AA培养基配制(1L)：

在1LAA培养基中添加下列成分：

As（100～200μM）；KT（0.2mg）；2,4-D（1mg）；DTT（1mM）；L-Cysteine（200～400mg）；silwet-L77（100～400μl）。

将培养好的农杆菌用上述渗透培养基悬浮，使悬浮菌液的OD₆₀₀值为0.4～0.7，pH至5.0～5.5，转化渗透培养液制备完毕。

4.大豆种子培养

浸泡大豆种子使之吸水饱和，在25℃光照保湿条件下萌发3～4天，至胚轴长2～3cm。大豆种子每天早晚各清洗一次。

5.农杆菌菌液浸染大豆下胚轴顶端

1）将薄刀刃浸泡在上述制备好的转化渗透培养基中，顺大豆两子叶夹缝，划伤上胚轴顶端外侧，注意不要划透胚轴，使夹缝向胚轴方向延长4～6mm；

2）将处理好的大豆幼苗浸没在转化渗透培养液中，28℃黑暗130～170rpm培养15～30min；

3）转化后的大豆幼苗在吸水纸上空干，随后种入湿润的蛭石/营养土（2/1）混合土中，覆薄土，25～28℃黑暗培养2天；

4）每孔单株种入50孔穴盘，标记左上角1孔种入2株野生型植株作为对照，大棚正常培养。

实施例二、大豆转基因阳性植株的检测以及获得

1、T0代转基因阳性苗的筛选以及获得

用农杆菌介导的纵切上胚轴顶端的方法转化大豆得到的T0代转基因植株为嵌合体，植株的部分器官含有目的表达，具有目标表型。因载体含有目的基因bar，如果转基因成功，bar插入大豆基因组，使转基因阳性植株的部分器官具有草铵磷抗性。所以，我们通过草胺磷检测实施例一中的转基因大豆的叶片来筛选T0代阳性转基因植株。大豆的叶片为三生复叶，选取复叶的中间小叶片，用Mark笔标记一个圆圈，用移液器滴加2μl草铵磷溶液(Basta100mg/L+silwet-L77200μl/L)在圆圈中间，5-6天后不具抗性的植株表现萎蔫、枯黄等明显的药害反应。用上述方法涂抹大豆的第一片直到第五片复叶。五片复叶均表现草铵磷药害反应的，认定为转基因阴性植株，有一片及以上叶片表现草胺磷抗性的，认定为转基因阳性植株（图1）。我们利用涂抹法筛选得到220株T0代阳性植株。得到的将阳性植株移栽入土壤中，在大棚条件下培养，直至种子成熟收获T1代种子。

2、T1代转基因植株的筛选

我们用草胺磷对T1代转基因株系进行了进一步的筛选。将收获的T₁代种子播种适于土壤中(播种量达36Kg/亩，1/10面积作管理控制用)，待第一片复生叶完全展开，喷洒草铵磷溶液(Basta 100mg/L+silwet-L77 200μl/L，除草剂喷洒量达到90L/亩)，7-10天后药害反应稳定，对草铵磷表现抗性的植株为转基因阳性植株（图2）。

3、T1代转基因植株的PCR检测

对T1代草胺磷筛选的抗性植株，进行PCR检测实验进一步验证转基因是否成功。转基因阳性植株因成功转化bar基因而表现草胺磷抗性。根据bar基因的序列，设计PCR扩增引物，进一步验证转基因株系的阳性。每株取一片新展开的叶片，CTAB法提取植物基因组DNA。取10pg的基因组DNA进行PCR反应。根据bar基因的序列，PCR扩增引物序列如下：

引物1（上游）：5′TCATCAGATTTCGGTGACGG 3′

引物2（下游）：5′TCAACTTCCGTACCGAGCCG 3′

分别利用引物1和引物2，以抗性植株基因组DNA模板，扩增bar基因片段。

扩增体系和程序为：

PCR反应条件为：

反应结束后，对PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，可以检测到450bp的目的片段（结果见图3）。我们对10个株系进行了PCR实验，结果全部呈阳性。这进一步证明了我们获得的抗性植株为转基因阳性株系。

4.T1代阳性植株的Southern blot检测

为了确定目标bar基因确实整合到了大豆基因组上，以及整合的拷贝数，我们进一步进行Southern blot检测。根据bar基因的序列，设计Southern blot的探针模板引物如下：

引物3（上游）：5′TCATCAGATTTCGGTGACG 3′

引物4（下游）：5′ATGAGCCCAGAACGACGC 3′

取大豆复叶的中间叶片，CTAB法提取植物基因组DNA。利用引物3和引物4扩增得到的片段制作bar探针,PCR扩增反应条件同上。Southern检测为本领域常规做法。我们得到了5个株系的单拷贝转基因阳性植株，检测结果如图4示。

以上实验证明，我们利用农杆菌介导的大豆纵切上胚轴顶端转化法成功得到了基因大豆，该方法操作简便、成本高、转化效率相对较高，具有比较大的实用性和产业推广价值。

Claims (8)

1.一种农杆菌介导的纵切幼苗上胚轴顶端转化大豆的转基因方法，包括以下步骤：

（a）浸泡大豆，光照保湿条件下培养至下胚轴长2～3cm；

（b）将含有目的基因的农杆菌用渗透培养基悬浮，所述渗透培养基含有0.1-4mg/L的细胞分裂素KT、0.5-5mg/L的植物生长素2,4-D、0.5-5mM/L的抗氧化剂DTT和100～400mg/L 的L-Cysteine；

（c）在渗透培养基中，用薄刀刃在大豆的上胚轴顶端纵切，制造伤口；

（d）致伤处理后的大豆幼苗浸没在渗透培养基中培养；

（e）农杆菌侵染后的大豆幼苗在吸水纸上吸干水分，种入土中。

2.根据权利要求1所述的转基因方法，其特征在于：所述含有目的基因的农杆菌是将目的基因插入表达载体，再将该载体导入农杆菌中。

3.根据权利要求2所述的转基因方法，其特征在于：所述表达载体为植物表达载体。

4.根据权利要求3所述的转基因方法，其特征在于：所述植物表达载体为pBin系列载体、pBI系列载体、Gateway系列载体、pCAMBIA系列载体。

5.根据权利要求1所述的转基因方法，其特征在于：所述农杆菌的菌株为AGL0、AGL1、GV3101、EHA105、LBA4404。

6.根据权利要求1所述的转基因方法，其特征在于：步骤（c）所述的在大豆的上胚轴顶端纵切为顺着大豆两子叶夹缝，划伤上胚轴顶端外侧，使夹缝向胚轴方向延长至4～6mm。

7.根据权利要求1所述的转基因方法，其特征在于：步骤（d）所述的在渗透培养基中的培养，培养条件为28℃、24hr黑暗、130～170rpm处理 15～30min。

8.根据权利要求1~7任一权利要求所述的转基因方法，其特征在于：所述大豆为栽培或野生大豆品种、品系、育种材料或中间材料。

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