CN1412307A - 大豆茎尖转化真空渗透辅助的外源基因导入方法 - Google Patents
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Abstract
一种大豆茎尖转化真空渗透辅助的外源基因导入方法，在农杆菌介导BT基因对大豆茎尖转化的过程中，采用大豆种子消毒后萌发、去除顶芽，并造成表皮分生细胞损伤，作为外植体，在真空压力条件下进行农杆菌感染处理，在萌发培养基上进行共培养，用一定量的硫酸卡那霉素加入芽伸长培养基和生根培养基进行筛选，能得到较多的再生苗和转化的大豆植株。本发明采用真空渗透法在外植体上制造微小伤口，充分的提高了农杆菌入侵的机会，明显的提高了农杆菌的感染效率，有效的提高了出芽数量和转化苗的数量。
Description
技术领域：
本发明涉及一种大豆茎尖转化真空渗透辅助的外源基因导入方法，是一种利用真空渗透辅助手段将外源基因导入大豆，从而改良大豆的遗传性状的的操作方法，属于生物技术和现代农业技术领域。
背景技术：
植物基因转化的成功，取决于是否具有良好的受体系统，即是否具有较强的植物再生能力和高频的转化率，(《植物基因工程原理与技术》王关林主编，技术出版社)。目前转基因的方法主要分为两类：1直接法，例如，花粉管通道法，微注射法，电击法，PEG法和基因枪法，2载体法，例如，农杆菌介导法和噬菌体作载体法等。其中农杆菌介导法在植物转基因中占有重要地位。Bechtold曾用真空渗入技术将农杆菌接种拟南芥植株得到了大量突变体(Bechtold 1993.life sciences 316：1194-99)，但此项技术在大豆的应用方面未见报导。有人先后选用子叶节，幼胚等作为外植体转化获得了成功，但转化效率不高(0.6％)。因而目前存在的主要问题是提高转化效率。
发明内容：
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种大豆茎尖转化真空渗透辅助的外源基因导入方法，解决在生物技术中存在的大豆转化苗少的难点，提高大豆转化率。
为实现这样的目的，本发明在大豆转化过程中辅助采用真空渗透法，在农杆菌介导BT基因对大豆茎尖转化的过程中，采用大豆种子消毒后萌发、去除顶芽，并造成表皮分生细胞损伤，作为外植体，在0.06MPa-0.08MPa真空压力条件下处理10～20分钟，进行农杆菌感染，在萌发培养基上进行共培养，用80mg/L硫酸卡那霉素加入芽伸长培养基和50mg/L硫酸卡那霉素加入生根培养基进行筛选，能得到较多的再生苗和转化的大豆植株。
本发明的具体方法包括如下步骤：
1)取大豆种子用自来水反复冲洗，放在70％的酒精中浸泡0.5～1分钟，转入含有饱和次氯酸钙溶液中浸泡15分钟，用无菌水冲洗4～5次，然后将种子置于无菌水中浸泡18～24小时，使种子萌发。
2)剥去种皮，去除子叶，在解剖镜下去除两片原叶，暴露出顶端分生组织区，从中取出约0.5cm的茎尖，置于MSB+6-BA3.0mg/L培养基上，预培养24小时。
3)在0.06MPa-0.08Mpa的真空压力条件下，农杆菌感染10～20分钟(OD600nm≈0.5)，侵染完毕，将材料取出，用无菌滤纸吸干，放在MSB+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L(PH5.8)培养基上避光共培养3天。
4)转入MSB+BA0.5mg/L+cb 500mg/L(ph5.8液体)连续培养3天，每天换新鲜培养基。
5)转入MSB+BA0.5mg/L+cb 500mg/L+KM80mg/L(ph5.8固体)，每2周转接一次，至不定芽出现伸长到2～3cm。
6)切下外植体上的不定芽并放在1/2MSB+KM50mg/L(PH5.8)培养基上，进行转化芽诱导生根15～20天，移栽到大盆至获得转化植株产生的种子。
本发明采用真空渗透法在外植体上制造微小伤口，充分的提高了农杆菌入侵的机会，明显的提高了农杆菌的感染效率，有效的提高了出芽数量和转化苗的数量。达到出芽多，再生苗能力强，形成高频的转化植株的效果。与普通农杆菌介导的方法相比，转化率大幅度提高。
具体实施方法：
以下结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
实施例1
实验品种为东农43，50粒。
取大豆种子用自来水反复冲洗，放在70％的酒精中浸泡0.5分钟，转入含有饱和次氯酸钙溶液中浸泡15分钟，用无菌水冲洗4次，然后将种子置于无菌水中浸泡18小时。剥去种皮，去除子叶，在解剖镜下去除两片原叶，暴露出顶端分生组织区，从中取出约0.5cm的茎尖，置于MSB5+6-BA3.0mg/L培养基上，预培养24小时。
将预培养的茎尖取出，置于0.06MPa真空压力条件下，农杆菌感染10分钟(OD600nm≈0.5)，放在MSB+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L(PH5.8)培养基上避光共培养3天。
转入MSB+BA0.5mg/L+cb 500mg/L(ph5.8液体)连续培养3天，每天换新鲜培养基。
转入MSB+BA0.5mg/L+cb 500mg/L+KM80mg/L(ph5.8固体)，每2周转按一次，至不定芽出现伸长到2cm。
切下外植体上的不定芽并放在1/2MSB+KM50mg/L(PH5.8)培养基上，进行转化芽诱导生根15天，移栽到大盆至获得转化植株产生的种子。
获得转BT基因的大豆植株东43号36株。
实施例2
实验品种为吉林27，50粒。
取大豆种子用自来水反复冲洗，放在70％的酒精中浸泡1分钟，转入含有饱和次氯酸钙溶液中浸泡15分钟，用无菌水冲洗5次，然后将种子置于无菌水中浸泡24小时。剥去种皮，去除子叶，在解剖镜下去除两片原叶，暴露出顶端分生组织区，从中取出约0.5cm的茎尖，置于MSB5+6-BA3.0mg/L培养基上，预培养24小时。
将预培养的茎尖取出，置于0.08MPa真空压力条件下，农杆菌感染15分钟(OD600nm≈0.5)，放在MSB+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L(PH5.8)培养基上避光共培养3天。
转入MSB+BA0.5mg/L+cb 500mg/L(ph5.8液体)连续培养3天，每天换新鲜培养基。
转入MSB+BA0.5mg/L+cb 500mg/L+KM80mg/L(ph5.8固体)，每2周转接一次，至不定芽出现伸长到3cm。
切下外植体上的不定芽并放在1/2MSB+KM50mg/L(PH5.8)培养基上，进行转化芽诱导生根20天，移栽到大盆至获得转化植株产生的种子。
获得转BT基因的大豆植株吉林27号36株。
实施例3
实验品种为合丰35，50粒。
取大豆种子用自来水反复冲洗，放在70％的酒精中浸泡0.5～1分钟，转入含有饱和次氯酸钙溶液中浸泡15分钟，用无菌水冲洗5次，然后将种子置于无菌水中浸泡19小时。剥去种皮，去除子叶，在解剖镜下去除两片原叶，暴露出顶端分生组织区，从中取出约0.5cm的茎尖，置于MSB5+6-BA3.0mg/L培养基上，预培养24小时。
将预培养的茎尖取出，置于0.07MPa真空压力条件下，农杆菌感染20分钟(OD600nm≈0.5)，放在MSB+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L(PH5.8)培养基上避光共培养3天。
转入MSB+BA0.5mg/L+cb 500mg/L(ph5.8液体)连续培养3天，每天换新鲜培养基。
转入MSB+BA0.5mg/L+cb 500mg/L+KM80mg/L(ph5.8固体)，每2周转接一次，至不定芽出现伸长到2cm。
切下外植体上的不定芽并放在1/2MSB+KM50mg/L(PH5.8)培养基上，进行转化芽诱导生根18天，移栽到大盆至获得转化植株产生的种子。
获得转BT基因的大豆植株合丰35号35株。
用本发明的方法能适合于大豆转各种基因，能快速得到较高频率的大豆转化植株。
Claims (1)
1、一种大豆茎尖转化真空渗透辅助的外源基因导入方法，其特征在于包括如下步骤：
1)大豆种子冲洗后放在70％的酒精中浸泡0.5～1分钟，转入含有饱和次氯酸钙溶液中浸泡15分钟，用无菌水冲洗后将种子置于无菌水中浸泡18～24小时，使种子萌发；
2)剥去种皮，去除子叶，在解剖镜下去除两片原叶，暴露出顶端分生组织区，从中取出约0.5cm的茎尖，置于MSB5+6-BA3.0mg/L培养基上，预培养24小时；
3)在0.06-0.08MPa真空压力条件下，农杆菌感染10～20分钟(OD600nm≈0.5)，然后放在MSB+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L(PH5.8)培养基上避光共培养3天；
4)转入MSB+BA0.5mg/L+cb 500mg/L(PH5.8液体)连续培养3天，每天换新鲜培养基；
5)转入MSB+BA0.5mg/L+cb 500mg/L+KM80mg/L(PH5.8固体)每2周转接一次，至不定芽出现伸长到2～3cm；
6)切下外植体上的不定芽并放在1/2MSB+KM50mg/L(PH5.8)培养基上，进行转化芽诱导生根15～20天，移栽到大盆至获得转化植株产生的种子。
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| CN (1) | CN1412307A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101001958B (zh) * | 2004-06-07 | 2010-06-23 | 巴斯福植物科学有限公司 | 改良的大豆转化 |
| CN101457235B (zh) * | 2008-08-05 | 2011-04-27 | 山东省林业科学研究院 | 一种真空渗透辅助农杆菌介导转化苜蓿的方法 |
| CN102329816A (zh) * | 2011-06-15 | 2012-01-25 | 北京未名凯拓作物设计中心有限公司 | 一种农杆菌介导的纵切幼苗上胚轴顶端转化大豆的方法 |
| CN102732558A (zh) * | 2012-04-13 | 2012-10-17 | 天津大学 | 对大豆直接进行基因转化的方法 |
-
2002
- 2002-11-28 CN CN 02150774 patent/CN1412307A/zh active Pending
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