CN112970583B - 一种红比利时杜鹃再生技术体系的建立方法及其应用 - Google Patents

一种红比利时杜鹃再生技术体系的建立方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种红比利时杜鹃再生技术体系的建立方法及其应用，该技术主要包括四大部分：一是以嫩叶为外植体诱导愈伤组织的产生；二是愈伤组织继代扩增；三是愈伤组织芽的诱导；四是愈伤组织根的诱导；红比利时杜鹃花作为一种国内外重要的观赏园艺杜鹃品种，开展组织快繁技术对于红比利时杜鹃花的快速产业化生产，以及开展分子遗传育种的研究都具有重要的现实意义和理论价值，本发明的红比利时杜鹃快繁技术有效地解决了目前繁育方法中繁殖困难、适应性低等问题，具有较高的商用以及推广价值，提供了一种高效、感染率低的红比利时杜鹃培育方法。

Description

一种红比利时杜鹃再生技术体系的建立方法及其应用
技术领域
本发明属于植物组培与快繁技术领域，涉及一种红比利时杜鹃再生技术体系的建立方法及其应用。
背景技术
植物快繁技术是指在无菌条件下，利用植物体的部分细胞或组织器官，在人工控制的营养和环境下依次通过愈伤组织诱导、愈伤组织继代、生芽、生根等实验进行植株个体的快速繁殖。该技术在应用过程中会遇到许多难题，其中污染率高是其中重要的一个。
红比利时杜鹃(Rhododendron×hybridum)隶属杜鹃花科、杜鹃花属的常绿灌木，在江浙一带广泛分布。红比利时杜鹃植株矮小，枝叶表面疏生柔毛，花色透亮艳丽，几乎四季有花，花期长，生命力极强。该品种由荷兰、比利时等国的园艺育种学家利用皋月杜鹃、映山红及毛白杜鹃等品种经过多年反复杂交培育而成，是目前世界盆栽花卉生产的主要种类之一，栽培面积广，经济价值高。不过在长期的栽培过程中发现，红比利时杜鹃生长缓慢，自然繁殖率低，常规的扦插、压条、嫁接等技术常常因组织腐烂、病虫害、土壤条件不适宜等因素影响导致繁殖困难、适应性低，也容易导致品种退化，因此寻求更加快速高效、经济、适应性强的繁殖技术对于红比利时杜鹃的大规模产业化具有重要的经济价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种红比利时杜鹃再生技术体系的建立方法，以解决目前红比利时杜鹃在培育中繁殖困难、适应性低的问题。
为了解决上述问题，本发明提供了一种红比利时杜鹃再生技术体系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)外植体准备、(2)愈伤组织诱导、(3)愈伤组织增殖、(4)芽的诱导、(5)根的诱导、(6)移栽；
所述步骤(2)具体包括将步骤(1)处理后的外植体消毒后切块放入外植体诱导培养基中进行培养；
所述步骤(3)具体包括将步骤(2)处理后的外植体放入愈伤组织培养基中进行培养；
所述步骤(4)具体包括将步骤(3)处理后的外植体放入不定芽诱导培养基中进行培养；
所述步骤(5)具体包括将步骤(4)处理后的外植体放入不定根诱导培养基中进行继代培养；
作为优选的方案，所述步骤(2)中采用的外植体诱导培养基的配方及其组成比例为：WPM粉2-2.5g/L，蔗糖15-25g/L，麦芽糖5-15g/L，琼脂5-10g/L，2,4-D 0.2-0.4mg/L，TDZ0.2-0.4mg/L，PPM抗菌剂0.01-0.1μL/L，溶剂为水。
作为优选的方案，所述步骤(3)中所述的愈伤组织增殖培养基的配方及其组成比例为：WPM粉2-2.5g/L，蔗糖15-25g/L，麦芽糖5-15g/L，琼脂5-10g/L，活性炭1-2g/L，6-BA0.5-1mg/L，TDZ 1-1.3mg/L，2,4-D 0.5-1mg/L，溶剂为水。
作为优选的方案，所述步骤(4)中所述不定芽诱导培养基配方及其组成比例为：WPM粉2-2.5g/L，蔗糖15-25g/L，麦芽糖5-15g/L，琼脂5-10g/L，2,4-D 0.05-0.15mg/L，TDZ0.2-0.4mg/L，溶剂为水。
作为优选的方案，所述步骤(5)中所述的不定根诱导培养基配方及其组成比例为：WPM粉2-2.5g/L，蔗糖15-25g/L，麦芽糖5-15g/L，琼脂5-10g/L，活性炭1-2g/L，6-BA 0.1-0.3mg/L，NAA 0.5-1mg/L，溶剂为水。
作为优选的方案，所述步骤(3)、(4)、(5)中培养的条件为：外植体在室温24℃，湿度65％RH，每天给予光照12小时；所述步骤(2)中培养的条件为：外植体在室温24℃，湿度65％RH，暗培养7天后，每天给予光照12小时。
作为优选的方案，所述步骤(2)的具体工艺为：将外植体置入酒精溶液中并搅拌，用无菌水清洗后将外植体置入氯化汞溶液中再次搅拌，继续用无菌水清洗后将外植体切割成0.5厘米×1厘米的长方块放入培养基中进行培养。
作为优选的方案，所述步骤(3)还包括对愈伤组织去褐化的步骤，具体的步骤如下：若发现愈伤组织出现褐化，将愈伤组织放到无菌环境下进行切割，切掉褐化部位，再接入新的培养基中培育。
作为优选的方案，所述步骤(2)-(5)中还包括继代培养的处理，且继代培养的周期为20-25天。
一种高效、感染率低的红比利时杜鹃再生技术体系的应用，具体包括红比利时杜鹃及其相近种属的组织培养技术及产业化应用。
本发明提供了一种红比利时杜鹃花快速繁育技术的方法，填补了目前红比利时杜鹃快繁技术的空缺，提供了一种红比利时杜鹃快速组织培养技术的培养基配方，本发明方法经试验测试，初代接种污染率低于12％，出愈率高达95％，分化率高达83.33％，生长速度高达20天平均增殖率为164.53％，具有较高的应用价值。
附图说明
图1为本发明红比利时杜鹃花嫩叶愈伤组织诱导的结果图；
图2为本发明红比利时杜鹃花嫩叶的愈伤组织增殖图；
图3为本发明红比利时杜鹃嫩叶诱导愈伤组织的不定芽诱导图；
图4为本发明红比利时杜鹃嫩叶诱导愈伤组织的不定根诱导图。
图5为本发明红比利时杜鹃花嫩叶的愈伤增值响应面图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1、红比利时杜鹃的选择与嫩叶的采摘
挑选3-5年生的，长势良好健康的红比利时杜鹃花植株为对象，选取新发一周左右的嫩叶并确保叶片表面无破损和病害，用剪刀从叶柄处小心剪下，并保证叶片的完整性。之后将嫩叶装入透明塑料袋并放置4℃冰箱暂存备用，此叶片为后续实验组培所用的外植体。
实施例2、红比利时杜鹃花嫩叶愈伤组织的诱导和继代培养
1.外植体诱导培养基配制：称取WPM培养基粉末加1L水煮沸，加入蔗糖20g、麦芽糖10g，缓慢分4次倒入总共7g的琼脂，煮至澄清透明无沉淀，待冷却至60℃时，加入TDZ、2,4-D激素，使溶液中TDZ、2,4-D最终浓度0.3mg/L，并用KOH溶液调节溶液pH为5.8，之后加入PPM抗菌剂50μL，分装，高压灭菌锅121℃灭菌20min。
2.外植体接种：无菌条件下，在瓶中倒入没过外植体的酒精，搅拌30秒。无菌水洗外植体2-3次。瓶中倒入没过外植体的升汞溶液(0.1％氯化汞溶液)，搅拌7分钟。无菌水洗外植体3次。将得到的外植体放入酒精灯灼烧过的盘中，进行切割，切掉叶边，随后将叶片切成0.5厘米×1厘米的长方块。
愈伤组织诱导的一种具体实施步骤如下：
将冲洗的叶片带入组培室，戴上防护用具。酒精喷洒手并揉搓。点燃酒精灯，对所有需要使用的器皿进行长时间的酒精灯灼烧灭菌。随后进行如下操作：
①瓶中倒入没过外植体的酒精，搅拌30秒，将酒精倒入空瓶。
②无菌水洗外植体2-3次，将废液倒入空瓶。
③瓶中倒入没过外植体的升汞(0.1％氯化汞)，搅拌7分钟，氯化汞回收入原瓶中。
④无菌水洗外植体3次，将废液倒入空瓶。
⑤将得到的外植体放入酒精灯灼烧过的盘中，进行切割，切掉叶边，随后将叶片切成0.5厘米×1厘米的长方块。完成全部切割后，将镊子酒精灼烧。
⑥取培养基，边旋转瓶子边对其瓶盖处进行灼烧5-6秒，打开瓶盖，将瓶盖口朝下放在无菌纸上，如果瓶中水较多，将水倒出，用镊子夹起叶片(夹住叶片边缘)，轻轻放入培养基中(切忌手不能伸入瓶中)，一个培养基放置三片叶片，随后在靠近酒精灯并盖上瓶盖，灼烧镊子，随后接下一瓶，反复直至所有瓶子接完。
3.培养条件：接种后放置在室温24℃，湿度65％RH，暗培养7天后，每天给予光照强度800lx的光照12小时。
4.继代培养：选取上述外植体诱导愈伤组织效果好的材料用于继代培养，每20-25天继代一次。
实施例3、红比利时杜鹃花嫩叶愈伤组织增殖培养
1.愈伤组织培养基的配制：称取WPM培养基粉末加1L水煮沸，加入蔗糖20g、麦芽糖10g，缓慢分4次倒入总共7.5g的琼脂，煮至澄清透明无沉淀，待冷却至60℃时，加入TDZ、2,4-D、6-BA激素，使溶液中6-BA、2,4-D最终浓度0.6mg/L，TDZ最终浓度1.3mg/L，并用KOH溶液调节溶液pH为5.8，之后缓加入活性炭搅拌均匀，分装，高压灭菌锅121℃灭菌20min，培养基快凝固时，摇动培养基，使活性炭均匀分布。
2.外植体接种：喷洒需要继代的组培瓶并放入超净工作台，酒精喷洒手并揉搓。点燃酒精灯，对所有需要使用的器皿进行长时间的酒精灯灼烧灭菌。随后进行如下操作：取需要继代的培养基，边旋转瓶子边对其瓶盖处进行灼烧5-6秒，打开瓶盖，取新的培养基打开瓶盖，将愈伤用镊子转移至继代培养基，随后靠近酒精灯并盖上瓶盖，灼烧镊子，随后接下一瓶，反复直至所有瓶子接完。(如愈伤出现褐化，将愈伤放到无菌的盘子上进行切割，切掉褐化部位，再接入新的培养基)。
3.培养条件：接种后放置在室温24℃，湿度65％RH，每天给予光照强度400lx光照12小时。
4.培养次数：愈伤组织增殖培养次数一般为3次，随后开始不定芽的诱导。
实施例4、红比利时杜鹃花嫩叶愈伤组织不定芽的诱导
取长势较好的愈伤进行不定芽诱导。
1.培养基配制：称取WPM培养基粉末加1L水煮沸，加入蔗糖20g、麦芽糖10g，缓慢分4次倒入总共7.5g的琼脂，煮至澄清透明无沉淀，待冷却至60℃时，加入TDZ、2,4-D激素，使溶液中TDZ最终浓度0.3mg/L，2,4-D最终浓度0.1mg/L，用KOH溶液调节溶液pH为5.8，之后缓加入活性炭搅拌均匀，分装，高压灭菌锅121℃灭菌20min，培养基快凝固时，摇动培养基，使活性炭均匀分布。
2.接种生芽培养基：无菌条件下，用无菌的镊子将愈伤转移至生芽培养基中。
具体的一种实施方式如下：
喷洒装有高活性愈伤的组培瓶并放入超净工作台，酒精喷洒手并揉搓。点燃酒精灯，对所有需要使用的器皿进行长时间的酒精灯灼烧灭菌。随后进行如下操作：
取需要诱导芽的培养瓶，边旋转瓶子边对其瓶盖处进行灼烧5-6秒，打开瓶盖，取新的芽诱导培养基打开瓶盖，将愈伤用镊子转移至芽诱导培养瓶，靠近酒精灯并盖上瓶盖，灼烧镊子，随后接下一瓶，反复直至所有瓶子接完。
3.培养条件：接种后放置在室温24℃，湿度65％RH，每天给予光照强度1000～2000lx光照12小时，大约7天左右即可生芽。
实施例5、红比利时杜鹃花嫩叶不定根的诱导
取长势好的丛生芽进行不定根诱导。
1.培养基配制：称取WPM培养基粉末加1L水煮沸，加入蔗糖20g、麦芽糖10g，缓慢分4次倒入总共7.5g的琼脂，煮至澄清透明无沉淀，待冷却至60℃时，加入6-BA、NAA激素，使溶液中6-BA最终浓度0.2mg/L，NAA最终浓度0.6mg/L，用KOH溶液调节溶液pH为5.8后缓加入活性炭搅拌均匀，分装，高压灭菌锅121℃灭菌20min，培养基快凝固时，摇动培养基，使活性炭均匀分布。
2.接种生根培养基：无菌条件下，用无菌的镊子将芽一株株地分开并转移至生根培养基中。
具体的一种操作方式如下：
喷洒装有出芽愈伤的组培瓶并放入超净工作台，酒精喷洒手并揉搓。点燃酒精灯，对所有需要使用的器皿进行长时间的酒精灯灼烧灭菌。随后进行如下操作：
取需要诱导生根的培养瓶，边旋转瓶子边对其瓶盖处进行灼烧5-6秒，打开瓶盖，取新的根诱导培养基打开瓶盖，将愈伤用镊子转移至根诱导培养瓶，靠近酒精灯并盖上瓶盖，灼烧镊子，随后接下一瓶，反复直至所有瓶子接完。
3.培养条件：接种后放置在室温24℃，湿度65％RH，每天给予光照强度1000～2000lx光照12小时。
4.继代间隔时间：每20-25天继代一次。
实施例6、移栽
待生根培养后的小苗根系长齐后进行炼苗，进行移栽，将小苗根系的培养基洗净后，将小苗移栽至基质中，最后移栽至土壤中。
图1-图4分别为上述实验实施例中愈伤组织诱导的结果图、愈伤组织增殖图、愈伤组织的不定芽诱导图以及愈伤组织的不定根诱导图。
图5为本发明本发明红比利时杜鹃花嫩叶的愈伤增值响应面图，对应的实验数据如下表所示：
Se1ect Std Run Factor 1A：2，4-Dmg/L Factor 2B：6-BA mg/L Factor 3C：TDZ mg/L Response 1增殖率％
17 1 0.6 0.6 1.3 142.28
13 2 0.6 0.6 1.3 167.99
2 3 1 0.2 1.3 0.12
6 4 1 0.6 0.6 43.42
7 5 0.2 0.6 2 39.02
10 6 0.6 1 0.6 47.5
16 7 0.6 0.6 1.3 154.55
12 8 0.6 1 2 145
3 9 0.2 1 1.3 8.27
4 10 1 1 1.3 9.65
9 11 0.6 0.2 0.6 9.44
8 12 1 0.6 2 60.37
5 13 0.2 0.6 0.6 22.53
15 14 0.6 0.6 1.3 175.74
11 15 0.6 0.2 2 72.61
1 16 0.2 0.2 1.3 22.39
14 17 0.6 0.6 1.3 182.1
从响应面实验数据可以看出，各激素量不同对其生长速率有显著的影响，当激素2，4-D：0.6mg/L，6-BA：0.6mg/L，TDZ：1.3mg/L时，愈伤在20天里增殖率最大即生长速率最快。
通过本发明实施例1-5的测试，本发明的红比利时杜鹃初代接种污染率低于12％，出愈率高达95％，分化率高达83.33％，生长速度高达20天平均增殖率为164.53％。
本发明上述实施例涉及到的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为符合生物基因工程领域的市售产品，也可以使用同类产品在不影响效果的前提下进行替换。
以上就本发明较佳的实施例作了说明，但不能理解为是对权利要求的限制。本发明不仅局限于以上实施例，其具体结构以及步骤允许有变化，凡在本发明独立要求的保护范围内所作的各种变化均在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种红比利时杜鹃再生技术体系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)外植体准备、(2)愈伤组织诱导、(3)愈伤组织增殖、(4)芽的诱导、(5)根的诱导、(6)移栽；
所述步骤（1）中外植体为3-5年生的，新发一周左右的嫩叶；
所述步骤(2)具体包括将步骤(1)处理后的外植体消毒后切块放入外植体诱导培养基中进行培养；
所述步骤(3)具体包括将步骤(2)处理后的外植体放入愈伤组织增殖培养基中进行培养；
所述步骤(4)具体包括将步骤(3)处理后的外植体放入不定芽诱导培养基中进行培养；
所述步骤(5)具体包括将步骤(4)处理后的外植体放入不定根诱导培养基中进行培养；
所述步骤(2)中采用的外植体诱导培养基的配方及其组成比例为：WPM粉2-2.5g/L，蔗糖15-25g/L，麦芽糖5-15g/L，琼脂5-10g/L，2,4-D 0.2-0.4mg/L，TDZ 0.2-0.4mg/L，PPM抗菌剂50μL/L，溶剂为水；
所述步骤(3)中采用的愈伤组织增殖培养基的配方及其组成比例为：WPM粉2-2.5g/L，蔗糖15-25g/L，麦芽糖5-15g/L，琼脂5-10g/L，活性炭1-2g/L，6-BA 0.5-1mg/L，TDZ 1-1.3mg/L，2,4-D 0.5-1mg/L，溶剂为水；
所述步骤(4)中采用不定芽诱导培养基配方及其组成比例为：WPM粉2-2.5g/L，蔗糖15-25g/L，麦芽糖5-15g/L，琼脂5-10g/L，活性炭浓度1-2g/L ，2,4-D 0.05-0.15mg/L，TDZ0.2-0.4mg/L，溶剂为水；
所述步骤(5)中采用不定根诱导培养基配方及其组成比例为：WPM粉2-2.5g/L，蔗糖15-25g/L，麦芽糖5-15g/L，琼脂5-10g/L，活性炭1-2g/L，6-BA 0.1-0.3mg/L，NAA 0.5-1mg/L，溶剂为水。
2.根据权利要求1所述的一种红比利时杜鹃再生技术体系的建立方法，其特征在于：所述步骤(3)、(4)、(5)中培养的条件为：外植体在室温24℃，湿度65％RH，每天给予光照12小时；所述步骤(2)中培养的条件为：外植体在室温24℃，湿度65％RH，暗培养7天后，每天给予光照12小时。
3.根据权利要求1所述的一种红比利时杜鹃再生技术体系的建立方法，其特征在于：所述步骤(2)-(5)中还包括选择长势较好的愈伤组织进行继代培养的处理，且继代培养的周期为20-25天。
4.根据权利要求1所述的一种红比利时杜鹃再生技术体系的建立方法，其特征在于：所述步骤(2)的具体工艺为：将外植体置入酒精溶液中并搅拌，用无菌水清洗后将外植体置入氯化汞溶液中再次搅拌，继续用无菌水清洗后将外植体切割成0.5厘米×1厘米的长方块放入培养基中进行培养。
5.根据权利要求1所述的一种红比利时杜鹃再生技术体系的建立方法，其特征在于：所述步骤(3)还包括对愈伤组织去褐化的步骤，具体的步骤如下：若发现愈伤组织出现褐化，将愈伤组织放到无菌环境下进行切割，切掉褐化部位，再接入新的培养基中培育。
6.权利要求1-5任一项所述的红比利时杜鹃再生技术体系的应用，具体包括红比利时杜鹃及其相近种属的组织培养技术及产业化应用。
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