CN108142295B - 中华野海棠的组织培养快速繁殖的培养基及繁殖方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种中华野海棠的组织培养快速繁殖的培养基及繁殖方法。基本培养基采用更适合灌木和木本植物的WPM培养基，通过连续继代和合适剂量的激素组合实现了中华野海棠组织培养中植株的高效再生，另外对外植体无菌处理和外植体无菌苗的培养等做了改进。本发明操作简单、污染率低、植株再生成功率高。

Description

中华野海棠的组织培养快速繁殖的培养基及繁殖方法
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种中华野海棠的组织培养快速繁殖的培养基及繁殖方法。
背景技术
中华野海棠(Bredia sinensis)，野牡丹科野海棠属植物，在浙南山区广泛分布，终年翠绿，花团锦簇，花色美艳，姿态优雅，在造园应用上观赏价值很高，是优良的园林地被绿化观赏树种，既可观叶又可赏花，同时该种全株可供药用。中华野海棠具有很高的经济效益，开发应用广阔，市场前景看好。
中华野海棠的常规繁殖方法是播种繁殖，但种子细小，发芽率较低（屠娟丽等，2003），繁殖量有限，而扦插、分株等其它繁殖方法也未见报道。所以中华野海棠种苗生产不能满足市场需求。
组织培养快速繁殖技术，可获得优质整齐的种苗，为多种植物的快速繁殖开辟了一条有效途径。但关于中华野海棠组织培养未见报道，野牡丹科野海棠属的其它物种如秀丽野海棠组织培养仅见报道的有林骏烈（2009）、洪震（2015）等，但这几篇报道均存在以下问题：(1)基本培养基选用MS，再选用不同的激素配比，增殖生长的增值倍数一般为6-8，生产周期较长；(2)丛生芽的诱导激素选择2,4-D，虽然诱导分化率较高，产生愈伤组织较多但容易出现玻璃化现象，抑制芽的形成，影响器官发育。
发明内容
针对存在的问题，本发明提供一种中华野海棠的组织培养快速繁殖的培养基及繁殖方法，基本培养基采用更适合灌木和木本植物的WPM培养基，不定芽诱导激素选择启动能力介于NAA和2,4-D之间的IBA，通过连续继代和合适剂量的激素组合实现了中华野海棠组织培养中植株的高效再生，该方法操作简单、污染率低、植株再生成功率高。
一种中华野海棠的组织培养快速繁殖的培养基，它包括
1）无菌苗培养基：WPM；
2）不定芽诱导培养基：WPM + 6-BA 1.0~3.0 mg /L+ IBA 0.1~0.3mg/L；
3）继代增殖培养基：WPM + 6-BA 1.0~3.0 mg /L+ IBA 0.1~0.3mg/L；
4）生根培养基：1/2WPM+ NAA0.5~1.5mg/L；
在WPM以及1/2WPM中，添加白糖15～30g/L，琼脂5～8 g/L，调节pH5.6～5.8。
包括以下步骤:
（一）培养基的配制
1）无菌苗培养基：WPM；
2）不定芽诱导培养基：WPM + 6-BA 1.0~3.0 mg /L+ IBA 0.1~0.3mg/L；
3）继代增殖培养基：WPM + 6-BA 1.0~3.0 mg /L+ IBA 0.1~0.3mg/L；
4）生根培养基：1/2WPM+ NAA0.5~1.5mg/L；
在上述WPM以及1/2WPM中，添加白糖15～30g/L，琼脂5～8 g/L，调节pH5.6～5.8；
(二) 中华野海棠组培苗的培养
1）外植体的选择：选择生长健壮的中华野海棠幼嫩顶芽或带芽点的茎段作为组织培养的外植体，流水冲洗1~2h，然后超净工作台上用无菌水冲洗干净，再用70%酒精消毒20-40s，0.1%升汞溶液进行灭菌6-8min，然后用无菌水冲洗多次，用无菌滤纸吸干外植体上的水分备用；
2）外植体无菌苗的培养：在超净工作台上将步骤1）中准备的外植体接种到无菌苗培养基中进行培养；培养条件：培养温度为25±2℃，光照光强为1500Lx，光照时间14h/d；
3) 待步骤2）中的无菌苗长到3.0 ~5.0 cm 高且有成熟叶片时，将叶片切成0.5×0.5cm大小接种到不定芽诱导培养基上进行诱导培养；培养条件：培养温度为25±2℃，光照光强为1500Lx，光照时间14h/d；
4）待步骤3）中诱导出大量不定芽后，将不定芽进行切割后接种到继代增殖培养基进行培养；培养条件：培养温度为25±2℃，光照光强为1500Lx，光照时间14h/d；
5) 待步骤4）中丛生芽长成的小苗生长到2. 0 ~ 3.0cm 高时，对小苗进行切割后接种到生根培养基中；培养条件：培养温度为25±2℃，光照光强为1500Lx，光照时间14h/d；
6) 待步骤5）中的小苗长到高3 ~ 5cm 且具有至少3 条长于2cm 的根时，得到可出瓶种植的种苗。
进一步，（三）组培苗的炼苗与移栽
将步骤6）所述的种苗带瓶一起移至温室大棚，先去盖放置2-5天，出瓶并洗净根部培养基，移栽入泥炭∶蛭石∶珍珠岩按体积2∶1∶1的混合基质中，管理至成品苗，出圃。
本发明的有益效果
一、本发明增加了对外植体进行无菌苗的培养，再取成熟叶片进行丛生芽诱导和分化的步骤，从而降低了污染率，为后续不定芽诱导及增殖扩繁提供了健壮的幼苗；
二、本发明通过采用更适宜木本植物的WPM培养基配方，不定芽诱导激素选择启动能力介于NAA和2,4-D之间的IBA，结合不同的激素配比和浓度调节，既有效诱导了不定芽又降低了玻璃化现象，提高了繁殖系数 (12-15倍)，也进一步提高了种苗的质量，使移栽成活率高达95% 以上；
三、采用本发明的方法，是一种不受季节等因素影响，高效、快速提供优质中华野海棠种苗的方法，可以加速良种推广速度，提高田间品种种植产量；
四、本发明建立的中华野海棠组织培养体系将为工厂化育苗提供理论依据和技术支撑，方法操作简单、污染率低、植株再生成功率高。
附图说明
图1是外植体无菌苗获得的叶片接种到不定芽诱导培养基上进行诱导培养；
图2是叶片诱导产生大量愈伤组织和不定芽；
图3是不定芽长成的小苗进行继代增值培养；
图4是幼苗进行生根培养。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1
一种中华野海棠的组织培养快速繁殖的方法，依次进行一下步骤：
（一）培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为：
1）基本培养基：无菌苗培育、不定芽诱导分化、继代增殖壮苗的培养基均采用WPM基本培养基，生根培养采用1/2WPM。
2）无菌苗培养基为：WPM+白糖20g/L+琼脂8g/L，pH5.6～5.8
3）不定芽诱导培养基：WPM + 6-BA 1.0 mg /L+ IBA 0.1mg/L；
4） 继代增殖培养基为：WPM + 6-BA 1.0 mg/L + IBA 0.1 mg/L+白糖25g/L+琼脂5g/L，pH5.6～5.8。
5）生根培养基为：1/2WPM + NAA0.5mg/L +白糖30g/L+琼脂5g/L，pH5.6～5.8；
(二) 中华野海棠组培苗的培养
1）外植体的选择：选择生长健壮的中华野海棠幼嫩顶芽或带芽点的茎段作为组织培养的外植体，流水冲洗1~2h，然后超净工作台上用无菌水冲洗干净，再用70%酒精消毒20-40s，0.1%升汞溶液进行灭菌6-8min，然后用无菌水冲洗多次，用无菌滤纸吸干外植体上的水分备用；
2）外植体无菌苗的培养：在超净工作台上将步骤1）中准备的外植体接种到无菌苗培养基中进行培养；培养条件：培养温度为25±2℃，光照光强为1500Lx，光照时间14h/d；
3) 待步骤2）中的无菌苗长到3.0 ~5.0 cm 高且有成熟叶片时，将叶片切成0.5×0.5cm大小接种到不定芽诱导培养基上进行诱导培养（图1）；培养条件：培养温度为25±2℃，光照光强为1500Lx，光照时间14h/d；
4）待步骤3）中诱导出大量不定芽后（图2），将不定芽进行切割后接种到继代增殖培养基进行培养；培养条件：培养温度为25±2℃，光照光强为1500Lx，光照时间14h/d；
5) 待步骤4）中丛生芽长成的小苗生长到2. 0 ~ 3.0cm 高时（图3），对小苗进行切割后接种到生根培养基中；培养条件：培养温度为25±2℃，光照光强为1500Lx，光照时间14h/d；
6) 待步骤5）中的小苗长到高3 ~ 5cm 且具有至少3 条长于2cm 的根时（图4），得到可出瓶种植的种苗。
（三）组培苗的炼苗与移栽
将步骤6）所述的种苗带瓶一起移至温室大棚，先去盖放置2-5天，出瓶并洗净根部培养基，移栽入泥炭∶蛭石∶珍珠岩按体积2∶1∶1的混合基质中，管理至成品苗，出圃。
实施例2
本例中，步骤（一）培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为：
无菌苗培养基为：WPM +白糖25g/L+琼脂5g/L，pH5.6～5.8；
不定芽诱导培养基：WPM + 6-BA 2.0 mg /L+ IBA 0.2mg/L；
继代增殖培养基为：WPM+ 6-BA2.0 mg/L + IBA 0.2 mg/L+白糖30g/L+琼脂5g/L，pH5.6～5.8。
生根培养基为：1/2WPM + NAA1.0 mg/L +白糖30g/L+琼脂5g/L，pH5.6～5.8；
其余步骤、工艺同实施例1。
实施例3
本例中，步骤（一）培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为：
无菌苗培养基为：WPM +白糖30g/L+琼脂5g/L，pH5.6～5.8；
不定芽诱导培养基：WPM + 6-BA 3.0 mg /L+ IBA 0.3mg/L；
继代增殖培养基为：WPM+ 6-BA3.0 mg/L + IBA0.3 mg/L+白糖30g/L+琼脂5g/L，pH5.6～5.8。
生根培养基为：1/2WPM + NAA1.5 mg/L +白糖30g/L+琼脂5g/L，pH5.6～5.8；
其余步骤、工艺同实施例1。

Claims (2)

1.一种中华野海棠的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤:
（一）培养基的配制
1）无菌苗培养基：WPM；
2）不定芽诱导培养基：WPM + 6-BA 1.0~3.0 mg /L+ IBA 0.1~0.3mg/L；
3）继代增殖培养基：WPM + 6-BA 1.0~3.0 mg /L+ IBA 0.1~0.3mg/L；
4）生根培养基：1/2WPM+ NAA0.5~1.5mg/L；
在上述WPM以及1/2WPM中，添加白糖15～30g/L，琼脂5～8 g/L，调节pH5.6～5.8；
(二) 中华野海棠组培苗的培养
1）外植体的选择：选择生长健壮的中华野海棠幼嫩顶芽或带芽点的茎段作为组织培养的外植体，流水冲洗1~2h，然后超净工作台上用无菌水冲洗干净，再用70%酒精消毒20-40s，0.1%升汞溶液进行灭菌6-8min，最后用无菌水冲洗多次，用无菌滤纸吸干外植体上的水分备用；
2）外植体无菌苗的培养：在超净工作台上将步骤1）中准备的外植体接种到无菌苗培养基中进行培养；培养条件：培养温度为25±2℃，光照光强为1500Lx，光照时间14h/d；
3) 待步骤2）中的无菌苗长到3.0 ~5.0 cm 高且有成熟叶片时，将叶片切成0.5×0.5cm大小接种到不定芽诱导培养基上进行诱导培养；培养条件：培养温度为25±2℃，光照光强为1500Lx，光照时间14h/d；
4）待步骤3）中诱导出大量不定芽后，将不定芽进行切割后接种到继代增殖培养基进行培养；培养条件：培养温度为25±2℃，光照光强为1500Lx，光照时间14h/d；
5) 待步骤4）中丛生芽长成的小苗生长到2. 0 ~ 3.0cm 高时，对小苗进行切割后接种到生根培养基中；培养条件：培养温度为25±2℃，光照光强为1500Lx，光照时间14h/d；
6) 待步骤5）中的小苗长到高3 ~ 5cm 且具有至少3 条长于2cm 的根时，得到出瓶种植的种苗。
2.根据权利要求1所述的一种中华野海棠的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，
（三）组培苗的炼苗与移栽
将步骤6）所述的种苗带瓶一起移至温室大棚，先去盖放置2-5天，出瓶并洗净根部培养基，移栽入泥炭∶蛭石∶珍珠岩按体积2∶1∶1的混合基质中，管理至成品苗，出圃。
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