CN101001958B - 改良的大豆转化 - Google Patents

Abstract

本发明涉及改良的方法，其包括使用初生叶节或更高叶节的分生组织细胞作为靶组织，通过农杆菌(Agrobacterium)介导的转化将DNA掺入大豆(Glycine max)植物的基因组，继之由转化的细胞再生成为完整植物。

Description

改良的大豆转化

发明领域

本发明涉及改良的方法，其包括使用初生叶节或更高叶节的分生细胞作为靶组织，通过农杆菌(Agrobacterium)介导的转化将DNA掺入大豆(Glycine max)植物基因组，继之由转化的细胞再生成为完整植物。

发明背景

大豆属于蝶形花科(Fabaceae)(Leguminosae豆科)。该科植物可通过其具有结在荚果(豆荚)中的种子而被鉴别。大豆被认为源自中国。野生型大豆是藤蔓植物，这可能是大豆最初被作为干草作物引入美国的主要原因。从中国、满洲里、韩国和日本的引进曾经对美国的品种开发有重要意义。用来提高农学性状，如更直立的生长、减少倒伏和增加种子大小的现代育种成就是大豆发展成为世界范围重要作物的主要原因。该谷类作物的收获面积和比例已经稳定增加而且如今大豆是全世界主要的农产品。

栽培的大豆在全世界具有重要的商业价值。全世界超过5千万公顷土地被用于生产超过100公吨具有超过200亿美元预计价值的一年生大豆作物。因此，发展提高这种作物的质量和产量的科学方法具有显著的商业重要性。

大豆被广泛用作蛋白质、油、调味品和化学原料的来源。已经通过传统植物育种为改良栽培大豆种类的品质做出了显著的成就，并且许多重要的成功已有记录。然而，传统植物育种方法局限于从一种大豆品种到另一品种的基因和性状的转移。

现代生物技术的研究和发展为通过植物基因工程改良农产品提供了有用的技术。植物基因工程包括将期望基因转移进作物植物可遗传的种系中，从而这些基因可以在现代农业中使用的优良品种中或在品种之间繁殖。基因转移技术使能够开发出具有改良的疾病抗性、除草剂耐性和增加的营养价值的新型优良作物品种。多种方法已被发展用于将基因转移入植物组织，其包括高速显微注射、显微注射、电穿孔、直接的DNA摄取和农杆菌介导的基因转化。

农杆菌介导的基因转化是在植物中最广泛使用的基因转移技术。该技术利用地下细菌根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的致病性。根癌农杆菌天然地具有转移其部分DNA(被称为T-DNA)进入植物细胞基因组以诱导这些细胞产生对细菌营养有用的代谢物的能力。农杆菌介导的转化通过用外源系列基因代替农杆菌的T-DNA这一概念，从而使该细菌成为能够将外源基因转移进入植物细胞基因组的载体。通常，被转移进入植物细胞的外源基因构建体包括具体的目的基因，预期其与赋予植物细胞对化学选择化合物抗性的选择性标记一起被设计导入植物种系。通常，农杆菌介导的基因转移是转移进组织培养物未分化的细胞(被称为愈伤组织细胞)之中，或转移进随后被诱导成为未分化的愈伤组织培养物的来自叶或茎的分化的植物细胞之中。

开发将外源基因导入大豆物种的方法极大增加了可赋予大豆的性状范围。为了获得将有用的基因导入大豆的体系必须克服一些障碍。这些障碍包括对靶组织再生为整个植物的优化、大豆细胞和农杆菌细胞共培养条件(如，时间、细菌浓度和培养基)的限定以及合适选择方法的建立。

然而，使用微粒轰击、电穿孔或农杆菌介导进入大豆的DNA传递已被证明是困难的。这部分地是由于在大豆中已发现少量细胞是全能的(Trick等人(1997)Plant Tissue Cult Biotechnol 3：9-26)。使用根癌农杆菌传递DNA的方法具有需要克服在大豆外植体和农杆菌之间任何不相容性的额外问题。两种传统使用的方法是靶向子叶节腋生分生组织的基于农杆菌的方法(Hinchee等人(1988)Bio/Technology 6：915-922)和使用成熟合子胚的微粒轰击的方法(Finer和McMullen(1991)In Vitro Cell Dev Biol27P：175-182)。

基于体细胞胚胎发生的方法已被描述：通过将外植体置于高水平的2，4-D(40mg/L)从未成熟大豆子叶诱导胚，继之在诱导培养基(Finer(1988)Plant Cell Rep 7：238-241)或液体悬浮培养基(Finer和Nagasawa(1988)Plant Cell Tissue Organ Cult 15：125-136)中增殖该胚胎发生组织。

更多的描述是基于农杆菌介导的合子未成熟子叶转化方法的描述(Parrott等人(1989)Plant Cell Rep 7：615-617；Yan等人(2000)Plant CellRep 19：1090-1097；Ko等人(2003)Theor Appl Genet 107：439-447)。然而，在Parrott等人的研究中，产生的三株植物是嵌合的，来自多细胞来源，且不能传递转基因到下一代。Yan等人(2000)Plant Cell Rep 19：1090-1097报道了0.03％的低转化频率。植物产生的转基因传递进入下一代，推测是由于为产生二级胚而对转化的初级胚的连续选择由此产生非嵌合植物。近来Ko等人(2003)Theor Appl Genet 107：439-447已报道转基因植物1.7％转化频率的恢复，然而，该方法依赖于使用带功能性TR-DNA序列的部分去臂(致癌)农杆菌菌株pKYRT，以刺激胚胎发生(Ko等人(2004)Planta218：536-541)。这些方法使用未成熟的子叶作为靶组织，继之在固体培养基增殖和选择。

用于大豆转化的其它方法是基于增殖的胚胎发生培养物的微粒轰击转化。已通过微粒轰击产生可育的转基因大豆植物(Finer和McMullen(1991)In Vitro Cell Dev Biol 27P：175-182；Sato等人(1993)Plant Cell Rep12：408-413；Parrott等人(1994)In Vitro Cell Dev Biol 30P：144-149；Hadi等人(1996)Plant Cell Rep 15：500-505；Stewart等人(1995)Plant Physiol112：121-129；Maughan等人(1999)In Vitro Cell Dev Biol-Plant35：334-349)。在这些方法中，从液体和固体培养基增殖的胚胎发生培养物被用于微粒轰击，并仍在固体或液体培养基中立即进行选择。

基于胚胎发生培养物的上述方法具有一个或多个下列缺点：

1.需要持续的提供温室生长的植物为建立胚发生培养物和诱导胚胎发生提供未成熟的子叶。

2.在微粒轰击前至少90天在固体或液体培养基中进行体细胞胚的诱导用于微粒轰击。在轰击后，胚被转移到选择性培养基长达4周，或直至胚伸长。活的胚胎发生丛被转移至成熟培养基至少4周。随后成熟胚被脱水2到7天后置于萌发培养基3到4周。在胚发育出芽和根之后，在转移到温室前将其置于Magenta盒中2到3周。这一过程约花费9个月到一年时间。

3.对于农杆菌感染，使用未成熟子叶作为靶材料因而缩短3个月时间。然而，为了产生非嵌合植物，需要在成熟胚脱水前从转基因初级胚产生二级胚以诱导小植株的萌发。

4.与体细胞胚发生和微粒轰击相关的灭菌是个难题(Samoylov等人(1998)Plant Cell Rep 18：49-54)。这主要是由于培养时间的长度(见上)。

5.体细胞胚的诱导和增殖的胚胎发生培养物的形成是高度依赖基因型的(Bailey等人(1993)In Vitro Cell Dev Biol 29P：102-108；Bailey等人(1993)Crop Sci 34：514-519；Simmonds和Donaldson(2000)PlantCell Rep 19：485-490)。

大豆转化的其它方法是使用胚轴作为靶组织。未成熟胚轴的微粒轰击转化的方法(McCabe等人(1988)Bio/Technology 6：923-926；Aragao等人(2000)Theor Appl Genet 101：1-6)被公开。成熟无菌种子的胚被切开并且通过移去初生叶暴露出顶端分生组织。在顶端分生组织的微粒轰击之后，外植体被移至芽诱导培养基过夜，并在开始出现芽伸长之前被转移到恢复加选择培养基中2周。3到4周之后，另外的芽再生。总共5到7条芽再生，并且在Aragao等人(2000)研究中，仅其中10％的芽伸长。转化效率从0.1到20.1％。该研究组使用ahas(乙酰羟酸合成酶)选择转基因细胞，而来自McCabe等人(1988)Bio/Technology 6：923-926的方法没有应用选择。农杆菌介导的未成熟胚轴的转化还被描述于US 20030046733和US6,384,301，其具有1到3％的转化效率。方法与上述类似，但使用农杆菌代替微粒轰击并且包括共培养步骤。同样，要求用激素预处理种子。

其它方法，如通过微粒轰击(US 5,322,783)涉及子叶节的转化。从吸涨的种子切下分生组织，用细胞分裂素预处理1天并在蔗糖培养基中预培养另一天后以子叶节作为靶标。在该专利中没有提出转化的植物。推测此方法将难以获得用于微粒轰击的细胞。使用根癌农杆菌感染子叶节产生的转化的植物已有报道(Hinchee等人(1988)Bio/Technology 6：915-922；Zhang等人(1999)Plant Cell Tissue Organ Cult 56：37-46；Olhoft和Somers(2001)Plant Cell Rep 20：706-711；Olhoft等人(2003)Planta216：723-735)。外植体从5天龄的幼苗制备，并接触根癌农杆菌。共培养后，在选择(压力)下诱导芽4周。转化的芽的伸长早在伸长培养基中4到6周开始，并持续6个月。转化的芽在转移到温室前于生根培养基中生根5到7天。

尽管一些与大豆转化有关的难题已通过本领域所述方法克服，由于所有目前已知的方法仅具有低到中等的转化效率和(尤其是)再生效率，仍明显需要对大豆转化方法进行改良。尽管在农杆菌介导的转化方法领域已有显著的进步，一直需要改进方法以促使大豆植物的转化更简单、迅速和有效的进行。因此，本发明的目标是提供在转基因大豆植物的再生过程中具有更高总效率的改良的方法。这一目标通过本发明而得到解决。

发明概述

本发明使用包括根癌农杆菌的农杆菌将T-DNA传递进入主要位于第一叶节和位于全部其它更高叶节的分生细胞，并使其再生成为成熟的转基因植物。这些靶组织是在幼苗期用农杆菌直接感染的。

因此，本发明的第一个实施方案涉及用于产生转基因大豆植物的方法，所述方法包括下列步骤：

(a)提供大豆幼苗初生叶节或更高叶节的腋生分生组织，和

(b)将所述腋生分生组织与含转基因T-DNA的农杆菌共培养，所述转基因T-DNA含有至少一个农业有价值性状的表达盒和任选地，一个或多个选择性标记基因，和

(c)转移所述共培养的腋生分生组织至芽诱导培养基，所述培养基包括

(i)至少一种植物生长因子，其浓度适于从所述腋生分生组织从头地引起芽诱导，和

(ii)任选地一种或多种选择化合物，其与(b)的选择性标记基因组合使得能够鉴别和/或选择含有所述选择性标记基因的植物细胞、组织或植物，和/或

(iii)任选地一种或多种适于抑制农杆菌生长的抗生素，并且培养所述共培养的腋生分生组织直至从中诱导并发育出芽，并分离所述芽，和

(d)将所述分离的芽转移至生根培养基，并在所述生根培养基中培养所述芽直至所述芽已形成根，并进一步使这样衍生的小植株再生成为成熟植物，该植物包括插入其基因组的T-DNA，该T-DNA含有所述至少一个农业有价值性状的植物表达盒和任选地，所述至少一个选择性标记基因。

优选地，本发明的方法包括一个或多个选自下列的附加步骤：

(a1)在共培养之前、期间或紧接其后创伤外植体，和

(b1)在步骤(b)之后将所述共培养的腋生分生组织转移至含有至少一种适于抑制农杆菌生长的抗生素和任选的至少一种植物生长因子的培养基中，其中所述培养基优选地缺少与(b)的选择性标记基因组合使得能够鉴别和/或选择含有所述选择性标记基因的植物细胞、器官或植物的选择化合物，和，

(b2)在步骤(b)和任选的(b1)之后在含至少一种植物生长因子的芽诱导培养基(SIM)中进一步孵育所述腋生分生组织，其中所述芽诱导培养基优选地缺少与(b)的选择性标记基因组合使得能够鉴别和/或选择含有所述选择性标记基因的植物细胞、器官或植物的选择化合物，和

(c1)在步骤(c)之后将所述芽转移至芽伸长培养基，其含有

(i)浓度适于使芽伸长的至少一种植物生长因子，和

(ii)任选地一种或多种选择化合物，其与(b)的选择性标记基因组合使得能够鉴别和/或选择含有所述选择性标记基因的植物细胞、器官或植物，

和在所述芽伸长培养基中培养所述芽直至所述芽已伸长到至少约2cm的长度。

可以以多种形式提供初生叶节或更高叶节的腋生分生组织：

a)方法A：幼苗腋生分生组织：可以用农杆菌接种完整的幼苗或它的基本部分(如没有根的幼苗或没有一个或两个子叶的幼苗)，并将其置于芽诱导培养基(SIM)中。优选地基本完整的幼苗选自以下材料

i)完整的幼苗，和

ii)被除去根的幼苗，和

iii)被除去一个子叶或两个子叶的幼苗，和

iv)被除去根和一个子叶或两个子叶的幼苗，和

v)被除去根、两个子叶和部分的上胚轴留下连接于部分上胚轴的腋生分生组织的幼苗。

b)方法B：叶腋生分生组织：以使腋生分生组织保持连接于叶的叶柄上的方式切下初生叶或更高叶，将其浸于农杆菌溶液，在共培养培养基中共培养，并置于芽诱导培养基(SIM)中。

c)方法C：增殖的腋生分生组织：从每个萌发的(优选约)7天龄幼苗移去下胚轴和两个子叶中一个半的或部分的子叶。幼苗随之被置于增殖培养基2到4周。一个芽源自主顶芽的生长，而偶尔地，在子叶节的每个腋芽各长出一个芽。每个芽长至约7cm长，并含有3到6个缩短的节间，以从其获得外植体(图3A)。可以切下从第一个到第四个叶节的腋节。从每个幼苗可以获得平均三到四个外植体。除了以上明确提到的来源(方法A、B、C)所指出的，其它来源也可以适合于腋生分生组织。这些来源可以是例如来自大豆幼苗如仅上胚轴和初生叶节的更有限的外植体。明显地，这类受限的(即小的)外植体不仅可以从初级叶节还可以从更高叶节(如第二和更高叶节)获得。

代表腋生分生组织外植体产生来源的大豆幼苗优选地在外植体产生前4到10天被萌发。本发明提供进行大豆种系转化的新的和有效的方法，该方法直接对大豆幼苗初生叶节或更高叶节的腋生分生细胞使用农杆菌介导转化。从转化的腋生分生细胞进行直接的芽诱导产生种系转基因植物。整个过程是快速和有效的。本发明的一个显著方面是大豆种子预处理周期的缩短提高了存活的外植体中的芽产生，并缩短了产生可转移到温室的植物所花费的时间。而且，时间和材料的减少为操作者提供了更经济的体系。本发明的方法不需要本领域公知的高度依赖栽培种(尤其在再生步骤)的愈伤组织培养步骤。结果，因为腋生分生细胞存在于所有大豆栽培种中且几乎都具有相似的再生能力，本发明的方法可用于任何大豆栽培种。

可以使用多种农杆菌菌株。根癌农杆菌和发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)菌株都可以被使用。在优选的实施方案，利用“去臂”的菌株(即，其根瘤或毛根表型诱导基因已被缺失)。特别优选的发根农杆菌菌株是去臂的发根农杆菌菌株K599或其衍生物。这类菌株在于2004年9月2日递交的美国临时申请No.60/606789中被描述，此处被完整的并入作为参考。

在本发明优选的实施方案中，腋生分生组织在用农杆菌接种前创伤。

在另一优选的实施方案，步骤(b)、(b1)、(b2)和/或(c)的至少一个步骤的培养基包含细胞分裂素(象例如6-苄基氨基嘌呤(BAP))。优选地，浓度约1μM和约10μM之间的6-苄基氨基嘌呤(BAP)。

尤其更加优选地，步骤(b)、(b1)、(b2)、(c)和/或(c1)的至少一个步骤的培养基，优选至少步骤(b)和/或(c1)的培养基包含约0.1μM和约2μM之间的赤霉酸(GA3)。

在另一优选的实施方案，步骤(b)、(b1)、(b2)和(c)的至少一个步骤的培养基，优选至少步骤(b)的培养基包含至少一种硫醇类化合物，优选地选自硫代硫酸钠、二硫苏糖醇(DTT)和半胱氨酸。优选浓度约1mM和10mM之间的L-半胱氨酸、0.1mM到5mM之间的DTT和/或0.1mM到5mM之间的硫代硫酸钠。

在本发明的另一优选的实施方案，步骤(c1)和/或(d)的至少一个步骤的培养基包含约0.01mg/l和约1μM mg/l之间的吲哚乙酸(IAA)和/或约0.1μM和约4μM之间的赤霉酸(GA3)和/或约0.5μM和约6μM之间的玉米素核糖核苷酸。

本发明的其它目的、优势和特点将通过下列说明而变得显而易见。

通用定义

缩略语：BAP-6-苄基氨基嘌呤；2，4-D-2，4-二氯苯氧乙酸；MS-Murashige和Skoog培养基(Murashige T和Skoog F(1962)Physiol.Plant.15，472-497)；NAA-1-萘乙酸；MES，2-(N-吗啉代)-乙烷磺酸，IAA，吲哚乙酸；IBA：吲哚丁酸；Kan：卡那霉素硫酸盐；GA3-赤霉酸；Timentin^TM：替卡西林钠盐/克拉维酸钾。

可以理解的是本发明并非限于如这些所述的具体的方法学、方案、细胞系、植物物种或属、构建体和试剂。还可被理解为此处所用术语仅以描述具体实施方案为目的，而非旨在限制本发明的范围，本发明的范围将仅被所附权利要求限制。必须指出的是，除非本文有其它明确的指示，如此处和在所附权利要求所用的单数形式包括复数指代。因此，例如提及“载体”指一种或多种载体，并且包括本领域技术人员所公知的其等同物等。

本文所用术语“约”意指大约地、粗略地、左右、或在区域内。当术语“约”与数字范围连接使用时，其通过所示数值上下边界的延伸修饰该范围。通常，术语“约”在这里被用于通过20％，优选地10％，更优选地5％上下(更高或更低的)改变修饰所述数值的上下的数值。

如这里所用，单词“或”意指具体列举中的任何成员并且还包括该列举成员的任意组合。

术语“核酸”指以单链或双链、正义或反义形式存在的脱氧核糖核酸或核糖核酸及其聚合物或杂合体。除非另有说明，除清楚指明的序列之外，具体的核酸序列还不言自明地包括其保守修饰的变体(如，简并密码子取代)和互补序列。术语“核酸”在这里与“基因”、“cDNA”、“mRNA”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可交换地使用。

如这里所用短语“核酸序列”指连续成列的代表核苷酸的缩写、字母、字符或单词。在一个实施方案中，核酸可以是相对短的，通常长度少于100核苷酸的“探针”。通常核酸探针是从约50核苷酸长到约10核苷酸长。核酸的“靶区”是被鉴定的目的核酸部分。核酸的“编码区”是当被置于合适的调控序列控制之下以序列特异性方式被转录和翻译产生特定多肽或蛋白质的核酸部分。编码区被表述为编码这些多肽或蛋白质。

术语“反义”应理解为意指具有与靶序列，例如信使RNA(mRNA)序列互补的序列的核酸，其表达的阻断被认为是由与靶序列的杂交起始的。

术语“正义”应理解为意指具有与靶序列同源的或相同的序列的核酸，例如结合至蛋白转录因子的序列和参与给定基因表达的序列。根据优选的实施方案，核酸包括目的基因和使所述目的基因表达的元件。

术语“基因”指有效连接于能够以某些方式调控多肽表达的合适调控序列的编码区。基因包括在编码区(开放阅读框，ORF)之前(上游)和之后(下游)的DNA的非翻译的调控区(如，启动子、增强子、阻遏物等)以及，适当情况下，在单个编码区(即外显子)之间的间插序列(即内含子)。

如这里所用的术语“编码区”当被用于结构基因时，指编码作为mRNA分子的翻译结果在新生多肽中发现的氨基酸的核苷酸序列。在真核生物中，该编码区在5′侧以编码起始密码子甲硫氨酸的核苷酸三联体为边界，而在3′侧以指定终止密码子的三个三联体(即TAA、TAG、TGA)之一为边界。除了含有内含子，基因的基因组形式还可以包括存在于RNA转录本之中的位于序列的5′和3′末端两端的序列。这些序列被称为“侧翼”序列或“侧翼”区(这些侧翼序列位于存在于mRNA转录本的非翻译序列的5′或3′侧)。5′侧翼区可以包含控制或影响基因转录的调控序列如启动子和增强子。3′侧翼区可以包含指导转录终止、转录后切割和多聚腺苷化作用的序列。

术语“多肽”、“肽”、“寡肽”、“多肽”、“基因产物”、“表达产物”和“蛋白质”在这里可交换地使用，指连续氨基酸残基的聚合物或寡聚体。

如这里所用术语“分离的”意指从其原始环境移出的物质。例如在活动物中存在的天然产生的多核苷酸或多肽不是分离的，但从天然体系中的一些或全部的共存物质中分出的同样的多核苷酸或多肽是分离的。这样的多核苷酸可以是载体的部分和/或这样的多核苷酸或多肽可以是组合物的部分，并且由于这样的载体或组合物不是它的原始环境的部分而将是分离的。

术语“野生型”、“天然的”或“天然来源”就生物、多肽或核酸序列而言，是指所述生物是天然产生的，或可从至少一种未经改变、突变或其它人工操作过的天然产生的生物中获得的。

本文所用术语“转基因”或“重组”(如关于大豆细胞或植物)指具有掺入的外源基因或DNA序列的细胞和/或植物，其包括但不限于可能通常并不存在的基因或DNA序列、在给定的细胞类型中通常不转录和翻译(“表达”)的基因或被期望导入未转化细胞和/或植物的任何其它的基因或DNA序列，如可能通常存在于未转化细胞和/或植物中但是希望其具有改变的表达的基因。优选地，如这里所用关于核酸的术语“重组”意指核酸被共价连接于和邻近于其在天然环境中不邻近的核酸。“重组”多肽或蛋白质指由重组DNA技术产生的多肽或蛋白质，即从编码期望的多肽或蛋白质的外源重组DNA构建体所转化的细胞产生的。重组的核酸和多肽还可以包括如那些在自然中不存在但被修饰、改变、突变或其它人工操作的分子。

“重组多肽”是在序列上与天然发生的多肽至少有一个氨基酸残基不同的非天然发生的多肽。产生所述重组多肽和/或核酸的优选的方法可以包括直接的或非直接的突变发生、DNA改组或回归重组(recursiverecombination)的其它方法。

术语“异源核酸序列”或“异源DNA”可交换地指连接于自然中未连接的核酸的核苷酸序列。异源DNA对其导入的细胞是非内源的，而是已从其它细胞获得的。通常，尽管非必须，这类异源DNA在其被表达的细胞中编码该细胞一般不产生的RNA和蛋白质。

如这里所用“转化效率”或“转化频率”可以通过在标准实验条件下(即标准化或正常化的与外源DNA接触的细胞数、传递的DNA量、DNA传递的类型和条件、一般的培养条件等)恢复的转化细胞数(或从单个转化的细胞生长的转基因生物)测量。例如，当使用分离的叶柄作为转化的起始材料时，转化频率可以表达为每个接种的叶柄获得的转基因芽(或产生的植物系)的数目。

术语“细胞”指单个细胞。术语复数形式的“细胞”指细胞群。所述细胞群可以是包括一种细胞类型的纯的群体。同样地，所述细胞群可以包括超过一种细胞类型。在本发明中，细胞群可以包括的细胞类型的数目没有限制。细胞可以是同步化的或非同步化的，优选细胞是同步化的。

术语“染色体DNA”或“染色体DNA序列”可以理解为不依赖于细胞周期状态的细胞核基因组DNA。染色体DNA可以因此是在染色体或染色单体中组装的，其可以是压缩的或伸展的。可以通过多种本领域已知的方法，如PCR分析、Southern印迹分析、荧光原位杂交(FISH)和原位PCR证明和分析染色体DNA的插入。

如这里所用术语“结构基因”意指被转录成为mRNA随后被翻译成为特定多肽所特有的氨基酸序列的DNA序列。

术语“表达”指基因产物的生物合成。例如，在结构基因的情况中，表达涉及结构基因转录成为mRNA和，优选地，随后mRNA翻译成为一条或多条多肽。

如这里所用术语“表达盒”或“表达构建体”意指将被表达的任意核酸序列的组合，所述序列被有效连接于启动子序列和任选的另外的有利于所述核酸序列表达的元件(如，终止子和/或多聚腺苷化作用序列)。

如这里所用的术语“启动子”意指指导DNA序列(如结构基因)转录的DNA序列。通常，启动子位于基因的5′区，邻近结构基因的转录起始位点。如果启动子是诱导型启动子，则转录率响应诱导剂而增加。相反，如果启动子是组成型启动子，转录率不受诱导剂调控。此外，启动子可以以组织特异性的或组织优选的方式调控，使其仅在特定组织类型，如叶、根或分生组织中具有转录与其连接的编码区的活性。

术语“有效连接”或“有效地连接”被理解为这样的含义，例如将调控元件(如启动子)与要表达的核酸序列以及(如果合适的)更多的调控元件(例如终止子)以一定方式顺序安排，使每个调控元件可以完成其预期的功能，从而能够改变、促进或以其它方式影响所述核酸序列的表达。该表达可以依赖于与正义或反义RNA有关的核酸序列的排列而产生结果。为此目的，不需要化学意义上的直接的连接。基因控制序列如，例如增强子序列还可以从更远的位置，或实际上从其它DNA分子上行使其对靶序列的功能。优选的排列是将待重组表达的核酸序列置于作为启动子起作用的序列之后，因而两个序列彼此共价地连接。在启动子序列和被重组表达的核酸序列之间的距离优选地是少于200碱基对，尤其优选地少于100碱基对，更加尤其优选地少于50碱基对。可以如所述通过常规的重组和克隆技术产生有效的连接和表达盒(如在Ausubel FM等人(1987)Current Protocolsin Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.和Wiley Interscience；Maniatis T，Fritsch EF和Sambrook J(1989)Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor(NY)；Gelvin等人(编辑)(1990)Plant Molecular BiologyManual；Kluwer Academic Publisher，Dordrecht，The Netherlands；Silhavy TJ，Berman ML和Enquist LW(1984)Experiments with GeneFusions，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor(NY))。然而，更多的序列，例如作为具有限制性酶的特异性切割位点的连接序列或作为信号肽的序列也可以被置于两个序列之间。序列的插入还可以导致融合蛋白质的表达。优选地，包括启动子与要表达的核酸序列的连接的表达盒可以以载体整合的形式存在和，例如通过转化被插入植物基因组。

术语“转化”包括进入植物细胞的遗传物质的导入，优选地产生染色体的整合和通过减数分裂的稳定的遗传。转化还可以包括以植物病毒载体的形式将遗传物质导入植物细胞，该植物病毒载体涉及可能呈现关于减数分离稳定性的多种特性的染色体外复制和基因表达。

术语“分生组织”或“分生组织细胞”或“分生组织”可以被可交换的使用和意指持续分裂形成如在茎或根顶端找到的那些新细胞的未分化的植物组织。

术语“节”或“叶节”意指叶连接或曾经连接在该处的茎上的点。术语“节间”意指在茎上两个节之间的片段或部分。

术语“叶柄”意指通过其使叶片连接于茎的柄，也被称之为叶-柄。

术语“腋芽”意指有时被保护性的鳞片包围并含有未发育的芽、叶或花的沿着茎或枝条的小突起；也被称为侧芽。

术语“下胚轴”意指在种子叶(子叶)和根之间的茎的部分。

术语“叶腋”意指在叶和茎之间产生的角。腋芽发生在叶腋。

术语“子叶”指在萌发时或者保留于种子中，或者出现、长大并变绿的种子植物胚的叶；也被称为种子叶。大豆种子包括两个为子叶或种子叶的种子瓣。两个子叶含有食物和营养储存，为幼苗供给营养直至幼苗建成。在发育的荚果中子叶颜色是绿色，但在现存的谷物品种中，其在植物成熟时变成黄色。胚轴是位于子叶之间且在最接近珠孔的末端与子叶连接。

当种子被暴露于包括合适的温度、水和氧气的有利环境时，萌发过程被起始。在种子萌发过程中，胚根通常是第一个突破种皮的器官。其发育成为大豆植物的初级根。在胚根从种皮出现之后，它主要向下生长并发育成主根。侧枝根从主根发育。一旦大豆种子开始萌发过程，下胚轴[在胚根(年轻的初级根)和子叶之间的茎的部分]伸长并将膨胀的子叶推向土壤表面。种皮通常在子叶从土壤中出现时脱落。一旦子叶出现后，下胚轴停止伸长且弯曲处(下胚轴拱)伸直。子叶随即分开，暴露开始生长的上胚轴。上胚轴最初包括两个具一小叶的叶(仅具有一个小叶的叶)和位于它们之间的生长点。大豆植物的地上生长从上胚轴起始。

从上胚轴发育的茎是植物主要的支持和转移结构。主茎的节迅速形成，形成全部节仅需4到5周。节可以通过存在来自主茎的叶或枝条被鉴别。尽管节间的长度(节间部分)是遗传控制的，其也可以经由光照、水、营养和其它环境因素被改变。当主茎尖不能继续抑制芽发育时，枝条从腋芽产生。

除了子叶和主茎的第二节，大豆植物在每个交错的连接于茎的每侧的每个节上具有单个的三小叶的叶(具有3个小叶的叶)。两个具有一个小叶的叶(包括叶柄和单独的小叶)在第二节彼此相对的连接。第一个具有三小叶的叶是在第三节。叶柄连接叶到主茎或枝条。一对柳叶形的修饰叶(托叶)是位于叶柄-茎连接处的叶柄基部。在叶柄基部和每个小叶基部是大量的被称为叶枕的细胞。叶枕相对膨胀度(水含量)的改变使小叶和叶柄呈现不同的角度。

在每个腋(茎和枝条或叶的连接)处存在腋芽。由环境决定，该芽可以发育成枝条、花序或不能发育。

发明详述

本发明是用于大豆品种的直接的种系基因转化的方法。该方法是基于由农杆菌介导将基因传递进入在萌发大豆初级节或更高节腋生分生组织的单个大豆细胞。转化的细胞继之被诱导形成作为高频率的种系大豆转化体的芽，该转化体能够被培养成为完整的性成熟且可育的转基因大豆植物。该方法不涉及愈伤组织培养阶段，因此从种子到转基因种子的整个过程的时间被显著缩短。

因此，本发明的第一个实施方案涉及产生转基因大豆植物的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供大豆幼苗初生叶节或更高叶节的腋生分生组织，和

(b)将所述腋生分生组织与含转基因T-DNA的农杆菌共培养，所述转基因T-DNA包含至少一种表达农业有价值性状的植物表达盒和任选的一个或多个选择性标记基因，和

(c)转移所述共培养的腋生分生组织于芽诱导培养基，该培养基包括

(i)浓度适于从所述腋生分生组织引起从头的芽诱导的至少一种植物生长因子，和

(ii)任选地一种或多种选择性化合物，其与(b)的选择性标记基因组合使得能够鉴别和/或选择含有所述选择性基因的植物细胞、组织或植物，和/或

(iii)任选地一种或多种适用于抑制农杆菌生长的抗生素，并且培养所述共培养的腋生分生组织直至从其诱导和发育出芽，并分离所述芽，和

(d)将所述分离的芽转移至生根培养基，并在所述生根培养基中培养所述芽直至所述芽已形成根，并进一步使这样衍生的小植株再生成为包括插入其基因组的T-DNA的成熟植物，所述T-DNA含有所述至少一个农业有价值性状的表达盒和任选的，所述的至少一个选择性标记基因。

这里描述的方法是基于农杆菌介导的基因传递进入在初生叶节或更高叶节的腋生分生组织中的生长细胞。这里所述的方法不使用愈伤组织或增殖期。相反地，农杆菌介导基因传递是进入在大豆幼苗初生叶节或更高叶节的腋生分生组织的细胞。可以用农杆菌接种被包含在完整幼苗中或连接于外植体(如切下的叶柄或叶)的腋生分生组织。随后，在诱导直接的芽形成的激素存在下培养该腋生分生组织区。优选地，在选择性标记(如，除草剂膦丝菌素或者D-氨基酸例如D-丙氨酸或D-丝氨酸)存在下培养分生组织。这一步骤的结果是从包括转化的分生组织细胞的小细胞簇诱导大豆芽的形成。相对于其它农杆菌介导的转化方法，这一方法所需的时间极大减少。在此操作开始后4到6周可以收集可存活的表型阳性的大豆芽。整个T₀(初级转化体)植物生命周期不比温室中大豆植物生长至成熟所需的最短时间长多少。

本发明的方法提供了相对于现有技术所述方法的一项或多项优势：

1)对于腋生分生组织方法，幼苗的萌发需要约4到10天，优选地约7天。使用本发明的方法比胚胎发生培养简化了建立培养物的努力。

2)该方法是省时的：基于腋生分生组织方法的本发明的方法在农杆菌感染后约2周之内产生从头产生的芽并且在农杆菌感染约3周内可检测到转基因的芽原基。腋生分生组织转化的过程是在农杆菌感染后于芽诱导培养基3到4周，于芽伸长培养基2-4周并于生根培养基7天。

3)相对于微粒轰击，使用农杆菌介导的方法产生的植物具有较少的多个或片段拷贝的导入DNA被整合进入基因组的问题(Hadi等人(1996)Plant Cell Rep 15：500-505；Trick等人(1997)Plant TissueCult Biotechnol 3：9-26)。

4)本发明的方法高度不依赖于基因型和栽培种。腋生分生组织发育更可能是跨基因型的。在这一过程中的大豆组织操作与以前的微粒介导的转化方法的操作类似，已证明该转化方法适用于全部所测试的优良的大豆品种。这一方法同样适用于直接基因转化进入优良大豆栽培种，因而有力地避免了在品种之间进行大量杂交育种的需要。

5)基于胚轴转化的方法每个外植体提供仅3到7个之间的芽。基于腋生分生组织转化的本发明的方法在时间上与植物生产相似。优势是大量芽原基(100到1000的)的增殖，其可产生多个转基因芽(增加从培养物移到温室的机会)和增加转基因细胞被选择用于芽伸长的机会。

6)由于与子叶节相比在芽诱导培养基形成的更小的愈伤组织/芽叶枕的组织块，基于腋生分生组织转化的本发明的方法更适于选择。与更坚硬组织的子叶相比，负责摄取选择化合物的下胚轴和/或上胚轴似乎能提供更高的摄取特性。

7)由于叶外植体和增殖的外植体的小组织尺寸，本发明的方法不需要很多的培养基、材料和空间用于培养过程。对于子叶节，在一个平板仅可以培养5个外植体，然而对于增殖的外植体和叶的外植体，在单个平板上可以培养高达20个。

8)基于增殖的腋生分生组织的方法就变化性而言有额外的优势，可以从来自3到4周龄的增殖的小植株的材料获得大量的靶材料(即，多个外植体)。一个芽来自主顶芽的生长和，偶尔地在子叶节的每个腋芽各长出一个芽。每个芽生长约7cm长并含有3到6个从其获得外植体的缩短的节间。小的外植体适于农杆菌转染、选择和再生，而且已经令人惊奇地证明增殖的腋生分生组织是高度可再生的并且产生植物不经过中间的愈伤组织期。小的外植体和芽的旺盛生长应该有利于作为当前转化方法中的难点的转化细胞的选择。

用于转化过程的起始材料是大豆种子。种子首先被灭菌、任选地被浸泡软化。种子在水中吸涨约3分钟，并继之使其软化长达2小时。种子随后被置于萌发培养基并萌发约4到10天，优选地约5到8天，和最优选地约7天。此时用于增殖的腋生分生组织和叶腋生分生组织方法的上胚轴优选地约为0.5cm，并且用于幼苗腋生分生组织方法的通常0.5到2cm。优选地，萌发在高光条件(＞100μM m^-2s^-1)于25℃进行。

用于农杆菌介导的转化的靶组织是包含在初生叶节或更高叶节的腋生分生组织。初生叶节是当按照从根到叶方向移动时紧接子叶节(即茎上连接子叶或曾经连接子叶的点)之后的节(即茎上连接叶或曾经连接叶的点)。更高叶节是在初生叶节之后的全部叶节，如，例如第二、第三、第四等叶节。优选的是初生叶节的腋生分生组织。

可以以多种形式提供和使用初生或更高节的腋生分生组织用于随后的农杆菌共培养步骤：

a)方法A：幼苗腋生分生组织：可以使用完整的幼苗或它的基本部分(如没有根的幼苗或没有一个或两个子叶的幼苗)，用农杆菌接种并置于芽诱导培养基(SIM)中。优选地基本上整个幼苗选自下列材料

i)完整的幼苗，和

ii)移去根的幼苗，和

iii)移去一个子叶或两个子叶的幼苗，和

iv)移去根和一个子叶或两个子叶的幼苗，和

v)移去根、两个子叶和部分上胚轴而留下连接于部分上胚轴的腋生分生组织的幼苗。

b)方法B：叶腋生分生组织：以使腋生分生组织保持连接于叶的叶柄上的方式切下初生叶或更高叶，将其蘸于农杆菌溶液(用农杆菌接种)，在共培养培养基中共培养，并置于芽诱导培养基(SIM)中。外植体的小尺寸和芽旺盛的生长应该有利于作为当前转化方法难点的转化细胞的选择。

c)方法C：增殖的腋生分生组织：从每个萌发的(优选地约)7天龄幼苗移去下胚轴和两个子叶中一个半或部分的子叶。幼苗继之被置于增殖培养基2到4周。幼苗产生数个分支的芽以从其获得外植体(图3A)。可以切割从第一个到第四个叶节的腋节。从每个幼苗可以获得平均三到四个外植体。

除了以上明确提到的来源(方法A、B、C)所指出的，其它来源可以适用于腋生分生组织。这些来源可以是例如来自大豆幼苗如仅上胚轴和初生叶节的更有限的外植体。明显地，这类受限的(即小的)外植体不仅可以从初级节还可以从更高节(如第二和更高节)获得。

优选地，本发明的方法包括一个或多个选自下列的附加步骤：

(a1)在共培养之前、期间或紧接其后创伤外植体，和

(b1)在步骤(b)之后将所述共培养的腋生分生组织转移至含有至少一种适于抑制农杆菌生长的抗生素和，任选地，至少一种植物生长因子的培养基中，其中所述培养基优选地缺少与(b)的选择性标记基因组合使得能够鉴别和/或选择含有所述选择性标记基因的植物细胞、器官或植物的选择化合物，和，

(b2)在步骤(b)和，任选地(b1)之后在含有至少一种植物生长因子的芽诱导培养基(SIM)中进一步孵育所述腋生分生组织，其中所述芽诱导培养基优选地缺少与(b)的选择性标记基因组合使得能够鉴别和/或选择含有所述选择性标记基因的植物细胞、器官或植物的选择化合物，和

(c1)在步骤(c)之后将所述芽转移至芽伸长培养基，其含有

(i)浓度适于使芽伸长的至少一种植物生长因子，和

(ii)任选地一种或多种选择性化合物，其与(b)的选择性标记基因组合使得能够鉴别和/或选择含有所述选择性标记基因的植物细胞、器官或植物，

和在所述芽伸长培养基中培养直至所述芽已伸长到至少约2cm长度。

在本发明优选的实施方案中，创伤腋生分生组织(步骤(a1))。在本发明的方法中创伤似乎具有至少两个增强效果：

(i)创伤有利于农杆菌感染和基因转移效率，

(ii)创伤增加从头的芽诱导效率，推测地是通过打断腋生分生组织连接，显著增加从外植体组织发育的芽数目。

可以在用农杆菌接种(共培养)之前、期间或之后创伤。为了同时获得两个有益效果，优选地在共培养之前或期间，更优选地在共培养之前进行创伤。可以使用许多创伤方法，其包括，例如切割、磨损、刺、戳、用细微粒或加压的液体渗透、原生质创伤、使用高压或超声。可以使用实物如，但不限于，解剖刀、剪子、针、研磨物、喷枪、粒子、电子基因枪或声波进行创伤。增加共培养步骤效率的另一备选是真空过滤(Bechtold等人(1998)Meth.Mol.Biol.82，259-266；Trieu等人(2000)The Plant Journal22(6)，531-541))。

将T-DNA导入大豆意指农杆菌介导的DNA转移。这里所用的术语“农杆菌”意指农杆菌科的全部的种(包括根癌农杆菌和发根农杆菌)。优选地，使用根癌农杆菌或发根农杆菌菌株实现转化。通过农杆菌介导的DNA转移的植物转化原理是本领域公知的(Horsch RB等人(1985)Science 225：1229页)。

农杆菌菌株将包括包含T-DNA的DNA构建体(如质粒)，该T-DNA包含至少一个选择性标记基因和任选地，另外的表达农业有价值性状的植物表达盒。作为农杆菌介导的转移的结果，所述T-DNA通常存在于转化后和再生之后植物组织的全部或基本上全部的细胞中。

根癌农杆菌和发根农杆菌是植物致病的土壤细菌，其遗传地转化植物细胞。根癌农杆菌和发根农杆菌的Ti质粒和Ri质粒分别地载有负责植物基因转化的基因(Kado(1991)Crit Rev Plant Sci 10：1)。载体是基于农杆菌的Ti质粒和Ri质粒，并利用天然的DNA转移体系进入植物基因组。作为高度发展的寄生现象的一部分，农杆菌转移其基因组信息的限定的部分(T-DNA，其侧接被称为左边界和右边界的约25bp重复)进入植物细胞的染色体DNA(Zupan等人(2000)Plant J 23(1)：11-28)。通过所谓的vir基因(部分的原始Ti质粒)的组合作用介导所述DNA转移。为了利用这一天然体系，发展了缺少原始肿瘤诱导基因的Ti质粒(“去臂载体”)。在进一步的改良中，从Ti质粒的其它功能性元件(如vir基因)物理地分离T-DNA，即所谓的“双元载体体系”，通过将其掺入穿梭载体使能够更容易地操作(EP-A 120516；US 4.940.838)。这些双元载体包含(除了带有其边界序列的去臂T-DNA)在农杆菌和大肠杆菌中都能复制的原核复制序列。农杆菌介导的转化的优势在于，通常仅侧翼为边界的DNA被转移进入基因组并且优选地仅一个拷贝被插入。农杆菌载体体系的描述和用于农杆菌介导的基因转移的方法是本领域公知的(Gruber等人(1993)″Vectors for PlantTransformation，″in METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGYAND BIOTECHNOLOGY；89-119页；Miki等人(1993)″Procedures forIntroducing Foreign DNA into Plants″in METHODS IN PLANTMOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY；67-88页；Moloney等人(1989)Plant Cell Reports 8：238)。

因此，对于农杆菌介导的转化，遗传成分(如包括表达盒)被整合入特定的质粒，或进入穿梭载体或中间载体，或进入双元载体。如果使用Ti质粒或Ri质粒转化，Ti质粒或Ri质粒T-DNA的至少右边界，但是在大多数情况右边界和左边界与表达盒连接，该表达盒将以侧翼区形式被导入。优选地使用双元载体。双元载体同时能够在大肠杆菌和农杆菌中复制。它们可以包含选择性标记基因和侧翼为右和左T-DNA边界序列的接头或多聚接头(用于插入如被转移的表达盒)。它们可以被直接转移进入农杆菌(Holsters等人(1978)Mol Gen Genet 163：181-187)。选择性标记基因允许选择转化的农杆菌，并且其是，例如赋予卡那霉素抗性的npt III基因。在此情况下作为宿主生物的农杆菌应该已经包含带有vir区的质粒。后者是转移T-DNA到植物细胞所需要的。以此方式转化的农杆菌可以被用于转化植物细胞。使用T-DNA转化植物细胞已被研究和详细的描述(EP 120516；Hoekema(1985)In：The Binary Plant Vector System，OffsetdrukkerijKanters B.V.，Alblasserdam，第五章；An等人(1985)EMBO J4：277-287)。

普通的双元载体是基于“广泛宿主范围”的质粒，如衍生自P型质粒RK2的pRK252(Bevan等人(1984)Nucl Acid Res 12：8711-8720)或pTJS75(Watson等人(1985)EMBO J 4(2)：277-284)。大部分的这些质粒是pBIN19的衍生物(Bevan等人(1984)Nucl Acid Res 12：8711-8720)。已知多种双元载体，其中的一些是可商购的，如，例如pBI101.2或pBIN19(Clontech Laboratories，Inc.USA)。另外载体的大小和可操作性被改良(如pPZP；Hajdukiewicz等人(1994)Plant Mol Biol 25：989-994)。改良的载体体系也在WO02/00900中被描述。

可以使用多种农杆菌菌株。根癌农杆菌和发根农杆菌菌株都可以被使用。在优选的实施方案，利用“去臂”菌株(即其根瘤或发根表型诱导基因已被缺失)。特别优选的发根农杆菌菌株是去臂的发根农杆菌K599菌株。这类菌株在于2004年9月2日递交的美国临时申请No.60/606789中被描述，此处被完整地并入作为参考。在本发明的方法中使用的优选的农杆菌菌株可以包括但不应限于章鱼碱型菌株，如LBA4404或农杆碱型菌株，如EHA101或EHA105。用于DNA转移的合适的根癌农杆菌菌株是例如EHA101[pEHA101](Hood等人(1986)J Bacteriol 168：1291-1301)、EHA105[pEHA105](Li(1992)Plant Mol Biol 20：1037-1048)、LBA4404[pAL4404](Hoekema等人(1983)Nature 303：179-181)、C58C1[pMP90](Koncz和Schell(1986)Mol Gen Genet 204：383-396)和C58C1[pGV2260](Deblaere等人(1985)Nucl Acids Res 13：4777-4788)。其它合适的菌株是根癌农杆菌C58，为胭脂碱型菌株。其它合适的菌株是根癌农杆菌C58C1(Van Laerebeke等人(1974)Nature 252，169-170)、A136(Watson等人(1975)J.Bacteriol 123，255-264)或LBA4011(Klapwijk等人(1980)J.Bacteriol.，141，128-136)。农杆菌菌株可以含有章鱼碱型Ti质粒，优选去臂的，如pAL4404。通常，当使用章鱼碱型Ti质粒或辅助质粒时，优选virF基因被缺失或灭活(Jarchow等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10426-10430)。另外的合适的菌株是C58C1[pGV2260]和C58C1[pMP90]。菌株C58C1[pGV2260]是“章鱼碱型”菌株而C58C1[pMP90]是“胭脂碱型”菌株。两者的遗传背景都是农杆菌菌株C58。C58也是菌株GV3101的遗传背景。

本发明的方法还可以与特定农杆菌菌株组合使用，以进一步增加转化效率，如由于存在突变或嵌合型的virA或virG基因所致的其中vir基因表达和/或诱导被改变的农杆菌菌株(如Hansen等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：7603-7607；Chen和Winans(1991)J.Bacteriol.173：1139-1144；Scheeren-Groot等人(1994)J.Bacteriol 176：6418-6426)。还可能是根癌农杆菌菌株(如LBA4404；Hiei等人(1994)Plant J 6：271-282)与超强毒质粒(如基于pTOK246的载体；Ishida Y等人(1996)Nature Biotech745-750)的组合，形成所谓的超强毒株。超强毒株的实例是琥珀碱型菌株EHA105。

双元载体或任何其它载体可以通过普通的DNA重组技术被修饰，在大肠杆菌中扩增，并通过如电穿孔或其它转化技术被导入农杆菌(Mozo和Hooykaas(1991)Plant Mol Biol 16：917-918)。

以本领域公知的方式生长和使用农杆菌。包含载体的农杆菌菌株可以，例如在补加了合适的抗生素(如，50mg/l的壮观霉素)的YEP培养基(见实施例2)上生长3天。用环从固体培养基收集细菌并重悬。在本发明优选的实施方案中，农杆菌的培养是由使用冻于-80℃的等份试样开始。优选地，细菌被重悬于共培养培养基(CCM)中用于多种大豆腋生分生组织外植体组织的农杆菌处理。

用于感染和共培养的农杆菌的浓度可能需要变化。因此，一般地，可以使用从OD₆₀₀ 0.1到3.0的农杆菌浓度范围和从几小时到7天的共培养期范围。对于多种腋生分生组织外植体，优选地使用下列浓度的农杆菌悬浮液：

a)方法A(幼苗腋生分生组织)：从约OD₆₀₀＝0.5到约3，优选地从约OD₆₀₀＝1到2。

b)方法B(叶腋生分生组织)：从约OD₆₀₀＝0.1到约1，优选地，从约OD₆₀₀＝0.125到0.5。

c)方法C(增殖的腋生分生组织)：从约OD₆₀₀＝0.2到约1.5，优选地，从约OD₆₀₀＝0.5到0.8。

农杆菌与多种大豆腋生分生组织外植体组织的共培养通常进行约1天到约6天，优选地，对于根癌农杆菌株约3天到约5天，对于发根农杆菌株约2天到约3天。

继之用农杆菌培养物接种外植体几分钟到几小时，通常约10分钟到3小时，优选地，约0.5小时到1小时。倒掉多余的培养基并使农杆菌与腋生分生组织在黑暗中共培养几天，通常是3到5天。在此步骤中，农杆菌转移外源基因构建体进入大豆腋生分生组织中的某些细胞。通常在此步骤中不存在选择化合物。

可以，尽管并非必须，在农杆菌共培养之前或期间在培养基中使用一种或多种酚类化合物。适合于本发明范围之内的“植物酚类化合物”或“植物酚”是那些能够诱导阳性趋化应答的分离的被取代的酚类分子，特别是那些能够在含Ti质粒的某种农杆菌(特别是含Ti质粒的根癌农杆菌)中诱导vir基因表达增加的酚类分子。优选乙酰丁香酮。此外，预期某些化合物，如渗透保护剂(如，L-脯氨酸，优选地浓度约700mg/L，或甜菜碱)、植物激素(尤其是NAA)、冠瘿碱或糖当与植物酚类化合物组合加入时可协同地作用。可以在农杆菌接触多种大豆腋生分生组织外植体组织之前(如几小时到一天)，将植物酚类化合物特别是乙酰丁香酮加入培养基中。培养基中可能的植物酚类化合物的浓度范围从约25μM到700μM。根癌农杆菌特别合适的诱导条件已被描述(Vernade等人(1988)J.Bacteriol.170：5822-5829)。可以通过例如真空过滤(WO 00/58484)、热休克和/或离心、加入硝酸银、超声处理等多种本领域公知的其它方法提高农杆菌的转化效率。

在共培养培养基中添加抗氧化剂(如二硫苏糖醇)或硫醇类化合物(如L-半胱氨酸，Olhoft PM和DA Somers(2001)Plants Cell Reports20：706-711；US2001034888)可以进一步提高农杆菌介导的转化效率，所述抗氧化剂或硫醇类化合物能够减少由植物防御应答(如酚类氧化)引起的组织坏死。

在与上述细菌共培养之后(如通过清洗步骤)。在共培养步骤之后使用的培养基(如在步骤(b1)、(c)和/或(c1)中使用的培养基)优选地含有杀菌剂(抗生素)。这一步骤旨在终止或至少延迟未转化细胞的生长和杀死残存的农杆菌细胞。因此，本发明的方法优选地包括下列步骤：

(b1)在步骤(b)之后将所述共培养的腋生分生组织转移到含有至少一种抑制农杆菌生长的抗生素和任选地至少一种植物生长因子的培养基中，其中所述培养基优选地缺少与(b)的选择性标记基因组合使得能够鉴别和/或选择含有所述选择性标记基因的植物细胞、器官或植物的选择性化合物，和，

使用的优选的抗生素是如羧苄青霉素(500mg/L或优选地100mg/L)或Timentin^TM(GlaxoSmithKline；优选地以浓度约250-500mg/L使用；Timentin^TM是替卡西林钠和克拉维酸钾的混合物；0.8g Timentin^TM含有50mg棒酸和750mg替卡西林)。化学上，替卡西林钠是N-(2-羧基-3，3-二甲基-7-氧代-4-硫杂-1-氮杂双环[3.2.0]庚-6-基)-3-噻吩丙酰胺酸二钠盐。化学上，克拉维酸钾是(Z)-(2R，5R)-3-(2-羟亚乙基)-7-氧代-4-氧杂-1-氮杂双环[3.2.0]庚烷-2-羧酸钾)。

在共培养步骤之后，在含有至少一种植物生长因子的芽诱导培养基中孵育共培养的外植体。在芽诱导培养基的所述孵育可以在共培养步骤之后(即与抑制农杆菌生长的步骤(b1)平行)或在其它中间步骤如(b1)(抑制农杆菌生长)和/或(b2)(没有选择化合物的再生，见以下)之后立即开始。

这些培养基还可以含有至少一种化合物，该化合物与(b)的选择性标记基因组合使得能够进行植物细胞的鉴别和/或选择(如可以使用选择化合物)。然而，优选的，在共培养步骤(b)之后从约4天到约7天的某段时间在缺少选择化合物的培养基中孵育外植体，所述选择化合物与(b)的选择性标记基因组合使得能够鉴别和/或选择包含所述选择性标记基因的植物细胞、器官或植物。针对所述选择性标记基因的可靠的抗性水平的建立需要一些时间以避免由选择化合物产生的甚至对于转化细胞和组织的未预期的损伤。因此，本发明的方法可以在共培养和选择步骤之间包含没有选择化合物的步骤。该步骤可以是步骤(b1)和/或具体的附加步骤：

(b2)在步骤(b)和任选地(b1)之后在含有至少一种植物生长因子的芽诱导培养基(SIM)中进一步孵育所述腋生分生组织，其中所述芽诱导培养基优选地缺少与(b)的选择性标记基因组合使得能够鉴别和/或选择包含所述选择性标记基因的植物细胞、器官或植物的选择性化合物。

如在本发明的方法中所用的用于芽诱导(和/或芽伸长)的培养基可以任选地另行添加一种或多种植物生长调节物，例如细胞分裂素化合物(如，6-苄基氨基嘌呤)和/或生长素化合物(2，4-D)。如此处所用术语“植物生长调节物”(PGR)意指可以调控植物生长和发育的天然产生的或合成的(非天然产生的)化合物。PGR可以单独地作用或彼此协同作用或与其它的化合物(如糖、氨基酸)协同作用。术语“生长素”或“生长素化合物”包括刺激细胞伸长和分裂、脉管组织分化、果实发育、不定根形成、乙烯产生和在高浓度时诱导分化(愈伤组织形成)的化合物。最常见的天然产生的生长素是在根和茎两极转运的吲哚乙酸(IAA)。合成的生长素被广泛使用于现代农业。合成的生长素化合物包括吲哚-3-丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)和2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)。诱导芽形成的化合物包括但不限于IAA、NAA、IBA、细胞细胞分裂素、生长素、激动素、草甘膦和噻苯隆(thiadiazuron)。

术语“细胞分裂素”或“细胞分裂素化合物”包括刺激细胞分裂、子叶扩展和侧芽生长的化合物。它们延迟脱落的叶的老化，并且与生长素(如IAA)组合可以影响根和芽的形成。细胞分裂素化合物包括例如6-异戊基烯腺嘌呤(IPA)和6-苄基腺嘌呤/6-苄基氨基嘌呤(BAP)。

在另一优选的实施方案中，步骤(b)、(b1)、(b2)和/或(c)中至少一个步骤的培养基包含细胞分裂素(如6-苄基氨基嘌呤(BAP))。优选地，浓度在约1μM和约10μM的6-苄基氨基嘌呤(BAP)之间。对于芽诱导培养基，优选的BAP浓度在约1μM到约3μM。优选地，BAP浓度不超过5μM。

更优选地，步骤(b)、(b1)、(b2)、(c)和/或(c1)中至少一个步骤的培养基，优选地至少步骤(b)和(c1)包含浓度在约0.1μM到约2μM之间的赤霉酸(GA3)。

在另一优选的实施方案中，步骤(b)、(b1)、(b2)和(c)中至少一个步骤的培养基包括至少一种硫醇类化合物，该硫醇类化合物优选地选自硫代硫酸钠、二硫苏糖醇(DTT)和半胱氨酸。优选地，浓度是在约1mM和10mM之间的L-半胱氨酸、0.1mM到5mM之间的DTT和/或0.1mM到5mM之间的硫代硫酸钠。

在所述芽诱导培养基孵育外植体直至已发育出芽。形成的芽原基大小一般不超过0.3cm。芽原基的形成是在芽诱导培养基中1周左右开始，并且，平均这样的芽起始持续约3到4周达到最大值。相应地，在所述芽诱导培养基孵育共培养的外植体约2到6周，优选地约3到4周。

农杆菌介导的技术通常可以导致基因传递进入靶组织中有限数目的细胞。因此，在本发明优选的实施方案中，选择化合物被用于在转化后杀死靶组织中所有未转化的细胞或被用于通过选择性优势鉴别转化的细胞。培养的时间长度部分地依赖于选择化合物对未转化细胞的毒性。用于所述选择或筛选的选择性标记基因和相应的选择化合物可以是任何多种众所周知的选择化合物，如抗生素、除草剂或D-氨基酸(详见下文)。这一培养步骤的时间长度是可变的(决定于选择化合物和其浓度、选择性标记基因)，从一天延至约180天。

选择性和/或筛选性标记基因的插入被包含在本发明的方法的范围之内。这可以是有益的，如在后面作为除草剂抗性性状使用。多种选择性标记基因和相应的选择化合物是本领域公知的。此外，可以使用报告基因以进行视觉筛选，其可以需要或可以不需要(依赖于报告基因的类型)补充作为选择化合物的底物。

多种时间方案可以被用于多种选择性标记基因。在抗性基因的情况下(如针对除草剂或D-氨基酸)，通常在约4周的芽起始的始终和进入芽伸长至少4周以上进行选择。这样的选择方案可被用于包括卡那霉素的所有的选择方案。还可能(尽管并非明确地优选)也在包括生根的整个再生方案始终保留选择。

例如，用卡那霉素抗性基因(新霉素磷酸转移酶，NPTII)作为选择性标记，培养基中可以包括浓度从约3到200mg/l的卡那霉素。通常用于选择的浓度是5到50mg/l。组织在此培养基生长为期约1周到约4周，优选约7天直至已发育出芽。由处理条件和共培养条件决定，芽形成在约1到约2周开始。

例如，用膦丝菌素抗性基因(bar)作为选择性标记，培养基中可以包括浓度从约1到50mg/l的膦丝菌素。通常用于选择的浓度是约1到约15mg/l。组织在此培养基生长为期约1周到约4周，优选约7天直至已发育出芽。由处理条件和共培养条件决定，芽形成在约1到约2周开始。

例如，用dao1基因作为选择性标记，培养基中可以包括浓度从约3到100mM的D-丝氨酸或D-丙氨酸。优选地，使用浓度从约10到约70mM(或从约1到约7.5g/L)的D-丝氨酸。通常用于选择的浓度是从约10mM到约50mM(或从约1到约5.3g/l)。组织在此培养基生长为期约1周到约4周，优选约7天直至已发育出芽。由处理条件和共培养条件决定，芽形成在约1到约2周开始。

在优选的实施方案中，所有在转化前形成的芽将在共培养两周后被移去，以刺激来自分生组织的新的生长。这有助于减少初级转化体中的分生组织，并增加转基因分生组织细胞的扩增。在此期间外植体可以被切成或不被切成更小的块(即通过切上胚轴将节从外植体分开)。

在SIM培养基(优选地带有选择性)中培养2到4周后(或直至大量的芽已经形成)，外植体被转移到刺激芽伸长(芽原基的伸长)的芽伸长(SEM)培养基。该培养基可以含有或不含有选择化合物，但是优选地含有选择化合物。芽伸长的频率和长度受SIM中的激素水平特别是BAP影响(实施例9)。

在另一优选的实施方案，步骤(c1)和/或(d)的至少一个步骤的培养基含有约0.01mg/l(0.057M)和约1mg/l(5.7μM)之间的吲哚乙酸(IAA)，和/或约0.1μM和约4μM之间的赤霉酸(GA3)，和/或在约0.5μM和约6μM之间的反式玉米素核苷酸。

优选地，每2到3周后在仔细地移去死组织之后，将外植体转移至新鲜的SEM培养基(优选地含有选择化合物)。外植体应保持完整且不应断裂成碎片且一定程度上保持健康。优选地，将连续转移所述外植体直至外植体死亡或芽伸长。

在转移到芽伸长培养基中约4到8周之后可以收获伸长的芽。通过表型的规则和健康评估芽，且仅收获具有伸长的茎(约1英寸或2cm)和形成完全的具三小叶的叶的芽。

将收集的芽置于生根培养基以诱导根形成。根形成需约1到4周，随后植物可以被转移到土壤并生长成完全成熟。生根培养基可以(也并非明确优选的)也含有选择化合物。优选地，伸长的芽(长度大于3cm)被移出并置于生根培养基(RM)约1周(方法B)，或由栽培种决定约2到4周(方法C)，在此期间根开始形成。在有根外植体的情况下，它们被直接地转移到土壤中。生根的芽被转移至土壤并在转移到温室之前于生长箱变硬2到3周。使用这一方法获得的再生植物是可育的，并且每株植物已平均产生500个种子。

通过此技术产生的T₀植物是转基因植物且通常收获十分合理的产量。对于方法C，使用增殖的腋生分生组织方案的大豆小植株的平均再生时间是从外植体接种开始14周。因此，本方法具有产生可育、健康的大豆植物的迅速再生时间。

表达标记基因的转化的植物材料(如细胞、组织或小植株)能够在抑制未转化的野生型组织生长的相应浓度选择化合物(如抗生素或除草剂)存在下发育。产生的植物可以以常规方式被培育和杂交。应该生长两个或以上的世代以确定基因组的整合是稳定和可遗传的。

本发明的其它重要的方面包括由公开的方法制备的转基因植物的子代以及源自这些子代的细胞和从这些子代获得的种子。

本发明T-DNA的构建

如其它使用农杆菌介导的方法一样，被插入大豆基因组的外源基因构建体或转基因是通过重组DNA操作的普通技术在体外产生的。随后基因构建体被转化进入农杆菌菌株以传递进入大豆细胞。农杆菌是非致癌的，且许多这样的菌株目前可被广泛的获得。

优选地，插入靶大豆植物基因组的T-DNA包括至少一种表达盒，其可以，例如，促进选择性标记基因、性状基因、反义RNA或双链RNA的表达。优选地，所述表达盒包括在植物细胞中有功能的启动子序列，该序列被有效地连接于表达时赋予转化的植物有利表型的核酸序列。本领域技术人员知道可以在此情境下使用众多序列，如用于增加食物和饲料的品质、产生化学品、精细化学品或药物(如维生素、油、碳水化合物；Dunwell(2000)J Exp Bot 51 Spec No：487-96)、赋予对除草剂的抗性或赋予雄性不育。此外，可以增加生长、产量以及对非生物胁迫因子和生物胁迫因子(例如真菌、病毒或昆虫)的抗性。可以通过过表达蛋白质或通过降低内源蛋白质的表达赋予有利的性状，降低内源蛋白质表达可通过如表达相应的反义RNA(Sheehy等人(1988)Proc Natl Acad Sci USA 85：8805-8809；US 4,801,340；Mol JN等人(1990)FEBS Lett 268(2)：427-430)或双链RNA(Matzke MA等人(2000)Plant Mol Biol 43：401-415；Fire A等人(1998)Nature 391：806-811；Waterhouse PM等人(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95：13959-13964；WO99/32619；WO 99/53050；WO 00/68374；WO 00/44914；WO 00/44895；WO00/49035；WO 00/63364)实现。

对于植物中的表达，优选植物特异性启动子。术语“植物特异性启动子”被理解为意指原则上能够在植物或植物的部分、植物细胞、植物组织或植物培养物中控制基因表达，特别是外源基因表达的任何启动子。在本文中，表达可以是，例如组成型、诱导型或发育依赖型的。以下是优选的：

a)组成型启动子

“组成型”启动子指那些在植物发育的大多时期，优选地在植物发育的全部时间，在大量的，优选全部的组织中使能够表达的启动子。尤其优选地使用植物启动子或源自植物病毒的启动子。尤其地优选CaMV(花椰菜花叶病毒)35S转录物的启动子(Franck等人(1980)Cell 21：285-294；Shewmaker等人(1985)Virology 140：281-288；Gardner等人(1986)PlantMol Biol 6：221-228；Odell等人(1985)Nature 313：810-812)或19S CaMV启动子(US 5,352,605；WO 84/02913；Benfey等人(1989)EMBO J8：2195-2202)。另一优选的组成型启动子是水稻肌动蛋白启动子(McElroy等人(1990)Plant Cell 2：163-171)、核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基(SSU)启动子(US 4,962,028)、豆球蛋白B启动子(GenBank登录号X03677)、来自农杆菌的胭脂碱合酶的启动子、TR双启动子、来自农杆菌的OCS(章鱼碱合酶)启动子、泛素启动子(Holtorf等人(1995)Plant Mol Biol29：637-649)、泛素1启动子(Christensen等人(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632；Christensen等人(1992)Plant Mol Biol 18：675-689；Bruce等人(1989)Proc Natl Acad Sci USA 86：9692-9696)、Smas启动子、肉桂醇脱氢酶启动子(US 5,683,439)、液泡ATP酶亚基启动子、pEMU启动子(Last DI等人(1991)Theor.Appl.Genet.81，581-588)、MAS启动子(Velten等人(1984)EMBO J.3(12)：2723-2730)和玉米H3组蛋白启动子(Lepetit等人(1992)Mol Gen Genet 231：276-285；Atanassova等人(1992)Plant J 2(3)：291-300)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)腈水解酶-1基因启动子(GenBank登录号：U38846，核苷酸3862到5325或到5342)或小麦富含脯氨酸蛋白质的启动子(WO 91/13991)和更多在植物中组成型表达的基因的启动子。

b)组织特异性或组织优选的启动子

此外，优选具有种子特异性的启动子，如，例如菜豆蛋白启动子(US5,504,200；Bustos等人(1989)Plant Cell 1(9)：839-53；Murai等人，Science23：476-482(1983)；Sengupta-Gopalan等人，(1985)Proc.Natl Acad.Sci.USA 82：3320-3324)、2S清蛋白基因启动子(Joseffson等人(1987)J BiolChem 262：12196-12201)、豆球蛋白启动子(Shirsat等人(1989)Mol GenGenet 215：326-331)、USP(未知种子蛋白)启动子(

等人(1991a)Mol Gen Genet 225(3)：459-467)、油菜籽蛋白(napin)基因启动子(US5,608,152；Stalberg等人(1996)Planta 199：515-519)、蔗糖结合蛋白启动子(WO 00/26388)或豆球蛋白B4启动子(LeB4；

等人(1991b)MolGen Genet 225：121-128；Becker等人(1992)Plant Mol.Biol.20：49)、拟南芥油质蛋白启动子(WO 98/45461)和芸苔(Brassica)Bce4启动子(WO91/13980)。更优选的是叶特异性和光诱导型的启动子，如来自cab或核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶的启动子(Simpson等人(1985)EMBO J4：2723-2729；Timko等人(1985)Nature 318：579-582)；如来自LAT52的花药特异性启动子(Twell等人(1989b)Mol Gen Genet 217：240-245)；如来自Zml3的花粉特异性启动子(Guerrero等人(1993)Mol Gen Genet224：161-168)；和如来自apg的小孢子优选的启动子(Twell等人(1983)Sex.Plant Reprod.6：217-224)。

c)化学诱导型启动子

表达盒还可以含有化学诱导型启动子(综述文章：Gatz等人(1997)Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48：89-108)，通过该启动子可以在特定时间点控制外源基因的表达。这些启动子，如，例如PRP1启动子(Ward等人(1993)Plant Mol Biol 22：361-366)、水杨酸诱导的启动子(WO95/19443)、苯磺酰胺诱导的启动子(EP 0388186)、四环素诱导的启动子(Gatz等人(1991)Mol Gen Genetics 227：229-237；Gatz等人(1992)PlantJ 2：397-404)、脱落酸诱导的启动子(EP 0335528)或乙醇-环己酮诱导的启动子(WO 93/21334)同样可以被使用。同样适合的是可以被外源施用的安全剂，如，例如N，N-二丙烯基-2，2-二氯乙酰胺(W093/01294)激活的谷胱甘肽-S转移酶同工型II基因(GST-II-27)的启动子，而且其在单子叶和双子叶的大量组织中都是可行的。可以在本发明中使用的更多的代表性的诱导型启动子包括应答铜的ACE1系统启动子(Mett等人(1993)Proc Natl AcadSci USA 90：4567-4571)或来自玉米的应答苯磺酰胺除草剂安全剂的In2启动子(Hershey等人(1991)Mol Gen Genetics 227：229-237；Gatz等人(1994)Mol Gen Genetics 243：32-38)。可以使用应答植物通常不响应的诱导剂的启动子。代表性的诱导型启动子是来自类固醇激素基因的可诱导的启动子，其转录活性可被糖皮质类固醇激素诱导(Schena等人(1991)Proc NatlAcad Sci USA 88：10421)。

特别优选的是组成型启动子。此外，启动子可以被有效地连接于要表达的核酸序列，该启动子使能够在更多的植物组织或在其它生物，如，例如大肠杆菌中表达。合适的植物启动子原则上是全部的上述启动子。

遗传成分和/或表达盒还可以包括启动子之外的遗传控制序列。术语“遗传控制序列”被广义理解并且指对根据本发明的表达盒的物质化或功能有作用的全部那些序列。例如，在原核或真核生物中修饰转录和翻译的遗传控制序列。优选地，根据本发明的表达盒包括在植物中待重组表达的所讨论核酸序列的5′-上游有功能的启动子，和作为另外的遗传控制序列的3′-下游的终止子序列，和，如果合适的话，在各种情况下有效地连接于被重组地表达的核酸序列上的更多常规调控元件。

此外，遗传控制序列还包括5′-非翻译区、内含子或基因的非编码的3′区，如，例如肌动蛋白-1内含子或Adh1-S内含子1、2和6(通常参考：The Maize Handbook，116章，Freeling和Walbot编辑，Springer，NewYork(1994))。已证明它们在调控基因表达中发挥重要作用。因此，已证明5′-非翻译序列可以提高异源基因的瞬时表达。可以提到的翻译增强子的实例是烟草花叶病毒5′-前导序列(Gallie等人(1987)Nucl Acids Res15：8693-8711)等等。此外，它们可以促进组织特异性(Rouster J等人(1998)Plant J 15：435-440)。

表达盒可以有利地包含一个或多个有效地连接于启动子的增强子序列，该增强子使核酸序列的增加的重组表达成为可能。另外的有利序列，如更多的调控元件或终止子也可以被插入在要被重组表达的核酸序列的3′末端。作为控制序列的适合的聚腺苷酸化信号是来自根癌农杆菌的植物聚腺苷酸化信号，具体而言，OCS(章鱼碱合酶)终止子和NOS(胭脂碱合酶)终止子。

控制序列还可以被理解为那些允许从基因组除去插入序列的序列。在适当的情形下，基于cre/lox(Sauer(1998)Methods 14(4)：381-92；Odell等人(1990)Mol Gen Genet 223：369-378；Dale和Ow(1991)Proc Natl AcadSci USA 88：10558-10562)、FLP/FRT(Lysnik(1993)Nucl Acid Res21：969-975)或Ac/Ds体系(Wader等人(1987)in TOMATOTECHNOLOGY 189-198(Alan R.Liss，Inc.)；US 5,225,341；Baker等人(1987)EMBO J 6：1547-1554；Lawson等人(1994)Mol Gen Genet245：608-615)的方法允许，组织特异性和/或可诱导地从宿主生物的基因组中除去特定的DNA序列。在本文中的控制序列可以意指随后使得能够除去(如通过cre重组酶)的特定侧翼序列(如lox序列)。

本发明的遗传成分和/或表达盒可以包含更多的功能元件。术语功能元件被广义地理解并且指所有那些对根据本发明的遗传成分、表达盒或重组生物的产生、扩增或功能有作用的元件。例如，功能元件可以包括(但不应限于)：

1.选择性标记基因

选择性标记基因被用于选择和分离成功转化的或同源重组的细胞。优选地，在本发明的方法中，可以使用一种标记用于在原核宿主中的选择，而可以使用另一标记用于在真核宿主，尤其是植物物种宿主的选择。标记可以是针对杀生物剂，如抗生素、毒素、重金属等的保护，或可以通过互补、对营养缺陷型宿主赋予原养型起作用。植物优选的选择性标记基因可以包括但不限于下列：

1.1负选择标记

负选择性标记赋予对杀生物剂化合物如代谢抑制物(如，2-脱氧葡萄糖-6-磷酸，WO 98/45456)、抗生素(如，卡那霉素、G418、博来霉素或潮霉素)或除草剂(如，膦丝菌素或草甘膦)的抗性。尤其优选的负选择标记是赋予对除草剂抗性的那些。可以被提到的实例是：

-膦丝菌素乙酰转移酶(PAT；又称为Bialophos^TM抗性；bar；De Block等人(1987)Plant Physiol 91：694-701；EP 0333033；US 4,975,374)

-5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS；US 5,633,435)或赋予对草甘膦^TM(N-(膦酰甲基)甘氨酸)抗性的草甘膦氧化还原酶基因(US5,463,175)(Shah等人(1986)Science 233：478)。

-草甘膦^TM降解酶(草甘膦^TM氧化还原酶；gox)

-失活茅草枯^TM的脱卤素酶(deh)

-失活磺酰脲和咪唑啉酮的乙酸乳酸合成酶(例如带有例如S4和/或Hra突变的ALS变体)

-降解溴苯腈^TM的腈水解酶(bxn)

-编码如新霉素磷酸转移酶的卡那霉素抗性基因或G418抗性基因(NPTII；NPTI)(Fraley等人(1983)Proc Natl Acad Sci USA80：4803)，其表达的酶赋予针对抗生素卡那霉素和相关抗生素新霉素、巴龙霉素、庆大霉素和G418的抗性。

-2-脱氧葡萄糖-6-磷酸磷酸酶(DOGR1-基因产物；WO 98/45456；EP0807836)，其赋予针对2-脱氧葡萄糖的抗性(Randez-Gil等人(1995)Yeast 11：1233-1240)。

-潮霉素磷酸转移酶(HPT)，其介导针对潮霉素的抗性(VandenElzen等人(1985)Plant Mol Biol.5：299)。

-二氢叶酸还原酶(Eichholtz等人(1987)Somatic Cell and MolecularGenetics 13：67-76)。

另外的细菌起源的赋予针对抗生素抗性的负选择性标记基因包括aadA基因，其赋予对抗生素壮观霉素的抗性，庆大霉素乙酰转移酶、链霉素磷酸转移酶(SPT)、氨基糖苷-3-腺苷转移酶和博来霉素抗性决定簇(Hayford等人(1988)Plant Physiol.86：1216；Jones等人(1987)Mol.Gen.Genet.，210：86；Svab等人(1990)Plant Mol.Biol.14：197；Hille等人(1986)Plant Mol.Biol.7：171)。

尤其优选的是针对由D-氨基酸，如D-丙氨酸和D-丝氨酸引起的毒性效果赋予抗性的负选择标记(WO 03/060133)。在本文中作为负选择标记尤其优选的是来自纤弱酵母(Rhodotorula gracilis)(圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides))的daol基因(EC：1.4.3.3：GenBank登录号：U60066)和大肠杆菌基因dsdA(D-丝氨酸脱水酶、D-丝氨酸脱氨酶)[EC：4.3.1.18；GenBank登录号：J01603)。

1.2正选择标记

正选择性标记赋予转化植物相对于未转化植物的生长优势。基因如来自根癌农杆菌(菌株：PO22；Genbank登录号：AB025109)的异戊烯基转移酶(作为细胞分裂素生物合成的关键酶)可以促进转化植物的再生(如通过无细胞分裂素培养基上的选择)。相应的选择方法被描述(Ebinuma等人(2000)Proc Natl Acad Sci USA 94：2117-2121；Ebinuma等人(2000)Selection of Marker-free transgenic plants using the oncogenes(ipt，rol A，B，C)of Agrobacterium as selectable markers，In Molecular Biology ofWoody Plants.Kluwer Academic Publishers)。另外的赋予转化植物相对于未转化植物的生长优势的正选择标记被描述如在EP-A 0601092中。生长刺激选择标记可以包括(但不应限于)β-葡糖醛酸酶(与如，细胞分裂素葡糖苷酸组合)、甘露糖-6-磷酸异构酶(与甘露糖组合)、UDP-半乳糖-4-表异构酶(与如半乳糖组合)，其中尤其优选与甘露糖组合的甘露糖-6-磷酸异构酶。

1.3反选择标记

反选择标记尤其适于选择带有包含所述标记的规定缺失序列的生物(Koprek等人(1999)Plant J 19：719-726)。反选择标记的实例包括胸苷激酶(TK)、胞嘧啶脱氨酶(Gleave等人(1999)Plant Mol Biol.40(2)：223-35；Perera等人(1993)Plant Mol.Biol 23：793-799；Stougaard(1993)Plant J3：755-761)、细胞色素P450蛋白质(Koprek等人(1999)Plant J 19：719-726)、卤代烷脱卤素酶(Naested(1999)Plant J 18：571-576)、iaaH基因产物(Sundaresan等人1995)、胞嘧啶脱氨酶codA(Schlaman和Hooykaas(1997)Plant J 11：1377-1385)或tms2基因产物(Fedoroff和Smith(1993)Plant J3：273-289)。

2.报告基因

此外，术语选择性标记基因还可以包括使得能够鉴别和/或选择转化的细胞或生物的其它基因，如使得能够视觉筛选和鉴别这类转化细胞(无需施用植物毒性的化合物)的报告基因。一些所述的报告基因可能需要另外的底物用于鉴别(如GUS基因)，而其它的报告基因可无需这类底物(如GFP)而起作用。

报告基因编码容易定量的蛋白质，并且通过它们的颜色或酶活性使得有可能评估转化效率、表达的位置或表达的时间。在本文中更加特别优选的是编码报告蛋白质的基因(Schenborn，Groskreutz(1999)Mol Biotechnol13(1)：29-44)，如绿色荧光蛋白(GFP)(Sheen等人(1995)Plant J8(5)：777-784；Haseloff等人(1997)Proc Natl Acad Sci USA 94(6)：2122-2127；Reichel等人(1996)Proc Natl Acad Sci USA 93(12)：5888-5893；Tian等人(1997)Plant Cell Rep 16：267-271；WO 97/41228；Chui等人(1996)CurrBiol 6：325-330；Leffel等人(1997)Biotechniques 23(5)：912-8)、珊瑚(Reef-coral)来源的蛋白质(Wenck等人(2003)Plant Cell Reporter 22：241-251)、氯霉素转移酶、荧光素酶(Ow等人(1986)Science 234：856-859；Millar等人(1992)Plant Mol Biol Rep 10：324-414)、水母发光蛋白基因(Prasher等人(1985)Biochem Biophys Res Commun 126(3)：1259-1268))、β-半乳糖苷酶、R基因座基因(编码调控植物组织中的花青苷色素(红色)产生并因此有可能直接进行启动子活性分析而无需加入更多的辅助底物或显色底物(Dellaporta等人(1988)In：Chromosome Structure and Function：Impact of New Concepts，18th Stadler Genetics Symposium，11：263-282；Ludwig等人(1990)Science 247：449)，更加尤其优选使用β-葡糖醛酸酶(GUS)(Jefferson(1987b)Plant Mol.Bio.Rep.，5：387-405；Jefferson等人(1987a)EMBO J 6：3901-3907)。通过将组织与5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸孵育产生的蓝色检测β-葡糖醛酸酶(GUS)表达；通过光发射检测细菌荧光素酶(LUX)表达；通过与荧光素孵育之后光发射检测萤火虫荧光素酶(LUC)；以及在用5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃型半乳糖苷对组织染色之后通过亮蓝色检测半乳糖苷酶表达。报告基因还可以被用作作为抗生素抗性标记备选的可计分的标记。这类标记被用于检测转移基因表达的存在或测量转移基因的表达水平。仅当细胞修饰效率高时，在植物中使用可计分的标记以鉴别或标记遗传修饰的细胞才效果良好。

3.确保根据本发明的表达盒或载体能够在，例如大肠杆菌中复制的复制起点。可以提到的实例是ORI(DNA复制起点)、pBR322 ori或P15A ori(Maniatis 1989)。在大肠杆菌中有功能的复制系统的另外的实例是ColE1、pSC101、pACYC184等。广泛宿主范围的复制系统，如P-1不相容质粒；如pRK290可以作为除大肠杆菌复制系统之外或大肠杆菌复制系统的替代而被使用。这些含有有臂的和去臂的Ti-质粒的质粒对于植物物种中T-DNA的转移特别有效。

4.农杆菌介导的植物转化所必须的元件，如，例如T-DNA的右和/或(任选地)左边界或vir区。

这里所公开和要求的全部组合物和方法可以在本公开的教导下制备和执行而无需通过度的实验。尽管本发明的组合物和方法已在优选的实施方案中被描述，对于本领域的技术人员显而易见的是这里所述的组合物、方法和所述方法的步骤或步骤的顺序可以发生改变而不背离本发明的概念、精神和范围。更具体的，显然某些化学和生理都有关的物质可以取代此处所述的物质而获得相同或类似的结果。对于本领域的那些技术人员显而易见的是所有这类相似的取代和修饰被认为在由所附权利要求书所定义的本发明的精神、范围和概念之内。在本说明书中提到的所有出版物和专利申请是对本发明所属领域的技术人员的技术水平的说明。所有出版物和专利申请在此处以相同的程度被并入作为参考，如同每一个单个出版物或专利申请被明确和单独地说明被并入作为参考一样。

序列

SEQ ID NO：1：编码载体pBPSEW008的核苷酸序列

[LB-pNOS-bar-NOSt-::pPcUBI-gusINT-NOSt-RB]

SEQ ID NO：2：编码载体pBPSMM192b的核苷酸序列

[LB-pSuper-gusINT-NOSt::AtAhast-AtAhas-pAtAhas-RB]

SEQ ID NO：3：编码载体pBPSLM003的核苷酸序列

[LB-OCSt-bar-pMAS::pSuper-gusINT-NOSt-RB]

附图说明

图1：在V2阶段的大豆植物图解。显示了子叶的位置、具一小叶的叶和上面的具三小叶的叶。在子叶和上胚轴以及每个叶柄和上胚轴的连接处发现腋芽。

图2：萌发后约7天的萌发的大豆Jack栽培种。

图3：使用增殖的腋生分生组织外植体的大豆转化方法；外植体制备。7天龄幼苗被移去根和部分的子叶，并置于含有5μM BAP的增殖培养基中用来制备增殖的外植体(A)。从原始大豆幼苗发育成的新的小植株制备外植体(B)。在增殖培养基中2到3周之后(C)，通过切割小植株节间的腋节之下0.5到1.0cm制备腋生分生组织外植体(D)，并用解剖刀切下腋生分生组织所在尖端以诱导从头的芽生长并使农杆菌进入靶细胞(E)。

图4：使用增殖的腋生分生组织外植体的大豆转化方法；芽再生。在共培养3天后将外植体置于芽诱导培养基中35天，在此期间形成大的愈伤组织/芽叶枕(A、B)。在芽诱导培养基4周之后已可见GUS阳性的芽(C)。带有多个芽的外植体继之被转移至芽伸长培养基中并于此保留平均57到65天。在这些外植体上伸长的芽(D)被移出并置于生根培养基中1到2周用于根发育，在生长箱硬化2到3周，随后被转移到温室(E)。

图5：基于幼苗腋生分生组织的方法。从7天龄的幼苗移去单个子叶、根(任选的)、第二节(具一小叶的叶节)以上的上胚轴和具一小叶的叶以用于转化。将此外植体与农杆菌共培养5天后置于芽诱导培养基中。显示了在芽诱导培养基上1周所制备的外植体的实例(图5-2)。

图6：将幼苗腋生分生组织外植体与根癌农杆菌在添加了硫醇类化合物的固体共培养培养基共培养之后，幼苗腋生分生组织外植体的瞬时表达。

图7：上图显示了在芽起始培养基中2周后，幼苗外植体初级节的从头的芽产生。左下图显示了在幼苗外植体上发育出的GUS阳性的芽原基。在芽起始培养基中4周后，外植体被移至芽伸长培养基，在转移于此4周后芽开始伸长(右下栏)。

图8：叶腋生分生组织外植体的制备。从子叶节以下2到4mm的下胚轴移取子叶和上胚轴组织(1)。为了获得叶外植体，移去一片子叶(2)然后在子叶节之上切割上胚轴(3)。将上胚轴对切获得两个对称的叶外植体(4)。为了从腋生分生组织细胞诱导从头的芽产生，所有预先形成的芽在叶柄末端被小心地移去(5)并且腋生分生组织细胞所在的托叶之间的区域被用锋利的解剖刀切割3到5次(6)。

图9：上图显示了芽诱导2周后在叶腋生分生组织外植体的叶柄基部发生的从头的芽产生。3到4周后，外植体被转移到芽伸长培养基中，其中显著的伸长在仅18到36天后明显可见(底图)。

图10：与农杆菌共培养5天后幼苗腋生分生组织外植体上的瞬时GUS表达。

图11：在芽诱导培养基4周后幼苗腋生分生组织上的稳定的GUS表达。新形成的芽原基和更大的茎以GUS阳性部分显示。

图12：在芽起始培养基中不同浓度的激动素(kinetin)和BAP对在芽伸长培养基培养18天的叶外植体上每个外植体最长芽长度(A)和每个外植体伸长的芽数目(B)的影响。

图13：在芽起始培养基中不同浓度的激动素(kinetin)和BAP对在芽伸长培养基培养36天的叶外植体每个外植体最长芽长度和每个外植体伸长的芽数目的影响。

图14：在用根癌农杆菌菌株AGL1/pBPSEW008接种并以不同的共培养条件(0＝0mg/L L-半胱氨酸；100＝100mg/L L-半胱氨酸(0.825mM)；400＝400mg/L L-半胱氨酸(3.3mM)；1000＝1000mg/L L-半胱氨酸(8.25mM)；NDC＝1mM硫代硫酸钠、1mM DTT、1000mg/L L-半胱氨酸(8.25mM))共培养之后，两份重复组在SIM 2周发育出愈伤组织芽叶枕后的叶外植体的百分比。

图15：增殖的腋生分生组织外植体及其对在萌发培养基(GM)和增殖培养基(prop)中BAP的应答图。当在萌发和增殖期间接触不同浓度的BAP时，在伸长培养基4周后产生伸长芽的外植体的百分比。

图16：三种不同的根癌农杆菌菌株感染Jack和L00106CN栽培种的PAM外植体的感染能力的评价。计数感染10天后在靶组织中带有GUS+集落的外植体数。

图17：使用增殖的腋生分生组织方法的大豆转化过程。使用7天龄幼苗(A)通过移去根和部分的子叶并置于含有5μM BAP的增殖培养基产生增殖的小植株。2到3周后(B)，通过从小植株移去连接的叶并暴露节区域(C)，与农杆菌共培养3天，随后置于芽诱导培养基35天(D)制备腋生分生组织外植体。继之将多个芽外植体(E、F)转移到芽伸长培养基，在其中保留平均57到65天。移取在这些外植体上伸长的芽(G)并置于生根培养基1到2周进行根发育(H)，在生长箱硬化2到3周，随后转移到温室(I)。

实施例

除非另外说明，全部化学药品来自Mallinckrodt Baker，Inc.(Phillipsburg，NJ，USA)、Phytotechnology Laboratories(Shawnee Mission，KS，USA)、EMD Chemicals，Inc.(Gibbstown，NJ，USA)和Sigma(St.Louis，MO，USA)。

A.在培养基中使用的母液：

1.B5主要盐

a.0.25M KNO₃(硝酸钾)

b.0.01M CaCl₂＊2H₂O(氯化钙)

c.0.01M MgSO₄＊7H₂O(硫酸镁)

d.0.01M(NH₄)₂SO₄(硫酸铵)

e.0.01M NaH₂PO4＊H2O(磷酸钠)

2.B5次要盐

a.5mM H₃BO₃(硼酸)

b.10mM MnSO₄＊H₂O(硫酸锰)

c.0.7mM ZnSO₄＊7H₂O(硫酸锌)

d.0.45mM KI(碘化钾)

e.0.1mM Na₂MoO₄＊2H₂O(钼酸)

f.0.01mM CuSO₄＊5H₂O(硫酸铜)

g.0.01mM CoCl₂＊6H₂O(氯化钴)

3.B5维生素

a.0.055M肌醇

b.0.8mM烟酸

c.0.5mM盐酸吡哆醇

d.3mM盐酸硫胺素

4.MS主要盐

a.0.2M NH₄NO₃(硝酸铵)

b.0.2M KNO₃(硝酸钾)

c.30mM CaCl₂＊2H₂O(氯化钙)

d.15mM MgSO₄＊7H₂O(硫酸镁)

e.12.5mM KH₂PO₄(磷酸钾)

5.MS次要盐

a.10mM H₃BO₃(硼酸)

b.13mM MnSO₄＊H₂O(硫酸锰)

c.3mM ZnSO₄＊7H₂O(硫酸锌)

d.0.5mM KI(碘化钾)

e.0.1mM Na₂MoO₄＊2H₂O(钼酸)

f.0.01mM CuSO₄＊5H₂O(硫酸铜)

g.0.01mM CoCl₂＊6H₂O(氯化钴)

6.MSIII铁

a.10mM FeSO₄＊7H₂O(硫酸铁)

b.10mM C₁₀H₁₄O₈Na₂N₂＊2H₂O(NaEDTA)

B.培养基的组合物

除非另外说明，以下的培养基可用于本发明方法中的全部三种优选的外植体组织。三种方法简述如下：

a)方法A：幼苗腋生分生组织——使用整个幼苗。

b)方法B：叶腋生分生组织——初生叶或更高叶以使腋生分生组织保持连接于叶柄的方式被切下。

c)方法C：增殖的腋生分生组织(见上文和下文的详述)

1.萌发培养基GM(固体)于25×100mm培养皿或Plantcon^TM(Sigma)培养盒：

a.1×B5主要盐，

b.1×B5次要盐

c.1×MSIII铁，

d.2％蔗糖，

e.1×B5维生素，

f.5μM BAP(任选)，

g.0.8％纯化的琼脂(Sigma)；

h.pH 5.8。

2.YEP培养基(固体和液体)于Erlenmeyer三角瓶或15×100mm培养皿：

a.10g/L细菌用蛋白胨(Difco；Becton Dickinson&Co.，Cockeysville，MD，USA)，

b.5g/L酵母膏(Difco)，

c.5g/L NaCl，

d.用于选择的合适的抗生素，

e.1.2％颗粒状琼脂(Difco)固体；

f.pH 7.0。

3.增殖培养基MODPROP(固体)于25×100mm培养皿：(方法C)

a.1×MS主要盐，

b.1×MS次要盐，

c.1×MSIII铁，

d.1×B5维生素，

e.3％蔗糖，

f.0.22到1.12mg/L(1μM to 5μM)BAP(优选约1μM)，

g.0.8％纯化的琼脂(Sigma)

g.pH 5.8。

4.共培养培养基CCM(液体)：

a.1/10×B5主要盐，

b.1/10×B5次要盐，

c.1/10×MSIII铁，

d.1×B5维生素，

e.3％蔗糖，

f.20mM 2-[N-吗啉代]乙烷磺酸(MES；M_w＝213.26g/Mol)，

g.200μM乙酰丁香酮(AS)，

h.0.72μM到1.44μM GA₃(赤霉酸；M_w＝346.38g/Mol)

i.BAR(6-苄基氨基嘌呤；M_W＝225.25g/mol)：7.5μM.

j.仅方法C：400mg/L L-半胱氨酸(3.3mM)(Sigma)

k.pH 5.4。

5.共培养培养基CCM(固体)于15×100mm培养皿：

a.1/10×B5主要盐，

b.1/10×B5次要盐，

c.1/10×MSIII铁，

d.1×B5维生素，

e.3％蔗糖，

f.20mM 2-[N-吗啉代]乙烷磺酸(MES)

g.200μM乙酰丁香酮AS，

h.0.72μM到1.44μM GA₃(赤霉酸；M_w＝346.38g/Mol)

i.BAP(6-苄基氨基嘌呤；M_W＝225.25g/mol)：7.5μM.

j.硫醇类化合物，

(i).100到1000g/L L-半胱氨酸(M_W＝121.16g/Mol；Sigma)；优选地：方法B和C：400mg/L L-半胱氨酸(3.3mM)；方法A：1g/l(8.25mM)L-半胱氨酸

(ii).0到1mM或154.2mg/L DTT(Fisher Scientific，Fair Lawn，NJ，USA)，

(iii).0到1mM无水硫代硫酸钠(158.1mg/L)或五水合硫代硫酸钠245mg/L(Mallinckrodt，Paris，KY，USA)，方法A：1mM二硫苏糖醇，1mM硫代硫酸钠。

k.0.5％纯化的琼脂；

l.pH 5.4。

6.洗涤培养基Modwash(液体)：(方法C)

a.1×B5主要盐，

b.1×B5次要盐，

c.1×MSIII铁，

d.3％蔗糖，

e.1×B5维生素，

f.30mM MES，

g.350mg/L Timentin^TM

h.pH 5.6。

6.芽诱导培养基SIM(液体)：(方法A和B)

a.1×B5主要盐，

b.1×B5次要盐，

c.1×MSIII铁，

d.1×B5维生素，

e.3％蔗糖，

f.3mM MES，

g.2.5μM BAP(方法B)，1μM到7.5μM(优选1μM)BAP(方法A)

h.5μM激动素(Kinetin)(仅方法B)

i.250mg/L Timentin^TM

j.0.8％纯化的琼脂；

k.pH 5.6。

5.芽诱导培养基SIM(固体)于20×100mm培养皿：

a.1×B5主要盐，

b.1×B5次要盐，

c.1×MSIII铁，

d.1×B5维生素，

e.3％蔗糖，

f.3mM MES，

g.1μM到7.5μM(优选约1μM)BAP(方法A)；2.5μM BAP(方法

B)；5.0μM BAP(方法C)

h.5μM激动素(Kinetin)(仅方法A和B)

i.250mg/L Timentin^TM

j.适当时的选择化合物，

k.0.8％纯化的琼脂；

l.pH 5.6。

7.芽伸长培养基SEM(固体)于20×100mm培养皿：

a.1×MS主要盐，

b.1×MS次要盐，

c.1×MSIII铁，

d.1×B5维生素，

e.3％蔗糖，

f.3mM MES，

g.50mg/L L-天冬酰胺(0.378mM)，

h.100mg/L L-焦谷氨酸(0.775mM)，

i.0.1mg/L IAA(0.57μM)，

j.0.5mg/L GA3(1.44μM)，

k.1mg/L反式玉米素核糖核苷(2.85μM)，

l.250mg/L Timentin^TM，

m.适当时的选择化合物，

n.0.8％纯化的琼脂；

o.pH 5.6。

7.生根培养基RM(固体)于25×100mm PYREX培养管(Corning Inc.，New York，NY，USA)：

a.1/2×B5主要盐，

b.1/2×B5次要盐，

c.1×MSIII铁，

d.2％蔗糖，

e.3mM MES，

f.1mg/L(5μM)吲哚丁酸(IBA，M_w＝203.24g/Mol)(方法A和B)，5μM到12.5μM(优选约5μM)IBA(方法C)，

g.0.8％纯化的琼脂；仅方法C：250mg/L Timentin

h.pH 5.6。

实施例1：大豆种子的灭菌和萌发

在本发明的方法中几乎可以使用任何大豆品种的种子。多种大豆栽培种(包括Jack、Williams 82和Resnik)适于进行大豆转化。将3.5ml 12N HCl逐滴加入具有密封盖子的干燥器中的100ml漂白液(5.25％次氯酸钠)产生氯气气体，在具有该气体的箱中对大豆种子灭菌。在该箱中24到48小时后，取出种子并将大约18到20个种子置于25×100mm培养皿中含有或不含有5μM 6-苄基氨基嘌呤(BAP)的固体GM培养基。不含有BAP的幼苗更多地伸长并且发育出根，特别是二级根和侧根的形成。BAP通过形成更短和矮的幼苗使幼苗更强壮。

于25℃在光照(＞100μM/m²s)下生长的7天龄幼苗可以被用于三类外植体的外植体材料(图2)。在此期间种皮已经裂开，并且具有一小叶的上胚轴已经最少长成子叶的长度。上胚轴应该至少是0.5cm以避免子叶节组织(由于大豆栽培种和种子批号在发育时间方面可变，描述萌发阶段比具体的萌发时间更准确)。

方法C中，下胚轴和两个子叶的一个半或两个子叶的部分被从每个幼苗除去。随后将幼苗置于增殖培养基中2到4周。幼苗产生许多分支的芽以从其获得外植体(图3A)。大部分外植体从顶芽生长出的小植株产生。这些外植体被优选地用作靶组织。

对于整个幼苗(方法A)或叶外植体(方法B)的接种，幼苗随后即适用于转化(图5和8)。

实施例2：农杆菌培养物的生长和制备

在固体YEP生长培养基上划线培养带有期望双元载体的农杆菌(如，根癌农杆菌或发根农杆菌)并在25℃孵育直至出现菌落(约2天)来制备农杆菌培养物。由在Ti或Ri质粒、双元载体和细菌染色体上存在的选择性标记基因决定，在YEP固体和液体培养基中使用不同的选择化合物用于根癌农杆菌和发根农杆菌的选择。多种农杆菌菌株可以被用于转化方法(见上文和下文实施例7)。

在约2天后，挑出单个菌落(用灭菌的牙签)并接种于含有抗生素的50ml液体YEP培养基，在175rpm(25℃)振摇直至OD₆₀₀到达0.8-1.0之间(约2天)。制备用于转化的工作甘油母液(15％)并将1ml的农杆菌母液等分至1.5ml Eppendorf管随后在-80℃贮存。

在外植体接种前一天，用5μl到3ml的工作农杆菌母液接种于500mlErlenmeyer三角瓶中的200ml的YEP中。于25℃振摇三角瓶过夜直至OD₆₀₀在0.8-1.0之间。在制备大豆外植体之前，通过于20℃在5500×g离心10分钟沉淀农杆菌。在液体CCM中重悬沉淀至期望密度(OD₆₀₀0.5-0.8)并在用前于室温静置至少30分钟。

实施例3：外植体制备和共培养(接种)

3.1方法A：转化当天的外植体制备。

此时的幼苗具有从至少0.5cm的但是通常在0.5和2cm之间的伸长的上胚轴。已经成功使用长至4cm的伸长的上胚轴。随后用以下材料制备外植体：

i)带有或不带有一些根

ii)带有部分的子叶、一个或两个子叶，移去包括顶端分生组织的全部预先形成的叶，并使用锋利的解剖刀在位于第一对叶的节上切上数刀进行损伤(见图5)。

在节上的切口不仅诱导农杆菌感染还散开腋生分生组织细胞并损伤预先形成的芽。在创伤和制备后，外植体被置于培养皿边上并随即与液体CCM/农杆菌混合物共培养30分钟。随后从液体培养基移出外植体并置于在15×100mm培养皿的固体共培养培养基上的无菌滤纸上。创伤的靶组织被如此放置从而使其直接与培养基接触。

3.2改良的方法A：上胚轴外植体制备

使用制备自4到8天龄幼苗的大豆上胚轴片段作为用于再生和转化的外植体。大豆栽培种L00106CN、93-41131和Jack的种子在含有或不含有细胞分裂素的1/10MS盐培养基或相似组分培养基中萌发4到8天。通过从茎段移去子叶节和茎节制备上胚轴外植体。上胚轴被切成2到5段。尤其优选的是连接于包含腋生分生组织的初级节或更高节的茎段。

该外植体被用于农杆菌感染。带有GUS标记基因和AHAS、bar或dsdA选择性标记基因的质粒的农杆菌AGL1被置于含有合适抗生素的LB培养基培养过夜，收获并重悬于含有乙酰丁香酮的接种培养基。将新鲜制备的上胚轴段浸于农杆菌悬液30到60分钟，并随后在无菌滤纸上蘸干。随后接种的外植体被培养在含有L-半胱氨酸和TTD以及其它用于增加T-DNA传递的化学品如乙酰丁香酮的共培养培养基中2到4天。随后将感染的上胚轴外植体置于含有选择物质如咪唑烟酸(imazapyr)(用于AHAS基因)、草铵膦(glufosinate)(用于bar基因)或D-丝氨酸(用于dsdA基因)的芽诱导培养基置。在含有选择性物质的伸长培养基上继代培养再生的芽。

继之将所述段培养在含有细胞分裂素如BAP、TDZ和/或激动素(Kinetin)的芽诱导培养基中用于转基因植物的再生。4到8周后，将培养的组织转移到含低浓度细胞分裂素用于芽伸长的培养基中。伸长的芽被转移到含生长素用于芽和植物发育的培养基中。多个芽得以再生。

恢复了许多显示出强GUS表达的稳定转化的部分。大豆植物得以从上胚轴外植体再生。有效的T-DNA传递和稳定转化的部分被证明。

3.3方法B：叶外植体

叶外植体的制备在图8被详述。首先，从下胚轴移取子叶。子叶被彼此分开并移取上胚轴。通过小心地切割托叶基部从上胚轴移取包括叶片、叶柄和托叶的初级叶，从而使腋生分生组织被包括在外植体中。为了创伤外植体和刺激从头的芽形成，移去任何预先形成的芽，并用锋利的解剖刀切割托叶之间的区域3到5次。

在外植体制备之后，立即将外植体完全浸入或将其创伤的叶柄末端蘸入农杆菌悬浮液。在接种之后，外植体被置于无菌滤纸蘸干多余的农杆菌培养物，并使外植体的创伤侧与置于固体CCM培养基之上的圆形7cmWhatman纸接触(见上文)。该滤纸阻止根癌农杆菌在大豆外植体的过度生长。用Parafilm^TM“M”(American National Can，Chicago，Illinois，USA)包裹5个板，并在黑暗或光照下于25℃孵育3到5天。

3.4方法C：增殖的腋生分生组织

增殖的腋生分生组织外植体的制备在图3(B-E)被详述。使用增殖的3-4周龄小植株，可以从第一到第四节制备腋生分生组织外植体。从每个幼苗可获得平均3到4个外植体。通过切割在节间的腋节以下0.5到1.0cm处制备外植体，并将叶柄和叶从外植体移去。用解剖刀切割腋生分生组织所在的顶端，以诱导从头的芽生长并使农杆菌能够进入靶细胞。因此，0.5cm的外植体包括茎和芽。

一旦切割，将外植体立即置于农杆菌悬浮液20到30分钟。接种后，将外植体置于无菌滤纸蘸干，以移去多余的农杆菌培养物，然后视农杆菌菌株而定，将外植体几乎完全浸入固体CCM中或置于覆盖在固体CCM之上的圆形7cm滤纸上。该滤纸阻止农杆菌在大豆外植体中过度生长。用Parafilm^TM“M”(American National Can，Chicago，Illinois，USA)包裹平板并在黑暗中于25℃孵育2到3天。

实施例4：芽诱导

在黑暗中于25℃共培养3到5天之后，在液体SIM培养基或Modwash培养基中清洗外植体(以移去多余的农杆菌)(方法C)，并在置于固体SIM培养基之前在无菌滤纸蘸干(以防止损伤尤其是在叶片的损伤)。大约5个外植体(方法A)或10到20个(方法B和C)外植体被如此放置从而使靶组织与培养基直接接触。在起初两周内用具有或不具有选择性的培养基培养外植体。优选地，外植体被转移在不具有选择性的SIM中一周。

对于叶外植体(方法B)，外植体应该被垂直培养基表面放置，使叶柄埋入培养基且叶片在培养基之外。

对于增殖的腋生分生组织(方法C)，外植体被平行于培养基表面(由上往下的)放置使外植体部分地浸没于培养基。

用Scotch 394通风胶带(3M，St.Paul，Minnesota，USA)缠绕平板，并置于生长箱在平均温度25℃，以18小时光/6小时黑暗循环于70-100μE/m²s培养2周。已对此外植体测试多种光强和波长、选择方案和SIM(实施例9)。外植体将保留在具有或不具有选择性的SIM直至在靶区域(如，在上胚轴以上第一节的腋生分生组织)发生从头的芽生长。在此期间可转移至新鲜培养基。在约一周之后，将外植体从具有或不具有选择性的SIM转移到具有选择性的SIM中。此时，有大量从头的芽发育发生在不同SIM中的叶外植体的叶柄基部(方法B；图9)，发生在幼苗外植体的初级节(方法A；图7)，以及发生在增殖的外植体的腋节(方法C；图4)。

优选地，在转化前形成的全部芽将在共培养两周后被移去以刺激来自分生组织的新的生长。这有助于减少初级转化体的嵌合状态并增加转基因分生组织细胞的扩增。在此期间外植体可以被或可以不被切成更小的块(即通过切割上胚轴从外植体上分开节)。

实施例5：芽伸长

在SIM培养基(优选地具有选择性)2到4周之后(或直至已经形成大量的芽)，将外植体转移到刺激芽原基的芽伸长的SEM培养基中。此培养基可以含有或可以不含有选择化合物。芽伸长的频率和长度受SIM中的激素水平特别是BAP的影响(实施例9)。

在每2到3周之后，仔细地去除死组织将外植体转移到新鲜SEM培养基(优选地含有选择性)。外植体应该是完整的且不会断裂成碎片并保持一定的健康。持续转移外植体直至外植体死亡或芽伸长。大于3cm的伸长的芽被移出并置于RM培养基约1周(方法A和B)或由栽培种决定约2到4周(方法C)，此时根开始形成。在外植体带有根的情况下，它们被直接转移到土壤中。生根的芽被转移至土壤并在转移到温室之前在生长箱硬化2到3周。使用本方法获得的再生的植物是可育的，并且每个植物产生平均500个种子。

在与根癌农杆菌共培养5天后，瞬时的GUS表达广泛分布于幼苗腋生分生组织外植体，尤其是在外植体制备期间的创伤区域(方法A，图6、10)。外植体被置于没有选择性的芽诱导培养基中以观察初级节如何应答芽诱导和再生。迄今为止，超过70％的外植体已经在此区域形成新的芽(图7)。在SIM中14天后GUS基因的表达是稳定的，意味着T-DNA整合进入大豆基因组。此外，初步的实验已经在SIM 3周后产生GUS阳性芽的形成(图7)。

对于方法C，使用增殖的腋生分生组织方法的大豆小植株的平均再生时间是从外植体接种起14周。因此，此方法具有产生可育、健康的大豆植物的迅速的再生时间。

实施例6：叶外植体上芽再生的基因型筛选

如上所述制备种子和外植体。在含有5μM激动素(Kinetin)和2.5μMBAP的SIM培养2周后，总共17个不同品种(9个来自Soygenetics和8个来自Dairyland)被筛选用于芽诱导和再生。在GM中8天之后，制备6个不同栽培种的20个叶外植体。外植体立即以每平板10个外植体置于SIM培养基中。实验重复3次。在3周时评估形成愈伤组织/芽叶枕的外植体的百分比。全部栽培种以高的百分比诱导愈伤组织/芽叶枕。在3周之后形成芽叶枕的全部外植体的范围是85％到100％。这些栽培种具有大于95％的再生百分比。这证明叶外植体叶柄上愈伤组织/芽叶枕的再生高度不依赖于本实验所用的大豆栽培种。全部栽培种中超过85％所制备的外植体发育出愈伤组织/芽叶枕，一些栽培种在所有重复组的全部外植体上发育出愈伤组织/芽叶枕。

实施例7：根癌农杆菌和发根农杆菌对叶外植体感染能力的评估

在发展有力的大豆转化体系中大豆对农杆菌的易感性是最重要的步骤之一。基因型、发育阶段、激素平衡和在外植体切除和制备时的环境条件都影响农杆菌感染特定大豆组织的能力。已经通过以子叶节的腋生分生组织细胞为靶标成功地使用根癌农杆菌菌株AGL1转化大豆(Olhoft和Somers(2001)Plants Cell Reports 20：706-711)。发根农杆菌K599在诱导毛根形成方面非常有效，并且已证明来自不同大豆栽培种的54％到95％的感染的子叶产生毛根(Cho等人(2000)Planta 210：195-204)。新的去臂型的发根农杆菌菌株K599被包括在本研究中。在本研究中，通过分析瞬时GUS表达评估根癌农杆菌和发根农杆菌感染叶外植体的能力。

使用两种农杆菌菌株：根癌农杆菌菌株AGL1(AGL0的衍生物)(recA::bla pTIBo542ΔMop+CBR)(Lazo(1991)Bio/Technology 9：963-967)和去臂型发根农杆菌K599(SHA016)(pRi2659)TetR NCPPB 2659(BASFPlant Sciences LLC，2004)。两种农杆菌菌株都含有带uidA基因的双元载体pBPSMM192b，该uidA基因是在增强的mas启动子(SuperP:pIV2GUS:nosT)控制下的。在外植体接种前一天，过夜培养物制备如下：用10-80μl的农杆菌工作母液接种置于挡板三角瓶(baffledErlenmeyer)中的含合适抗生素的30ml YEP液体中，并在轨道摇床上以150rpm于28℃振摇10到12小时。一旦培养物到达OD₆₀₀ 0.5到0.8，通过在50ml管(falcon tube)于3500rpm离心10分钟沉淀细胞。在液体CCM中重悬细胞。

大豆栽培种(如Jack)的种子如以上所述进行灭菌和幼苗萌发。制备叶外植体并浸于农杆菌/CCM悬浮液10-20秒，在无菌滤纸上蘸干，并置于在含400mg/L L-半胱氨酸(3.3mM)的固体CCM之上的滤纸之上。共培养2天之后，在液体SIM中洗涤叶外植体，继之置于含有2.5μM BAP和5.0μM激动素(Kinetin)的固体SIM上3天。在此之后，在外植体组织的瞬时GUS表达被评估。进行两个实验。在第一个实验中，制备总共30个外植体的两份重复组并用AGL1接种。在仅有一组重复的第二个实验中，用AGL1或SHA016接种40个外植体，并在接种后5天测定GUS表达。

第一个实验评估AGL1感染叶外植体的能力。在接种后5天全部组织用于进行瞬时表达的GUS染色。有60％的外植体在腋生分生组织所处的叶柄的切割末端具有GUS(+)集落(表1)。此外，外植体的其它区域也表现出GUS+集落，包括叶片。

表1：测试AGL1感染叶腋生分生组织能力而进行的起始实验。

感染后6天之后GUS组织化学测定结果

	感染的外植体总数	在靶区域具有GUS(+)集落的外植体
			重复组1	10	6
重复组2	20	12

在第二个实验中，根癌农杆菌AGL1和去臂的发根农杆菌K599(SHA016)成功地转移T-DNA进入叶外植体的叶柄。用AGL1感染的外植体的40％在靶区域显示出GUS(+)集落，而SHA016在4％的靶区域显示出GUS(+)集落(表2)。在那些用SHA016感染的外植体中瞬时GUS表达的减少主要是在共培养期间组织死亡的结果。

表2：农杆菌菌株AGL1和SHA016感染叶外植体的能力。

菌株	感染的外植体总数	在靶区域带有GUS(+)集落的外植体
			AGL1	40	17
SH016	40	10

这些结果证明了去臂的根癌农杆菌和发根农杆菌菌株成功地传递T-DNA到位于或邻近叶外植体靶区域的细胞的能力。

实施例8：优化外植体再生和农杆菌感染的共培养条件。

在农杆菌介导的转化方法中，共培养条件的优化是获得转基因植物的一大因素。在有利于农杆菌的生长条件和植物的健康生长条件之间必须达到平衡。被测试的常见条件包括：光照条件、孵育时间长度、温度、农杆菌细胞密度和培养基组分。在本研究中，光照条件、添加硫醇类化合物到CCM中(Olhoft和Somers(2001)Plants Cell Reports 20：706-711)、孵育的天数和接种方法都被考虑在内。

在两个实验中，使用大豆栽培种(如Jack)和含有双元质粒pBPSEW008(SEQ ID NO：1)的根癌农杆菌菌株AGL1。该双元质粒含有nosP-bar-nosT和pUBI-gusINT-nosT。如前所述制备叶外植体和农杆菌。用于全部实验的最终农杆菌OD₆₀₀是0.5。在第一个实验中，制备两个重复组以测试下列条件，

(1)将五种硫醇类组合之一加入CCM(无硫醇类、100mg/L L-半胱氨酸(0.825mM)、400mg/L L-半胱氨酸(3.3mM)、1000mg/L L-半胱氨酸(8.25mM)或1mM硫代硫酸钠+1mM DTT+1000mg/LL-半胱氨酸(8.25mM))，

(2)在25℃共培养3、4或5天，并且

(3)在黑暗中或在100μE/m²s冷白光下以16小时光照/8小时黑暗的光照方案孵育。

为每种处理制备10个外植体。外植体在SIM培养基生长2周，记录在这一时间后发育出愈伤组织/芽叶枕的外植体的百分比。

在第二个实验中，制备外植体并进行上述处理，不同之处在于全部叶外植体被共培养5天，并将整个外植体浸没于农杆菌/CCM悬浮液10分钟或将外植体切割的叶柄末端蘸入。每次处理10个外植体被完整地浸没而4个外植体被蘸入。全部外植体在共培养之后即刻被GUS染色。

在实验1中，愈伤组织/芽叶枕的再生显著受CCM中的L-半胱氨酸水平影响，而不受共培养光照条件或孵育天数的影响(见图14)。不论其它测试因素如何，在不含硫醇类化合物或含有100mg/L L-半胱氨酸(0.825mM)的CCM中共培养的外植体的80％到100％在叶柄发育出愈伤组织/芽叶枕。然而，通过叶片脱色和切割叶柄末端观察到在400mg/L(3.3mM)以上的L-半胱氨酸水平一致地导致组织死亡。在实验2中，以不同共培养条件培养的外植体的GUS染色揭示含有超过400mg/L L-半胱氨酸(3.3mM)的CCM有利于最佳的T-DNA传递(见表3)。

表3：

实验2中每个共培养处理的外植体叶柄的GUS阳性部分的数目给出如下：

硫醇类处理	光照条件	整个浸没的：有GUS(+)集落的外植体	蘸入的：有GUS(+)集落的外植体
				0mg/l Cys	光照	0/10	0/4
0mg/l Cys	黑暗	1/10	0/4
				100mg/l Cys	光照	6/10	0/4
100mg/l Cys	黑暗	7/10	0/4
				400mg/l Cys	光照	9/10	1/4
400mg/l Cys	黑暗	9/10	3/4
				1000mg/l Cys	光照	3/10	1/4
1000mg/l Cys	黑暗	3/10	0/4
				NDC1000<sup>＊</sup>	光照	9/10	1/4
NDC1000<sup>＊</sup>	黑暗	9/10	2/4

^＊NDC＝1mM硫代硫酸钠/1mM DTT/8.25mM(1000mg/L)L-半胱氨酸

被施用1000mg/L L-半胱氨酸的外植体被显著脱色，因此解释了在这些外植体中发现的较低数目的GUS(+)集落。这一初步试验还表明光照条件在T-DNA传递进入大豆细胞中不起大的作用。

在这一系列实验中，同时影响再生和GUS瞬时表达的主要处理是在CCM中加入硫醇类化合物。测试的其它共培养条件没有很大程度影响在这些实验中所用的再生或GUS瞬时表达的数目。因此，发现L-半胱氨酸的最佳浓度是400mg/L或3.3mM。

实施例9：芽起始培养基(SIM)的来自叶外植体的芽再生的影响。

包括盐、激素和光照量的培养条件全都影响植物中对再生的植物应答。比较基本的盐和激素在芽诱导期间对叶外植体的芽起始和再生的影响的研究已经在木豆中完成(Dayal等人(2003)Plant Cell Rep.21：1072-1079)。在这一系列实验中，测试基本盐MS和B5，细胞分裂素BAP和激动素的水平以及不同的光照量，以观察这些因素如何影响叶外植体上的芽形成和伸长。

如上所述从来自Soygenetics栽培种31(93-41131)的7天龄幼苗制备叶外植体。所述外植体被随机地置于16种不同的含有MS或B5盐两者之一和8种激动素和BAP组合之一的SIM培养基(基本培养基：B5或MS盐、B5维生素、MS III铁、3mM MES、3％蔗糖、0.8％纯化的琼脂和250到500mg/L Timentin)。

表4：制备叶外植体并转移至含B5或MS盐及多种浓度激动素和BAP的SIM中。

编号	盐	激动素(μM)	BAP(μM)		编号	盐	激动素(μM)	BAP(μM)
									C1B	B5	5	0		C1M	MS	5	0
C2B	B5	5	1		C2M	MS	5	1
									C3B	B5	5	2.5		C3M	MS	5	2.5
C4B	B5	5	5		C4M	MS	5	5
									C5B	B5	5	7.5		C5M	MS	5	7.5
C6B	B5	5	10		C6M	MS	5	10
									C7B	B5	0	7.5		C7M	MS	0	7.5
C8B	B5	0	0		C8M	MS	0	0

在实验一，进行3个重复组，其中为每个重复组预备160个外植体(见上文详述)，并且在16种不同SIM处理的每种随机放置10个外植体。一位研究人员制备全部三个重复组。外植体在SIM生长两周之后，来自重复组2的5个外植体和来自重复组3的5个外植体被转移至SEM[1×MS主要盐、1×MS次要盐、1×MSIII铁、1×B5维生素、3％蔗糖、3mM MES、50mg/L L-天冬酰胺(0.378mM)、100mg/L L-焦谷氨酸(0.775mM)、0.1mg/l IAA(0.57μM)、0.5mg/l GA3(1.44μM)、1mg/l ZR(2.85μM)、250到500mg/L替卡西林、0.8％纯化的琼脂；pH 5.6]以诱导芽伸长。这一实验中的外植体在平均温度25℃，使用冷白光灯泡在18小时光照/6小时黑暗循环，＞100μE/m²s的Percival箱中生长。实验2包括3个重复组，其中的外植体由3个不同的研究人员制备。每个研究人员切割160个外植体并在16种处理的每一种随机放置10个外植体。外植体在各自的SIM上生长2周继之全部外植体被转移到SEM。外植体在使用冷白与GroLux灯混合的16小时光照/8小时黑暗循环，＜67μE/m²s光强的生长箱中生长。

在SIM生长2周后记录含有愈伤组织/芽叶枕的外植体数。此时，每位实验人员根据愈伤组织/芽叶枕的发育所见主观分析两个实验中外植体对SIM培养基的最佳应答。也在SEM培养18天和36天后测量了SIM对芽伸长的影响。计数每个外植体显著伸长的芽的平均数和每个外植体最长芽的平均长度。

记录每种处理中具有原始芽形式或器官发生愈伤组织形式的腋细胞生长的外植体数。平均而言，在两个实验的全部重复组中，98.6％的外植体被如此切割，从而使腋细胞被包括在叶柄中(表5)。

表5：切割以使腋细胞包括在叶柄中的具有腋生分生组织细胞的外植体数。

实验1	实验2
		158/160对于R1	159/160对于R1
155/160对于R2	160/160对于R2
		157/160对于R3	159/160对于R3
平均：470/480(97.9％)	478/480(99.6％)

在不同处理之间，尤其是在B5和MS盐基础培养基之间，愈伤组织/芽叶枕的生长有明显的不同。在MS生长的外植体具有呈现强绿色的显著的愈伤组织生长，而在B5生长的外植体主要发育出浅绿色芽原基，不具有显著的愈伤组织生长。在SIM两周之后，每个研究人员选择最大、最健康的芽叶枕生长的最佳培养基。考虑全部三位研究人员在实验1的重复组2和重复组3以及实验2的全部三个重复组中的观察，选出诱导外植体的芽原基的最佳培养基。最佳培养基被列为“1”。未被任何研究人员选择的那些处理用破折号(-)标明。

图6：在接触不同SIM培养基时在芽原基形成方面外植体应答的主观定级。

SIM	实验1	实验2	SIM	实验1	实验2
						C1B	3	-	C1M	-	-
C2B	3	2	C2M	-	4
						C3B	2	1	C3M	1	3
C4B	3	5	C4M	3	5
						C5B	2	5	C5M	3	-
C6B	3	3	C6M	-	-
						C7B	3	6	C7M	-	-
C8B	-	-	C8M	-	-

1到6＝最佳到最差，(-)未由任何实验员在任何重复选择。

由这一主观分析，在含有较低浓度BAP的SIM，尤其是C2B、C3B、C3M中的外植体在两周后发育出更大和更健康的愈伤组织/芽叶枕。此外，生长在B5盐的外植体也在外植体芽诱导上产生更好的应答。在本研究中所用光照强度和波长不影响在SIM 2周后愈伤组织/芽叶枕的形成。

对于在芽伸长培养基18天后进行的两个实验，SIM中的激素对每个外植体最长芽长度和每个外植体伸长芽的平均数的影响是相似的(图12A、B)。对于两个实验，较高水平的BAP倾向于产生开始伸长的芽数的增加，而这些芽通常是不够伸长的。在使用混合的光波长和低光强的实验2中，当培养基中存在BAP时，最长芽的长度总体而言大大降低，而当培养基中没有BAP时会更长(图12A)。在SIM培养基中的BAP浓度轻微影响每个外植体的芽数但不如影响最长芽长度那样明显。相反，在广光谱低光照条件下生长于含有任何浓度BAP的B5基础培养基的外植体与其它条件和处理的外植体相比倾向于每个外植体具有更多的芽(图12B)。在SEM培养36天之后这些外植体在不同处理之间的芽伸长趋势没有显著改变，但是对于所有处理，每个外植体最长芽的平均长度没有如预期的那样增长(图13C)。理想的SIM将为每个外植体提供多个伸长的芽以及那些芽迅速且茁壮的伸长。基于这些结果，促进芽伸长的最佳SIM是那些不含BAP或有低水平的BAP的培养基，例如C2M、C4M、C8M、C1B、C4B以及C8B和如在实验1中的高光照条件。

多种芽诱导培养基对叶外植体的芽形成和再生的影响被测试和测量。在MS基础盐培养的外植体结合测试的处理产生大量深绿但是易碎的愈伤组织生长，而在B5基础盐中的外植体形成很少愈伤组织生长的苍白的芽。含有较低水平BAP、B5盐的培养基和两种光照方案是在SIM培养2周的叶外植体形成健康和大量芽叶枕的最适条件。光照水平并不显著影响外植体在SEM 18天之后的芽伸长和形成；那些在广光谱但是低光照水平下培养在BAP的外植体，每个外植体产生更多伸长的芽。然而，那些芽通常比测试的其它条件下的更短。因此，在芽诱导期间被培养在低水平的BAP和B5基本盐中以及始终的高光照条件下的叶外植体最适于再生形成大的、健康的愈伤组织/芽叶枕，这将迅速产生每个外植体的伸长至大尺寸的多个芽。

实施例10：对于增殖的腋生分生组织外植体的两种不同供体材料的评估

从温室供体植物和体外生长的植物获得的外植体材料的比较是通过测量每个外植体的芽再生进行的。外植体材料包括具有从第一节到第四节的连接的近端节间组织的增殖的腋生分生组织。

在测试的两种生长条件中使用栽培种Jack。对于体外供体材料，无菌的种子被播种于含有1/2MS盐和2％蔗糖pH 5.7的Plantcon^TM(SIGMA)中。幼苗被维持在25℃，16/8小时(光照/黑暗)光周期，光强在40到70μM m^-2s^-1之间。对于温室供体植物，种子被播种于Metromix^TM并生长在25℃和16小时光周期的温室中。3周之后从温室植物切下组织。对于温室材料，通过浸于含有5％吐温20的溶液，接着浸于70％(v/v)乙醇2分钟，继之在3.5％(v/v)次氯酸钠溶液中洗10分钟并用无菌水冲洗3次对组织进行表面灭菌。对于体外供体材料，不需要进一步灭菌。腋生分生组织被由上向下地置于芽起始培养基，所述培养基含有完全浓度的MS盐和B₅Gamborg氏维生素并补充以5μM BAP或2mg/L(9.1μM)TDZ。在芽诱导培养基3周之后通过计数每个外植体＞0.3mm的芽数进行评估。

含有来自两种供体植物(体外和温室)的腋生分生组织的外植体阳性应答由BAP或TDZ产生的多芽诱导(表7)。发现来自体外生长的供体材料的腋生分生组织外植体具有更高的再生能力。在所用的细胞分裂素中，BAP比TDZ具有更大的芽诱导能力。来自两种供体材料的培养在TDZ中的外植体产生大量的愈伤组织和小芽。污染也是培养来自温室生长植物的外植体中的难题。

表7：来自温室和体外供体植物的腋生分生组织区域再生能力的评估。

结果来自三个重复组(n＝22)。

如果外植体材料来自体外生长的植物并在芽诱导期间暴露于BAP，用于增殖的腋生分生组织转化方法的外植体材料具有最高的芽诱导能力。

实施例11：影响来自体外生长植物的外植体芽诱导能力的因素

11.1培养容器类型对大豆腋生分生组织再生能力的影响

进行评估以确定不同培养容器是否影响从体外小植株获得的腋生分生组织外植体的再生。Wright等人(1987)证明在塑料培养皿或玻璃培养管中培养的大豆组织在相同环境的生长条件下导致芽再生和表型表现的不同。

通过先在70％(v/v)乙醇清洗6分钟对栽培种Jack的种子表面消毒。随后将种子浸入含有25％商业漂白剂(NaOCl)和0.1％的吐温20的溶液中，以200rpm搅拌20分钟。在无菌的双蒸水中清洗种子4次。以16/8小时(光照/黑暗)的光周期光照(40到70μMm^-2s^-1)进行萌发。灭菌的种子被分配于三个不同的含有萌发培养基的培养容器中：(1)培养板(150×20mm)、(2)耦合Magenta盒和(3)Plantcon^TM(SIGMA)。在萌发培养基3周之后，如上所述制备腋生分生组织外植体继之从上向下地置于芽起始培养基，该芽起始培养基含有完全浓度的MS盐和B₅ Gamborg氏维生素并补充以5μMBAP。在芽诱导4周之后，通过每个外植体＞3mm芽的平均数测量再生能力。

在三个不同的培养容器中萌发的腋生分生组织外植体具有不同的再生能力。发现在塑料培养板萌发的腋生分生组织外植体的再生能力最高；在耦合Magenta盒中萌发的种子发育的每个外植体平均0.3个芽，在塑料培养板中为0.81，而在Plantcon中为0.1。此外，来自耦合Magenta盒和Plantcon^TM(SIGMA)的外植体更难以从小植株移取且难以创伤，推测可能由于木质素含量增加。

11.2.在萌发培养基和/或芽起始培养基中BAP浓度对增殖的腋生分生组织的芽起始的影响。

理想的供体植物应该能够产生高度可再生的腋生分生组织外植体，并且每个小植株发育出大量的外植体。观察到当种子在无激素培养基中生长且被直接用于外植体材料时，可以制备少量腋生分生组织外植体。此外，在这些容器中大量的根生长严重限制了小植株形成的空间和营养。因此，我们在加入增殖步骤和在萌发培养基中加入减少根生长的BAP之后测试了外植体再生芽的能力。由于BAP还已知影响芽再生能力，设计实验以测量在整个萌发和增殖过程中暴露于不同BAP浓度的芽的再生能力。

如上所述，种子在浓度为0、0.36、1.25、2.5或5μM的BAP中萌发。7天之后，移去根、下胚轴和一片子叶，剩下的组织被置于灌注在培养板(150×20mm)中的增殖培养基(MS盐、3％蔗糖、B5维生素、0.8％植物琼脂、加上合适的BAP)中。来自每种BAP浓度的幼苗在增殖期间被移至全部5种浓度。4周之后，制备腋生分生组织外植体，并转移至在150×20mm平板中的芽诱导培养基(MS盐、3％蔗糖、B₅维生素、5μM BAP、0.8％植物琼脂)。1周之后，所述材料被转移至伸长培养基(MS盐、3％蔗糖、B5维生素、0.36μM BAP、0.8％植物琼脂)，4周后对芽伸长(大于0.3mm的芽)记数。

在外植体制备之前通过移去根并将小植株置于增殖培养基中能够从每个增殖的小植株制备更多的外植体；获得平均4到6个腋生分生组织外植体。此外，附加的切割和增殖步骤不影响外植体的芽诱导能力。在萌发培养基中加入BAP，尤其在2.5μM浓度的BAP也倾向于增加产生伸长芽的外植体的百分比(图15；灰色阴影条)。发现通常倾向是在腋生分生组织方法的增殖期间外植体与更高浓度的BAP接触与那些没有接触BAP的外植体相比产生更少的伸长的芽(见图15)。

在萌发培养基加入BAP(0.36到5μM)不会负面影响芽再生；相反，在2.5μM BAP中萌发的种子通常倾向于具有增加的芽再生。在增殖培养基中增加的BAP水平不会负面影响外植体的芽再生。

11.3.两种基础盐(MS和B₅)对增殖的腋生分生组织外植体的萌发、增殖和芽诱导影响的评估

在培养基中的盐的组成对于大豆植物的健康和发育非常重要。进行实验以比较在萌发、增殖和芽诱导期间当生长在由MS基础盐或B₅基础盐组成的培养基时外植体对起始芽的应答能力(组成见以上[A]部分)。三种不同的栽培种：Jack、Westag97和L00106CN被用于再生研究。如前所述进行种子灭菌、增殖和芽诱导。除了基础盐，向全部三种培养基加入5μM BAP。进行两个重复组。基础盐对芽起始能力的影响是栽培种依赖性的。基础盐从MS变为B5，使栽培种L00106CN和Jack的每个外植体产生大量芽(表8)。在MS或B5盐培养栽培种Westag97，其外植体芽形成没有显著差异。

表8：评估含有不同基础盐的2种培养基在萌发、增殖和芽诱导期间对于来自栽培种Jack、Westag97和L00106CN的增殖的腋生分生组织的芽诱导的影响。在芽诱导培养基3周之后，记录每个外植体＞0.3mm的芽平均数。

栽培种	n	B5盐		MS盐
							每个PAM的芽平均数±SD	n	每个PAM的芽平均数±SD

栽培种	n	B5盐		MS盐
					Jack	80	2.20±1.27	100	1.35±0.35
Westag 97	100	3.88±0.39	100	3.40±0.85
					L00106CN	94	4.05±1.48	72	2.64±1.61

改变培养基中的基础盐影响大豆PAM外植体的芽起始。对于栽培种Jack和Westag 97，在萌发、增殖和芽诱导培养基中B5基础盐显著增加每个外植体产生的芽数。

实施例12：使用增殖的腋生分生组织外植体评估不同公用大豆栽培种的再生能力

不同大豆栽培种的再生能力的评估是发展有力的大豆转化和再生体系的重要组成部分。鉴别高度可再生系使得能够根据它们的起源更灵活地发展性状。在两个实验中所用的栽培种包括3个美国品种、6个加拿大品种和27个Soygenetics栽培种。在最初评估中包括的栽培种是来自美国大豆公用系的Jack、Resnik、Williams 82和来自圭尔夫OAC大学(安大略农学院)的RCAT Staples、Westag 97、RCAT Bobcat、OAC Prudence、OACWoodstock、OAC9908。通过暴露于70％(v/v)乙醇6分钟对种子表面消毒。随后将种子浸入含有25％商业漂白剂(NaOCl)和0.1％的吐温20的溶液中，以200rpm振摇20分钟。在无菌双蒸水中清洗种子4次。在黑暗中萌发5到7天。一旦萌发，移去根和每个子叶的一半，随后剩余的组织在含有5μM BAP的MSB5培养基中增殖。平板被置于条件为25℃，光强(40-70μM m^-2s^-1)和光周期16/8小时(光照/黑暗)的生长箱中。三周之后，如实施例3.3所述制备腋生分生组织外植体，继之从上向下地置于含有完全浓度的MS盐、B₅Gamborg氏维生素和5μM BAP的芽起始培养基中。4周之后对每个增殖的腋生分生组织外植体的＞0.3mm芽总数进行评估。

如上所述制备种子和外植体。在评估中使用完全地随机设计。使用两个重复组，并且由两个不同研究人员准备外植体。在评估中每种栽培种包括总共40个增殖的腋生分生组织。在芽诱导4周之后计数每个增殖的腋生分生组织＞0.3mm芽的总数，并且其为在此评估中研究的主要变量。进行单向方差分析。使用PROC GLM(SAS Institute，Cary，NC)分析最小均方和数据。使用Dunnett-Hsu检测(P＞0.05)以Jack作为对照进行多均值比较。还进行残差分析以确定分析的假设是合适的。

3个美国品种和6个加拿大品种的每个增殖的外植体的芽平均值被包括在表9中。在测试的7个栽培种中，5个应答多芽诱导。栽培种Westag97比Jack的每个外植体发育出更多芽。大量来自不同成熟组的大豆栽培种能够产生高数目的多个芽，特别是Westag97。这一转化方法应该适用于广泛范围的大豆栽培种。

表9：使用增殖的腋生分生组织(n＝180)

对不同的美国大豆和加拿大大豆的芽诱导能力的评估

来源	成熟组	每PAM外植体的平均芽数
			美国栽培种
Jack(对照)	3	3.0
			Resnik	3	1.7
Williams 82	3	2.4
			加拿大栽培种
RCAT Staples	2.6	2.6
			Westag 97	1.9	3.6
RCAT Bobcat	1.2	1.9
			OAC Prudence	0	1.8
OAC Woodstock	0	1
			OAC 99-08	0	2.8

实施例13：共培养条件

13.1L-半胱氨酸的影响

Olhoft和Somers(2001)(Plants Cell Reports 20：706-711)证明当使用农杆菌介导的子叶节转化方法时，在共培养培养基中加入硫醇类化合物(L-半胱氨酸、硫代硫酸钠和二硫苏糖醇)增加大豆栽培种Bert的瞬时和稳定的转化(又见Olhoft等人(2003)Planta 216：723-735)。因此，设计实验以评估是否向固体共培养培养基加入L-半胱氨酸也可以增加T-DNA传递和整合进入增殖的腋生分生组织外植体。

外植体制备：通过将Jack品种的种子暴露于70％(v/v)乙醇6分钟，随后浸入含有25％商业漂白剂(NaOCl)和0.1％的吐温20的溶液中，以200rpm搅拌20分钟对种子进行表面消毒。在无菌的双蒸水中清洗种子4次。在黑暗中于25℃萌发7天。从7天龄的幼苗移去根和每个子叶的一半并埋入在150×20mm培养板中的增殖培养基。用Parafilm^TM封板并置于培养室在25℃，光照下培养2到5周。

根癌农杆菌制备和外植体接种：使用带有双元载体pBPSMM192b[LB-pSuper-gusINT-NOSt::AtAhast-AtAhas-pAtAhas-RB](SEQ ID NO：2)的根癌农杆菌菌株AGL1。使用单个菌落接种含有合适抗生素的25到30ml的LB培养基。三角瓶在轨道摇床(220rpm)于28℃振摇24到36小时至OD₆₀₀到达0.8到1.0。通过在3500rpm离心8到10分钟沉淀细菌。在含有200μM乙酰丁香酮的液体共培养基中重悬细菌细胞。一旦切割，增殖的腋生分生组织外植体被立即浸入根癌农杆菌悬浮液并保持30分钟。感染的组织被继之转移到真空室(25-30mm Hg)5分钟或被直接置于共培养培养基上。在转移至培养基之前，在无菌滤纸上蘸干外植体。所测试的处理是将0、400或800mg/L L-半胱氨酸加入固体共培养培养基(分别为0、3.3或6.6mM)。在黑暗中于25℃共培养3天。真空浸润在没有添加半胱氨酸的方法中使转化效率增加，但是对于添加半胱氨酸的方法没有显著效果。

GUS组织化学测定：3天后从共培养培养基移出用根癌农杆菌菌株AGL1感染的增殖的腋生分生组织外植体，并用GUS在37℃染色过夜。剩下的外植体被转移至含有500mg/L Timentin^TM的芽诱导培养基。在接种后10天和45天进行GUS组织化学测定。

结果：共培养3天之后，通过向固体共培养培养基分别加入800(6.6mM)或400mg/L(3.3mM)L-半胱氨酸使具有GUS(+)集落的外植体发生率从2.5％增加至45％和63％。暴露于L-半胱氨酸的外植体与没有暴露于L-半胱氨酸的外植体相比较少地遭受变褐和组织坏死。在共培养之后10天和45天还可见到GUS染色的增加(表10)。

表10：在存在或缺乏L-半胱氨酸下共培养的外植体的GUS表达的评估。显示了在用根癌农杆菌AGL1感染3、10和45天之后呈现GUS⁽⁺⁾集落的增殖的腋生分生组织(品种Jack)的发生率。r＝2 n＝360

向固体共培养培养基添加硫醇类化合物，即L-半胱氨酸对于T-DNA传递和整合以及在共培养期间和共培养之后的增殖的腋生分生组织外植体的存活具有有益影响。

13.2根癌农杆菌菌株和双元载体比较

期望能够找到最佳根癌农杆菌菌株和双元载体的组合使能够进行有效的T-DNA传递和整合。对比三种根癌农杆菌菌株感染两种大豆栽培种Jack和L00106CN的增殖的腋生分生组织外植体的能力。此外，进行第二个实验测试带有三个不同双元载体之一的根癌农杆菌菌株AGL1的感染能力。

如前所述进行种子萌发、增殖、根癌农杆菌和腋生分生组织制备以及接种。在第一个实验中，比较了三种含有双元载体pBPSMM192b(SEQ IDNO：2)的根癌农杆菌菌株MP90、LBA4404和AGL1。用三种根癌农杆菌菌株感染的增殖的腋生分生组织在3天后从共培养培养基中移出，并在接种10天之后进行GUS染色。

在分开的实验中，用含有双元载体pBPSLM003[LB-OCSt-bar-pMAS::pSuper-gusINT-NOSt-RB](SEQ ID NO：3)、pBPSMM192a[LB-NOSt-gusINT-pSuper::AtAhast-AtAhas-pAtAhas-RB]或pBPSMM192b[LB-pSuper-gusINT-NOSt::AtAhast-AtAhas-pAtAhas-RB](SEQ ID NO：2)的农杆菌菌株AGL1感染10天之后，评估来自栽培种L00106CN的外植体上的GUS表达。pBPSLM003(SEQ ID NO：3)的骨架序列与pBPSMM192a和b(SEQ ID NO：2)的不同。载体pBPSMM192a[LB-NOSt-gusINT-pSuper::AtAhast-AtAhas-pAtAhas-RB通过相反取向的pSuper-gusINT-NOSt表达盒而与载体pBPSMM192b(SEQ ID NO：2)相区别。

在含有或不含有400mg/L(3.3mM)L-半胱氨酸的固体共培养培养基中共培养的外植体的GUS表达也被用于评估外植体。每种处理制备20个外植体用于每个重复组，在本实验中总共2个重复组。感染开始10天之后计数GUS表达。

在10天龄外植体中靶区域的GUS⁺集落数被计数。对于栽培种Jack，用LBA4404接种的外植体具有最高的GUS⁺部分的发生频率(60％)，之后是AGL1和MP90。当使用AGL1菌株接种时，来自栽培种L00106CN的外植体显示最高的GUS⁺部分的发生频率(55％)。对于两种栽培种，尽管能够被感染，菌株MP90具有最低的GUS阳性部分发生率(见图16)。

在本研究中，测试了带有驱动gusA转录的超级启动子的多种构建体，以确定是否T-DNA上的基因方向或骨架序列影响接种的外植体中的GUS表达。用含有三个双元载体之一的AGL1共培养的外植体的平均发生频率显示在表11中。使用不同双元载体对在外植体靶组织的GUS表达水平没有显著影响。然而，在用400mg/L或3.3mM L-半胱氨酸共培养的外植体中GUS表达明显增加。

表11：用含有三种不同的双元载体的AGL1感染10天之后，外植体的GUS(+)集落发生率。

在本转化方法中使用的外植体是对于使用多种农杆菌菌株，尤其是使用菌株LBA4404和AGL1感染敏感的。发现与双元载体的方向或骨架序列相比，L-半胱氨酸对于T-DNA传递具有大得多的影响。

实施例14：通过增殖的腋生分生组织方法的再生过程

有力的大豆转化体系包括在组织培养中使用有限的时间迅速再生以减少与体细胞克隆变异相关的问题。

使用上文列出的增殖的腋生分生组织方法的转化方法，从农杆菌接种到温室中的植物建成的平均再生时间约100天。将芽诱导步骤作为第0天，在平均第57天到65天已经获得伸长的芽，随后3到4周生根并转移到温室(图17)。从农杆菌接种到温室植物建成的所述转化方法平均约为130天。

序列表

<110>巴斯福植物科学有限公司

<120>改良的大豆转化

<130>AE20040365/PF 56048US

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>10632

<212>DNA

<213>载体pBPSEWO08

<400>1

cgctgcgctc aagtgcgcgg tacagggtcg agcgatgcac gccaagcagt gcagccgcct   60

ctttcacggt gcggccttcc tggtcgatca gctcgcgggc gtgcgcgatc tgtgccgggg  120

tgagggtagg gcgggggcca aacttcacgc ctcgggcctt ggcggcctcg cgcccgctcc  180

gggtgcggtc gatgattagg gaacgctcga actcggcaat gccggcgaac acggtcaaca  240

ccatgcggcc ggccggcgtg gtggtaacgc gtggtgattt tgtgccgagc tgccggtcgg  300

ggagctgttg gctggctggt ggcaggatat attgtggtgt aaacaaattg acgcttagac  360

aacttaataa cacattgcgg acgtctttaa tgtactgaat taacatccgt ttgatacttg  420

tctaaaattg gctgatttcg agtgcatcta tgcataaaaa caatctaatg acaattatta  480

ccaagcagga tcctctagaa ttcccgatct agtaacatag atgacaccgc gcgcgataat  540

ttatcctagt ttgcgcgcta tattttgttt tctatcgcgt attaaatgta taattgcggg  600

actctaatca taaaaaccca tctcataaat aacgtcatgc attacatgtt aattattaca  660

tgcttaacgt aattcaacag aaattatatg ataatcatcg caagaccggc aacaggattc  720

aatcttaaga aactttattg ccaaatgttt gaacgatcgg ggaaattcga gctcgccggc  780

gtcgacgata tcctgcaggt caaatctcgg tgacgggcag gaccggacgg ggcggtaccg  840

gcaggctgaa gtccagctgc cagaaaccca cgtcatgcca gttcccgtgc ttgaagccgg  900

ccgcccgcag catgccgcgg ggggcatatc cgagcgcctc gtgcatgcgc acgctcgggt  960

cgttgggcag cccgatgaca gcgaccacgc tcttgaagcc ctgtgcctcc agggacttca 1020

gcaggtgggt gtagagcgtg gagcccagtc ccgtccgctg gtggcggggg gagacgtaca 1080

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agaaatattt gctagctgat agtgacctta ggcgactttt gaacgcgcaa taatggtttc 1500

tgacgtatgt gcttagctca ttaaactcca gaaacccgcg gctgagtggc tccttcaacg 1560

ttgcggttct gtcagttcca aacgtaaaac ggcttgtccc gcgtcatcgg cgggggtcat    1620

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agctggcaat tccggttcgc ttgctgtcca taaaaccgcc cagtctagct atcgccatgt    1800

aagcccactg caagctacct gctttctctt tgcgcttgcg ttttcccttg tccagatagc    1860

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ccgcttcctt tagcagccct tgcgccctga gtgcttgcgg cagcgtgaag cttgactaga    1980

gaattcgaat ccaaaaatta cggatatgaa tataggcata tccgtatccg aattatccgt    2040

ttgacagcta gcaacgattg tacaattgct tctttaaaaa aggaagaaag aaagaaagaa    2100

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gatcccctct tccttcaccg cctcaaacac aaaaataatc ttctacagcc tatatataca    2280

accccccctt ctatctctcc tttctcacaa ttcatcatct ttctttctct acccccaatt    2340

ttaagaaatc ctctcttctc ctcttcattt tcaaggtaaa tctctctctc tctctctctc    2400

tctgttattc cttgttttaa ttaggtatgt attattgcta gtttgttaat ctgcttatct    2460

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tttgttgatt tgactgtgta tctacacgtg gttatgttta tatctaatca gatatgaatt    2580

tcttcatatt gttgcgtttg tgtgtaccaa tccgaaatcg ttgatttttt tcatttaatc    2640

gtgtagctaa ttgtacgtat acatatggat ctacgtatca attgttcatc tgtttgtgtt    2700

tgtatgtata cagatctgaa aacatcactt ctctcatctg attgtgttgt tacatacata    2760

gatatagatc tgttatatca ttttttttat taattgtgta tatatatatg tgcatagatc    2820

tggattacat gattgtgatt atttacatga ttttgttatt tacgtatgta tatatgtaga    2880

tctggacttt ttggagttgt tgacttgatt gtatttgtgt gtgtatatgt gtgttctgat    2940

cttgatatgt tatgtatgtg cagcccggat ctccgggtag gtcagtccct tatgttacgt    3000

cctgtagaaa ccccaacccg tgaaatcaaa aaactcgacg gcctgtgggc attcagtctg    3060

gatcgcgaaa actgtggaat tggtcagcgt tggtgggaaa gcgcgttaca agaaagccgg    3120

gcaattgctg tgccaggcag ttttaacgat cagttcgccg atgcagatat tcgtaattat    3180

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gtgatggagc atcagggcgg ctatacgcca tttgaagccg atgtcacgcc gtatgttatt    3360

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agcaattgct tttctgtagt ttataagtgt gtatatttta atttataact tttctaatat    3540

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tctgttgact ggcaggtggt ggccaatggt gatgtcagcg ttgaactgcg tgatgcggat    3840

caacaggtgg ttgcaactgg acaaggcact agcgggactt tgcaagtggt gaatccgcac    3900

ctctggcaac cgggtgaagg ttatctctat gaactgtgcg tcacagccaa aagccagaca    3960

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gcagatgaac atggcatcgt ggtgattgat gaaactgctg ctgtcggctt taacctctct    4260

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tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta tgattagagt    5220

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gaataatcgg atatttaaaa gggcgtgaaa aggtttatcc gttcgtccat ttgtatgtcc    5520

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gggatcaaga tctgatcaag agacaggatg aggatcgttt cgcatgattg aacaagatgg    5700

attgcacgca ggttctccgg ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg actgggcaca    5760

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gctatcgtgg ctggccacga cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg ttgtcactga    5940

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ccttgctcct gccgagaaag tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc tgcatacgct    6060

tgatccggct acctgcccat tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc gagcacgtac    6120

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catcgactgt ggccggctgg gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt tggctacccg    6360

tgatattgct gaagagcttg gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc tttacggtat    6420

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gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc    6660

taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc    6720

ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc    6780

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<210>2

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<212>DNA

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ttggatttgt ggtgatggga ttcgttggat tcttcgtgaa gctcgttttc atcccaatca    1620

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ggatgaattt cagctagttt ttttttttgg cttattgtct caaaagatta gtgctttgct    1920

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gtctaagaag cctgtgttgt atgttggtgg tggttgtttg aattctagcg atgaattggg    3660

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tttttgattt cacgggttgg ggtttctaca ggacgtaaca taagggactg acctacccgg    8580

gagatcttcg atttggtgta tcgagattgg ttatgaaatt cagatgctag tgtaatgtat    8640

tggtaatttg ggaagatata ataggaagca aggctattta tccatttctg aaaaggcgaa    8700

atggcgtcac cgcgagcgtc acgcgcattc cgttcttgct gtaaagcgtt gtttggtaca    8760

cttttgacta gcgaggcttg gcgtgtcagc gtatctattc aaaagtcgtt aatggctgcg    8820

gatcaagaaa aagttggaat agaaacagaa tacccgcgaa attcaggccc ggttgccatg    8880

tcctacacgc cgaaataaac gaccaaatta gtagaaaaat aaaaactgac tcggatactt    8940

acgtcacgtc ttgcgcactg atttgaaaaa tctccctcga tcgagaaaga gatcaatgtt    9000

gagctgcttc aaaagcaatg ggattgacca gctcgcggat cctacaggcc aaattcgctc    9060

ttagccgtac aatattactc accggtgcga tgccccccat cgtaggtgaa ggtggaaatt    9120

aatgatccat cttgagacca caggcccaca acagctacca gtttcctcaa gggtccacca    9180

aaaacgtaag cgcttacgta catggtcgat aagaaaaggc aatttgtaga tgttaacatc    9240

caacgtcgct ttcagggatc ctacaggcca aattcgctct tagccgtaca atattactca    9300

ccggtgcgat gccccccatc gtaggtgaag gtggaaatta atgatccatc ttgagaccac    9360

aggcccacaa cagctaccag tttcctcaag ggtccaccaa aaacgtaagc gcttacgtac    9420

atggtcgata agaaaaggca atttgtagat gttaacatcc aacgtcgctt tcagggatcc    9480

tacaggccaa attcgctctt agccgtacaa tattactcac cggtgcgatg ccccccatcg    9540

taggtgaagg tggaaattaa tgatccatct tgagaccaca ggcccacaac agctaccagt    9600

ttcctcaagg gtccaccaaa aacgtaagcg cttacgtaca tggtcgataa gaaaaggcaa    9660

tttgtagatg ttaacatcca acgtcgcttt cagggatccg cgagcttatc gataccgtcg    9720

aatctagagt cgacctgcag gcatgcaagc ttggcgcgcc ttaattaaag gaaactatca    9780

gtgtttgaca ggatatattg gcgggtaaac ctaagagaaa agagcgttta ttagaataac    9840

ggatatttaa aagggcgtga aaaggtttat ccgttcgtcc atttgtatgt gcatgccaac    9900

cacagggttc ccctcgggat caaagtactt tgatccaacc cctccgctgc tatagtgcag    9960

tcggcttctg acgttcagtg cagccgtctt ctgaaaacga catgtcgcac aagtcctaag   10020

ttacgcgaca ggctgccgcc ctgccctttt cctggcgttt tcttgtcgcg tgttttagtc   10080

gcataaagta gaatacttgc gactagaacc ggagacatta cgccatgaac aagagcgccg   10140

ccgctggcct gctgggctat gcccgcgtca gcaccgacga ccaggacttg accaaccaac   10200

gggccgaact gcacgcggcc ggctgcacca agctgttttc cgagaagatc accggcacca   10260

ggcgcgaccg cccggagctg gccaggatgc ttgaccacct acgccctggc gacgttgtga   10320

cagtgaccag gctagaccgc ctggcccgca gcacccgcga cctactggac attgccgagc   10380

gcatccagga ggccggcgcg ggcctgcgta gcctggcaga gccgtgggcc gacaccacca   10440

cgccggccgg ccgcatggtg ttgaccgtgt tcgccggcat tgccgagttc gagcgttccc   10500

taatcatcga ccgcacccgg agcgggcgcg aggccgccaa ggcccgaggc gtgaagtttg   10560

gcccccgccc taccctcacc ccggcacaga tcgcgcacgc ccgcgagctg atcgaccagg   10620

aaggccgcac cgtgaaagag gcggctgcac tgcttggcgt gcatcgctcg accctgtacc   10680

gcgcacttga gcgcagcgag gaagtgacgc ccaccgaggc caggcggcgc ggtgccttcc   10740

gtgaggacgc attgaccgag gccgacgccc tggcggccgc cgagaatgaa cgccaagagg   10800

aacaagcatg aaaccgcacc aggacggcca ggacgaaccg tttttcatta ccgaagagat   10860

cgaggcggag atgatcgcgg ccgggtacgt gttcgagccg cccgcgcacg tctcaaccgt   10920

gcggctgcat gaaatcctgg ccggtttgtc tgatgccaag ctggcggcct ggccggccag   10980

cttggccgct gaagaaaccg agcgccgccg tctaaaaagg tgatgtgtat ttgagtaaaa   11040

cagcttgcgt catgcggtcg ctgcgtatat gatgcgatga gtaaataaac aaatacgcaa   11100

ggggaacgca tgaaggttat cgctgtactt aaccagaaag gcgggtcagg caagacgacc   11160

atcgcaaccc atctagcccg cgccctgcaa ctcgccgggg ccgatgttct gttagtcgat   11220

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gttgtcggca tcgaccgccc gacgattgac cgcgacgtga aggccatcgg ccggcgcgac   11340

ttcgtagtga tcgacggagc gccccaggcg gcggacttgg ctgtgtccgc gatcaaggca   11400

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ctggtggagc tggttaagca gcgcattgag gtcacggatg gaaggctaca agcggccttt   11520

gtcgtgtcgc gggcgatcaa aggcacgcgc atcggcggtg aggttgccga ggcgctggcc   11580

gggtacgagc tgcccattct tgagtcccgt atcacgcagc gcgtgagcta cccaggcact   11640

gccgccgccg gcacaaccgt tcttgaatca gaacccgagg gcgacgctgc ccgcgaggtc   11700

caggcgctgg ccgctgaaat taaatcaaaa ctcatttgag ttaatgaggt aaagagaaaa   11760

tgagcaaaag cacaaacacg ctaagtgccg gccgtccgag cgcacgcagc agcaaggctg   11820

caacgttggc cagcctggca gacacgccag ccatgaagcg ggtcaacttt cagttgccgg   11880

cggaggatca caccaagctg aagatgtacg cggtacgcca aggcaagacc attaccgagc   11940

tgctatctga atacatcgcg cagctaccag agtaaatgag caaatgaata aatgagtaga   12000

tgaattttag cggctaaagg aggcggcatg gaaaatcaag aacaaccagg caccgacgcc  12060

gtggaatgcc ccatgtgtgg aggaacgggc ggttggccag gcgtaagcgg ctgggttgcc  12120

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aaccatccgg cccggtacaa atcggcgcgg cgctgggtga tgacctggtg gagaagttga  12240

aggccgcgca ggccgcccag cggcaacgca tcgaggcaga agcacgcccc ggtgaatcgt  12300

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tttcccatct aaccgaatcc atgaaccgat accgggaagg gaagggagac aagcccggcc  12660

gcgtgttccg tccacacgtt gcggacgtac tcaagttctg ccggcgagcc gatggcggaa  12720

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agcgtacgaa gaaggccaag aacggccgcc tggtgacggt atccgagggt gaagccttga  12840

ttagccgcta caagatcgta aagagcgaaa ccgggcggcc ggagtacatc gagatcgagc  12900

tagctgattg gatgtaccgc gagatcacag aaggcaagaa cccggacgtg ctgacggttc  12960

accccgatta ctttttgatc gatcccggca tcggccgttt tctctaccgc ctggcacgcc  13020

gcgccgcagg caaggcagaa gccagatggt tgttcaagac gatctacgaa cgcagtggca  13080

gcgccggaga gttcaagaag ttctgtttca ccgtgcgcaa gctgatcggg tcaaatgacc  13140

tgccggagta cgatttgaag gaggaggcgg ggcaggctgg cccgatccta gtcatgcgct  13200

accgcaacct gatcgagggc gaagcatccg ccggttccta atgtacggag cagatgctag  13260

ggcaaattgc cctagcaggg gaaaaaggtc gaaaaggtct ctttcctgtg gatagcacgt  13320

acattgggaa cccaaagccg tacattggga accggaaccc gtacattggg aacccaaagc  13380

cgtacattgg gaaccggtca cacatgtaag tgactgatat aaaagagaaa aaaggcgatt  13440

tttccgccta aaactcttta aaacttatta aaactcttaa aacccgcctg gcctgtgcat  13500

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gctccctacg ccccgccgct tcgcgtcggc ctatcgcggc cgctggccgc tcaaaaatgg  13620

ctggcctacg gccaggcaat ctaccagggc gcggacaagc cgcgccgtcg ccactcgacc  13680

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tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga  13800

caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggcgcagc catgacccag  13860

tcacgtagcg atagcggagt gtatactggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac  13920

tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca  13980

tcaggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc  14040

gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg  14100

caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt  14160

tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa  14220

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ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc  14340

cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg  14400

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tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag  14520

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agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga  14640

agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg  14700

gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag  14760

aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag  14820

ggctgatgaa tcccctaatg atttttatca aaatcattaa gttaaggtag atacacatct  14880

tgtcatatga tcaaatggtt tcgccaaaaa tcaataatca gacaacaaaa tgtgcgaact  14940

cgatatttta cacgactctc tttaccaatt ctgccccgaa ttacacttaa aacgactcaa  15000

cagcttaacg ttggcttgcc acgccttact tgactgtaaa actctcactc ttaccgaact  15060

tggccgtaac ctgccaacca aagcgagaac aaaacataac atcaaacgaa tcgaccgatt  15120

gttaggtaat cgtcacctcc acaaagagcg actcgctgta taccgttggc atgctagctt  15180

tatctgttcg ggcaatacga tgcccattgt acttgttgac tggtctgata tccgtgagca  15240

aaaacggctt atggtattgc gagcttcagt cgcactacac ggtcgttctg ttactcttta  15300

tgagaaagcg ttcccgcttt cagagcaatg ttcaaagaaa gctcatgacc aatttctagc  15360

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aggaaaagta caatatgcag acctaggagc ggaaaactgg aaacctatca gcaacttaca  15540

tgatatgtca tctagtcact caaagacttt aggctataag aggctgacta aaagcaatcc  15600

aatctcatgc caaattctat tgtataaatc tcgctctaaa ggccgaaaaa atcagcgctc  15660

gacacggact cattgtcacc acccgtcacc taaaatctac tcagcgtcgg caaaggagcc  15720

atggattcta gcaactaact tacctgttga aattcgaaca cccaaacaac ttgttaatat  15780

ctattcgaag cgaatgcaga ttgaagaaac cttccgagac ttgaaaagtc ctgcctacgg  15840

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cgccctgatg cttcaactaa catgttggct tgcgggcgtt catgctcaga aacaaggttg  15960

ggacaagcac ttccaggcta acacagtcag aaatcgaaac gtactctcaa cagttcgctt  16020

aggcatggaa gttttgcggc attctggcta cacaataaca agggaagact tactcgtggc  16080

tgcaacccta ctagctcaaa atttattcac acatggttac gctttgggga aattatgagg  16140

ggatctctca gcgttaaggg attttggtca tgcattctag gtactaaaac aattcatcca  16200

gtaaaatata atattttatt ttctcccaat caggcttgat ccccagtaag tcaaaaaata  16260

gctcgacata ctgttcttcc ccgatatcct ccctgatcga ccggacgcag aaggcaatgt  16320

cataccactt gtccgccctg ccgcttctcc caagatcaat aaagccactt actttgccat  16380

ctttcacaaa gatgttgctg tctcccaggt cgccgtggga aaagacaagt tcctcttcgg  16440

gcttttccgt ctttaaaaaa tcatacagct cgcgcggatc tttaaatgga gtgtcttctt  16500

cccagttttc gcaatccaca tcggccagat cgttattcag taagtaatcc aattcggcta  16560

agcggctgtc taagctattc gtatagggac aatccgatat gtcgatggag tgaaagagcc  16620

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ccgagcaaag gacgccatcg gcctcactca tgagcagatt gctccagcca tcatgccgtt  16740

caaagtgcag gacctttgga acaggcagct ttccttccag ccatagcatc atgtcctttt  16800

cccgttccac atcataggtg gtccctttat accggctgtc cgtcattttt aaatataggt  16860

tttcattttc tcccaccagc ttatatacct tagcaggaga cattccttcc gtatctttta  16920

cgcagcggta tttttcgatc agttttttca attccggtga tattctcatt ttagccattt  16980

attatttcct tcctcttttc tacagtattt aaagataccc caagaagcta attataacaa  17040

gacgaactcc aattcactgt tccttgcatt ctaaaacctt aaataccaga aaacagcttt  17100

ttcaaagttg ttttcaaagt tggcgtataa catagtatcg acggagccga ttttgaaacc  17160

gcggtgatca caggcagcaa cgctctgtca tcgttacaat caacatgcta ccctccgcga  17220

gatcatccgt gtttcaaacc cggcagctta gttgccgttc ttccgaatag catcggtaac  17280

atgagcaaag tctgccgcct tacaacggct ctcccgctga cgccgtcccg gactgatggg  17340

ctgcctgtat cgagtggtga ttttgtgccg agctgccggt cggggagctg ttggct    17396

<210>3

<211>11070

<212>DNA

<213>载体pBPSLMO03

<400>3

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ccagagtaaa tgagcaaatg aataaatgag tagatgaatt ttagcggcta aaggaggcgg   2100

catggaaaat caagaacaac caggcaccga cgccgtggaa tgccccatgt gtggaggaac   2160

gggcggttgg ccaggcgtaa gcggctgggt tgtctgccgg ccctgcaatg gcactggaac   2220

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gcatcatgga cgtggccgtt ttccgtctgt cgaagcgtga ccgacgagct ggcgaggtga    2580

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ggttgttcaa gacgatctac gaacgcagtg gcagcgccgg agagttcaag aagttctgtt    3180

tcaccgtgcg caagctgatc gggtcaaatg acctgccgga gtacgatttg aaggaggagg    3240

cggggcaggc tggcccgatc ctagtcatgc gctaccgcaa cctgatcgag ggcgaagcat    3300

ccgccggttc ctaatgtacg gagcagatgc tagggcaaat tgccctagca ggggaaaaag    3360

gtcgaaaagg tctctttcct gtggatagca cgtacattgg gaacccaaag ccgtacattg    3420

ggaaccggaa cccgtacatt gggaacccaa agccgtacat tgggaaccgg tcacacatgt    3480

aagtgactga tataaaagag aaaaaaggcg atttttccgc ctaaaactct ttaaaactta    3540

ttaaaactct taaaacccgc ctggcctgtg cataactgtc tggccagcgc acagccgaag    3600

agctgcaaaa agcgcctacc cttcggtcgc tgcgctccct acgccccgcc gcttcgcgtc    3660

ggcctatcgc ggccgctggc cgctcaaaaa tggctggcct acggccaggc aatctaccag    3720

ggcgcggaca agccgcgccg tcgccactcg accgccggcg cccacatcaa ggcaccctgc    3780

ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc    3840

acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt    3900

gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacc cagtcacgta gcgatagcgg agtgtatact    3960

ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa    4020

taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca    4080

ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg    4140

taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc    4200

agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc    4260

cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac    4320

tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc    4380

tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata    4440

gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc    4500

acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca    4560

acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag    4620

cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta    4680

gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg    4740

gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc    4800

agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt    4860

ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgcat tctaggtact    4920

aaaacaattc atccagtaaa atataatatt ttattttctc ccaatcaggc ttgatcccca    4980

gtaagtcaaa aaatagctcg acatactgtt cttccccgat atcctccctg atcgaccgga    5040

cgcagaaggc aatgtcatac cacttgtccg ccctgccgct tctcccaaga tcaataaagc    5100

cacttacttt gccatctttc acaaagatgt tgctgtctcc caggtcgccg tgggaaaaga    5160

caagttcctc ttcgggcttt tccgtcttta aaaaatcata cagctcgcgc ggatctttaa    5220

atggagtgtc ttcttcccag ttttcgcaat ccacatcggc cagatcgtta ttcagtaagt    5280

aatccaattc ggctaagcgg ctgtctaagc tattcgtata gggacaatcc gatatgtcga    5340

tggagtgaaa gagcctgatg cactccgcat acagctcgat aatcttttca gggctttgtt    5400

catcttcata ctcttccgag caaaggacgc catcggcctc actcatgagc agattgctcc    5460

agccatcatg ccgttcaaag tgcaggacct ttggaacagg cagctttcct tccagccata    5520

gcatcatgtc cttttcccgt tccacatcat aggtggtccc tttataccgg ctgtccgtca    5580

tttttaaata taggttttca ttttctccca ccagcttata taccttagca ggagacattc    5640

cttccgtatc ttttacgcag cggtattttt cgatcagttt tttcaattcc ggtgatattc    5700

tcattttagc catttattat ttccttcctc ttttctacag tatttaaaga taccccaaga    5760

agctaattat aacaagacga actccaattc actgttcctt gcattctaaa accttaaata    5820

ccagaaaaca gctttttcaa agttgttttc aaagttggcg tataacatag tatcgacgga    5880

gccgattttg aaaccgcggt gatcacaggc agcaacgctc tgtcatcgtt acaatcaaca    5940

tgctaccctc cgcgagatca tccgtgtttc aaacccggca gcttagttgc cgttcttccg    6000

aatagcatcg gtaacatgag caaagtctgc cgccttacaa cggctctccc gctgacgccg    6060

tcccggactg atgggctgcc tgtatcgagt ggtgattttg tgccgagctg ccggtcgggg    6120

agctgttggc tggctggtgg caggatatat tgtggtgtaa acaaattgac gcttagacaa    6180

cttaataaca cattgcggac gtttttaatg tactgaatta acgccgaatt aagcttggac    6240

aatcagtaaa ttgaacggag aatattattc ataaaaatac gatagtaacg ggtgatatat    6300

tcattagaat gaaccgaaac cggcggtaag gatctgagct acacatgctc aggtttttta    6360

caacgtgcac aacagaattg aaagcaaata tcatgcgatc ataggcgtct cgcatatctc    6420

attaaagcag ggcatgccgg tcgagtcaaa tctcggtgac gggcaggacc ggacggggcg    6480

gtaccggcag gctgaagtcc agctgccaga aacccacgtc atgccagttc ccgtgcttga    6540

agccggccgc ccgcagcatg ccgcgggggg catatccgag cgcctcgtgc atgcgcacgc    6600

tcgggtcgtt gggcagcccg atgacagcga ccacgctctt gaagccctgt gcctccaggg    6660

acttcagcag gtgggtgtag agcgtggagc ccagtcccgt ccgctggtgg cggggggaga    6720

cgtacacggt cgactcggcc gtccagtcgt aggcgttgcg tgccttccag gggcccgcgt    6780

aggcgatgcc ggcgacctcg ccgtccacct cggcgacgag ccagggatag cgctcccgca    6840

gacggacgag gtcgtccgtc cactcctgcg gttcctgcgg ctcggtacgg aagttgaccg    6900

tgcttgtctc gatgtagtgg ttgacgatgg tgcagaccgc cggcatgtcc gcctcggtgg    6960

cacggcggat gtcggccggg cgtcgttctg ggctcatggt agactcgacg gatccacgtg    7020

tggaagatat gaattttttt gagaaactag ataagattaa tgaatatcgg tgttttggtt    7080

ttttcttgtg gccgtctttg tttatattga gatttttcaa atcagtgcgc aagacgtgac    7140

gtaagtatcc gagtcagttt ttatttttct actaatttgg tcgaagcttt gggcggatcc    7200

tctagattcg acggtatcga taagctcgcg gatccctgaa agcgacgttg gatgttaaca    7260

tctacaaatt gccttttctt atcgaccatg tacgtaagcg cttacgtttt tggtggaccc    7320

ttgaggaaac tggtagctgt tgtgggcctg tggtctcaag atggatcatt aatttccacc    7380

ttcacctacg atggggggca tcgcaccggt gagtaatatt gtacggctaa gagcgaattt    7440

ggcctgtagg atccctgaaa gcgacgttgg atgttaacat ctacaaattg ccttttctta    7500

tcgaccatgt acgtaagcgc ttacgttttt ggtggaccct tgaggaaact ggtagctgtt    7560

gtgggcctgt ggtctcaaga tggatcatta atttccacct tcacctacga tggggggcat    7620

cgcaccggtg agtaatattg tacggctaag agcgaatttg gcctgtagga tccctgaaag    7680

cgacgttgga tgttaacatc tacaaattgc cttttcttat cgaccatgta cgtaagcgct    7740

tacgtttttg gtggaccctt gaggaaactg gtagctgttg tgggcctgtg gtctcaagat    7800

ggatcattaa tttccacctt cacctacgat ggggggcatc gcaccggtga gtaatattgt    7860

acggctaaga gcgaatttgg cctgtaggat ccgcgagctg gtcaatccca ttgcttttga    7920

agcagctcaa cattgatctc tttctcgatc gagggagatt tttcaaatca gtgcgcaaga    7980

cgtgacgtaa gtatccgagt cagtttttat ttttctacta atttggtcgt ttatttcggc    8040

gtgtaggaca tggcaaccgg gcctgaattt cgcgggtatt ctgtttctat tccaactttt    8100

tcttgatccg cagccattaa cgacttttga atagatacgc tgacacgcca agcctcgcta    8160

gtcaaaagtg taccaaacaa cgctttacag caagaacgga atgcgcgtga cgctcgcggt    8220

gacgccattt cgccttttca gaaatggata aatagccttg cttcctatta tatcttccca    8280

aattaccaat acattacact agcatctgaa tttcataacc aatctcgata caccaaatcg    8340

aagatctccc gggtggtcag tcccttatgt tacgtcctgt agaaacccca acccgtgaaa    8400

tcaaaaaact cgacggcctg tgggcattca gtctggatcg cgaaaactgt ggaattgatc    8460

agcgttggtg ggaaagcgcg ttacaagaaa gccgggcaat tgctgtgcca ggcagtttta    8520

acgatcagtt cgccgatgca gatattcgta attatgcggg caacgtctgg tatcagcgcg    8580

aagtctttat accgaaaggt tgggcaggcc agcgtatcgt gctgcgtttc gatgcggtca    8640

ctcattacgg caaagtgtgg gtcaataatc aggaagtgat ggagcatcag ggcggctata    8700

cgccatttga agccgatgtc acgccgtatg ttattgccgg gaaaagtgta cgtaagtttc    8760

tgcttctacc tttgatatat atataataat tatcattaat tagtagtaat ataatatttc    8820

aaatattttt ttcaaaataa aagaatgtag tatatagcaa ttgcttttct gtagtttata    8880

agtgtgtata ttttaattta taacttttct aatatatgac caaaatttgt tgatgtgcag    8940

gtatcaccgt ttgtgtgaac aacgaactga actggcagac tatcccgccg ggaatggtga    9000

ttaccgacga aaacggcaag aaaaagcagt cttacttcca tgatttcttt aactatgccg    9060

gaatccatcg cagcgtaatg ctctacacca cgccgaacac ctgggtggac gatatcaccg    9120

tggtgacgca tgtcgcgcaa gactgtaacc acgcgtctgt tgactggcag gtggtggcca    9180

atggtgatgt cagcgttgaa ctgcgtgatg cggatcaaca ggtggttgca actggacaag    9240

gcactagcgg gactttgcaa gtggtgaatc cgcacctctg gcaaccgggt gaaggttatc    9300

tctatgaact gtgcgtcaca gccaaaagcc agacagagtg tgatatctac ccgcttcgcg    9360

tcggcatccg gtcagtggca gtgaagggcc aacagttcct gattaaccac aaaccgttct    9420

actttactgg ctttggtcgt catgaagatg cggacttacg tggcaaagga ttcgataacg    9480

tgctgatggt gcacgaccac gcattaatgg actggattgg ggccaactcc taccgtacct    9540

cgcattaccc ttacgctgaa gagatgctcg actgggcaga tgaacatggc atcgtggtga    9600

ttgatgaaac tgctgctgtc ggctttaacc tctctttagg cattggtttc gaagcgggca    9660

acaagccgaa agaactgtac agcgaagagg cagtcaacgg ggaaactcag caagcgcact    9720

tacaggcgat taaagagctg atagcgcgtg acaaaaacca cccaagcgtg gtgatgtgga    9780

gtattgccaa cgaaccggat acccgtccgc aagtgcacgg gaatatttcg ccactggcgg    9840

aagcaacgcg taaactcgac ccgacgcgtc cgatcacctg cgtcaatgta atgttctgcg    9900

acgctcacac cgataccatc agcgatctct ttgatgtgct gtgcctgaac cgttattacg    9960

gatggtatgt ccaaagcggc gatttggaaa cggcagagaa ggtactggaa aaagaacttc   10020

tggcctggca ggagaaactg catcagccga ttatcatcac cgaatacggc gtggatacgt   10080

tagccgggct gcactcaatg tacaccgaca tgtggagtga agagtatcag tgtgcatggc   10140

tggatatgta tcaccgcgtc tttgatcgcg tcagcgccgt cgtcggtgaa caggtatgga   10200

atttcgccga ttttgcgacc tcgcaaggca tattgcgcgt tggcggtaac aagaaaggga   10260

tcttcactcg cgaccgcaaa ccgaagtcgg cggcttttct gctgcaaaaa cgctggactg   10320

gcatgaactt cggtgaaaaa ccgcagcagg gaggcaaaca atgaatcaac aactctcctg  10380

gcgcaccatc gtcggctaca gcctcgggaa ttgctaccga gctcgaattt ccccgatcgt  10440

tcaaacattt ggcaataaag tttcttaaga ttgaatcctg ttgccggtct tgcgatgatt  10500

atcatataat ttctgttgaa ttacgttaag catgtaataa ttaacatgta atgcatgacg  10560

ttatttatga gatgggtttt tatgattaga gtcccgcaat tatacattta atacgcgata  10620

gaaaacaaaa tatagcgcgc aaactaggat aaattatcgc gcgcggtgtc atctatgtta  10680

ctagatcggg aattggcatg caagcttggc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg  10740

ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg  10800

gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg  10860

cgaatgctag agcagcttga gcttggatca gattgtcgtt tcccgccttc agtttaaact  10920

atcagtgttt gacaggatat attggcgggt aaacctaaga gaaaagagcg tttattagaa  10980

taacggatat ttaaaagggc gtgaaaaggt ttatccgttc gtccatttgt atgtgcatgc  11040

caaccacagg gttcccctcg ggatcaaagt                                   11070

Claims (68)

1.用于产生转基因大豆植物的方法，包括步骤：

(a)提供大豆幼苗的初生叶节或更高叶节的腋生分生组织，和

(b)将所述腋生分生组织与含转基因T-DNA的农杆菌共培养，所述转基因T-DNA含有至少一个农业有价值性状的表达盒和一个或多个选择性标记基因，和

(c)转移所述共培养的腋生分生组织到芽诱导培养基中，所述培养基包含

(i)至少一种植物生长因子，其浓度适于从所述腋生分生组织引起从头的芽诱导，和

(ii)一种或多种选择化合物，该选择化合物与(b)的选择性标记基因组合使得能够鉴别和/或选择含有所述选择性基因的植物细胞、组织或植物，和/或

(iii)一种或多种适用于抑制农杆菌生长的抗生素，

并培养所述共培养的腋生分生组织直至从其诱导和发育出芽，并分离所述芽，和

(d)将所述分离的芽转移至生根培养基，并在所述生根培养基中培养所述芽直至所述芽已形成根，并进一步使这样衍生的小植株再生成为基因组中含有插入的T-DNA的成熟植物，所述T-DNA含有至少一个农业有价值性状的植物表达盒，和所述至少一个选择性标记基因。

2.权利要求1的方法，其中所述方法还包括一个或多个选自下列的附加步骤：

(a1)在共培养之前、期间或紧接其后创伤外植体，和

(b1)在步骤(b)之后转移所述共培养的腋生分生组织至包含至少一种适于抑制农杆菌生长的抗生素和至少一种植物生长因子的培养基中，其中所述培养基包含与(b)的选择性标记基因组合使得能够鉴别和/或选择含有所述选择性标记基因的植物细胞、器官或植物的选择化合物，和，

(b2)在步骤(b)和(b1)之后在含有至少一种植物生长因子的芽诱导培养基中进一步孵育所述腋生分生组织，其中所述芽诱导培养基包含与(b)的选择性标记基因组合使得能够鉴别和/或选择含有所述选择性标记基因的植物细胞、器官或植物的选择化合物，和

(c1)在步骤(c)之后转移所述芽至芽伸长培养基中，该培养基包含

(i)至少一种植物生长因子，其浓度适于使芽伸长，和

(ii)一种或多种与(b)的选择性标记基因组合使得能够鉴别和/或选择含有所述选择性标记基因的植物细胞、器官或植物的选择化合物，和在所述芽伸长培养基中培养直至所述芽已伸长到至少2cm长。

3.权利要求1或2的方法，其中初级节或更高节的腋生分生组织以选自下组的形式被提供：

a)由基本完整的幼苗提供幼苗腋生分生组织，和

b)通过以保留腋生分生组织连接于叶柄的方式切下初生叶或更高叶以提供叶的腋生分生组织，和

c)增殖的腋生分生组织，

其中基本完整的幼苗选自下列材料：

a)完整的幼苗，和

b)被除去根的幼苗，和

c)被除去一个子叶或两个子叶的幼苗，和

d)被除去根和一个子叶或两个子叶的幼苗，和

e)被除去根、两个子叶和部分的上胚轴留下连接于部分上胚轴的腋生分生组织的幼苗。

4.权利要求1或2的方法，其中大豆幼苗是在外植体产生之前4到10天被萌发。

5.权利要求1或2的方法，其中步骤(b)、(b1)、(b2)和/或(c)的至少一个步骤的培养基包含细胞分裂素。

6.权利要求3的方法，其中步骤(b)、(b1)、(b2)和/或(c)的至少一个步骤的培养基包含细胞分裂素。

7.权利要求4的方法，其中步骤(b)、(b1)、(b2)和/或(c)的至少一个步骤的培养基包含细胞分裂素。

8.权利要求5的方法，其中细胞分裂素是浓度在1μM和10μM之间的6-苄基氨基嘌呤。

9.权利要求6的方法，其中细胞分裂素是浓度在1μM和10μM之间的6-苄基氨基嘌呤。

10.权利要求7的方法，其中细胞分裂素是浓度在1μM和10μM之间的6-苄基氨基嘌呤。

11.权利要求1或2的方法，其中步骤(b)、(b1)、(b2)、(c)和/或(c1)的至少一个步骤的培养基包含在0.1μM和2μM之间的赤霉酸。

12.权利要求1或2的方法，其中步骤(b)、(b1)、(b2)和(c)的至少一个步骤的培养基包含至少一种硫醇类化合物。

13.权利要求3的方法，其中步骤(b)、(b1)、(b2)和(c)的至少一个步骤的培养基包含至少一种硫醇类化合物。

14.权利要求4的方法，其中步骤(b)、(b1)、(b2)和(c)的至少一个步骤的培养基包含至少一种硫醇类化合物。

15.权利要求5的方法，其中步骤(b)、(b1)、(b2)和(c)的至少一个步骤的培养基包含至少一种硫醇类化合物。

16.权利要求6的方法，其中步骤(b)、(b1)、(b2)和(c)的至少一个步骤的培养基包含至少一种硫醇类化合物。

17.权利要求7的方法，其中步骤(b)、(b1)、(b2)和(c)的至少一个步骤的培养基包含至少一种硫醇类化合物。

18.权利要求8的方法，其中步骤(b)、(b1)、(b2)和(c)的至少一个步骤的培养基包含至少一种硫醇类化合物。

19.权利要求9的方法，其中步骤(b)、(b1)、(b2)和(c)的至少一个步骤的培养基包含至少一种硫醇类化合物。

20.权利要求10的方法，其中步骤(b)、(b1)、(b2)和(c)的至少一个步骤的培养基包含至少一种硫醇类化合物。

21.权利要求11的方法，其中步骤(b)、(b1)、(b2)和(c)的至少一个步骤的培养基包含至少一种硫醇类化合物。

22.权利要求12的方法，其中所述硫醇类化合物是浓度在1mM和10mM之间的L-半胱氨酸，浓度在0.1mM到5mM之间的二硫苏糖醇，和/或浓度在0.1mM到5mM之间的硫代硫酸钠。

23.权利要求13的方法，其中所述硫醇类化合物是浓度在1mM和10mM之间的L-半胱氨酸，浓度在0.1mM到5mM之间的二硫苏糖醇，和/或浓度在0.1mM到5mM之间的硫代硫酸钠。

24.权利要求14的方法，其中所述硫醇类化合物是浓度在1mM和10mM之间的L-半胱氨酸，浓度在0.1mM到5mM之间的二硫苏糖醇，和/或浓度在0.1mM到5mM之间的硫代硫酸钠。

25.权利要求15的方法，其中所述硫醇类化合物是浓度在1mM和10mM之间的L-半胱氨酸，浓度在0.1mM到5mM之间的二硫苏糖醇，和/或浓度在0.1mM到5mM之间的硫代硫酸钠。

26.权利要求16的方法，其中所述硫醇类化合物是浓度在1mM和10mM之间的L-半胱氨酸，浓度在0.1mM到5mM之间的二硫苏糖醇，和/或浓度在0.1mM到5mM之间的硫代硫酸钠。

27.权利要求17的方法，其中所述硫醇类化合物是浓度在1mM和10mM之间的L-半胱氨酸，浓度在0.1mM到5mM之间的二硫苏糖醇，和/或浓度在0.1mM到5mM之间的硫代硫酸钠。

28.权利要求18的方法，其中所述硫醇类化合物是浓度在1mM和10mM之间的L-半胱氨酸，浓度在0.1mM到5mM之间的二硫苏糖醇，和/或浓度在0.1mM到5mM之间的硫代硫酸钠。

29.权利要求19的方法，其中所述硫醇类化合物是浓度在1mM和10mM之间的L-半胱氨酸，浓度在0.1mM到5mM之间的二硫苏糖醇，和/或浓度在0.1mM到5mM之间的硫代硫酸钠。

30.权利要求20的方法，其中所述硫醇类化合物是浓度在1mM和10mM之间的L-半胱氨酸，浓度在0.1mM到5mM之间的二硫苏糖醇，和/或浓度在0.1mM到5mM之间的硫代硫酸钠。

31.权利要求21的方法，其中所述硫醇类化合物是浓度在1mM和10mM之间的L-半胱氨酸，浓度在0.1mM到5mM之间的二硫苏糖醇，和/或浓度在0.1mM到5mM之间的硫代硫酸钠。

32.权利要求1或2的方法，其中步骤(c1)和/或(d)的至少一个步骤的培养基包含0.01mg/l和1mg/l之间的吲哚乙酸，和/或0.1μM和4μM之间的赤霉酸和/或0.5μM和6μM之间的玉米素核糖核苷酸。

33.权利要求1或2的方法，其中农杆菌是选自包括去臂的根癌农杆菌和发根农杆菌组成的组的菌株。

34.权利要求33的方法，其中农杆菌菌株是去臂的发根农杆菌K599菌株。

35.用于产生转基因大豆植物的方法，包括步骤：

(a)提供大豆幼苗的初生叶节或更高叶节的腋生分生组织，和

(b)将所述腋生分生组织与含转基因T-DNA的农杆菌共培养，所述转基因T-DNA含有至少一个农业有价值性状的表达盒和一个或多个选择性标记基因，和

(c)转移所述共培养的腋生分生组织到芽诱导培养基中，所述培养基包含

(i)至少一种植物生长因子，其浓度适于从所述腋生分生组织引起从头的芽诱导，和

(ii)一种或多种适用于抑制农杆菌生长的抗生素，

并培养所述共培养的腋生分生组织直至从其诱导和发育出芽，并分离所述芽，和

(d)将所述分离的芽转移至生根培养基，并在所述生根培养基中培养所述芽直至所述芽已形成根，并进一步使这样衍生的小植株再生成为基因组中含有插入的T-DNA的成熟植物，所述T-DNA含有至少一个农业有价值性状的植物表达盒，和所述至少一个选择性标记基因。

36.权利要求35的方法，其中所述方法还包括一个或多个选自下列的附加步骤：

(a1)在共培养之前、期间或紧接其后创伤外植体，和

(b1)在步骤(b)之后转移所述共培养的腋生分生组织至包含至少一种适于抑制农杆菌生长的抗生素和至少一种植物生长因子的培养基中，其中所述培养基包含与(b)的选择性标记基因组合使得能够鉴别和/或选择含有所述选择性标记基因的植物细胞、器官或植物的选择化合物，和，

(b2)在步骤(b)和(b1)之后在含有至少一种植物生长因子的芽诱导培养基中进一步孵育所述腋生分生组织，其中所述芽诱导培养基包含与(b)的选择性标记基因组合使得能够鉴别和/或选择含有所述选择性标记基因的植物细胞、器官或植物的选择化合物，和

(c1)在步骤(c)之后转移所述芽至芽伸长培养基中，该培养基包含

(i)至少一种植物生长因子，其浓度适于使芽伸长，和

(ii)一种或多种与(b)的选择性标记基因组合使得能够鉴别和/或选择含有所述选择性标记基因的植物细胞、器官或植物的选择化合物，和在所述芽伸长培养基中培养直至所述芽已伸长到至少2cm长。

37.权利要求35或36的方法，其中初级节或更高节的腋生分生组织以选自下组的形式被提供：

a)由基本完整的幼苗提供幼苗腋生分生组织，和

b)通过以保留腋生分生组织连接于叶柄的方式切下初生叶或更高叶以提供叶的腋生分生组织，和

c)增殖的腋生分生组织，

其中基本完整的幼苗选自下列材料：

a)完整的幼苗，和

b)被除去根的幼苗，和

c)被除去一个子叶或两个子叶的幼苗，和

d)被除去根和一个子叶或两个子叶的幼苗，和

e)被除去根、两个子叶和部分的上胚轴留下连接于部分上胚轴的腋生分生组织的幼苗。

38.权利要求35或36的方法，其中大豆幼苗是在外植体产生之前4到10天被萌发。

39.权利要求35或36的方法，其中步骤(b)、(b1)、(b2)和/或(c)的至少一个步骤的培养基包含细胞分裂素。

40.权利要求37的方法，其中步骤(b)、(b1)、(b2)和/或(c)的至少一个步骤的培养基包含细胞分裂素。

41.权利要求38的方法，其中步骤(b)、(b1)、(b2)和/或(c)的至少一个步骤的培养基包含细胞分裂素。

42.权利要求39的方法，其中细胞分裂素是浓度在1μM和10μM之间的6-苄基氨基嘌呤。

43.权利要求40的方法，其中细胞分裂素是浓度在1μM和10μM之间的6-苄基氨基嘌呤。

44.权利要求41的方法，其中细胞分裂素是浓度在1μM和10μM之间的6-苄基氨基嘌呤。

45.权利要求35或36的方法，其中步骤(b)、(b1)、(b2)、(c)和/或(c1)的至少一个步骤的培养基包含在0.1μM和2μM之间的赤霉酸。

46.权利要求35或36的方法，其中步骤(b)、(b1)、(b2)和(c)的至少一个步骤的培养基包含至少一种硫醇类化合物。

47.权利要求37的方法，其中步骤(b)、(b1)、(b2)和(c)的至少一个步骤的培养基包含至少一种硫醇类化合物。

48.权利要求38的方法，其中步骤(b)、(b1)、(b2)和(c)的至少一个步骤的培养基包含至少一种硫醇类化合物。

49.权利要求39的方法，其中步骤(b)、(b1)、(b2)和(c)的至少一个步骤的培养基包含至少一种硫醇类化合物。

50.权利要求40的方法，其中步骤(b)、(b1)、(b2)和(c)的至少一个步骤的培养基包含至少一种硫醇类化合物。

51.权利要求41的方法，其中步骤(b)、(b1)、(b2)和(c)的至少一个步骤的培养基包含至少一种硫醇类化合物。

52.权利要求42的方法，其中步骤(b)、(b1)、(b2)和(c)的至少一个步骤的培养基包含至少一种硫醇类化合物。

53.权利要求43的方法，其中步骤(b)、(b1)、(b2)和(c)的至少一个步骤的培养基包含至少一种硫醇类化合物。

54.权利要求44的方法，其中步骤(b)、(b1)、(b2)和(c)的至少一个步骤的培养基包含至少一种硫醇类化合物。

55.权利要求45的方法，其中步骤(b)、(b1)、(b2)和(c)的至少一个步骤的培养基包含至少一种硫醇类化合物。

56.权利要求46的方法，其中所述硫醇类化合物是浓度在1mM和10mM之间的L-半胱氨酸，浓度在0.1mM到5mM之间的二硫苏糖醇，和/或浓度在0.1mM到5mM之间的硫代硫酸钠。

57.权利要求47的方法，其中所述硫醇类化合物是浓度在1mM和10mM之间的L-半胱氨酸，浓度在0.1mM到5mM之间的二硫苏糖醇，和/或浓度在0.1mM到5mM之间的硫代硫酸钠。

58.权利要求48的方法，其中所述硫醇类化合物是浓度在1mM和10mM之间的L-半胱氨酸，浓度在0.1mM到5mM之间的二硫苏糖醇，和/或浓度在0.1mM到5mM之间的硫代硫酸钠。

59.权利要求49的方法，其中所述硫醇类化合物是浓度在1mM和10mM之间的L-半胱氨酸，浓度在0.1mM到5mM之间的二硫苏糖醇，和/或浓度在0.1mM到5mM之间的硫代硫酸钠。

60.权利要求50的方法，其中所述硫醇类化合物是浓度在1mM和10mM之间的L-半胱氨酸，浓度在0.1mM到5mM之间的二硫苏糖醇，和/或浓度在0.1mM到5mM之间的硫代硫酸钠。

61.权利要求51的方法，其中所述硫醇类化合物是浓度在1mM和10mM之间的L-半胱氨酸，浓度在0.1mM到5mM之间的二硫苏糖醇，和/或浓度在0.1mM到5mM之间的硫代硫酸钠。

62.权利要求52的方法，其中所述硫醇类化合物是浓度在1mM和10mM之间的L-半胱氨酸，浓度在0.1mM到5mM之间的二硫苏糖醇，和/或浓度在0.1mM到5mM之间的硫代硫酸钠。

63.权利要求53的方法，其中所述硫醇类化合物是浓度在1mM和10mM之间的L-半胱氨酸，浓度在0.1mM到5mM之间的二硫苏糖醇，和/或浓度在0.1mM到5mM之间的硫代硫酸钠。

64.权利要求54的方法，其中所述硫醇类化合物是浓度在1mM和10mM之间的L-半胱氨酸，浓度在0.1mM到5mM之间的二硫苏糖醇，和/或浓度在0.1mM到5mM之间的硫代硫酸钠。

65.权利要求55的方法，其中所述硫醇类化合物是浓度在1mM和10mM之间的L-半胱氨酸，浓度在0.1mM到5mM之间的二硫苏糖醇，和/或浓度在0.1mM到5mM之间的硫代硫酸钠。

66.权利要求35或36的方法，其中步骤(c1)和/或(d)的至少一个步骤的培养基包含0.01mg/l和1mg/l之间的吲哚乙酸，和/或0.1μM和4μM之间的赤霉酸和/或0.5μM和6μM之间的玉米素核糖核苷酸。

67.权利要求35或36的方法，其中农杆菌是选自包括去臂的根癌农杆菌和发根农杆菌组成的组的菌株。

68.权利要求67的方法，其中农杆菌菌株是去臂的发根农杆菌K599菌株。

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