JP3830649B2 - 蛋白多糖体００４１ - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は免疫増強性抗腫瘍活性を有する蛋白多糖体００４１に関するものである。
本発明の蛋白多糖体００４１は、免疫増強性抗腫瘍活性を発揮するので、抗腫瘍剤や免疫増強組成物としてきわめて有用である。
【０００２】
【従来の技術】
従来、アガリクス・ブラゼイ（Agaricus blazei）は、子実体が人工栽培によって生産され、乾燥し、その乾燥子実体が機能性食品として大量に販売されている。
アガリクス・ブラゼイの乾燥子実体は、煎じた液（熱水抽出物）が免疫増強などの薬効の期待をもって飲用されているのである。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
アガリクス・ブラゼイの子実体の生産は、種菌の培養から栽培による子実体の生成までかなりの時間がかかり、生産効率も低く、販売価格はかなり高いものとなっている。
また、アガリクス・ブラゼイの変異種類も多く、薬効も多種にわたり、全般的に均一性に欠けるきらいがあった。
本発明では、アガリクス・ブラゼイの子実体ではなく、培養菌糸体において、薬効にすぐれ、安定した生産性を示すヒメマツタケ新菌株の探索及びその培養菌糸体から新たな免疫増強物質を単離することを目的とした。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ブラジル原産の多数のアガリクス・ブラゼイ子実体から、菌糸の生育が著じるしく良い菌株を多数単離し、それぞれについて液体培養を行い、得られた菌糸体から熱水抽出し、単離した物質について抗腫瘍性を調べたところ、１菌株のみに他の菌株よりすぐれた免疫増強性抗腫瘍活性があることを認め、本発明を完成するに至った。
【０００５】
本発明においては、新たに分離した１菌株をAgaricus blazei Mullil 0041と命名し、また、この菌株が生産する免疫増強性抗腫瘍活性物質を蛋白多糖体００４１と名付けた。
【０００６】
Agaricus blazei Mullil 0041は生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−６２１０として寄託されている。
Agaricus blazei Mullil 0041の菌学的性質は次に示される。
１．ＭＹ寒天培地（モルツエキス３０ｇ、イーストエキス５ｇ、寒天９ｇ、蒸留水１０００ｍｌ）で、２７℃で良く生育する。菌体は白色で密に生育し、シャーレ背面は薄いクリーム色を呈する。菌糸は放射状に伸長するが、シイタケなどの担子菌の二核菌糸にみられるクランプ・コネクションを形成しての伸長生長と異なり、菌糸の一部が二方向に分枝し、樹枝状に伸長生長する。長期間の培養で一部菌糸束を形成するが、シャーレでの子実体形成はなく、また無性胞子は観察されない。
２．バレイショ・ブドウ糖寒天培地でもよく生育し、上記１と同じ性質を示す。
３．液体培地（グルコース５０ｇ、イーストエキス５ｇ、モルツエキス３０ｇ、あと蒸留水で１Ｌとする）の２７℃振とう培養で菌糸がよく生育し、菌糸中に蛋白多糖体００４１を多量に生成する。
【０００７】
Agaricus blazei Mullil 0041は、菌糸生産のために培養される。
培養は固体培地、液体培地のいずれでもよいが、液体培地の方が生成した菌糸の処理に好適であり、一般的である。
液体培地としては、担子菌の菌糸製造用培地であればいかなる培地でもよい。振とう培養用培地としては、グルコース（５０ｇ／Ｌ）、イーストエキス（５．０ｇ／Ｌ）、モルツ・エキス（３０ｇ／Ｌ）と蒸留水を加えて１．０Ｌとした液体培地が好ましい。
【０００８】
培養は、振とう培養、通気攪拌培養など好気的培養で、２７℃程度、１０〜１４日の培養によって、菌糸体は十分に生成する。
【０００９】
得られた菌糸体は、減圧濾過し、次いでフィルタープレス機で圧搾し、湿菌体を得る。この湿菌体は熱風乾燥により乾燥菌糸体となる。
【００１０】
得られた乾燥菌糸体は容器に入れ、１０倍量の蒸留水で、１時間程度加熱還流して抽出処理する。
プレス濾過して得られた濾液はセライト濾過で清澄化し、これを限外濾過により低分子画分を除き、１／２〜１／１０程度まで減圧濃縮し、これに十分量のエタノールを添加し、一夜室温に放置し、淡褐色の沈澱物を得る。この沈澱物を熱風乾燥し、淡褐色粉末の蛋白多糖体００４１を得る。
【００１１】
蛋白多糖体００４１の理化学的性質は次に示される。
１．蛋白多糖体である。
２．グルコースとマンノースを主構成糖とし、これに蛋白が結合する。
３．フェノール硫酸反応で濃褐色を呈し、５２．８％の糖含量を示した。
４．ローリー・フォリン反応で青色を呈し、２７．２％の蛋白含量を示した。
５．６Ｎ塩酸による１１０℃、１２時間減圧封管加水分解物のアミノ酸分析計による測定により、Asp 10.12、Thr 4.13、Ser 4.85、Glu 13.55、Gly 12.92、Ala 11.55、Val 7.44、Met 2.16、Ile 4.72、Leu 10.94、Tyr 2.68、Phe 3.91、Lys 4.62、His 2.05、Arg 2.40、Cys 0.60、Pro 1.50 のアミノ酸含有量（％）を得た。
【００１２】
６．分子量：８５，０００〜１０５，０００（ゲル濾過クロマトグラフィーによる）
７．融点：２４５℃で褐色となり、２７５〜２７９℃で黒褐色となり分解。
９．溶解性：０．０５Ｎ ＮａＯＨ水溶液によく溶け、水にもやや溶け易い。メタノール、エタノール、クロロホルム、ベンゼン、ヘキサンにはほとんど溶けない。
１０．呈色反応：フェノール硫酸反応、ビューレット反応、ローリー・フォリン反応、キサントプロテイン反応に陽性である。
１１．塩基性、酸性、中性の区別：水中１．５８％でｐＨ＝７．４
１２．物質の色：淡褐色粉末
１３．紫外線吸収スペクトル：図１に示す通り。
１４．赤外線吸収スペクトル：図２に示す通り。
１５．ＮＭＲスペクトル：図３に示す通り。
【００１３】
本発明の蛋白多糖体００４１は、他の担子菌から得られる多くの蛋白多糖体と同様に毒性はほとんどなく、各種投与によって免疫増強性抗腫瘍活性を示すので、抗腫瘍剤として有用であり、また、免疫増強組成物として有効に利用することができる。
蛋白多糖体００４１の経口投与量としては、１０ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは１００ｍｇ〜２００ｍｇ／１日／１人程度がよい。
【００１４】
【実施例】
【００１５】
（実施例１：蛋白多糖体００４１の製造）
Agaricus blazei Mullil 0041（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２１０）をシャーレ培地（寒天９ｇ、モルツ・エキス３０ｇ、イースト・エキス５ｇを蒸留水に溶かし、全量を１Ｌとし、１２１℃、２０分間殺菌）で２６℃、暗所、２０日間培養を行い、白い樹枝状によく生育した菌糸体、約１２ｍｍのコルク・ボーラーで打ち抜き、種菌とした。
【００１６】
グルコース５０ｇ、イーストエキス５．０ｇ、モルツ・エキス３０ｇと蒸留水を加えて液体培地１Ｌとし、これを１００ｍｌづつ５００ｍｌ坂口フラスコに分注し、１２１℃、４５分間滅菌後、上記種菌をそれぞれに接種し、２７℃、１０日間培養した。この培養菌の入った坂口フラスコ４本分を、２０Ｌの培養タンク（上記液体培地１２Ｌを入れた）に加え、２７℃、通気量０．５ｖｖｍ、攪拌速度５０〜１００ｒｐｍで１４日間培養した。
【００１７】
得られた培養液１２Ｌを減圧濾過し、菌糸体を得、これをフィルタープレス機で圧搾し、湿菌糸体（水分６５〜７５％）を得、この湿菌糸体を熱風乾燥し、乾燥菌糸体６．０ｇを得た。
【００１８】
乾燥菌糸体を集めて、その５０ｇを、１０００ｍｌ丸底フラスコに入れ、蒸留水５００ｍｌを加え、１時間加熱還流し、冷却後、プレス濾過し、得られた濾液をセライト濾過で清澄化した。
得られた清澄化濾液を限外濾過して低分子画分を除き、濾液を減圧濃縮で１００ｍｌまで濃縮した。
【００１９】
この濃縮濾液１００ｍｌに無水エタノール４００ｍｌを加え、一夜室温に放置し、沈澱物を濾取し、熱風乾燥し、４．８ｇの蛋白多糖体００４１を得た。
【００２０】
（実施例２：免疫増強性抗腫瘍活性試験）
蛋白多糖体００４１のザルコーマ１８０腫瘍に対する効果を試験した。
腫瘍接種（背面皮下０．１ｍｌ：細胞数３×１０6個）２４時間後から実施例１で得られた淡褐色の蛋白多糖体００４１を生理食塩水に溶解させて（１０ｍｇ／１０ｍｌ）１群１０匹のマウス（ＩＣＲ，雄，３０ｇ前後）の腹腔内にマウス１０ｇ当り０．１ｍｌ（マウス体重１ｋｇ当り１０ｍｇ投与）を１０日間１０回投与した。別に生理食塩水を用いて試験し、対照群とした。試料投与群及び対照群について最終投与２０日目に腫瘍結節を摘出し、その重量を測定した。試料群及び腫瘍結節の腫瘍平均重量をそれぞれＴ及びＣとし
抑制率（％）＝（Ｃ−Ｔ）／Ｃ×１００
で算出した。
その結果を以下に示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】蛋白多糖体００４１の紫外線吸収スペクトルを示す図である。
【図２】蛋白多糖体００４１の赤外線吸収スペクトルを示す図である。
【図３】蛋白多糖体００４１のＮＭＲスペクトルを示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は免疫増強性抗腫瘍活性を有する蛋白多糖体００４１に関するものである。
本発明の蛋白多糖体００４１は、免疫増強性抗腫瘍活性を発揮するので、抗腫瘍剤や免疫増強組成物としてきわめて有用である。
【０００２】
【従来の技術】
従来、アガリクス・ブラゼイ（Agaricus blazei）は、子実体が人工栽培によって生産され、乾燥し、その乾燥子実体が機能性食品として大量に販売されている。
アガリクス・ブラゼイの乾燥子実体は、煎じた液（熱水抽出物）が免疫増強などの薬効の期待をもって飲用されているのである。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
アガリクス・ブラゼイの子実体の生産は、種菌の培養から栽培による子実体の生成までかなりの時間がかかり、生産効率も低く、販売価格はかなり高いものとなっている。
また、アガリクス・ブラゼイの変異種類も多く、薬効も多種にわたり、全般的に均一性に欠けるきらいがあった。
本発明では、アガリクス・ブラゼイの子実体ではなく、培養菌糸体において、薬効にすぐれ、安定した生産性を示すヒメマツタケ新菌株の探索及びその培養菌糸体から新たな免疫増強物質を単離することを目的とした。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ブラジル原産の多数のアガリクス・ブラゼイ子実体から、菌糸の生育が著じるしく良い菌株を多数単離し、それぞれについて液体培養を行い、得られた菌糸体から熱水抽出し、単離した物質について抗腫瘍性を調べたところ、１菌株のみに他の菌株よりすぐれた免疫増強性抗腫瘍活性があることを認め、本発明を完成するに至った。
【０００５】
本発明においては、新たに分離した１菌株をAgaricus blazei Mullil 0041と命名し、また、この菌株が生産する免疫増強性抗腫瘍活性物質を蛋白多糖体００４１と名付けた。
【０００６】
Agaricus blazei Mullil 0041は生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−６２１０として寄託されている。
Agaricus blazei Mullil 0041の菌学的性質は次に示される。
１．ＭＹ寒天培地（モルツエキス３０ｇ、イーストエキス５ｇ、寒天９ｇ、蒸留水１０００ｍｌ）で、２７℃で良く生育する。菌体は白色で密に生育し、シャーレ背面は薄いクリーム色を呈する。菌糸は放射状に伸長するが、シイタケなどの担子菌の二核菌糸にみられるクランプ・コネクションを形成しての伸長生長と異なり、菌糸の一部が二方向に分枝し、樹枝状に伸長生長する。長期間の培養で一部菌糸束を形成するが、シャーレでの子実体形成はなく、また無性胞子は観察されない。
２．バレイショ・ブドウ糖寒天培地でもよく生育し、上記１と同じ性質を示す。
３．液体培地（グルコース５０ｇ、イーストエキス５ｇ、モルツエキス３０ｇ、あと蒸留水で１Ｌとする）の２７℃振とう培養で菌糸がよく生育し、菌糸中に蛋白多糖体００４１を多量に生成する。
【０００７】
Agaricus blazei Mullil 0041は、菌糸生産のために培養される。
培養は固体培地、液体培地のいずれでもよいが、液体培地の方が生成した菌糸の処理に好適であり、一般的である。
液体培地としては、担子菌の菌糸製造用培地であればいかなる培地でもよい。振とう培養用培地としては、グルコース（５０ｇ／Ｌ）、イーストエキス（５．０ｇ／Ｌ）、モルツ・エキス（３０ｇ／Ｌ）と蒸留水を加えて１．０Ｌとした液体培地が好ましい。
【０００８】
培養は、振とう培養、通気攪拌培養など好気的培養で、２７℃程度、１０〜１４日の培養によって、菌糸体は十分に生成する。
【０００９】
得られた菌糸体は、減圧濾過し、次いでフィルタープレス機で圧搾し、湿菌体を得る。この湿菌体は熱風乾燥により乾燥菌糸体となる。
【００１０】
得られた乾燥菌糸体は容器に入れ、１０倍量の蒸留水で、１時間程度加熱還流して抽出処理する。
プレス濾過して得られた濾液はセライト濾過で清澄化し、これを限外濾過により低分子画分を除き、１／２〜１／１０程度まで減圧濃縮し、これに十分量のエタノールを添加し、一夜室温に放置し、淡褐色の沈澱物を得る。この沈澱物を熱風乾燥し、淡褐色粉末の蛋白多糖体００４１を得る。
【００１１】
蛋白多糖体００４１の理化学的性質は次に示される。
１．蛋白多糖体である。
２．グルコースとマンノースを主構成糖とし、これに蛋白が結合する。
３．フェノール硫酸反応で濃褐色を呈し、５２．８％の糖含量を示した。
４．ローリー・フォリン反応で青色を呈し、２７．２％の蛋白含量を示した。
５．６Ｎ塩酸による１１０℃、１２時間減圧封管加水分解物のアミノ酸分析計による測定により、Asp 10.12、Thr 4.13、Ser 4.85、Glu 13.55、Gly 12.92、Ala 11.55、Val 7.44、Met 2.16、Ile 4.72、Leu 10.94、Tyr 2.68、Phe 3.91、Lys 4.62、His 2.05、Arg 2.40、Cys 0.60、Pro 1.50 のアミノ酸含有量（％）を得た。
【００１２】
６．分子量：８５，０００〜１０５，０００（ゲル濾過クロマトグラフィーによる）
７．融点：２４５℃で褐色となり、２７５〜２７９℃で黒褐色となり分解。
１０．呈色反応：フェノール硫酸反応、ビューレット反応、ローリー・フォリン反応、キサントプロテイン反応に陽性である。
１１．塩基性、酸性、中性の区別：水中１．５８％でｐＨ＝７．４
１２．物質の色：淡褐色粉末
１３．紫外線吸収スペクトル：図１に示す通り。
１４．赤外線吸収スペクトル：図２に示す通り。
１５．ＮＭＲスペクトル：図３に示す通り。
【００１３】
本発明の蛋白多糖体００４１は、他の担子菌から得られる多くの蛋白多糖体と同様に毒性はほとんどなく、各種投与によって免疫増強性抗腫瘍活性を示すので、抗腫瘍剤として有用であり、また、免疫増強組成物として有効に利用することができる。
蛋白多糖体００４１の経口投与量としては、１０ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは１００ｍｇ〜２００ｍｇ／１日／１人程度がよい。
【００１４】
【実施例】
【００１５】
（実施例１：蛋白多糖体００４１の製造）
Agaricus blazei Mullil 0041（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２１０）をシャーレ培地（寒天９ｇ、モルツ・エキス３０ｇ、イースト・エキス５ｇを蒸留水に溶かし、全量を１Ｌとし、１２１℃、２０分間殺菌）で２６℃、暗所、２０日間培養を行い、白い樹枝状によく生育した菌糸体、約１２ｍｍのコルク・ボーラーで打ち抜き、種菌とした。
【００１６】
グルコース５０ｇ、イーストエキス５．０ｇ、モルツ・エキス３０ｇと蒸留水を加えて液体培地１Ｌとし、これを１００ｍｌづつ５００ｍｌ坂口フラスコに分注し、１２１℃、４５分間滅菌後、上記種菌をそれぞれに接種し、２７℃、１０日間培養した。この培養菌の入った坂口フラスコ４本分を、２０Ｌの培養タンク（上記液体培地１２Ｌを入れた）に加え、２７℃、通気量０．５ｖｖｍ、攪拌速度５０〜１００ｒｐｍで１４日間培養した。
【００１７】
得られた培養液１２Ｌを減圧濾過し、菌糸体を得、これをフィルタープレス機で圧搾し、湿菌糸体（水分６５〜７５％）を得、この湿菌糸体を熱風乾燥し、乾燥菌糸体６．０ｇを得た。
【００１８】
乾燥菌糸体を集めて、その５０ｇを、１０００ｍｌ丸底フラスコに入れ、蒸留水５００ｍｌを加え、１時間加熱還流し、冷却後、プレス濾過し、得られた濾液をセライト濾過で清澄化した。
得られた清澄化濾液を限外濾過して低分子画分を除き、濾液を減圧濃縮で１００ｍｌまで濃縮した。
【００１９】
この濃縮濾液１００ｍｌに無水エタノール４００ｍｌを加え、一夜室温に放置し、沈澱物を濾取し、熱風乾燥し、４．８ｇの蛋白多糖体００４１を得た。
【００２０】
（実施例２：免疫増強性抗腫瘍活性試験）
蛋白多糖体００４１のザルコーマ１８０腫瘍に対する効果を試験した。
腫瘍接種（背面皮下０．１ｍｌ：細胞数３×１０6個）２４時間後から実施例１で得られた淡褐色の蛋白多糖体００４１を生理食塩水に溶解させて（１０ｍｇ／１０ｍｌ）１群１０匹のマウス（ＩＣＲ，雄，３０ｇ前後）の腹腔内にマウス１０ｇ当り０．１ｍｌ（マウス体重１ｋｇ当り１０ｍｇ投与）を１０日間１０回投与した。別に生理食塩水を用いて試験し、対照群とした。試料投与群及び対照群について最終投与２０日目に腫瘍結節を摘出し、その重量を測定した。試料群及び腫瘍結節の腫瘍平均重量をそれぞれＴ及びＣとし
抑制率（％）＝（Ｃ−Ｔ）／Ｃ×１００
で算出した。
その結果を以下に示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】蛋白多糖体００４１の紫外線吸収スペクトルを示す図である。
【図２】蛋白多糖体００４１の赤外線吸収スペクトルを示す図である。
【図３】蛋白多糖体００４１のＮＭＲスペクトルを示す図である。
Claims (3)
- 下記の工程からなる蛋白多糖体００４１の製造方法：
（Ａ）Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｌａｚｅｉ Ｍｕｌｌｉｌ ００４１（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２１０）を液体培地中で培養する；
（Ｂ）得られた培養液から湿菌糸体を得る；
（Ｃ）得られた湿菌糸体を乾燥する；
（Ｄ）乾燥菌糸体を熱水抽出して抽出液を得る；
（Ｅ）抽出液から下記の物理化学的性質を有する蛋白多糖体００４１を得る：
１．蛋白多糖体である。
２．グルコースとマンノースを主構成糖とし、これに蛋白が結合する。
３．分子量：８５，０００〜１０５，０００（ゲル濾過クロマトグラフィーによる）
４．融点：２４５℃で褐色となり、２７５〜２７９℃で黒褐色となり分解。
５．比旋光度：ナトリウムのＤ線に対する２１℃における本物質の比旋光度〔α〕＝＋３１８°（水中 ０．３３％）
６．溶解性：０．０５Ｎ ＮａＯＨ水溶液によく溶け、水にもやや溶け易い。メタノール、エタノール、クロロホルム、ベンゼン、ヘキサンにはほとんど溶けない。
７．呈色反応：フェノール硫酸反応、ビューレット反応、ローリー・フォリン反応、キサントプロテイン反応に陽性である。
８．塩基性、酸性、中性の区別：水中１．５８％でｐＨ＝７．４
９．物質の色：淡褐色粉末 - 請求項１に記載の方法によって製造してなる蛋白多糖体００４１を有効成分とする抗腫瘍剤。
- 請求項１に記載の方法によって製造してなる蛋白多糖体００４１を含有してなる免疫増強組成物。
Priority Applications (3)
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