CN1546677A - 一种生产灰树花胞内多糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及采用天然真菌通过发酵制备一种具有抗艾滋病病毒、抗肿瘤、调节免疫系统等功能的可食用的药用糖缀合物。本发明的特征在于通过灰树花菌种的液体深层发酵，将发酵获得的灰树花菌丝体通过细胞破碎，热水浸提，脱蛋白或经过酒精分步沉淀后再脱蛋白，脱色，脱盐，柱纯化等步骤获得单一组分的灰树花胞内多糖。本发明的优点在于：1)由于采用液体生层发酵，它具有灰树花液体培养的一切优点；2)本发明所获得的灰树花胞内多糖具有明显的抗HIV的功效，且基本无毒副作用；3)本发明所获得的灰树花胞内多糖为单一组分，可以直接制备成药用针剂或口服药。

Description

一种生产灰树花胞内多糖的方法

技术领域

本发明涉及采用天然真菌通过发酵制备一种具有抗艾滋病病毒、抗肿瘤、调节免疫系统等功能的可食用的药用糖缀合物，具体的说是通过灰树花菌种的液体深层发酵，将发酵获得的灰树花菌丝体通过细胞破碎，脱蛋白，脱色，脱盐，柱纯化等步骤获得单一组分的灰树花胞内多糖。所获的灰树花胞内多糖可以直接制备成药用针剂或食药用口服制剂，具有抗艾滋病病毒、抗肿瘤、调节免疫系统等功能。

背景技术

灰树花(Grifola frondosa)又名栗子蘑、莲花菌、贝叶多孔菌、千佛菌、叶奇果菌、云蕈等，日本人称为マィタケ(舞茸，Maitake)。在分类学上灰树花隶属于担子菌亚门，层菌纲，非褶菌目，多孔菌科，树花菌属，是一种天然的珍稀食药两用真菌。

灰树花具有似野鸡般的鲜美口味和质感^[13]，在日本倍受喜爱，供不应求。封建时期，灰树花售价高至重量与白银等值，即便在近代，甚至仅于采菇者遗嘱中才得以透露野生菇生长数年的神秘地点。其所含的生物活性物质——灰树花多糖具有生物反应调节剂(BRM)的功能，是一类理想的免疫调节剂，具有“菇类免疫之王”的美称。它具有明显的抗肿瘤、抗HIV病毒、改善免疫系统功能、调节血糖、血脂及胆固醇水平、降血压等作用，对防止癌细胞的生成和转移、爱滋病、高血压、肥胖症、糖尿病以及免疫系统功能紊乱都有一定的疗效，且无任何毒副作用。此外，国外有学者认为灰树花多糖是所有真菌生物活性物质中抗肿瘤活性最强的，而且口服有效。

灰树花的生产方式包括液体发酵和固体发酵，传统的固态发酵可获得灰树花子实体，但具有菌丝萌发慢，发酵周期长的不足。用液体培养法具有以下优点：(1)与传统的固体栽培相比，大大缩短了生产周期；(2)采用发酵罐可进行工业化生产，大大提高产量；(3)节省劳动强度，降低生产成本；(4)产品质量稳定。

灰树花多糖可以从固态发酵生产的菌丝体和子实体中提取；也可从液体深层发酵中提取，其中发酵液的菌丝体中提取的是胞内多糖，从剩余的发酵液中提取的是胞外多糖。由于培养基、培养方式等条件的不同，灰树花多糖在其分子量、结构等方面也会产生差异。

艾滋病(Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS)的病原体是人类免疫缺陷病毒(human Immunodeficiency virus，HIV)，临床表现主要是条件致病性感染及(或)发生恶性肿瘤。艾滋病自发现以来，传播迅速，据世界卫生组织估计，AIDS流行最早的许多非洲国家预计到2010年时，其平均期望寿命将因AIDS减寿30年左右。更有甚者，全球AIDS流行的势头还在迅猛上升，尤其是南非、拉丁美洲和亚洲。目前尚无有效的治疗方法，病死率极高。

目前国内对灰树花多糖的研究主要集中在其抗肿瘤方面，关于它的抗艾滋病病毒的功效尚未见报道；而且主要是从灰树花子实体中提取，得率低且得到的往往是包含一系列分子量、结构不同的灰树花胞内多糖的组合物。

在国外，研究的较多是日本的Nanba教授，他将获得的灰树花多糖进行了人体试验，80％左右的病人自我感觉良好，但艾滋病病毒未见减少；在对灰树花胞内多糖硫酸化后进行试验，发现其抗艾滋病病毒的效果有了较大的提高但毒性也大大增加，因此还不能很好的解决问题。此外他所获得的灰树花多糖同样是包含一系列分子量、结构不同的灰树花胞内多糖的组合物。

发明内容

本发明的目的是为了克服目前国内外研究中得不足，确立一种获得一种单一组分的灰树花胞内多糖的方法，使其可以直接制备成具有抗艾滋病病毒、抗肿瘤、改善免疫系统等功能的药用针剂或食药用口服制剂。

为实现上述目的，本发明所采取的步骤如下：

第一步：灰树花菌种液体深层发酵，其培养基组成为：葡萄糖1～2％、玉米粉0.5～1.5％、棉子壳0.25～0.75％、麸皮0.5～1％、磷酸二氢钾0.05～0.4％、磷酸镁0.05～0.4％、氯化钙0.02～0.3％，在121℃下灭菌30分钟；液体深层发酵条件为：发酵温度22～29℃，通风比0.2～1.0vvm，搅拌速度40～120转/分，发酵培养时间120～168h，接种量为10％(体积比)。

第二步：将发酵液离心后获得的菌丝体进行细胞破碎和热水浸提。细胞破碎可以采用组织捣碎法、超声波法、高压破碎法，细胞破碎的目的是为了提高热水浸提胞内多糖的效果；热水浸提胞内多糖的条件为提取温度为88～95℃，提取时间为2.5～6小时，菌丝体质量与水体积的比值为1∶3～1∶6。

第三步：酒精分步沉淀法获得粗多糖粉，即在热水浸提液中加入无水酒精，使液体中酒精的体积百分比浓度达到22～38％，将该液体离心后取上清液。在上清液中再加入无水酒精，使液体中酒精的体积百分比浓度达到55～75％，将该液体离心10分钟后取沉淀80℃下烘干，所得即为粗多糖粉。将粗多糖粉用超纯水溶解(溶液中粗多糖的质量百分比为0.5～2.0％)后即可以进行脱蛋白、脱色、脱盐、柱纯化等步骤。

第四步：脱蛋白。脱蛋白可以采用三氯乙酸脱蛋白法，即在热水浸提液中直接加入三氯乙酸，使液体中三氯乙酸的质量百分比浓度达到5～25％。将该液体离心后即可以达到脱蛋白的目的，所获的上清液即为粗多糖液。也可以采用Sevag法脱蛋白。Sevag法采用的步骤为：将粗多糖液与氯仿-正丁醇混合液(按体积比，氯仿∶正丁醇＝4∶1混合)按体积比3∶1混合，置于具塞试管中，充分振摇30min后，在4000转/分的条件下离心1min，然后将水相与氯仿相分开，取水相；再重复上述步骤两次。

第五步：脱色。脱色可以采用双氧水氧化脱色，在pH8条件下滴加20％双氧水溶液至淡黄色，40℃下保温1小时。

第六步：脱盐。脱盐所采用的方法是将已经脱蛋白和脱色的粗多糖溶液置于截留分子量为10000～12000的透析袋内，以超纯水透析至离子强度不变。

第七步：柱纯化。柱纯化所采用的方法是采用16/10 DEAE层析柱，以pH6.0～9.0的磷酸盐缓冲液，1M氯化钠溶液梯度洗脱，以1～3ml/min流速洗脱，5ml/管收集，经苯酚——硫酸法逐管检测每管多糖含量，Folin-酚法逐管检测蛋白含量，以测定中多糖和蛋白含量第一次同时达到高峰时的那一管以它之前和之后各三管的样品为本发明所需的胞内多糖。将这些样品再次脱盐后即得到纯的灰树花胞内多糖。

本发明所述的第三、四、五可以全部实施，也可以跳过其中几步实施。一般说来如果不实施第三步，那么第四、五步一般要实施；如果实施第三步，那么第四、五步一般不要实施。

在第二步之后，第三步之前，可以根据实施情况将热浸提液或粗多糖液进行适当的浓缩，浓缩过程在旋转蒸发器中进行，浓缩的温度不超过60℃，浓缩倍数可以根据具体情况确定，但以不超过5倍为宜。

本发明所述的灰树花菌种购自河南省清丰县食用菌技术推广中心。

本发明所述的DEAE-纤维素为离子交换层析中常用的一种支持介质。

本发明所述的转/分为转速单位，即每分钟搅拌的转数；vvm为通风单位，即每分钟单位体积的发酵液通入空气的体积数；M为浓度单位，表示摩尔每升；min为时间单位，表示分钟。

本发明所述的离心是在每分钟3000转条件下进行的。

本发明如无特殊说明均为质量百分比。

本发明所获得的灰树花胞内多糖为组分单一的纯的糖缀合物，其中蛋白质含量为2％，单糖组成为鼠李糖，阿拉伯糖，甘露糖，葡萄糖，半乳糖，各组成单糖主要以β键相连接，分子量在200万以上；存在O-糖苷键的糖肽连接方式，氨基酸组成主要以丝氨基、甘氨酸和赖氨酸为主。

本发明的特征在于通过灰树花菌种的液体深层发酵，将发酵获得的灰树花菌丝体通过细胞破碎，热水浸提，脱蛋白或经过酒精分步沉淀后再脱蛋白，脱色，脱盐，柱纯化等步骤获得单一组分的灰树花胞内多糖。

本发明的优点在于：1)由于采用液体生层发酵，它具有灰树花液体培养的一切优点；2)本发明所获得的灰树花胞内多糖具有明显的抗HIV的功效，且基本无毒副作用；3)本发明所获得的灰树花胞内多糖为单一组分，可以直接制备成药用针剂或口服药。

附图说明

图1为GFP-1的Supdex200凝胶过滤图谱。

图2为GFP-1Superdex200凝胶过滤的多糖检测图谱。

图3为GFP-1的高压液相图谱。

①GFP-1的Superdex200凝胶过滤层析

胞内多糖经DEAE-纤维素层析分离所得的GFP-1组分经Superdex200 HR10/13柱凝胶过滤层析，于215nm，280nm波长下在线检测，苯酚-硫酸法逐管检测多糖含量，Folin-酚法逐管检测蛋白含量。

由图1可见，GFP-1经Superdex200 HR10/13凝胶过滤层析，于215nm，280nm波长下在线检测，得到215nm，280nm下的重叠对称单峰。

由图2可见，由图11所得的重叠单峰亦是多糖，蛋白的重叠单一对称洗脱峰。

②GFP-1的高压液相层析

由图3可见，GFP-1经HPLC层析，示差折光检测显示层析结果为一尖锐对称单峰。

具体实施方式

下面对具体实施例进行描述，在实施例的描述过程中如无特殊说明均为质量百分比；接种量均为10％(体积比)；离心均在3000转每分钟条件下进行。浓缩过程均在旋转蒸发器中进行，浓缩的温度不超过60℃。本文所述Sevag法脱蛋白的具体步骤为：将热水浸提液或粗多糖液与氯仿-正丁醇混合液按体积比3∶1混合，置于具塞试管中，充分振摇30分钟后，在4000转/分钟的条件下离心1分钟，然后将水相与氯仿相分开，取水相；再重复上述步骤两次，其中，氯仿-正丁醇混合液中两者的体积比为氯仿∶正丁醇＝4∶1。脱色采用双氧水氧化脱色，则操作为在pH8条件下滴加20％双氧水溶液至淡黄色，40℃下保温1小时。脱盐均采用透析法，即粗多糖溶液置于截留分子量为10000～12000的透析袋内，以超纯水透析至离子强度不变。柱纯化的条件为采用16/10 DEAE-纤维素层析柱，以磷酸盐缓冲液，1M氯化钠溶液梯度洗脱，以一定流速洗脱，5ml/管部分收集，经苯酚——硫酸法逐管检测每管多糖含量，Folin-酚法逐管检测蛋白含量，以测定中多糖和蛋白含量第一次同时达到高峰时的那一管以它之前和之后各三管的样品为本发明所需收集的胞内多糖，并将这些收集的胞内多糖溶液再次脱盐后进行冷冻干燥；多糖得率为多糖质量与相应发酵液的体积比。

实施例1：培养基组成为葡萄糖2％、玉米粉1.5％、棉子壳0.75％、麸皮1％、磷酸二氢钾0.4％、磷酸镁0.4％、氯化钙0.3％，在121℃下灭菌30分钟；发酵温度25℃，通风比0.65vvm，搅拌速度80转/分，培养120小时后结束发酵；将发酵液离心15分钟，收集菌丝体；按菌丝体质量与水体积的比值为1∶5的比例加入水后进行细胞破碎，并在90℃条件下热水浸提6小时；冷却至室温后离心15分钟取上清液，浓缩5倍，向其中加入三氯乙酸，使液体中三氯乙酸的浓度达到10％，静置后离心20分钟，所得上清液即为粗多糖液；将粗多糖液脱色、脱盐、在以pH6.0的磷酸盐缓冲液，1M氯化钠溶液梯度洗脱，以1ml/min流速洗脱条件下柱纯化，获得纯的灰树花胞内多糖GFP-1，提取得率为0.24‰。

实施例2：培养基组成为葡萄糖1.2％、玉米粉1.0％、棉子壳0.5％、麸皮0.5％、磷酸二氢钾0.2％、磷酸镁0.1％、氯化钙0.1％，在121℃下灭菌30分钟；发酵温度25℃，通风比1.0vvm，搅拌速度40转/分，培养168小时后结束发酵；将发酵液离心15分钟，收集菌丝体；按菌丝体质量与水体积的比值为1∶5的比例加入水后进行细胞破碎，并在92℃条件下热水浸提6小时；冷却至室温后离心15分钟取上清液，浓缩3倍，向其中加入三氯乙酸，使液体中三氯乙酸的浓度达到15％，静置后离心20分钟，所得上清液即为粗多糖液；将粗多糖液脱色、脱盐、在以pH9.0的磷酸盐缓冲液，1M氯化钠溶液梯度洗脱，以3ml/min流速洗脱条件下柱纯化，后获得纯的灰树花胞内多糖GFP-1，提取得率为0.28‰。

实施例3：培养基组成为葡萄糖1.8％、玉米粉1.0％、棉子壳0.5％、麸皮0.8％、磷酸二氢钾0.2％、磷酸镁0.2％、氯化钙0.05％，在121℃下灭菌30分钟；发酵温度29℃，通风比0.2vvm，搅拌速度120转/分，培养132小时后结束发酵；将发酵液离心15分钟，收集菌丝体；按菌丝体质量与水体积的比值为1∶3的比例加入水后进行细胞破碎，并在95℃条件下热水浸提2.5小时；冷却至室温后离心15分钟取上清液，向其中加入三氯乙酸，使液体中三氯乙酸的浓度达到25％，静置后离心20分钟，所得上清液即为粗多糖液；将粗多糖液脱色、脱盐、在以pH6.0的磷酸盐缓冲液，1M氯化钠溶液梯度洗脱，以3ml/min流速洗脱条件下柱纯化，后获得纯的灰树花胞内多糖GFP-1，提取得率为0.24‰。

实施例4：培养基组成为葡萄糖1％、玉米粉0.5％、棉子壳0.25％、麸皮0.5％、磷酸二氢钾0.05％、磷酸镁0.05％、氯化钙0.02％，在121℃下灭菌30分钟；发酵温度25℃，通风比0.40vvm，搅拌速度100转/分，培养120小时后结束发酵；将发酵液离心15分钟，收集菌丝体；按菌丝体质量与水体积的比值为1∶5的比例加入水后进行细胞破碎，并在90℃条件下热水浸提6小时；冷却至室温后离心15分钟取上清液，向其中加入三氯乙酸，使液体中三氯乙酸的浓度达到5％，静置后离心20分钟，所得上清液即为粗多糖液；将粗多糖液脱色、脱盐、在以pH9.0的磷酸盐缓冲液，1M氯化钠溶液梯度洗脱，以1ml/min流速洗脱条件下柱纯化，后获得纯的灰树花胞内多糖GFP-1，提取得率为0.26‰。

实施例5：培养基组成为葡萄糖1％、玉米粉1.5％、棉子壳0.25％、麸皮0.75％、磷酸二氢钾0.3％、磷酸镁0.1％、氯化钙0.1％，在121℃下灭菌30分钟；发酵温度22℃，通风比0.65vvm，搅拌速度80转/分，培养168小时后结束发酵；将发酵液离心15分钟，收集菌丝体；按菌丝体质量与水体积的比值为1∶6的比例加入水后进行细胞破碎，并在92.5℃条件下热水浸提4.5小时；冷却至室温后离心15分钟取上清液，浓缩5倍，加入无水酒精，使液体中酒精的体积百分比浓度达到30％，将该液体离心10分钟后取上清液。在上清液中再加入无水酒精，使液体中酒精的体积百分比浓度达到60％，将该液体离心10分钟后取沉淀80℃下烘干，所得即为粗多糖粉。将粗多糖粉用超纯水溶解成粗多糖溶液，溶液中粗多糖的质量百分比为0.5％。将该粗多糖液脱盐，在以pH6.8的磷酸盐缓冲液，1M氯化钠溶液梯度洗脱，以1ml/min流速洗脱条件下柱纯化，后获得纯的灰树花胞内多糖GFP-1，提取得率为0.25‰。

实施例6：培养基组成为葡萄糖1.2％、玉米粉1.0％、棉子壳0.5％、麸皮0.5％、磷酸二氢钾0.2％、磷酸镁0.1％、氯化钙0.1％，在121℃下灭菌30分钟；发酵温度25℃，通风比0.45vvm，搅拌速度120转/分，培养120小时后结束发酵；将发酵液离心15分钟，收集菌丝体；按菌丝体质量与水体积的比值为1∶4的比例加入水后进行细胞破碎，并在88℃条件下热水浸提3.5小时；冷却至室温后离心15分钟取上清液，浓缩2倍，加入无水酒精，使液体中酒精的体积百分比浓度达到22％，将该液体离心10分钟后取上清液。在上清液中再加入无水酒精，使液体中酒精的体积百分比浓度达到55％，将该液体离心10分钟后取沉淀80℃下烘干，所得即为粗多糖粉。将粗多糖粉用超纯水溶解成粗多糖溶液，溶液中粗多糖的质量百分比为2.0％。将该粗多糖液用sevag法脱蛋白后再脱盐，在以pH6.8的磷酸盐缓冲液，1M氯化钠溶液梯度洗脱，以2ml/min流速洗脱条件下柱纯化，后获得纯的灰树花胞内多糖GFP-1，提取得率为0.24‰。

实施例7：培养基组成为葡萄糖1.8％、玉米粉1.0％、棉子壳0.5％、麸皮0.8％、磷酸二氢钾0.2％、磷酸镁0.2％、氯化钙0.05％，在121℃下灭菌30分钟；发酵温度25℃，通风比0.8vvm，搅拌速度40转/分，培养136小时后结束发酵；将发酵液离心15分钟，收集菌丝体；按菌丝体质量与水体积的比值为1∶3.5的比例加入水后进行细胞破碎，并在95℃条件下热水浸提2.5小时；冷却至室温后离心15分钟取上清液，加入无水酒精，使液体中酒精的体积百分比浓度达到38％，将该液体离心10分钟后取上清液。在上清液中再加入无水酒精，使液体中酒精的体积百分比浓度达到75％，将该液体离心10分钟后取沉淀80℃下烘干，所得即为粗多糖粉。将粗多糖粉用超纯水溶解成粗多糖溶液，溶液中粗多糖的质量百分比为1.5％。将该粗多糖液脱色、脱盐、在以pH7.8的磷酸盐缓冲液，1M氯化钠溶液梯度洗脱，以1.5ml/min流速洗脱条件下柱纯化，后获得纯的灰树花胞内多糖GFP-1，提取得率为0.26‰。

实施例8：培养基组成为葡萄糖1.2％、玉米粉1.0％、棉子壳0.5％、麸皮0.5％、磷酸二氢钾0.2％、磷酸镁0.1％、氯化钙0.1％，在121℃下灭菌30分钟；发酵温度22℃，通风比1.0vvm，搅拌速度60转/分，培养148小时后结束发酵；将发酵液离心15分钟，收集菌丝体；按菌丝体质量与水体积的比值为1∶6的比例加入水后进行细胞破碎，并在90℃条件下热水浸提6小时；冷却至室温后离心15分钟取上清液，加入无水酒精，使液体中酒精的体积百分比浓度达到32％，将该液体离心10分钟后取上清液。在上清液中再加入无水酒精，使液体中酒精的体积百分比浓度达到68％，将该液体离心10分钟后取沉淀80℃下烘干，所得即为粗多糖粉。将粗多糖粉用超纯水溶解成粗多糖溶液，溶液中粗多糖的质量百分比为2.0％。将向该粗多糖液中加入三氯乙酸，使液体中三氯乙酸的浓度达到10％，静置后离心20分钟，所得上清液再脱色、脱盐，在以pH6.8的磷酸盐缓冲液，1M氯化钠溶液梯度洗脱，以1ml/min流速洗脱条件下柱纯化，后获得纯的灰树花胞内多糖GFP-1，提取得率为0.23‰。

实施例9：培养基组成为葡萄糖1.8％、玉米粉1.0％、棉子壳0.5％、麸皮0.8％、磷酸二氢钾0.2％、磷酸镁0.2％、氯化钙0.05％，在121℃下灭菌30分钟；发酵温度28℃，通风比0.65vvm，搅拌速度100转/分，培养140小时后结束发酵；将发酵液离心15分钟，收集菌丝体；按菌丝体质量与水体积的比值为1∶4的比例加入水后进行细胞破碎，并在88℃条件下热水浸提5小时；冷却至室温后离心15分钟取上清液，浓缩1倍，加入无水酒精，使液体中酒精的体积百分比浓度达到26％，将该液体离心10分钟后取上清液。在上清液中再加入无水酒精，使液体中酒精的体积百分比浓度达到70％，将该液体离心10分钟后取沉淀80℃下烘干，所得即为粗多糖粉。将粗多糖粉用超纯水溶解成粗多糖溶液，溶液中粗多糖的质量百分比为1.75％。将该粗多糖液脱盐，在以pH6.8的磷酸盐缓冲液，1M氯化钠溶液梯度洗脱，以1.5ml/min流速洗脱条件下柱纯化，后获得纯的灰树花胞内多糖GFP-1，提取得率为0.28‰。

Claims (13)

1、一种生产灰树花胞内多糖的方法，a、深层发酵，将灰树花液体在发酵温度22～29℃，通风比0.2～1.0vvm，搅拌速度40～120转/分，发酵培养时间120～168h的条件下深层发酵；b、细胞破碎，将上述发酵液中的菌丝体进行破碎；c、热水浸提，在温度为88～95℃，时间为2.5～6小时，菌丝体质量与水体积的比值为1∶3～1∶6的条件下进行浸提，得到含有胞内多糖的浸提液；d、脱盐，利用透析法对粗多糖溶液进行脱盐处理；e、柱纯化，利用16/10 DEAE层析柱对已经脱过盐的粗多糖溶液进行柱纯化。

2、按权利要求1所述的方法，其特征是：灰树花液体深层发酵所用的培养基组成为：葡萄糖1～2％、玉米粉0.5～1.5％、棉子壳0.25～0.75％、麸皮0.5～1％、磷酸二氢钾0.05～0.4％、磷酸镁0.05～0.4％、氯化钙0.02～0.3％。

3、按权利要求1所述的方法，其特征是：在细胞破碎时，将经过深层发酵后的菌丝体利用组织捣碎法或超声波法或高压破碎法进行细胞破碎。

4、按权利要求1所述的方法，其特征是：在热水浸提后，脱盐前，利用酒精对上述浸提液分步沉淀，即在热水浸提液中加入无水酒精，使液体中酒精的体积百分比浓度达到22～38％，将该液体离心后取上清液，在上清液中再加入无水酒精，使液体中酒精的体积百分比浓度达到55～75％，将该液体离心后取沉淀物于80℃下烘干，所得即为粗多糖粉，将粗多糖粉用超纯水溶解成粗多糖溶液，溶液中粗多糖的质量百分比为0.5～2.0％。

5、按权利要求1所述的方法，其特征是：在热水浸提后，再脱蛋白。

6、按权利要求5所述的方法，其特征是：在脱蛋白后，再脱色，即在上述粗多糖溶液中滴加20％双氧水溶液至淡黄色，在滴加20％双氧水溶液时，粗多糖的pH值为8，再在40℃下保温1小时。

7、按权利要求1所述的方法，其特征是：在脱盐时，将已经脱色的粗多糖溶液置于截留分子量为10000～12000的透析袋内，以超纯水透析至离子强度不变。

8、按权利要求1所述的方法，其特征是：在柱纯化时，采用16/10 DEAE层析柱，以pH6.8～9.0的磷酸盐缓冲液，1M氯化钠溶液梯度洗脱，以1～3ml/min流速洗脱，5ml/管部分收集，经苯酚——硫酸法逐管检测每管多糖含量，Folin-酚法逐管检测蛋白含量，以测定中多糖和蛋白含量第一次同时达到高峰时的那一管以它之前和之后各三管的样品为所需的胞内多糖。

9、按权利要求7所述的方法，其特征是：所获得的灰树花胞内多糖为各组成单糖主要以β键相连接，分子量在200万以上组分单一的纯的糖缀合物。

10、按权利要求4所述的方法，其特征是：在获得粗多糖溶液后，脱盐前，进行脱蛋白。

11、按权利要求4或10所述的方法，其特征是：在获得粗多糖溶液或脱蛋白后，再脱色，即在上述粗多糖溶液中滴加20％双氧水溶液至淡黄色，在滴加20％双氧水溶液时，粗多糖的pH值为8，再在40℃下保温1小时。

12、按权利要求5或10所述的方法，其特征是：在脱蛋白时，在热水浸提液或粗多糖溶液中直接加入三氯乙酸，使液体中三氯乙酸的质量百分比浓度达到5～25％，再将该液体离心，脱去其中的蛋白，所获的上清液即为粗多糖溶液。

13、按权利要求5或10所述的方法，其特征是：在脱蛋白时，在热水浸提液或粗多糖溶液中利用Sevag法脱蛋白：将热水浸提液或粗多糖液与氯仿-正丁醇混合液按体积比3∶1混合，置于具塞试管中，充分振摇30分钟后，在4000转/分钟的条件下离心1分钟，然后将水相与氯仿相分开，取水相；再重复上述步骤两次，其中，氯仿-正丁醇混合液中两者的体积比为氯仿∶正丁醇＝4∶1。