CN102274487B - 重组灵芝免疫蛋白在制备治疗白细胞减少症药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及重组灵芝免疫调节蛋白rLZ‑8在制备治疗白细胞减少症的药物中的应用。本发明建立了环磷酰胺所致的大鼠白细胞减少症疾病模型，并使用重组灵芝免疫调节蛋白对其进行治疗实验，实验结果证明重组灵芝免疫调节蛋白rLZ‑8对升高白细胞具有极为显著的作用。

Description

重组灵芝免疫蛋白在制备治疗白细胞减少症药物中的应用

本申请是“具有抗肿瘤作用的重组灵芝免疫调节蛋白及其药物制剂”申请的分案申请。其原申请的申请日是2008年1月3日，申请号是200810050206.x，原发明的名称是“具有抗肿瘤作用的重组灵芝免疫调节蛋白及其药物制剂”。

技术领域

本发明属于生物医药工程领域，涉及使用巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达的重组灵芝免疫调节蛋白的抗肿瘤用途及其抗肿瘤药物制剂。

背景技术

灵芝免疫调节蛋白(Immunoregulatory Protein of Ganoderma lucidium)，由日本Kino等人1989年从赤灵芝菌丝体提取物中分离和纯化的小分子蛋白质(Kohsuke Kino et al.，J.Boil.Chem.1989，1：472-478)，命名为LZ-8，并测定其氨基酸顺序和免疫生理活性。蛋白质测序表明LZ-8由110个氨基酸残基组成，氨基端乙酰化，分子量为12.4KD，等电点为4.4。灵芝免疫调节蛋白的主要功能在于它可以促进末梢淋巴细胞和脾脏细胞的增生，诱导动物和人体的巨噬细胞分泌多种细胞因子(如白细胞介素，肿瘤坏死因子和干扰素等)，进而防御及消除病原体的侵害，维护机体的健康，实现免疫调节功能。

很多研究表明，LZ-8发挥抗肿瘤作用主要是通过免疫调节途径实现。但本发明的积极效果在于首次公开了重组灵芝免疫调节蛋白(Recombinant Immunoregulatory Protein ofGanoderma Lucidium，rLZ-8)通过与肿瘤细胞膜特异结合诱导其凋亡来直接杀伤或杀死肿瘤细胞而发挥抗肿瘤的用途。在发挥作用的同时，不同于化疗药物会降低白细胞，rLZ-8会维持和升高白细胞，且不影响正常细胞的作用。

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的常见病和多发病，目前尚无特别有效的防治策略。近年来，随着分子肿瘤学、分子药理学的不断发展，以及对肿瘤本质的阐明，大规模、快速筛选组合化学、基因工程等先进技术的发明和应用加速了药物开发进程。用不同方法启动或激活肿瘤细胞凋亡机制，影响细胞不同基因表达，诱导肿瘤细胞凋亡，减少对正常细胞的影响和放化疗带来的副作用，已成为目前肿瘤治疗的重要策略。

本发明的重组灵芝免疫调节蛋白不仅在体外能快速高效诱导多种肿瘤细胞凋亡，而且在小鼠肿瘤模型体内也能有效杀死肿瘤细胞，且无明显毒副作用，并能保持或升高白细胞的水平，对应用重组灵芝免疫调节蛋白研制抗肿瘤药物有一定的积极作用。

发明内容

1.公开了rLZ-8抗肿瘤作用及升高白细胞作用。

2.杀伤白血病细胞的药效学和细胞凋亡实验，药效学实验表明rLZ-8对白血病细胞NB4、K562和HL-60具有很强杀伤作用，流式细胞仪进行的细胞凋亡检测进一步证明了rLZ-8诱导人白血病细胞发生凋亡。

3.溶血实验、大鼠骨髓像实验和促红细胞凝聚实验证实其对正常细胞没有影响。

4.荷瘤小鼠实验表明，rLZ-8可以抑制小鼠艾氏腹水瘤S180和移植性肝癌细胞H22在体内生长。

5.蛋白荧光标记实验表明，rLZ-8可以通过与肿瘤细胞膜特异结合诱导其凋亡而杀伤或杀死肿瘤细胞。

6.rLZ-8药物制剂的核心成分含有重组灵芝免疫调节蛋白和任选的药学可接受的辅剂。

7.rLZ-8药物制剂可以通过口服和非肠道给药。

说明书附图说明：

图1rLZ-8对NB4肿瘤细胞体外杀伤结果

图2rLZ-8对K562肿瘤细胞体外杀伤结果

图3rLZ-8诱导K562和NB4细胞凋亡PI单染检测结果

图4rLZ-8诱导K562和HL-60细胞凋亡Annexin V/PI双染检测结果

图5用流式细胞仪检测NB4细胞发生凋亡时线粒体膜电位的变化

图6接种S180艾氏腹水瘤细胞小鼠体重变化(横轴为时间(d)；纵轴为平均体重(g)；曲线符号-◆-代表S180组；-■-代表S180+rLZ-8组；-▲-代表CK组)

图7接种H22移植性肿瘤细胞小鼠体重变化((横轴为时间(d)；纵轴为平均体重(g)；曲线符号-◆-代表H22组；-■-代表H22+rLZ-8组；-▲-代表CK组))

图8FITC-rLZ-8(100ng.ml-1)对大鼠心肌组织的标记(暗、明场)

图9FITC-rLZ-8(100ng.ml-1)对兔软骨细胞的标记(暗、明场)

图10FITC-rLZ-8(100ng.ml-1)对HL-60细胞的标记(暗、明场)

注：以上图1-图5，C1代表NB4正常对照组；P代表As₂O₃阳性药对照组；C2代表K562正常对照组；C3代表HL-60正常对照组；R1-R6代表rLZ-8药物组(浓度由0.78μg·ml^-1-25μg·ml^-1)；H1-H6代表rLZ-8药物组(浓度为3.125μg·ml^-1-100μg·ml^-1)；I1-I3代表rLZ-8药物组(浓度分别为5μg·ml^-1、10μg·ml^-1和20μg·ml^-1)

具体实施方式：

实施例1：重组灵芝免疫调节蛋白的获得

1.rLZ-8基因人工合成、工程菌构建和筛选

根据毕赤酵母遗传密码偏爱性，在原有的灵芝免疫调节蛋白基因序列的基础上，重新设计编码了rLZ-8基因进行全基因合成，并与酵母α-因子前导肽编码序列相连成为融合基因，克隆入pMD18-T载体中。将测序正确的载体线性化，转入酵母基因组中，在MM和MD平板上筛选甲醇利用高效型Mut⁺菌株。

2.rLZ-8工程菌的表达

对规模发酵表达的温度、转速、pH值、装液体积、甲醇添加量等条件进行检测，确立了酵母工程菌在80L发酵罐规模下表达rLZ-8的工艺条件优化方法。根据rLZ-8的理化 特性，设计了发酵培养基的配方。目的蛋白产量约为800mg·L^-1。

3.rLZ-8纯化工艺

发酵液分离机离心→将上清用管式分离机→超滤→阳离子交换纯化柱→AKTA蛋白质纯化工作站制备目的蛋白→强阴离子交换作用层析→疏水作用纯化柱→凝胶过滤层析。

4.rLZ-8纯度鉴定及分子量测定

利用反相液相色谱对分离纯化的产物进行纯度分析，rLZ-8纯度为＞99％。

激光飞行质谱鉴定重组表达的rLZ-8分子量为12722。

5.rLZ-8高级空间结构的确定

利用悬滴气相扩散法获得了0.2cm×0.2cm×0.2cm的单晶。硒代晶体在MacChessF2beamline上收集了1.8埃分辨率的晶体衍射数据。非硒代母体晶体在MarResearch 345dtd像板衍射数据收集系统收集了一套1.8埃分辨率的晶体衍射数据。重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8亚基的二级结构由2个α-螺旋，7个β-折叠和一个无规则卷曲组成。

实施例2：rLZ-8对人早幼粒白血病细胞NB4的杀伤作用

1.试剂

rLZ-8除菌后用IMDM培养液配制成8个浓度，分别为0.78μg·ml^-1，1.56μg·ml^-1，3.125μg·ml^-1，6.25μg·ml^-1，12.5μg·ml^-1，25μg·ml^-1。

2.实验方法

96孔培养板中，试验孔加NB4肿瘤细胞0.1ml和rLZ-80.1ml，rLZ-8浓度由低到高；阴性对照组加NB4肿瘤细胞和培养液各0.1ml；阳性药物对照组为三氧化二砷As₂O₃；每组作6个复孔。置37℃、5％CO₂培养箱中48h，在细胞培养终止前4h加入MTT15μl(5mg ml^-1)，细胞培养终止后加入100μl 0.1mol L^-1盐酸异丙醇，在酶联免疫检测仪上570nm测OD值。

3.实验结果

表1和图1显示，rLZ-8药物组在OD_570nm的光吸收值与NB4正常对照组比较，有明显差异，说明rLZ-8在体外对NB4肿瘤细胞有较强杀伤作用。

表1rLZ-8对NB4细胞体外杀伤作用

各药物组与NB4正常对照组比较，^*P＜0.01

实施例3：rLZ-8对人慢性髓性白血病细胞K562的杀伤作用

1.试剂

rLZ-8除菌后用IMDM培养液配制成6个浓度，分别为3.125μg·ml^-1，6.25μg·ml^-1，12.5μg·ml^-1，25μg ml^-1，50μg·ml^-1，100μg·ml^-1。

2.实验方法

96孔培养板中，试验孔加K562肿瘤细胞0.1ml和rLZ-80.1ml，rLZ-8浓度由低到高；阴性对照组加K562细胞和培养液各0.1ml；阳性药物三氧化二砷；每组作6个复孔。置37℃、5％CO₂培养箱中48h，在细胞培养终止前4h加入MTT15μl(5mg·ml^-1)，细胞培养终止后加入100μl 0.1mol·L^-1盐酸异丙醇，在酶联免疫检测仪上570nm测OD值。

3.实验结果

表2和图2所示，rLZ-8药物组在OD_570nm的光吸收值与K562正常对照组比较，有明显差异，说明rLZ-8在体外对K562细胞同样具有杀伤作用。

表2rLZ-8对K562肿瘤细胞体外杀伤作用

各药物组与K562正常对照组比较，^*P＜0.01

实施例4：rLZ-8对血液肿瘤细胞凋亡作用的影响

1.PI单染流式细胞仪检测

1.1仪器和细胞株

荧光显微镜，型号LeicaASLMD、K562、NB4。

1.2试剂

rLZ-8分别设高、中、低三个剂量组，用含2％FCS的IMDM培养液配制成浓度为20μg·ml^-11，10μg/ml，5μg·ml^-1。碘化乙锭(PI)50μg·ml^-1。

1.3实验分组

K562设为正常对照组，rLZ-8低剂量组(5μg·ml^-1)、rLZ-8中剂量组(10μg·ml^-1)、rLZ-8高剂量组(20μg·ml^-1)；NB4设为正常对照组，rLZ-8低剂量组(5μg·ml^-1)、rLZ-8中剂量组(10μg·ml^-1)、rLZ-8高剂量组(20μg·ml^-1)。

1.4实验方法

将K562细胞与NB4细胞分别加入24孔板，1ml/孔，并加入不同浓度rLZ-8，1ml/孔，每组设3个复孔。置37℃、5％CO₂培养箱24h，将每个浓度组细胞收集，PBS洗涤2次并调整细胞浓 度为1×10⁶/ml，70％冰乙醇固定，置-20℃过夜。固定后细胞用PBS洗涤2次，加入PI(终浓度为50μg·ml^-1)室温避光孵育10min，1000r·min^-1离心5min，弃上清液用400μlPBS重悬沉淀。1h之内上机检测。

1.5实验结果

由表3和图3可见，与K562及NB4正常对照组比较，rLZ-8药物组细胞调亡率均有所提高，可以得出使细胞凋亡是rLZ-8杀死肿瘤细胞的途径之一。

表3rLZ-8对K562及NB4细胞凋亡诱导率(％)

2.Annexin V-FITC试剂盒流式细胞仪检测细胞凋亡

2.1仪器和细胞株

FACS Calibur型流式细胞仪美国Becton-Dickinson公司。NB4、HL-60。

2.2试剂

rLZ-8用含2％FCS的IMDM培养液配制成5μg·ml^-1、10μg·ml^-1、20μg·ml^-1，三氧化二砷(As₂O₃)5μg·ml^-1。AnnexinV-FITC试剂盒：结合缓冲液4×；碘化丙锭溶液(PI)，20μg·ml^-1，0.2ml；重组人Annexin V/FITC，0.1ml。

2.3实验分组

NB4设正常对照组，阳性药物组(As₂O₃5μg·ml^-1)，蛋白低剂量组(5μg·ml^-1)、中剂量组(10μg·ml^-1)、高剂量组(20μg·ml^-1)；HL-60设正常对照组，蛋白低剂量组(5μg·ml^-1)、中剂量组(10μg·ml^-1)、高剂量组(20μg·ml^-1)。

2.4实验方法

将NB4与HL-60细胞分别加入24孔板，1ml/孔，并加入不同浓度rLZ-8，1ml/孔，每组设3个复孔。置37℃、5％CO₂培养箱中24小时，将每个浓度组细胞收集，用4℃预冷的PBS洗细胞2次，用250μl结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为1×10⁶/ml。取100μl的细胞悬液于5ml流式管中，加入5μl Annexin V/FITC和10μl 20μg·ml^-1的PI溶液，混匀后于室温避光孵育15min，在反应管中加400μlPBS，流式细胞仪分析。

2.5实验结果

由图4及表4可以看出，NB4-rLZ-8组和HL-60-rLZ-8组凋亡率明显高于其正常对照组，并且，HL-60-rLZ-8组，随着rLZ-8浓度的增加，凋亡率亦增加。

表4rLZ-8对NB4及HL-60细胞凋亡诱导率(％)

图5是用流式细胞仪检测NB4细胞发生凋亡时线粒体膜电位的变化，rLZ-8三个实验组与正常组比较，线粒体膜电位均前移。经透射电子显微镜观察rLZ-8诱导发生凋亡的NB4细胞发现，线粒体形态呈不规则变化，并有线粒体肿大现象。

实施例5：rLZ-8的溶血实验

1.试剂

rLZ-8用5％葡萄糖溶液配制成1mg·ml^-1；血细胞悬液配制：人血4ml，1000r/min离心10min，去上清。将红细胞沉淀加入5％葡萄糖溶液约10倍量，摇匀，1000r/min离心20min，去上清，重复洗涤2-3次，至上清液不显红色为止。将所得红细胞用5％葡萄糖溶液配成2％的混悬液，供实验用。

2.实验方法

取洁净的试管28只，进行编号。1-5号为rLZ-8药物组，6号管为阴性对照组(5％葡萄糖溶液)，7号管为阳性对照管(蒸馏水)。共设4组平行对照管。依次加入2％红细胞悬液、5％葡萄糖或蒸馏水，混匀后，立即置37℃±0.5℃的恒温箱中温育。开始每隔15min观察1次，1h后每隔1h观察1次，共3小时。结束后将各管中的溶液置入干燥离心管中离心，1500r，25min。取上清，在分光光度计545nm处，以蒸馏水为空白读取各管OD值，计算溶血率。

3.实验结果

由表5可以看出，1-5组rLZ-8药物组溶血率均小于5％，可以说明未出现溶血反应。

表5rLZ-8对人红细胞致溶作用的实验结果

实施例6：rLZ-8对大鼠骨髓像的影响

1.实验材料

Waster大鼠9只，100g左右。rLZ-8用无菌生理盐水配制。分为60mg·kg^-1、30mg·kg^-1、15mg·kg^-1剂量组。

2.实验方法

正常对照组3只，蛋白低剂量组2只，蛋白中剂量组2只，蛋白高剂量组2只。rLZ-8药物组大鼠，分别给予不同剂量的rLZ-8尾静脉注射，1次/日；对照组给予等量生理盐水。给药第七天，取右侧大腿骨髓涂片。

3.实验结果

大鼠骨髓他涂片与正常对照组比较未见异常。

实施例7：rLZ-8对人红细胞凝聚作用的影响

1.试剂

A型、B型、O型和AB型血各2ml分别来源于健康志愿者；绵羊红细胞(sheep red cell)2ml。将上述红细胞1200g·min^-1离心10min，弃上清，用5ml PBS洗涤，重复上述操作3-5次，然后用0.01mol/L PBS配制成1.5％悬液。rLZ-8用生理盐水配置，使其终浓度分别为50μg·ml^-1，25μg·ml^-1，12.5μg·ml^-1，6.25μg·ml^-1，3.13μg·ml^-1，1.56μg·ml^-1，0.78μg·ml^-1，0.39μg·ml^-1，0.20μg·ml^-1，0.10μg·ml^-1，0.05μg·ml^-1，0.03μg·ml^-1。植物凝集素(PHA)配制同上。

2.实验方法

将实验对象分为rLZ-8各浓度组、阳性药对照组，正常对照组。

96孔微量血凝板中加入A型1.5％红细胞25μl/孔，再加入0.2％明胶，75μl/孔。药物组分别加不同浓度rLZ-8，其终浓度如上所述；阳性药对照组PHA25μl/孔；正常对照组PBS25μl/孔。每组设6个平行对照。室温下振荡30s，37℃培养箱，1小时后开始观察。B型、AB型、O型及绵羊红细胞实验方法同上。

3.试验结果

由表6所示，阳性对照药PHA对人四种红细胞及绵羊红细胞均具有凝集作用；rLZ-8对人四种红细胞无凝集作用，而在12.5μg·ml^-1-50μg·ml^-1浓度时对绵羊红细胞表现出凝集活性。

表6rLZ-8对人四种型别红细胞凝集作用实验结果

实施例8：rLZ-8对大鼠白细胞的影响

1.实验材料

Waster大鼠18只，100g左右。

试剂：

(1)rLZ-8用无菌生理盐水配制。分为60μg·kg^-1、30μg·kg^-1、15μg·kg^-1剂量组。

(2)金磊赛强[重组人粒细胞集落刺激因子注射液(rhG-CSF)]，生产批号：20060403；75μg/支。用无菌生理盐水配制成13.5μg·ml^-1，0.1ml/只。

(3)注射用环磷酰胺(CP)，生产批号050216；200mg/支。用无菌生理盐水配制：20mg·ml^-1，0.1ml/只，即20mg·kg^-1。

2.实验方法

正常对照组，蛋白低剂量组，蛋白高剂量组，蛋白高剂量组，阳性对照组(金磊赛强)。

除正常对照组(给予等量生理盐水)外，每组大鼠均给予环磷酰胺尾静脉注射，20mg·ml^-1，0.1ml/只，连续3天。于第三天，大鼠尾静脉取血，送吉林大学第一医院检验科，细胞分析仪检测白细胞数。造模成功后按上述分组分别给予相应剂量rLZ-8及阳性药(金磊赛强)治疗，正常对照组和CP组给予等量生理盐水，于治疗第3天和第7天分别大鼠尾静脉取血，送吉大一院检测白细胞数。对比治疗前后白细胞数变化，分析药物疗效。

3.实验结果

由表7可以看出，与CP对照组比较，在给药第3天rLZ-8药物组已明显升高大鼠白细胞，差异及其显著，在给药第7天基本达到正常。

表7rLZ-8对白细胞低下大鼠模型的影响

与CP对照组比较，^*P＜0.01

实施例9：rLZ-8对小鼠S180艾氏腹水瘤的抑制实验

1.实验材料

小鼠，体重18-22g，雌雄各半，由吉林大学实验动物中心提供。小鼠艾氏腹水细胞株S180由本室提供。环磷酰胺(CTX)，江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：06101921。S180腹水瘤及实体瘤实验组均分为正常对照组、阴性对照组、阳性对照组、rLZ-8低剂量治疗组(0.25mg·kg^-1)、rLZ-8中剂量治疗组(0.5mg·kg^-1)、rLZ-8高剂量治疗组(1mg·kg^-1)。每组10只。

2.实验方法

S180皮下抑瘤实验方法：取生长良好的S180细胞，以适量无菌生理盐水稀释成瘤细胞悬液，细胞计数为10⁷·L^-1，每鼠右腋窝皮下接种0.2ml(正常对照组除外)。接种24h后，给予治疗。正常对照组和阴性对照组给予生理盐水0.2ml·只^-1·d^-1，腹腔注射；阳性对照组给予 环磷酰胺20mg·kg^-1，0.2ml·只^-1·d^-1，腹腔注射。rLZ-8治疗组分别给予相应剂量尾静脉注射，0.2ml·只^-1·d^-1。连续10天。分别于给药前、给药10d后从小鼠眼眶静脉丛取血，送检于吉大一院检验科测白细胞数。并在停药次日，颈椎脱臼处死全部小鼠，解剖取出瘤块，称瘤重。

按下式计算抑瘤率：

抑瘤率(％)＝(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％

S180腹水抑瘤实验方法：取生长良好的S180细胞，以适量无菌生理盐水稀释成瘤细胞悬液，细胞计数为10⁷·L^-1，每鼠腹腔接种0.2ml(正常对照组除外)。接种24h后，给予治疗。正常对照组和阴性对照组给予生理盐水0.2ml·只^-1·d^-1，腹腔注射；阳性对照组给予环磷酰胺20mg·kg^-1，0.2ml·只^-1·d^-1，腹腔注射。rLZ-8治疗组分别给予相应剂量尾静脉注射，0.2ml·只^-1·d^-1。连续10天。每日称重，观察小鼠体重变化程度，作体重增长曲线。

3.实验结果

S180皮下抑瘤实验结果：由表8可以看出，3个剂量的rLZ-8均能抑制S180的生长，抑瘤率分别为16.8％、25.7％和45.5％。rLZ-8治疗组瘤重与阴性对照组比较，均极有显著差异(P＜0.01)。

由表9可以看出，给药前，各组小鼠白细胞数均在同一水平上，与阴性对照组比较无差异(P＞0.05)。治疗10天后，阴性对照组白细胞数较正常对照组高，rLZ-8低剂量组和中剂量组白细胞数与阴性对照组比较无差异(P＞0.05)，高剂量组与正常对照组比较无差异(P＞0.05)，阳性对照组白细胞数明显降低，与正常对照组及阴性对照组比较均有显著差异(P＜0.01)。

表8rLZ-8对小鼠移植性肿瘤S180的抑制作用

与阴性对照组比较，^*P＜0.01

表9rLZ-8对小鼠移植性肿瘤S180白细胞影响

与阴性对照组比较，^*P＜0.01；^**P＞0.05

S180腹水抑瘤实验结果：实验结果表明，各组小鼠腹水出现时间基本一致，阴性对照组小鼠体重增长迅速，存活时间减少。由图6可见，rLZ-8组小鼠平均体重增长趋势比正常组大，但比阴性对照组比较小。说明rLZ-8能够在一定程度上抑制小鼠腹腔S180肿瘤细胞的增长。

实施例10：rLZ-8对小鼠肝癌细胞H22的抑制实验

1.实验材料

小鼠，体重18-22g，雌雄各半，由吉林大学实验动物中心提供。小鼠肝癌细胞株H22，由本室提供。环磷酰胺(CTX)，江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：06101921。

2.实验方法

H22肝癌细胞实验组均分为正常对照组、阴性对照组、阳性对照组、rLZ-8低剂量治疗组(0.25mg·kg^-1)、rLZ-8中剂量治疗组(0.5mg·kg^-1)、rLZ-8高剂量治疗组(1mg·kg^-1)。每组10只。

H22皮下抑瘤实验方法：取生长良好的H22细胞，以适量无菌生理盐水稀释成瘤细胞悬液，细胞计数为10⁷·L^-1，每鼠右腋窝皮下接种0.2ml(正常对照组除外)。接种24h后，给予治疗。正常对照组和阴性对照组给予生理盐水0.2ml·只^-1·d^-1，腹腔注射；阳性对照组给予环磷酰胺20mg·kg^-1，0.2ml·只^-1·d^-1，腹腔注射。rLZ-8治疗组分别给予相应剂量尾静脉注射，0.2ml·只^-1·d^-1。连续10天。分别于给药前、给药10d后从小鼠眼眶静脉丛取血，送检于吉大一院检验科测白细胞数。并在第停药次日，颈椎脱臼处死全部小鼠，解剖取出瘤块，称瘤重。

按下式计算抑瘤率：

抑瘤率(％)＝(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％

H22腹水抑瘤实验方法：取生长良好的H22细胞，以适量无菌生理盐水稀释成瘤细胞悬液，细胞计数为10⁷·L^-1，每鼠腹腔接种0.2ml(正常对照组除外)。接种24h后，给予治疗。正常对照组和阴性对照组给予生理盐水0.2ml·只^-1·d^-1，腹腔注射；阳性对照组给予环磷酰胺20mg·kg^-1，0.2ml·只^-1·d^-1，腹腔注射。rLZ-8治疗组分别给予相应剂量尾静脉注射，0.2ml·只^-1·d^-1。连续10天。每日称重，观察小鼠体重变化程度，作体重增长曲线。

3.实验结果

H22皮下抑瘤实验结果：由表10可以看出，3个剂量的rLZ-8均能抑制S180的生长，抑瘤率分别为16.7％、30.0％、42.5％。rLZ-8治疗组瘤重与阴性对照组比较，均有极显著差异(P＜0.01)。

表10rLZ-8对小鼠移植性肿瘤H22的抑制作用

与阴性对照组比较，^*P＜0.01

由表11看出，给药前，各组小鼠白细胞数均在同一水平上，与阴性对照组比较无差异(P＞0.05)。治疗10天后，阴性对照组白细胞数较正常对照组高，rLZ-8低剂量组和中剂量组白细胞数与阴性对照组比较无差异(P＞0.05)，高剂量组与正常对照组比较无差异(P＞0.05)，阳性对照组白细胞数明显降低，与正常对照组及阴性对照组比较均有显著差异(P＜0.01)。

表11rLZ-8对小鼠移植性肿瘤H22白细胞影响

与阴性对照组比较，^*P＜0.01；^**P＞0.05

H22腹水抑瘤实验结果：实验结果显示rLZ-8组小鼠生存时间比阴性对照组延长，阴性对照组小鼠食欲减退，但体重增长迅速，活动减少。由图7可见，rLZ-8组小鼠平均体重增长趋势比正常组大，但比阴性对照组比较小。说明rLZ-8能够在一定程度上抑制小鼠腹腔H22肿瘤细胞的增长。

实施例11：rLz-8荧光标记及其对正常组织细胞和Hl-60细胞的影响

1.rLz-8的FITC荧光素标记

(1)试剂与仪器

荧光色素(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte，FITC)，吉尔生化(上海)；二甲基亚砜；碳酸盐缓冲液(pH 8～9.5)(Na₂CO₃ 4.3g，NaHCO₃ 8.6g加ddH₂O至500ml)；磷酸盐缓冲液(PBS)；Desalting Hiprep 26/10脱盐柱；AKTA purifier；日立分光光度计等。

(2)实验方法

将纯化的rLZ-8(7.5mg·ml^-1)20ml对碳酸盐缓冲液(pH8.3)透析过夜，称取3.75mg FITC，加入二甲亚砜(DMSO)3.75ml配制成FITC-DMSO溶液。在50ml小烧杯中先放入rLZ-8按FITC-DMSO溶液逐滴加入rLZ-8溶液中，用PBS加至30ml，磁力搅拌器室温下避光搅拌4h， 用Desalting Hiprep 26/10脱盐柱于AKTA purifier系统上除去游离荧光素，75ml PBS洗脱，280nm、495nm检测，峰收集。

(3)实验结果

将制备的FITC-rLZ-8(10倍稀释)于220nm～520nm扫描，A₄₉₅＝0.445，A₂₈₀＝0.67，计算标记效率(F/P)为3.80。

2.对大鼠心肌组织的标记作用

(1)试剂与仪器

Leica CM1850冷冻切片机；wistar大鼠；荧光显微镜80i(Nikon)；等渗PBS缓冲液(pH7.2)；胎牛血清(FBS，Gibco)；FITC-rLZ-8本室制备。

(2)实验方法

将大鼠脱颈处死，去心脏，置于冷冻切片机，待温度降至-20℃进行切片，将心肌组织切片与PBS配制的FITC-rLZ-8溶液(100ng·ml^-1)37℃孵育1h后，荧光显微镜下观察，并设空白对照组。

(3)实验结果

荧光显微镜下观察心肌组织无可见荧光，与空白对照组无差异，见图8。

3.对原代培养兔软骨细胞的标记作用

(1)试剂与仪器

日本大耳白兔(雄性，2.5kg)4只；手术器械；0.25％胰酶+0.02％EDTA；0.2％‖型胶原酶；D-Hanks；IMDM培养基(50mg·ml^-1维生素c、双抗)；0.025mg·ml^-1多聚赖胺酸；无菌水(WFI)。

(2)实验方法

固定实验动物，空气栓塞处死，腹正中剥皮暴露四肢，大剪刀剪开肌肉筋膜，由骨干断开长骨后，小心取下整个膝、髋和肩部骨，粗略修剪后浸入D-Hanks。将装有组织的烧杯移进入超净台，组织清洗修剪后移入第二杯无菌D-Hanks。组装手术刀，用刀片轻轻削下一薄层软骨，弯镊移植入6cm培养皿，然后D-Hanks洗三次，弃去大部分D-Hanks，眼科剪剪碎软骨片至1mm。弃去多余D-Hanks，小勺转移碎骨片至10cm²培养瓶，加胰酶-EDTA消化，37℃、30min；弃去胰酶更换为胶原酶，摇匀后置37℃孵箱，每1h取出振摇5min，经4-4.5h，结束消化。制细胞悬液并加入3ml含FBS 15％的IMDM，以5×10⁴.ml^-1接种于培养瓶。

细胞接种于24孔板，每孔0.5ml，设空白对照组，以终浓度为0.25μg·ml^-1的FITC-rLZ-80.5ml，37℃孵育1h。将细胞移入1.5ml EP管离心(1000r·min^-1，7min)，以等渗PBS洗3次，向EP管中加入0.1ml PBS，重悬细胞。取悬液于荧光显微镜观察。

(3)实验结果

荧光显微镜下观察，兔软骨细胞形态完好，无绿色荧光，与对照组相比无显著差异。

各实验组照片如图9所示。

4.对Hl-60细胞的标记作用

(1)试剂与仪器

荧光显微镜80i(Nikon)，IMDM细胞培养液(Hyclone)，胎牛血清(FBS，Gibco)，FITC-rLZ-8和等渗PBS缓冲液(pH7.2)本室制备。

(2)实验方法

将HL-60以2×10⁶接种于24孔培养板中，每孔0.5ml，以IMDM(2％FBS)培养液配制FITC-rLZ-8为100ng·ml^-1，每孔0.5ml孵育(37℃)，设空白对照组、1h实验组和6h实验组。分别于1h和6h取出细胞加入至1.5mlEP管中，1000r·min^-1离心，弃上清，以PBS清洗3次，洗净重悬。

(3)实验结果

如图10，荧光显微镜下观察，经FITC-rLZ-8孵育1h和6h的HL-60细胞绿色荧光强，其中6h组细胞出现凝集，空白对照组无绿色荧光，与前者具显著差异。

实施例12：重组灵芝免疫调节蛋白抗肿瘤组合物制剂

1.通过上述药理实验证明，重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8的抗肿瘤作用和提高白细胞水平的效果是显著的，而且无毒副作用，因此。可以认为重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8适于药物使用而且是安全的。

2.本发明的重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8作为抗肿瘤药物的应用可以通过口服和非肠道给药。服用的剂量由症状、年龄、体重等因素决定。对成年人来说，口服，每人每剂10-1000mg，每日数次；非肠道给药10-100mg，每日数次。

3.本发明口服药包片剂、丸剂胶囊(包括硬胶囊和软胶囊)，这些剂型包括重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8和至少一种惰性稀释剂(例如乳糖、甘露糖醇、葡萄糖、淀粉、聚乙烯吡咯烷酮)也可以加入惰性稀释剂以外的药物学上可以接受的添加物如润滑剂、崩解剂、稳定剂。如果需要，片剂或丸剂可用胃溶或肠溶材料涂敷上一层或一层以上的膜。非肠道用注射剂包括重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8和至少一种惰性水稀释剂(如注射用蒸馏水、生理盐水)，也可以将重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8制成冻干粉，使用前将其溶解于惰性水稀释剂供注射用。

(1)制剂例1

取重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8 1000mg，溶于100ml无菌生理盐水中，混合均匀后，分装成rLZ-8 10mg/ml/支浓度的注射液于药瓶中，密封，灭菌制成产品。其他项目应符合中华人民共和国药典2005年版注射液项下要求。

(2)制剂例2

取重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8100g，，药用淀粉0.5kg按公知的胶囊制备技术和设备制成 胶囊，rlz8 10mg/粒.其他项目应符合中华人民共和国药典2005年版胶囊项下要求。

(3)制剂例3

取重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8 100g，微晶纤维素560g，无水乳糖380g，硬脂酸镁200g，按公知的制片技术和设备制成片剂，rLZ-8 10mg/片.其他项目应符合中华人民共和国药典2005年版片剂项下要求。

(4)制剂例4

取重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8适量，中华人民共和国药典2005年口服液项下要求，按公知的制片技术和设备制口服液。

Claims (3)

1.重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8在制备治疗白细胞减少症的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的药物是由活性成分重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8和任选的药学可接受的辅剂组成。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的药物给药途径为口服和非肠道给药，口服给药包括口服液、片剂、丸剂和胶囊；非肠道给药包括外用药和注射剂。