CN103463618B - 重组灵芝免疫调节蛋白在制备治疗局灶性脑缺血药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及毕赤酵母（Pichiapastoris）所表达的重组灵芝免疫调节蛋白（rLZ-8）在制备治疗局灶性脑缺血药物中的应用。rLZ-8能够治疗神经功能损伤，降低脑损伤引起的神经功能评分，减少ED-1阳性细胞数，从而降低炎性反应，并可抑制细胞凋亡。

Description

重组灵芝免疫调节蛋白在制备治疗局灶性脑缺血药物中的应用
技术领域
本发明属于生物制药领域，涉及使用毕赤酵母（Pichia pastoris）表达的重组灵芝免疫调节蛋白（rLZ-8）在制备治疗局灶性脑缺血药物中的应用。
背景技术
灵芝是中医药学中一种珍贵的药用真菌，属担子菌纲多孔菌目灵芝科。灵芝免疫调节蛋白首次由Kino等从灵芝子实体提取物中分离纯化得到的真菌免疫调节蛋白，由110个氨基酸所组成，N端丝氨酸乙酰化，蛋白分子质量为12.4kD，并命名为LZ-8。很多研究表明，LZ-8具有促进细胞有丝分裂和免疫调节的作用等多种活性。重组灵芝免疫调节蛋白（Recombinant Immunoregulatory Protein of Ganoderma Lucidium，rLZ-8）是经由rLZ-8真核表达载体PichiaPinkTM菌株，筛选出稳定高效分泌表达的工程菌株中提取，并验证rLZ-8具有与LZ-8相同的免疫学活性与生物活性。
脑缺血是脑血管意外的一种，脑血管意外又称脑卒中、中风，是中老年人的常见病、多发病，严重威胁着人类的健康与生活。近些年来，随着科学技术的不断发展，研究学者对脑缺血病发病机制、脑组织细胞损伤级联反应等的深入研究，发现可通过抑制细胞凋亡、降低炎症反应与自由基等多种途径来缓解脑组织损伤。
本发明的重组灵芝免疫调节蛋白不仅可改善脑缺血损伤引起的行为功能障碍，而且可通过降低炎症反应、抑制细胞凋亡缓解脑组织损伤，对应用重组灵芝免疫调节蛋白研制治疗脑缺血损伤药物有一定的积极作用。
发明内容
本发明涉及重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8在制备治疗局灶性脑缺血药物中的应用，通过一系列的实验手段和结果表明rLZ-8对大鼠局灶性脑缺血具有显著的治疗作用，具体发明内容如下：
本发明以大鼠作为研究对象，采用改良的Zea Longa法制备大鼠局灶性脑缺血模型，设计了包括阴性对照组（假手术组），阳性药对照组（单唾液酸巳己糖神经节苷脂钠注射液（GM-1）），模型组， rLZ-8高剂量组（70μg·kg-1）、rLZ-8中剂量组（35μg·kg -1）、rLZ-8低剂量组（17.5μg·kg -1）在内的6个实验组。在给药程序方面设计为：腹腔注射，每天给药2次，假手术组与模型组注射等体积生理盐水，连续给药7天。首先，考察了rLZ-8对神经功能损伤的治疗作用，按改良的NSS评分标准对其进行评分（16分制），各给药组及模型组动物在造模后（当日，术后约5h）均出现不同程度神经功能障碍，rLZ-8高、低剂量组评分效果显著（p<0.01），说明rLZ-8可降低神经功能评分，改善神经功能。有力说明了，rLZ-8对局灶性脑缺血的治疗作用；通过HE染色实验，假手术组脑组织神经元及胶质细胞数量、形态分布正常，细胞膜完整，胞浆均匀，细胞核位于中央，染色质分布较均匀；模型组脑组织稀疏，可见大量坏死神经元，细胞结构消失，胞核固缩深染，细胞坏死崩解，细胞间隙增大，坏死面积较大；rLZ-8高剂量组动物脑组织较模型组有不同程度的改善，表现为胞核固缩、溶解等病理改变较轻，坏死面积较小。采用PV-6000二步法免疫组化检测试剂对实验大鼠进行ED-1阳性细胞表达的检测，结果表明与模型组比较，rLZ-8高剂量组ED-1阳性细胞数明显减少，可降低脑缺血损伤引起的炎性反应。采用TUNEL试剂盒检测细胞凋亡，按照试剂盒说明书指导步骤进行试验，实验结果表明rLZ-8剂量组凋亡细胞数明显低于模型组，并且随着rLZ-8浓度的增加，细胞凋亡数逐渐减少。进一步说明了，rLZ-8对局灶性脑缺血的治疗作用。
经过上述重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8在制备治疗局灶性脑缺血药物中的应用的一系列实验结果表明， rLZ-8能够治疗和缓解实验大鼠的神经损伤和生存状态，抑制脑组织细胞凋亡而治疗脑缺血损伤。
说明书附图说明
图1  各组大鼠体重变化
其中，S为假手术组，M为模型组，GM-1为阳性药对照组，H为rLZ-8高剂量组，Z为rLZ-8中剂量组，L为rLZ-8低剂量组
图2  各组大鼠脑组织形态学观察（HE染色，40×）
其中，A为假手术组，B为模型组，C为GM-1组，D为rLZ-8高剂量组，E为rLZ-8中剂量组，F为rLZ-8低剂量组
图3  造模8天后各组ED-1阳性细胞（40×）
其中，A为假手术组，B为模型组，C为GM-1组，D为rLZ-8高剂量组，E为rLZ-8中剂量组，F为rLZ-8低剂量组
图4  造模8天后各组凋亡细胞（40×）
其中，A为假手术组，B为模型组，C为GM-1组，D为rLZ-8高剂量组，E为rLZ-8中剂量组，F为rLZ-8低剂量组
具体实施方法
实施例 1：rLZ-8对神经功能损伤的治疗作用
1. 实验材料
大鼠，体重250-300g，雌雄各半，由吉林大学实验动物中心提供。单唾液酸巳己糖神经节苷脂钠注射液（GM-1），北京四环制药有限公司，手术器械。
2. 实验方法
采用改良的Zea Longa法制备大鼠局灶性脑缺血模型，术后待大鼠完全清醒后，每天按改良的NSS评分标准对其进行评分（16分制）。实验设假手术组，模型组，阳性药对照组，rLZ-8高剂量组（70μg·kg-1）、rLZ-8中剂量组（35μg·kg -1）、rLZ-8低剂量组（17.5μg·kg -1）。腹腔注射，每天给药2次，假手术组与模型组注射等体积生理盐水，连续给药7天。阳性对照药为单唾液酸巳己糖神经节苷脂钠注射液（GM-1）。
3. 实验结果
表1显示，各给药组及模型组动物在造模后（当日，术后约5h）均出现不同程度神经功能障碍，以模型组神经功能评分最高，rLZ-8高、低剂量组评分可明显改善（p<0.01），说明rLZ-8可降低神经功能评分，改善神经功能。
表1 各组大鼠NSS评分结果（x ± s，n=12）
组 别 第0天 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天 第7天
Sham 0 0 0 0 0 0 0 0
M 6.75±1.69 4.75±1.42 3.92±0.67 3.67±0.78 3.25±0.72 3.00±0.74 2.83±0.94 2.75±0.87
GM-1 4.75±1.30▲▲ 4.33±1.30 3.92±1.38 3.58±1.24 2.75±1.09 2.50±1.00 2.58±1.08 2.41±1.00
rLZ-H 4.17±1.67▲▲ 4.00±2.00 3.67±1.78 3.17±1.53 2.58±1.11 2.50±1.09 2.25±1.06 2.17±0.94
rLZ-M 6.75±2.20 4.67±1.30 4.00±0.85 3.58±1.00 3.17±0.90 3.00±0.85 2.83±0.83 2.58±0.90
rLZ-L 4.25±1.09▲▲ 4.00±0.95 3.75±0.75 3.33±0.89 2.83±1.00 2.33±0.89 2.25±0.97 2.17±0.94
注：各给药组及模型组与假手术组比较有显著性差异p<0.01；与模型组比较， ▲ p<0.05， ▲▲ p<0.01；
实施例 2：rLZ-8对大鼠体重的影响
1. 实验方法
造模前，对大鼠进行称重，采用改良的Zea Longa法制备大鼠局灶性脑缺血模型，术后第1天称重，连续给药7天后，称重。
2. 实验结果
    表2和图1显示，造模前，各组大鼠体重无明显差异，造模后，各组大鼠体重明显降低，给药7天后，rLZ-8高剂量组大鼠体重有所增加，表明rLZ-8可降低脑缺血引起的损伤。
表2   各组大鼠体重变化（x± s）
组 别 造模0天 造模第1天 造模第8天
Sham 268.33±13.87 267.17±13.73 295.00±24.22
M 261.50±16.57 235.67±18.97** 230.17±26.49**
GM-1 266.17±21.21 246.17±21.99 251.17±40.31*
rLZ-H 261.67±16.23 245.00±29.17 250.50±34.23*
rLZ-M 262.50±19.64 234.50±21.49* 229.67±38.85**
rLZ-L 265.17±31.53 241.83±36.97 237.67±38.10*
注：与假手术组比较：*p<0.05，**p<0.01
实施例 3：HE染色实验
1. 实验方法
灌注固定：大鼠以水合氯醛麻醉后仰卧位固定，开胸暴露心脏，将灌注针经左心室尖部插入升主动脉，先用生理盐水快速灌注，同时剪开右心耳，止血钳夹腹主动脉，当流出液不见血色时，快速灌注固定液，身体变硬时停止灌注，断头取出脑组织。利用大鼠脑切片模具，制备冠状脑切片，福尔马林固定，选择视交叉水平脑切片（第3片），常规石蜡包埋，切片。
HE染色：（1）二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ脱蜡，各15min；（2）无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、95%乙醇、90%乙醇、85%乙醇水化，各3min，蒸馏水，1min；（3）苏木素染色，5~10min；（4）流水吸取苏木素，1min；（5）1%盐酸-乙醇分化，1~3s；（6）返蓝，流水洗1~3min；（7）伊红染色，3~5min；（8）蒸馏水洗，1~3min；（9）脱水、透明，中性树胶封片；（10）光学显微镜下初步观察病理切片。
2. 实验结果
    由图2可见，假手术组脑组织神经元及胶质细胞数量、形态分布正常，细胞膜完整，胞浆均匀，细胞核位于中央，染色质分布较均匀；模型组脑组织稀疏，可见大量坏死神经元，细胞结构消失，胞核固缩深染，细胞坏死崩解，细胞间隙增大，坏死面积较大；rLZ-8高剂量组动物脑组织较模型组有不同程度的改善，表现为胞核固缩、溶解等病理改变较轻，坏死面积较小。
实施例 4：rLZ-8可降低炎性反应
1. 实验试剂
rLZ-8分别设高、中、低三个剂量组，用生理盐水配制成浓度为70μg·ml-1，35μg·ml-1，17.5μg·ml-1。ED-1抗体（武汉博士德生物工程有限公司），PV-6000二步法免疫组化检测试剂（北京中杉金桥生物技术有限公司）。
2. 实验分组
实验设假手术组，模型组，阳性药对照组，rLZ-8高剂量组（70μg·kg -1）、rLZ-8中剂量组（35μg·kg -1）、rLZ-8低剂量组（17.5μg·kg -1）。
3. 实验方法
常规石蜡包埋、切片后，采用免疫组织化学染色的方法检测ED-1阳性细胞的表达。（1）烤片：脑组织石蜡切片置于60℃烤箱中30~60min，自然凉；（2）脱蜡：脑组织切片于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各15min；（3）水化：脑组织切片于无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、90%乙醇、70%乙醇、蒸馏水中各2min；（4）预处理：根据所应用的一抗的特殊要求，对组织切片进行预处理。0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）热修复抗原；（5）3%H2O2去离子水孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶，PBS清洗3次，每次5min；（6）滴加ED-1抗体，4℃ 过夜，PBS清洗3次，每次5min；（7）滴加通用型IgG抗体-HRP多聚体，室温孵育15min，PBS清洗3次，每次5min；（8）应用DAB溶液显色；（9）蒸馏水冲洗、苏木精复染、脱水、透明，中性树胶封片；（10）光学显微镜下观察。
4. 实验结果
由表3和图3可见，与模型组比较，rLZ-8高剂量组ED-1阳性细胞数明显减少，可降低脑缺血损伤引起的炎性反应。
表3  各组造模8天后ED-1阳性细胞数（x ± s）
组 别 ED-1
Sham 8.73±2.93
M 24.53±4.04**
GM-1 13.87±2.39*▲
rLZ-H 15.27±1.42*▲
rLZ-M 20.00±2.62#**
rLZ-L 19.00±2.31**
与假手术比较 * p<0.05 ， ** p<0.01；与模型组比较 ▲ p<0.05 ；与GM-1组比较 # p<0.05。
实施例 5：TUNEL试剂盒检测细胞凋亡
1. 实验试剂
rLZ-8分别设高、中、低三个剂量组，用生理盐水配制成浓度为70μg·ml-1，35μg·ml-1，17.5μg·ml-1，TUNEL试剂盒。
2. 实验分组
实验设假手术组，模型组，阳性药对照组，rLZ-8高剂量组（70μg·ml-1）、rLZ-8中剂量组（35μg·ml-1）、rLZ-8低剂量组（17.5μg·ml-1）。
3. 实验方法
常规石蜡包埋、切片，按TUNEL试剂盒说明书操作。（1）脑组织石蜡切片常规脱蜡、水化；（2）用胰蛋白酶处理，37℃，暗湿盒中15~60min；（3）PBS漂洗2次，每次5min；（4）加50μl TUNEL反应混合液（阴性对照组尽加50μl荧光素标记的dUTP液）于标本上，在37℃暗湿盒中反应，1h；（5）PBS漂洗3次，每次5min；（6）加50μl Converter-POD 于标本上，在37℃暗湿盒中反应，30min；（7）PBS漂洗3次，每次5min；（8）在组织处加50~100μl DAB溶液显色；（9）蒸馏水冲洗、苏木精复染、脱水、透明，中性树胶封片；（10）光学显微镜下观察。
4. 实验结果
由表4和图4可见，rLZ-8剂量组凋亡细胞数明显低于模型组，并且随着rLZ-8浓度的增加，细胞凋亡数逐渐减少。
表4   各组造模8天后凋亡细胞数（x ± s）
组 别 TUNEL
Sham 7.87±0.12
M 45.20±3.81**
GM-1 23.10±2.47**▲▲
rLZ-H 18.80±4.08**▲▲
rLZ-M 33.20±2.16**▲▲##
rLZ-L 39.27±4.80**##
注：与假手术比较， ** p<0.01；与模型组比较， ▲▲ p<0.01；与GM-1组比较， ## p<0.01。

Claims (5)

1.重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8在制备治疗局灶性脑缺血药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于重组灵芝免疫调节蛋白降低由脑缺血损伤引起的神经功能评分。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于重组灵芝免疫调节蛋白减少ED-1阳性细胞数，降低炎性反应，治疗脑缺血损伤。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于重组灵芝免疫调节蛋白降低凋亡细胞数，抑制脑组织细胞凋亡。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于给药途径为口服和非肠道给药，其中，口服包括口服液，片剂，丸剂和胶囊；非肠道给药包括外用药和注射剂。
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