CN116196333A - 一种负载thc的干细胞源外泌体皮肤稳态剂及其制备方法、应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种负载四氢姜黄素（THC）的干细胞源外泌体皮肤稳态剂及其制备方法、应用。本发明的皮肤稳态剂含负载THC的外泌体（THC‑exo）、舒缓剂、保湿剂和依克多因（ectoin）等成分，可以减少炎症性皮肤疾病症状的严重程度和激素使用频率。该皮肤稳态剂不具有刺激性，不含激素和防腐剂，在降低促炎介质表达的同时，修复受损皮肤屏障，增强皮肤细胞解毒功能，如抵抗氧化损伤、抗凋亡，维持皮肤内稳态平衡，是一种有效治疗或辅助治疗炎症性皮肤疾病的皮肤稳态剂。

Description

一种负载THC的干细胞源外泌体皮肤稳态剂及其制备方法、 应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种负载THC的干细胞源外泌体皮肤稳态剂及其制备方法、应用。
背景技术
炎症性皮肤疾病，如特应性皮炎(AD)、银屑病、硬皮病、痤疮以及影响皮肤的自身免疫性疾病，包括移植物抗宿主病（GvHD）和系统性红斑狼疮（SLE），导致生活质量严重恶化，已成为世界范围的健康问题之一。快速工业化增加了二氧化碳和各种废气的产量，导致了多种形式的空气污染和高过敏原环境，柴油排气颗粒可直接诱导肥大细胞(MCs)释放组胺，并加重过敏症状，致使炎症性皮肤疾病患者每年呈递涨趋势。瘙痒、失眠和长期的不适导致炎症性皮肤患者的生活质量下降，造成极大的心理和经济负担。然而，对于这些疾病的治疗方法有限，尤其是对局部类固醇或全身免疫抑制剂无反应的患者，临床上尚无更好的治疗方法。一些抗体药物，且存在重复给药副作用大、给药长达数月才能起到治疗效果的缺点。
间充质干细胞(MSCs)，细胞治疗领域的主要干细胞，已在临床使用超过10年，是一种安全有效的治疗各种顽固性的自身免疫性和炎症性疾病的生物制剂。早期的研究报道，MSC可以迁移到损伤部位，然后分化为功能细胞，或与受损细胞融合，再生受损组织。至今，仍缺少MSC在损伤部位进行有效分化参与治疗机制的证据。研究显示，MSC可以通过旁分泌机制，释放可溶性免疫调节因子，如 IDO（indoleamine-2，3-dioxygenase， 吲哚胺 2，3-双加氧酶），PGE2（prostaglandin E2）， TSG6（tumour necrosis factor（TNF）-stimulated gene 6 protein）以及外泌体等生物活性物质帮助恢复健康的皮肤微环境，促进组织修复，参与免疫调节。这些生物活性物质亦称为MSC的分泌组（MSC-Sec），为“无细胞”治疗带来了发展。两项临床试验证实了MSC-Sec在治疗炎症性皮肤病方面的潜力，其积极结果是改善了AD患者的皮肤屏障功能，并减少了银屑病头皮患者的银屑病斑块。然而，MSC-Sec含有MSC分泌的多种细胞因子、可溶性蛋白、代谢物等，成分复杂，作用机制不明确，不适宜进一步在临床中推广使用。多数研究显示，MSC-Sec中的外泌体（exo）成分是其起组织修复以及免疫调节等功能的主要有效成分。外泌体属于细胞外囊泡的一种，直径30-150 nm，通过体液循环，进入附近或远处的靶细胞，并通过直接融合、内吞和受体配体的结合传递功能性mRNA、miRNA、蛋白质和脂质促进细胞间的通信，从而参与人体的多种生理和病理过程，如抗原呈递、免疫反应和细胞分化。研究表明，脐带间充质干细胞分泌的外泌体（UCMSC-exo）具有独特的免疫调节特性，这是其成为治疗各种炎症性疾病的潜在机制。
MSC-exo是 MSC 分泌的独特的亚细胞结构的物质，从而介导了一些归属于间充质干细胞的生物学功能，如组织再生、免疫调节和神经保护。现有的体外和体内实验证据表明，MSC-exo具有促进抗凋亡，促血管生成和抗纤维化活性，特别是表现出与源细胞相似的免疫调节作用。此外，与干细胞治疗相比，使用外泌体有特定的优势，减轻了许多安全性问题。例如，MSC-exo降低了触发免疫反应和异位移植的潜在风险。同时，MSC-exo体积小，无血栓形成风险，临床应用形式多端，除了静脉滴注、可轻易通过雾化、吸入、气管滴注、局部介入等手段辅助临床治疗。因此开发协同其免疫调节特性同时能够提高治疗效果的皮肤治疗制剂将丰富炎症性皮肤疾病的临床治疗手段，为改善患者的疾病进展，尤其是一部分激素依赖型患者带来治疗机会。
CN 109431910 B 公开了一种皮肤屏障修复组合物的配方，用于恢复头皮屏障功能，降低其易感性，其主要成分为化学物质。CN 109125107 B 利用组合物多肽产生的协同增效作用，提出了一种改善和修复面部激素依赖性皮炎的多肽组合物。CN 108379124 B 公开了预防与修复皮肤屏障损伤的精华油的发明，对于皮肤屏障功能异常的敏感皮肤具有良好的抗敏作用。以上发明主要以化妆品原料作为主要功效成分。CN 111432799 A 公开了干细胞来源外排体作为有效成分的组合物在使皮肤屏障增强和使其功能改善中的用途，旨在通过改善皮肤屏障指标脂类(如改善神经酰胺、二氢神经酰胺和/或鞘氨醇类碱的生产)和提高皮肤水合作用实现保护角质层的皮肤屏障、增强角质层的皮肤屏障和/或改善皮肤屏障功能。在上述现有技术文献中，化学成分限定的配方中多以舒敏、降低易感性达到皮肤屏障提升的辅助作用。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的首要目的在于提供一种全新的炎症性皮肤疾病的治疗剂——负载四氢姜黄素（THC）的干细胞源外泌体（THC-exo）皮肤稳态剂，该皮肤稳态剂中，THC-exo和依克多因（ectoin）协同增效，通过科学的试验配比，无需添加防腐剂，且可以有效增加外泌体的体外稳定性，对比单一的外泌体制剂，显著的提高了治疗效果。
本发明还提供了一种负载THC的干细胞源外泌体（THC-exo）皮肤稳态剂的制备方法。
本发明的另一目的为提供了一种负载THC的干细胞源外泌体皮肤稳态剂的应用，该皮肤稳态剂有效地用于预防、抑制、减轻或改善由多种因素引起的受损的皮肤屏障功能，这种皮肤屏障功能的改善体现在直接促进皮肤屏障蛋白的增高；且能够从根本上改善细胞功能，通过清除功能损伤细胞，维持受损皮肤的微环境，改善皮肤屏障持续受损状态。
为实现上述目的，发明人通过细胞、动物、人体试验验证，创新形成一套皮肤稳态剂的制备方法及其应用。该皮肤稳态剂可以有效的治疗炎症性皮肤疾病或者作为辅助治疗手段，减少炎症介质、增强皮肤屏障蛋白分泌，维持皮肤细胞正常解毒功能的作用，以上综合功效将有效改善皮肤内稳态失衡状态，达到治疗炎症性皮肤疾病的作用。
本发明所采用的技术方案具体为：
本发明提供了一种负载THC的干细胞源外泌体皮肤稳态剂，所述皮肤稳态剂的有效成分为THC-exo和依克多因。
本发明提供的皮肤稳态剂还包括舒缓剂、保湿剂。
进一步的，所述皮肤稳态剂通过以下百分数的原料组成：THC-exo 10% （v/v）、依克多因0.2%-5.0% （w/v）、舒缓剂0.5%-5%（w/v）、保湿剂 0.01%-0.5%（w/v）、余量为生理盐水或无菌水。
上述外泌体为干细胞、免疫细胞、植物细胞、皮肤成纤维细胞等分泌的外泌体。
上述外泌体包括试剂盒提取、切向流、超高速离心、密度梯度离心、尺寸排阻等方法提取的外泌体或细胞外囊泡。如不能穷举，不限于以上技术。
更优选的，本发明所述的抗炎活性成分：依克多因0.2%-2%（w/v）。
进一步的，所述舒缓剂为洋甘菊、尿囊素、金缕梅、金盏花、积雪草中的一种或几种；更优选的，本发明所述的舒缓剂为：洋甘菊0.7%-5 % （w/v）。
进一步的，所述保湿剂甘油、芦荟胶或透明质酸。更优选的，本发明所述的保湿剂为：多分子量组成的透明质酸0.1%-2.5 %（w/v），分子量 3000-100万。
进一步优选的，本发明所述的皮肤稳态剂的最佳组成为THC-exo 终浓度2×109个颗粒数，其他成分质量分数（w/v）: 依克多因 1%、洋甘菊 0.8%、透明质酸 （3000分子量）0.6%、透明质酸（5万分子量）0.2%、透明质酸（20-40万分子量）0.2%，还包括用于调节渗透压、缓冲pH的无机或有机盐类，其他有效成分，余量为生理盐水。
本发明还提供了一种负载THC的干细胞源外泌体皮肤稳态剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）将THC-exo加入溶媒制成THC-exo悬液备用；
（2）按比例将ectoin、舒缓剂、保湿剂混合，高压蒸汽灭菌锅或者辐射灭菌，所得溶液与THC-exo悬液混合，保持4℃，无菌操作；最后，用无菌缓冲液调节溶液pH，即得THC-exo皮肤稳态剂THC-exo-ect。
进一步的，步骤（1）中，所述THC-exo悬液的浓度为2×108-2×1010 particles /mL。
进一步的，步骤（2）中，所述pH为6.8-7.2。
本发明还提供了一种上述负载THC的干细胞源外泌体皮肤稳态剂在制备用于预防、抑制、减轻或改善由受损的皮肤屏障功能、改善细胞功能的化妆品或药物中的应用。
本发明制备过程中，所使用的的溶媒为缓冲液或生理盐水；优选的缓冲液为PBS缓冲液；同时，无菌缓冲液为PBS缓冲液。
根据本发明的一个实施方案的组合物可以制成各种剂型，经口剂型，例如散剂、丸剂、片剂、胶囊剂、混悬液、乳液、糖浆剂、颗粒剂、酏剂、气雾剂等。
根据本发明的一个实施方案的组合物可以制成皮肤外用制剂、栓剂、或无菌注射溶液剂。
根据本发明的一个实施方案的组合物可以制成化妆品组合物如精华液、粉剂(胶囊、冻干粉)、乳剂、霜剂、凝胶、面膜、敷料等。
根据本发明一个实施方案的组合物可制备成药物组合物。当将根据本发明一个实施方案的组合物制备成药物组合物时，根据本发明一个实施方案的组合物可以是用于经口或肠胃外施用的任何制剂。
根据常规方法，根据本发明一个实施方案的药物组合物可包含可药用的载体、赋形剂或稀释剂。
根据本发明一个实施方案的药物组合物的施用意指通过任何合适的方法将期望的物质引入到患者中，并且药物组合物可通过任何一般途径来施用，只要物质可到达靶组织即可。例如，根据本发明一个实施方案的药物组合物可经口或肠胃外施用。用于肠胃外施用的途径可包括经皮施用、腹膜内施用、静脉内施用、动脉内施用、淋巴内施用、肌内施用、皮下施用、皮内施用、表面施用、直肠内施用等。然而，本发明的范围不限于此，并且不排除本领域中已知的多种施用方法。
皮肤屏障发育缺陷发生在炎症性皮肤疾病中，包括AD和银屑病。与正常皮肤相比，炎症性皮肤疾病患者皮损处表现出经表皮水分丢失 ( transepidermal water loss，TEWL) 增加、皮肤屏障蛋白表达降低以及免疫反应异常等特征，说明其皮肤屏障功能下降。作为与外部环境接触的主要屏障，完整的皮肤屏障对于维持组织内稳态至关重要。因此，皮肤屏障修复的关键在于恢复皮肤屏障功能以及维持皮肤组织内稳态平衡，而不仅仅是增强角质层保护作用或提高水合作用可以达到的。炎症性皮肤病与皮肤内部环境的不平衡有关，包括生化缺陷、免疫反应的不平衡和细胞因子系统的异常。外部损伤，如紫外线辐射引起的损伤，会增加活性氧的形成，破坏DNA、脂质和蛋白质，破坏细胞外基质（ECM），促进细胞凋亡和细胞老化，从而加速炎症损伤。皮肤屏障损伤患者的皮肤细胞存在功能障碍，如何恢复细胞正常功能，确保皮肤微环境平衡，清除凋亡细胞带来的循环炎症、氧化损伤等失衡皮肤微环境，最终表现为屏障功能恢复，才是治疗皮肤屏障功能异常的根本。总的来说，皮肤内稳态是细胞与皮肤微环境相互作用过程中发生的一系列病理事件，其失衡引发细胞功能障碍，从而导致皮肤病的发生和发展。因此，本发明从恢复皮肤细胞基本功能出发，公开一种通过维持皮肤内稳态平衡改善皮肤屏障功能的皮肤稳态剂。并通过实施例验证了该发明最终可以增强皮肤屏障蛋白FLG的提升。
本发明具有以下优点：
（1）本发明提供的皮肤稳态剂中，ectoin既有增强皮肤水合及促渗作用，同时可以维持外泌体的稳定性，通过THC-exo、ectoin及各辅料协同作用下，在抗炎、提升屏障蛋白表达、改善细胞功能方面都优于单纯应用外泌体治疗。
（2）本发明制备得到的THC-exo具有免疫调节和恢复受损细胞功能的作用，有效降低炎症介质表达，再生受损细胞。负载THC的干细胞源外泌体，可以增强皮肤屏障蛋白——FLG的表达，有效提高受损皮肤屏障的修复作用。
附图说明
图1为THC-exo和THC-EVs的电镜形态对比图。
图2为THC-exo和THC-EVs的群体粒径对比图。
图3为THC-exo和THC-EVs的囊泡标志蛋白的检测图。
图4为THC-exo与THC-EVs 四氢姜黄素的负载比值 。
图5为THC-exo的浓度对HaCaT细胞增殖的影响图。
图6为依克多因浓度对的细胞毒性检测图。
图7为HaCaT紫外照射模型中FLG担保表达的检测。
图8为THC-exo皮肤稳态剂在3D皮肤模型中修复受损组织提高组织活力的功效验证。
图9为炎症因子抑制率比较图。
图10 皮肤稳态剂抑制凋亡细胞生成的防护及修复能力图。
图11 自由基清除功能验证图。
图 12 新西兰兔多次皮肤刺激试验图。
图 13 皮肤稳态剂降低刺激源致敏率。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。
实施例1负载THC的间充质干细胞和负载THC的外囊泡制备
MSC包裹THC的制备已在（专利号：ZL 2021 1 0670023.3）中详细说明，简要的：按照浓度梯度-温度梯度递增顺序将THC和间充质干细胞混合然后保温孵育，收集并纯化培养基。培养基经过10000g，离心30min后，得到纯化培养基。将纯化的培养基加入30 KDa超滤管中，4500rpm，4℃，离心2h，获得负载THC的外囊泡（THC-Evs ）的浓缩液。为了除去大的囊泡以及杂质，获得纯度较高的THC-exo，本发明将通过以下实施例2获得纯化的负载THC的外泌体。
实施例2 THC-exo的制备
实施例1获得THC-EVs加入蛋白低吸附的容器中，用预冷的PBS稀释20倍，0.22 μm滤器过滤，滤液加入超速离心管，密封管口，100,000g，4℃ 离心90 min。倾倒废液，预冷PBS清洗沉淀，100,000g，4℃ 离心60 min后，弃上清。用预冷生理盐水重悬沉淀，留样检测，余量-80 ℃冻存，即为THC-exo。
实施例3 THC-exo与THC-EVs的质量检验对比
THC-exo的形态：在封口膜上滴加样品溶液，用镊子夹住一片碳涂层铜网，正面朝下倒扣在样品液滴上，等待1 min，小心用镊子夹起铜网，用滤纸吸干铜网表面的液体。在封口膜上滴加2%磷钨酸染液30s ，将铜网正面朝下倒扣在磷钨酸染液上，盖到液滴上，等待约1 min，用滤纸吸干铜网表面的液体。将铜网放入透射电镜样品杆中，在80 kV的加速电压下观察THC-exo和THC-EVs的形态，如图1所示：在相同放大倍数下，所得溶液含有大量外泌体，形态规则，具有典型的茶杯样形态。THC-MVs中含有一定的非囊泡物质（白色框内），通过进一步超离获取的THC-exo的外泌体相对均一，成分更加明确。
的群体粒径：取100 μl THC-exo及THC-Evs样本，稀释到合适上样的浓度，通过纳米流式分析样本的群体粒径。68-155 nm 粒径标准品校准仪器后，每个样品上样100 μl测样。通过图2对比可以看出，THC-MVs 的群体粒径较为分散，有大的囊泡存在，符合技术要求。相较于改进技术，相同样品中，THC-exo的群体粒径较为均一。THC-exo 中卫粒径：THC-MVs 中卫粒径=65.8：77.2，可以看出THC-exo的粒径更小一些，可以较好的去除大的囊泡。通过富集更多的THC-EVs制备THC-exo，THC-exo 终浓度可达7.81×1011 particles/mL，THC-MVs中含有的囊泡浓度约6.9×109 particles/mL，二者相差约1100倍。
综合图1、图2可以看出，本发明制备的负载THC的外泌体，粒径上符合外泌体群体分布，电镜显示其形态符合外泌体典型特征-茶杯样。另外，该改进方法可以在THC-EVs基础上，获得更高浓度、杂质更少，均一度更高的外泌体溶液。这将可以通过更少的用量，实现更多的治疗方式。
实施例4 THC-exo的特征marker检测
取THC-exo、THC-MVs、MSC细胞悬液，囊泡用外泌体蛋白专用裂解液裂解，加入5×上样缓冲液（终浓度为 1×），混匀后煮沸5 min，得到的蛋白-20℃冻存备用。上样10% SDS-PAGE胶，调节电压为80 V，时间为20 min，之后设置100 V跑至溴酚蓝到达分离胶底部。将蛋白转移至PVDF膜，5%牛奶封闭过夜。加一抗孵育，PBS清洗5次后，加二抗孵育，显色。如图3所示，两种方法获得的囊泡物质THC-exo和THC-MVs均具有标志性蛋白CD9，CD81和TSG 101，阴性蛋白GM130 不包括在提取的囊泡中。相反，MSC中含有微量CD81，CD9和TSG101为阴性，GM130 表达阳性。通过对比可以发现，THC-exo中 CD9 和 CD 81以及TSG101 的丰度高于THC-EVs，证明我们获得的负载THC的外泌体纯度和浓度更高。
实施例 5 THC含量检测
收集THC-exo和THC-EVs样品，均稀释成2×108 particles/mL的样品，超声破碎，4℃，13000rpm离心30min，通过LC-MS/MS检测THC的浓度，方法同专利（专利号：ZL 2021 10670023.3），简要的：
色谱条件：色谱柱Agilent SB C18柱（4.6 mm×50 mm，1.8 μm），柱温30 ℃；流动相为含0.1%的甲酸的乙腈-水（50:50），流速0.3 mL/min；进样量10 μL；
质谱条件：采用电喷雾离子化源，正离子模式，喷雾电压源温度为100℃；雾化气为氮气，雾化压力40 psi；去溶剂气为氮气，温度为350℃，流速为10L/mL；碰撞气为高纯氮气，压力为0.1MPa，采用多反应监测（MRM）；
标准曲线：以四氢姜黄素浓度为横坐标，四氯姜黄素和内标物（地西泮）的峰面积比值为纵坐标，计算样品所含四氢姜黄素质量。
按照以下公式计算两样品中THC的比值：THC负载比值= M0/M×100%，其中，
M为THC-exo样品中四氢姜黄素质量检测值（g/L），
M0为THC-Ev样品中四氢姜黄素质量检测值（g/L）。
通过3批次检测发现，THC-exo/THC-Evs 为 1.2, 2.1, 1.6，均值1.63。说明如果得到相同的囊泡数，THC-exo中THC的负载率更高，说明THC主要包裹于exo中，因为THC-exo中的外泌体更加均一且浓度更高。
实施例6 细胞毒性评价
HaCaT细胞培养至90%融合度，胰酶消化，加入96孔平板，3000细胞/孔，6个平行，放入培养箱，37℃、5% CO2 。待细胞贴壁后，加入相应样品处理，孵育48 hr后，每孔加入10 μLCCK8反应液，继续孵育4 hr。于450 nm波长处用酶标仪测定光吸收值。按下式计算相对增殖率（RGR）： RGR = A / A0 × 100%
式中：
RGR——相对增殖率，%；
A——实验组吸光度-空白；
A0——阴性对照组吸光度-空白。
如图5所示，与对照组control相比，THCexo的终浓度为2×108-2×1010 时， 可以促进HaCaT细胞的增殖，其中，最佳浓度为2×109 particles/mL（**）。接下来的测试中，选择终浓度为2×109 particles/mL的THC-exo复合ectoin，筛选最佳配方。由图6可知，与THC-exo组相比，ectoin的质量分数为0.2%-3%之间时，RGR%＞100%，无细胞毒性。当复合的ectoin质量分数为0.5%-2%时，ectoin可以协同THC-exo促进HaCaT细胞的增殖，最佳浓度为1%。
实施例7 皮肤屏障稳态剂的制备
由实施例6可知，THC-exo的最佳作用剂量为2×109 particles/mL，ectoin含量1%。
本发明所述的皮肤稳态剂不含防腐剂、激素，无菌保存，制备方法如下：
实施例2中获得THC-exo在无菌生物安全柜中，制成2×1010 particles / mL的悬液备用，溶媒为缓冲液、生理盐水等。按如下配方添加质量分数组分：ectoin 1%、洋甘菊0.8%、透明质酸 （3000分子量）0.6%、透明质酸（5万分子量）0.2%、透明质酸（20-40万分子量）0.2%，高压蒸汽灭菌锅或者辐射灭菌。所得溶液以9:1 与THC-exo悬液于生物安全柜中混合。该过程保持4℃，无菌操作。最后，用无菌缓冲液调节溶液pH 6.8-7.2，即为THC-exo皮肤稳态剂，记为THC-exo-ect。
效果实施例一屏障修复功能评价
（一）THC-exo 与 ectoin协同增强屏障蛋白表达
采用含有 10% 胎牛血清1640培养基培养贴壁生长的人角质形成细胞系 HaCaT细胞，当融合度＞90%时，UVA/UVB 紫外线，70 mJ/cm2照射细胞10min，加入待测样品，其中，exo为相同方法获得的不含THC的等量外泌体。Exo，THC-exo悬液中外泌体的浓度与皮肤稳态剂中的一致，均为2×109 particles / mL。37 ℃ 继续培养48 hr。300 rpm离心收集细胞，PBS清洗收集细胞裂解，用于WB检测，检测方法同实施例4。
如图7所示，HaCaT细胞经过紫外辐照后，与对照组（con）相比，PBS组中FLG的表达显著降低。与exo相比，THC-exo促进FLG表达的能力提高，并且当与 1% ectoin同时加入培养体细胞，FLG的丰度更高。可见，THC、exo、ectoin三者在恢复皮肤屏障蛋白FLG的功能中具有协同增效的作用。
（二）组织活性及形态能力评价
应用3D皮肤模型评价该皮肤稳态剂的组织活性及组织形态恢复能力。
评价方法：0.2% 十二烷基硫酸钠（SLS）处理3D皮肤模型（EpiKutis）构建屏障损伤的炎症性皮肤模型。分组如下：
Control组：PBS；
模型组：PBS+SLS；
样品组1：exo+SLS
样品组2：THC-exo+SLS
样品组3：（THC-exo-ect）+SLS
3D皮肤模型涂抹终浓度0.2% SLS后2hr，加入待测样品和对照处理。所有样品均匀分布于模型表面，置于培养箱（37℃、5% CO2）中孵育 24 hr，收集3D皮肤模型培养液，备用于应“用例10”中ELISA试剂盒检测炎症因子。皮肤模型移入相应的孔板，利用MTT试剂盒，检测细胞活力。MTT 孵育结束后，PBS 清洗模型外表面，移入新的孔板中，加入异丙醇，并封口震荡。刺穿模型，吸取异丙醇浸提液，酶标仪 570nm 波长读取吸光度（OD）值。空白为异丙醇溶液。按以下公式计算各试验分组的相对组织活力：
(给药孔 OD－空白 OD) / (对照孔 OD－空白 OD) = 组织活力（%）
如图8所示，SLS可以有效造成模型组的皮肤组织活力降低，显著性###。当应用THC-exo或者THC-exo皮肤稳态剂治疗时，均能不同程度达到修复受损皮肤组织的作用，与模型组相比，显著性分别为 *，p<0.5 或 **，p<0.01。与单纯THC-exo相比，可见发明配方制作的皮肤稳态剂效果更佳。
效果实施例二炎症因子抑制功能评价应用例
（一）炎症因子抑制效果评价
“效果实施例一”中获得的3D皮肤模型培养液，利用ELISA试剂盒进行炎症因子IL-1β，IL-6，IL-8，TNF-α，PGE2的检测。炎症因子抑制率=（样品中炎症因子含量-对照组炎症因子含量）/ 对照组炎症因子含量 × 100%。 如图9所示，各组样本对炎症因子都有不同程度的一致作用。THC-exo以及THC-exo-etc稳态剂的炎症抑制作用较exo组更明显。显著地，THC-exo-etc 稳态剂对PGE2、TNF-α、IL-1β的抑制能力均高于其他组。
效果实施例三恢复细胞解毒功能，维持皮肤内稳态功能评价
（一）抑制细胞凋亡能力评价
收集 HaCaT 细胞，传至六孔板中，37℃，5% CO2 培养24 hr。
紫外照射
1）防护：六孔板中细胞经过PBS清洗后，设置处理组，加入不同浓度的待测样本，继续培养48 hr。48 hr后在距离紫外照射15cm处辐照5min，继续培养18 hr。
2）修复：在距离紫外照射15cm处辐照5min，辐照后细胞经PBS清洗一遍，加入不同浓度的待测样本，继续培养18 hr。
检测
收集细胞，离心弃上清，PBS重悬洗一遍，100 ul 1*Binding buffer重悬，加5 ul的FITC-Annexin V, 室温孵育15 min，清洗，离心后用 1*Binding buffer重悬，加入 PI，孵育5 min后用1*Binding buffer清洗，清洗后过滤，用于流式细胞仪检测对细胞凋亡的防护及修护能力。
由图10可知，紫外可以造成HaCaT细胞的凋亡。THC-exo与exo对UV损伤的防护和修复能力没有明显差异，当THC-exo与ectoin复配时，对UV的防护作用具有显著性，同时其在UV损伤后也表现出减少细胞凋亡的作用。
（二）·OH清除能力评价
取若干50 mL 离心管，按下（mL）表1加样，浓度参照上面溶液配制浓度。
表1. 加样体积表
Figure DEST_PATH_IMAGE001
37℃ 反应30min，冷却，2000 rpm/min离心10min。取上清液至96孔酶标板中，每孔200ul，于酶标仪上测定510nm波长的吸光度(OD)。每个浓度设置3个复孔，实验重复3次。按下列公式求出羟自由基清除率。
羟自由基清除率=A空白对照组-（A样品组-A样品对照组）/A空白对照组*100%。
炎症性皮肤疾病患者的皮肤微环境导致细胞功能受损，活性氧增多，反之又加剧炎症反应，破坏皮肤功能，加剧炎症性皮肤疾病的进程。通过·OH清除实验，与具有显著抗氧化活性的Vc（100μg/mL）相比，THC-exo对·OH的清除率显著提高（约为1.5倍）；THC-exo-etc稳态剂对· OH的清除率大于100μg / mL Vc 的2倍以上，与200μg/mL 的Vc 相当（均＞90%），已接近100%，详见图11。以上结果说明，该皮肤稳态剂可以有效抗氧化，清楚多余的羟基自由基，维持皮肤内稳态平衡，提高皮肤细胞的解毒能力。
效果实施例四多次皮肤刺激评价
新西兰兔剃毛备皮，将每只兔子的背部皮肤分为四个区域，分别涂抹0.5 mL PBS和试验组样品，每天两次，共14天进行刺激性试验。记录受试兔子的皮肤反应，记录相应得分，见下表2。由表2和图12可知，THC-exo和THC-exo-ect均不会引起皮肤刺激性。
表2. 受试物对新西兰兔多次皮肤刺激试验结果
Figure 140682DEST_PATH_IMAGE002
注：每组样品统计动物4只
效果实施例五对常见刺激物的防护作用
受试者10人，手臂前端涂抹PBS（对照组）或皮肤稳态剂后，再进行刺激物的斑贴试验，统计受试者数据发现，涂抹区域能大大减缓刺激源对皮肤所造成的损伤，说明本发明皮肤稳态剂可以在一定程度上保护表皮细胞膜结构完整性及屏障功能，提高皮肤的耐受性，并有修复受损肌肤减轻过敏症状的功效（图13）。

Claims (9)

1.一种负载THC的干细胞源外泌体皮肤稳态剂，其特征在于，所述皮肤稳态剂的有效成分为THC-exo和依克多因。
2.根据权利要求1所述的负载THC的干细胞源外泌体皮肤稳态剂，其特征在于，所述皮肤稳态剂还包括舒缓剂、保湿剂。
3.根据权利要求1或2所述的负载THC的干细胞源外泌体皮肤稳态剂，其特征在于，通过以下百分数的原料组成：THC-exo 10% （v/v）、依克多因0.2%-5.0% （w/v）、舒缓剂0.5%-5%（w/v）、保湿剂 0.01%-0.5%（w/v）、余量为生理盐水或无菌水。
4.根据权利要求3所述的负载THC的干细胞源外泌体皮肤稳态剂，其特征在于，所述舒缓剂为洋甘菊、尿囊素、金缕梅、金盏花、积雪草中的一种或几种。
5.根据权利要求3所述的负载THC的干细胞源外泌体皮肤稳态剂，其特征在于，所述保湿剂甘油、芦荟胶或透明质酸。
6.一种如权利要求1-5任一项所述的负载THC的干细胞源外泌体皮肤稳态剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将THC-exo加入溶媒制成THC-exo悬液备用；
（2）按比例将ectoin、舒缓剂、保湿剂混合，高压蒸汽灭菌锅或者辐射灭菌，所得溶液与THC-exo悬液混合，保持4℃，无菌操作；最后，用无菌缓冲液调节溶液pH，即得THC-exo皮肤稳态剂THC-exo-ect。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述THC-exo悬液的浓度为2×108-2×1010 particles / mL。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述pH为6.8-7.2。
9.一种如权利要求1所述的负载THC的干细胞源外泌体皮肤稳态剂在制备用于预防、抑制、减轻或改善由受损的皮肤屏障功能、改善细胞功能的化妆品或药物中的应用。
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